ヘリコバクター・ピロリの糖鎖生合成は宿主免疫細胞の認識と応答を調節する

2024年3月20日 16:15

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オリジナル研究論文
フロント Cell. Infect. 微生物学、2024年3月20日
Sec.微生物と自然免疫
第14巻 - 2024年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2024.1377077
この論文は次の研究テーマの一部です
宿主と病原体の相互作用における微生物のグリコシル化の役割

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ヘリコバクター・ピロリの糖鎖生合成は宿主免疫細胞の認識と応答を調節する

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2024.1377077/full?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Katharine A. Barrett Francis Jacob Kassama William Surks Andrew J. Mulholland Karen D. Moulton Danielle H. Dube*.
米国ミネソタ州ブランズウィック、ボウディン大学化学・生化学部
はじめに病原細菌ヘリコバクター・ピロリは、宿主の免疫防御を回避するために糖鎖を介したメカニズムを進化させてきた。本研究では、ピロリ菌の糖鎖生合成の遺伝子破壊が、ヒト胃上皮細胞および単球由来樹状細胞による免疫認識と応答を変化させるという仮説を検証する。

方法この仮説を検証するために、ヒト細胞株を野生型ピロリ菌と、ピロリ菌の糖鎖生合成変異体のアレイと並べてチャレンジした。未熟樹状細胞の成熟とサイトカイン分泌により、免疫応答の相対レベルを測定した。

結果その結果、リポ多糖の生合成を阻害すると、樹状細胞の認識と活性化を阻害することなく、胃のサイトカイン産生が減少することが示された。これとは対照的に、タンパク質の糖鎖付加変異体では免疫応答の変動が観察された。このことから、細菌の細胞表面の糖鎖付加とそれに続く免疫認識を制御する上で、相変化が役割を果たしているという仮説を検証することになった。ルイス抗原提示は免疫応答の程度と相関しないが、リポ多糖O-抗原精製の程度は相関する。

考察：本研究の結果は、ピロリ菌の糖鎖が宿主の免疫応答を調節することを示している。この研究成果は、微生物病原体の免疫原性を調節するために、細菌糖鎖の免疫ベースのテーラーリングを追求する基盤を提供するものである。

1 はじめに
細菌病原体における耐性メカニズムの進化と拡散により、抗生物質の治療効果は失われつつある（Thung et al.）グラム陰性胃細菌であるヘリコバクター・ピロリは、世界保健機関（WHO）の新規抗生物質開発の最優先課題である抗生物質耐性菌のリストに入っている（Dong and Graham, 2017; Tshibangu-Kabamba and Yamaoka, 2021）。ピロリ菌は日和見主義のグラム陰性菌で、世界中のおよそ50％の人々の消化管に存在している（Dunne et al.）比較的偏在しているにもかかわらず、ピロリ菌が重篤な病態を引き起こすのは症例のおよそ15%にすぎず、その場合、感染は消化器系の問題やエネルギー枯渇から消化性潰瘍疾患や胃がんへと急速に変化する可能性がある（Suerbaum and Michetti, 2002; Chen et al., 2013; Kim, 2016; Bravo et al., 2018; Malfertheiner et al.）最近の研究では、ピロリ菌の病原と、心血管疾患、神経疾患、皮膚疾患などの胃外疾患との関連が示唆されている（Gravinaら、2018）。さらに、低所得者層では、汚染された飲料水や設備の整っていない衛生システムでの感染が考えられるため、感染リスクが高い（Kim, 2016; Lim et al., 2013; Stefano et al.）ピロリ菌は、免疫応答が発現しているにもかかわらず、数十年にわたってヒトの胃に持続的に定着する可能性がある。さらに、効果のない治療、休眠状態の変化、または再感染による最初の除菌後の感染の再発は、抗生物質耐性が増加している現在の状況において脅威となっている（Celliniら、2008；MoyaおよびCrissinger、2012；Huら、2017；ReshetnyakおよびReshetnyak、2017；Di Fermoら、2023）。これらのことから、ピロリ菌の病原性を軽減するための新規アプローチを特定することが急務である。

ピロリ菌がある環境では病原性を示し、他の環境では休眠状態にあることから、感染による有害な結果を調節できる可能性が示唆される。特に、ピロリ菌に対する局所的な宿主免疫応答が患者の予後と直接相関していることは、広範な研究によって証明されている。ピロリ菌感染におけるインターロイキン-8や他のサイトカインの分泌などの炎症性シグナル伝達のアップレギュレーション（El Filalyら、2023年）は、胃炎を支える慢性炎症を促進し、消化性潰瘍疾患や胃がんのリスクを増加させる（Robinsonら、2007年；Lamb and Chen、2013年；White and Winter、2015年）。従って、宿主の免疫応答を調整することで、感染の経過を変化させ、根絶を促進する一方で、慢性炎症による下流の影響を最小限に抑えることができる可能性がある。

慢性炎症と発がんに関与する因子がいくつか同定されている（Baj et al.）ピロリ菌はプロテアーゼを産生し、上皮細胞を保護するムチンを分解し、免疫系によるサイトカイン産生を誘発する（Byrdら、2000；Yoshimuraら、2002；Posseltら、2017）。さらに、ピロリ菌はウレアーゼを分泌してアンモニアを生成し、酸性の胃を中和し、このタンパク質が免疫細胞を活性化することで炎症を促進する（Olivera-Severoら、2017年）。ピロリ菌は、ある種の接着因子であるBabAとSabA（Doohanら、2021年）、毒素であるVacA（CoverとBlanke、2005年）、その他の病原性関連タンパク質であるOipAとDupAの発現量が、感染の病原性を高めることを示すデータがある（Yamaokaら、2002年；Luら、2005年）。有名なことに、ピロリ菌CagAタンパク質とcagA病原性アイランドによってコードされるIV型分泌システムのアップレギュレーションは、CagA、ペプチドグリカン、その他の分子の宿主細胞への注入を引き起こし、炎症を大幅に増加させる（Vannini et al.） CagAによって引き起こされる胃の炎症は、胃の発がんと相関するほど深刻であり、CagAは発がん性があると考えられている（Tanaka et al., 2010; Jiménez-Soto and Haas, 2016）。しかし、これらの因子と患者の病態との相関は必ずしも直線的ではなく、宿主の遺伝子型、感染年齢、環境因子などの他の決定因子がさらに炎症、胃炎、その後の病態の分布を複雑にしている（El-Omarら、2003; MaChadoら、2003; Luら、2005）。ピロリ菌の感染源にかかわらず、炎症レベルとピロリ菌感染によって誘導される独特の免疫応答は、疾患の転帰を決定する（Robinsonら、2007; White and Winter, 2015; Gobert and Wilson, 2022）。ピロリ菌がヒトの免疫認識を回避または刺激する経路をさらに研究することで、細菌感染に対する免疫ベースの治療法の開発が促進されるであろう。

宿主と細菌の相互作用のインターフェースとして機能する糖鎖は、ピロリ菌の免疫原性を理解し、最終的にそれを調節する鍵となるかもしれない。ピロリ菌はその細胞外皮を糖鎖と呼ばれる炭水化物で飾っている（Tra and Dube, 2014）。大まかに言えば、細菌の糖鎖は細胞接着、宿主の擬態、免疫回避において役割を果たしている（Tra and Dube, 2014; Prado Acosta and Lepenies, 2019; Alemka et al.）ピロリ菌はその外膜のリポ多糖（LPS）の末端にルイス抗原四糖を設置する。これらのエピトープはヒト血液細胞上に一般的に存在し、病原体が宿主の免疫反応を回避するのを助ける（Wangら、2000；Simoons-Smitら、1996；Radら、2002）。さらに、ピロリ菌アドヘシンタンパク質のグリコシル化は、宿主の胃上皮細胞に結合する機能に不可欠である（Champasaら、2013；Tengら、2022）。パターン認識受容体（Toll様受容体など）によるリポ多糖やペプチドグリカンの宿主認識から、免疫寛容受容体（DC-SIGNなど）に関与する糖鎖模倣を利用した細菌への免疫応答の引き金に至るまで、細菌の糖鎖が宿主の免疫認識と応答をどのように媒介するかについては、これまでに実証されている（Aleka et al、 DC-SIGN）（Alemka et al., 2013; Smedley et al., 2005）であることから、ピロリ菌の細胞表面糖鎖は、慢性炎症シグナルを刺激し、専門的な抗原提示細胞による検出を妨害することによって、宿主の免疫応答を調節する上で重要な役割を担っているという仮説を立てた。この仮説を検証するために、我々は糖鎖生合成経路の異なるステップで変異を持つピロリ菌株に対するヒト免疫細胞の応答を特徴付けることを目的とした。

ここでは、ヒトの胃免疫微小環境の2つのモデルと共培養した際に、5つの糖鎖変異株によって惹起される免疫応答の特徴を明らかにする（図1A）。各糖鎖変異株で刺激したときの胃のサイトカイン産生と免疫細胞の成熟度を、野生型ピロリ菌と比較して評価した。その結果、LPSを切断した株は、野生型ピロリ菌と比較して、同レベルの未熟樹状細胞（iDC）の活性化を刺激するにもかかわらず、炎症性サイトカインの産生を抑制することが示された。さらに、タンパク質のグリコシル化変異体は、相変化するルイスYエピトープの発現とは相関しない、様々な免疫応答を誘導した。これらの結果は、LPSの提示がピロリ菌の宿主免疫認識に関与していることを示唆しており、免疫認識の推進における糖タンパク質の正確な役割はまだ不明である。本研究は、病原微生物に対する胃の免疫応答と糖鎖構造の関係を探る今後の研究の必要性と実現可能性を示している。

図1
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図1 糖鎖生合成変異体を免疫刺激性についてスクリーニングした。(A) ピロリ菌に対する宿主の免疫認識および応答に関する糖鎖集合体変異を評価するアプローチの実験フロー概略図。(B）変異の対象とした5つの遺伝子と糖タンパク質およびリポ多糖のアセンブリーにおけるそれらの役割を含む、推定される糖鎖生合成経路の概略図。GP、糖タンパク質；GT、糖転移酵素；LPS、リポ多糖；OST、オリゴ糖転移酵素；UndPP、ウンデカプレニル二リン酸。画像はBioRenderを用いて作成した。

2 材料と方法
2.1 H. pylori株と菌の増殖。
野生型G27ピロリ菌は、4％コロンビア寒天ベース、5％馬血液、10μg/mLのバンコマイシン、5μg/mLのセフスロジン、5μg/mLのトリメトプリム、8μg/mLのアムホテリシンBからなる馬血液寒天プレート（HBA）上で増殖させた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットを持つH. pylori糖鎖変異体（Δ579, Δ580, Δ1179, Δwzk, ΔwaaL）は、34μg/mLのクロラムフェニコール添加HBAプレートで増殖させた。各実験では異なるフリーザーロットを用いた。各実験に先立ち、野生型および変異型細菌を、細菌増殖の完全な芝生が観察されるまで4～5日間増殖させ、腺がん由来胃上皮細胞（AGS）との共培養では1.0～1.4×10（Chenら、2013）cells/mL、樹状細胞共培養では4.7×10（Kim、2016）cells/mLの濃度に希釈した。

2.2 バイオインフォマティクス解析による推定オリゴ糖転移酵素遺伝子の同定
ピロリ菌の一般的なタンパク質糖鎖付加システムに関与する推定オリゴ糖転移酵素遺伝子を同定する目的で、ピロリ菌G27のバイオインフォマティクス解析を行った。簡単に述べると、他のH. pyloriゲノム（G27, 26695, J99, P12）間で保存されている糖転移酵素をコードする遺伝子を同定するために、Geneious Prime 2020 (Darling et al., 2004)上でMauve (version 1.1.3)を用いて全ゲノムアライメントを行った。G27ゲノムは、"Annotate Microbial Genome "としてデフォルトパラメータでKBaseサーバーにプリロードされたRAST（RASTtk - v1.073）パイプライン（Aziz et al.、2008）を用いて、KBaseサーバー（Arkin et al.、2018）上でGlimmer（Delcher et al.、2007）を使用してオープンリーディングフレームを解析した。G27ゲノムの遺伝子解析はGeneious Prime 2020を用いて行い、遺伝子の比較はBLAST (Altschul et al., 1990)を用いて行った。ドメインは、PFam HMM 32.0データベース(El-Gebali et al., 2019)を用いたG27ゲノムに対するHMMER(Eddy, 2011)検索を用いて同定した。過去に生化学的な特徴付けがなされていないオープンリーディングフレームについては、PHYRE2認識サーバー（Kelley et al.、2015）を用いて相同性を解析した。このアプローチにより、HpG27_1179はH. pyloriの一般的なタンパク質グリコシル化システムにおいて役割を果たすと考えられるオリゴ糖転移酵素であることが同定された。

2.3 糖鎖形成変異体の構築と糖タンパク質生合成表現型の解析
Δ579株とΔ580株は以前に記載されており（Moulton et al.、2020）、Δ1179株、Δwzk株、ΔwaaL株は本研究のために作製された。ギブソンアセンブリーを用いて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットによる標的遺伝子の挿入不活性化用の直鎖DNA断片を作製した。得られた直鎖DNAをパッチ法による自然形質転換により野生株G27に形質転換し、相同組換えにより遺伝子の挿入を自律的に完了させた。クロラムフェニコール/HBA寒天培地で選抜された変異株への耐性カセットの挿入が成功したことは、選抜された変異株のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）解析により確認された。ペルアセチル化N-アジドアセチルグルオクサミン（Ac4GlcNAz）とPhos-FLAGを用いた生物直交化学を用いた既報の代謝糖鎖標識法を用いて、野生型H. pyloriと新たに構築した糖鎖変異株Δ1179、Δwzk、ΔwaaLにおける糖タンパク質生合成を検出した（Moulton et al.

2.4 組織細胞培養
組織培養試薬、組織培養プレート、ELISAキットは、ThermoFisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム）、MilliporeSigma社（マサチューセッツ州バーリントン）、R&D Systems社（ミネアポリス）、USA Scientific社（フロリダ州オカラ）から購入した。AGS細胞（ATCC番号：CRL-1739）は、Ham's F-12 Glutamax培地で培養し、80-90％のコンフルエントに達した時点で継代した。THP-1未熟樹状細胞（iDC；ATCC番号：TIB-202）は、細胞濃度が1×10（Bravoら、2018）cells/mLを超えた時点で新鮮培地（グルタミン入りRPMI1640）で1：3〜1：5に希釈し、過密状態を防止した。共培養の前に、THP-1単球をヒト組換えサイトカインIL-4（1500 IU/mL）およびGM-CSF（1500 IU/mL）を介して未成熟樹状細胞に分化させた後、共培養用の6ウェルプレートにウェル当たり2 x 10（Suerbaum and Michetti, 2002）細胞の濃度で播種した。AGS細胞は、共培養前に6ウェルプレートに5 x 10 (Suerbaum and Michetti, 2002) cells/mLで播種した。

2.5 共培養
野生型ピロリ菌または変異型ピロリ菌を、組織培養培地1mL中で、未熟樹状細胞チャレンジの場合は1:100、胃細胞培養の場合は1:200のMOIで、播種した6ウェルプレートに添加した。共培養は、37℃、5% CO2で3～24時間培養した後、回収した。

2.6 ELISAアッセイ
AGS細胞では3時間、未成熟樹状細胞では24時間の共培養後、培養液を回収して分析した。ヒトサイトカインデュオセット酵素免疫測定法（ELISA）キット（R&D Systems社製）を用いて、CXCL-8（IL-8）、IL-10、TNF-α、IL-6、IL-1βの相対濃度を検出した。
IL-6、またはIL-1 β
コンディショニング培地サンプルの相対濃度を検出した。すべてのサイトカイン濃度データは、各 DuoSet キットに含まれる組換えヒトサイトカイン標準物質を用いて作成した 8 ポイント標準曲線に基づいて決定した。

2.7 未熟樹状細胞のフローサイトメトリー解析
野生型および変異型細菌との共培養後、未成熟樹状細胞を回収し、FITC標識CD80およびPE標識CD86ヤギ抗ヒト抗体を含む10%FBS添加RPMI培地に氷上で30分間懸濁した（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）。その後、細胞をPBSで洗浄し、BD Accuri C6+装置（BD Biosciences, San Jose, California）を用いてフローサイトメトリーで解析した。CD80とCD86を発現する樹状細胞をゲーティングし、FlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）を用いてカウントした。

2.8 ルイスYウエスタンブロット
樹状細胞チャレンジと並行して、細菌細胞によって産生されたルイスYを分析するために、同じロットの細菌細胞を同日にプレーティングした。細胞をプロテアーゼ阻害剤入りのH. pylori溶解バッファー［20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Igepal, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, Protease inhibitor (MilliporeSigma)］に再懸濁し、30分間凍結して細胞を溶解した。溶解液のタンパク質濃度はLowry assayを用いて測定し、溶解液濃度は2.5 mg/mlに標準化した。サンプルは、Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast 12%アクリルアミドゲル（4%スタッキング層付き）（Bio-Rad）でSDS-PAGEにより電気泳動した。タンパク質のローディングを評価するためにクマシー染色を用いた。ルイスY検出のため、電気泳動したサンプルをニトロセルロースに移し、ウェスタンブロット解析を行った。サンプルを転写したニトロセルロース膜を抗ルイスY抗体（Abcam, Waltham, MA）、抗マウスIgM HRP（Southern Biotech, Birmingham, AL）でプローブした後、ルミノール／ペルオキシダーゼ試薬で処理し、Syngene G box（Cambridge, UK）を用いて可視化した。

2.9 LPS発現プロファイリング
樹状細胞チャレンジと並行して、細菌細胞によって産生されたLPSを解析するために、同じロットの細菌細胞を同日にプレーティングした。細菌を溶解し、LPS溶解バッファー［10% SDS、4% β-メルカプトエタノール、0.06 mg/mL ブロモフェノールブルー、10% グリセロール、75% 1M Tris-HCl（pH6.8）］で希釈し、100℃で10分間インキュベートした後、室温まで冷却し、55℃で一晩Proteinase K（New England Biolabs）で処理した。LPSを可視化するため、サンプルはその後、コントロールとして250 µg/mLの大腸菌LPS（血清型055:B5）とともに、15% Tris-HClのSDS-PAGEゲルを用いてSDS-PAGEで電気泳動した。電気泳動後、ProQ Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてゲルを染色した。ゲルをUVP BioDoc-It Imaging System（Upland、CA）で可視化し、共培養時のLPS発現を測定した。

3 結果
3.1 LPS精製は炎症性胃シグナルを増加させる
免疫反応と下流の臨床病態の重要な指標は、胃微小環境におけるインターロイキン8（IL-8またはCXCL-8）の分泌である。CXCL-8は炎症性サイトカインであり、炎症反応を促進し、好中球を感染部位に動員するためにアップレギュレートされる（Haradaら、1994；Bickel、1993；Qiら、2020）。簡単に説明すると、胃上皮細胞はその表面にToll様受容体（TLR）を発現しており、細菌性糖鎖を含む病原体関連分子パターン（PAMP）と結合し、細菌性病原体の挑戦を受けるとCXCL-8の分泌につながる（Lepperら、2005；Smith、2014；Pachathundikandiら、2015；Pachathundikandi and Backert、2016）。さらに、ピロリ菌は、細胞内へのADP-ヘプトース注入、細胞内でのPAMP認識、およびNF-kBの活性化が関与する、CagタイプIV分泌系（Cag-T4SS）依存性の機序を介して、胃上皮細胞のCXCL-8産生を刺激することができる（Faassら、2021；Pfannkuchら、2019）。ピロリ菌感染では、CXCL-8の過剰発現が胃炎やがんの増殖に直接関係している（Waugh and Wilson, 2008; Liu et al.）ピロリ菌の病原におけるCXCL-8の重要性を考慮し、我々はまず、ピロリ菌の糖鎖を調節することが、胃細胞からの相対的なCXCL-8応答に及ぼす影響を明らかにしようとした。

これらの実験では、宿主の認識と応答におけるピロリ菌の糖タンパク質とLPSの役割に特に興味を持った。そこで我々は、H. pyloriの一般的なO-結合タンパク質グリコシル化系および／またはLPS生合成（図1B）で役割を果たすグリコシル化遺伝子に注目した（Moultonら、2020；Tengら、2022；Liら、2019；Liら、2016）。手短に言えば、我々の研究室および他の研究室における以前の研究では、挿入により不活性化された糖鎖形成遺伝子を持つG27 H. pylori変異体における糖タンパク質およびLPS生合成の表現型を測定した（Moultonら、2020；Liら、2019）。これらの研究は、H. pyloriの糖タンパク質およびLPS生合成に関与する遺伝子を同定するとともに、当初は重複していた糖タンパク質およびLPS生合成経路が、後の段階で分岐していることを示す証拠となった（図1B）。両経路とも、まず糖転移酵素の触媒作用により、ウンデカプレニル-リン酸脂質担体に単糖が一度に一つずつ付加され、細胞質膜表面に精巧な脂質結合型糖鎖が生成される。次に、この糖鎖はフリッパーゼWzkによって膜上で反転され、リガーゼWaaLによって脂質A上に一括転移され、LPSを産生するか、あるいは（WaaL、あるいはHpG27_1179にコードされる推定上のオリゴ糖転移酵素（OST）によって）標的タンパク質上に転移され、糖タンパク質を産生する。糖タンパク質上の精製された糖鎖は、HpG27_579とHpG27_580にコードされる糖転移酵素（H. pylori 26695のオルソログについては補足表S1を参照）によってさらに調整されるようである（Moulton et al.）以前の研究で、H. pylori糖鎖変異体Δ579およびΔ580は糖タンパク質生合成に欠損があることが示され（Moulton et al.、2020）、ΔwzkおよびΔwaaLがO-抗原を欠くコアリピドAを合成することが立証された（Li et al.、2019）。この糖タンパク質生合成モデルをさらにプローブするため、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットを挿入してwzk、waaL、HpG27_1179を不活性化し、変異株における糖タンパク質生合成をプローブした。確立された代謝糖鎖標識に基づくスクリーニング（Moulton et al., 2020）を用いて、Δ1179、Δwzk、およびΔwaaLが糖タンパク質生合成に欠損を持つことを決定した（図2）。この5つのピロリ菌糖鎖生合成変異株（Δ579, Δ580, Δwzk, ΔwaaL, Δ1179；補足表S1）からなる控えめなパネルを用いて、野生型菌に対するこれらの株の免疫原性を評価した。

図2
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図2 Δ1179、ΔwaaL、Δwzkは糖タンパク質生合成欠損を示すことが代謝標識から明らかになった。(A）抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロット解析により、Ac4GlcNAz（Az）で処理した野生型（WT）H. pyloriでは強固な糖タンパク質生合成が見られ、Ac4GlcNAc（Azなし）で処理した陰性対照では明らかなアジド依存性シグナルは見られなかった。糖鎖付加変異体Δ1179、ΔwaaL、Δwzkは、Ac4GlcNAzで代謝的に標識した場合、WTと比較して糖タンパク質生合成が著しく減少した。 (B) 代謝的糖鎖標識実験から得られた電気泳動サンプルのクマシー染色により、ウェスタンサンプルには同量のタンパク質が含まれていることが明らかになった。

変異株と野生型ピロリ菌から惹起される相対的な炎症反応を評価するために、胃上皮細胞をそれぞれの菌株と3時間共培養した。その後、上清を回収し、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いてCXCL-8の分泌量を測定した（図3A）。陰性対照として、培地のみで培養した胃細胞から上清を回収した。陽性対照として、野生型（WT）細菌と共培養した胃細胞の上清を用いた。文献から予想されるように、すべての野生型細菌処理は、細菌チャレンジのない対照細胞と比較して、胃細胞のCXCL-8分泌を有意に増加させた（図3）（El Filalyら、2023；GobertとWilson、2022；Outliouaら、2020）。精巧なLPS構造を持つ糖タンパク質変異体Δ579は、野生型細菌と比較して胃細胞からのCXCL-8分泌を一貫して増加させたが（図3B）、LPS変異体ΔwzkはCXCL-8分泌を一貫して減少させた（図3C）。これらのデータは、LPSの生合成を阻害することで緩和される可能性のある、TLR4に関与する完全に精製されたLPSの炎症性特性と一致している。LPS生合成の阻害によって炎症性シグナル伝達が減少することは、Cag T4SSに依存するLPS代謝産物送達によるCXCL-8誘導の確立されたメカニズムとも一致する（Faassら、2021；Coverら、2020）。対照的に、糖タンパク質変異体Δ580とΔ1179、およびLPS変異体ΔwaaLは、野生型よりも有意に高いCXCL-8レベルを示すこともあれば（図3D、F、H）、野生型よりも有意に低くコントロールレベルに近いこともあった（図3E、G、I）。Δ580、Δ1179、ΔwaaL処置の生物学的複製実験間で観察されたCXCL-8分泌のばらつきに当初は驚いたが、これらの結果を確認するために多数の独立した実験を行った。これらの変異体について、少なくとも3つの独立した複製実験では、野生型細菌と比較してCXCL-8分泌レベルが増加し、さらに少なくとも3つの生物学的複製実験では、野生型細菌と比較してサイトカイン分泌レベルが減少した。同様の表現型切断を持つ変異体に対するCXCL-8応答の不一致は、CXCL-8分泌の調節にさらなる因子が関与していることを示唆している。

図3
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図3 CXCL-8の分泌は糖鎖の変化によって変化した。(A）野生型H. pyloriと比較した糖鎖変異体の炎症性サイトカイン分泌を評価する実験ワークフロー。画像はBioRenderを用いて作成した。(B）精巧なLPS構造を持つ糖タンパク質変異体Δ579は、野生型と比較して胃上皮細胞からのCXCL-8分泌を増加させた。(C）LPS変異体Δwzkは、野生型に対して胃上皮細胞からのCXCL-8分泌低下を誘導した。(D-I）糖タンパク質変異体Δ580とΔ1179、およびLPS変異体ΔwaaLは、共培養実験によって野生型と比較してCXCL-8分泌に様々な影響が観察された。エラーバーはテクニカルレプリケート。Tukeyの多重比較検定一元配置ANOVAを用いた。(**P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001, ns, not significant)。データは、同じ所見を示した独立した反復実験（n＞3）の代表値である。

細菌の体力に関係なく糖鎖の免疫刺激活性を突き止めるために、熱で殺した細菌を胃上皮細胞と共培養した。驚くべきことに、熱で殺したピロリ菌と接触させた胃細胞からは、CXCL-8分泌のアップレギュレーションは見られなかった（補足図S1）。その代わりに、熱で死滅させた野生型ピロリ菌または熱で死滅させたΔ580細胞で処理した胃細胞からは、細菌を添加しない場合と同程度の陰性対照レベルのCXCL-8が放出された（補足図S1）。これらの結果は、細菌の積極的な感染と統合された糖鎖の提示が免疫刺激応答に不可欠である可能性を示している。

3.2 ピロリ菌糖鎖変異体に対する樹状細胞の活性化
樹状細胞は、細胞を介した適応免疫応答の形成において中心的な役割を果たしている。これらの細胞は、制御性T細胞との結合による免疫寛容と、CD4およびCD8 T細胞への貪食および抗原提示による免疫反応のバランスをとっている（Coombes and Powrie, 2008）。ピロリ菌は、大腸菌のLPSに匹敵するレベルで、ヒト樹状細胞の強力な活性化と成熟を誘導する（Kranzer et al.）しかし、ピロリ菌が樹状細胞の成熟制御をどのように調節しているのか、また、この調節が病原体と常在腸内微生物の識別における樹状細胞の役割にどのように影響しているのかは明らかではない。ピロリ菌LPSの免疫刺激活性が比較的低いことが、ピロリ菌の明らかな免疫回避に寄与していることを示唆する研究もある一方（Pérez-Pérezら、1995年）、下流経路のシフトが制御性T細胞の結合を促進し、病原体に対する免疫寛容をもたらすことを示唆する研究もある（Kaoら、2010年）。

いずれにせよ、私たちは、樹状細胞の成熟を介した適応免疫調節をより直接的に測定することで、AGS細胞から得られた自然免疫応答に関する知見を補完することを目指した。樹状細胞はプロの抗原提示細胞として、胃の上皮層を横断し、病原体に出会うまで消化管を調査する。接触し認識されると、未熟な樹状細胞は活性化され、CD4とCD8の両方のT細胞を活性化するように形態を変化させ、強固な適応免疫応答を行う（Liu and Cao, 2015）。この形質転換の一環として、樹状細胞は細胞表面の共刺激性レセプターCD80とCD86をアップレギュレートし、CD4+とCD8+ T細胞上のCD28と結合する。これらのバイオマーカーは、未成熟樹状細胞上で低レベルで発現するため、免疫細胞活性化の代理として検出される可能性がある（Kim and Kim, 2019）。iDC活性化の割合は、適応免疫応答の程度を反映する。野生型ピロリ菌によって生じるCD80およびCD86の発現レベルが高いことは、より高い認識と、細胞傷害性T細胞の発生を含む下流の適応免疫応答の増加に対応する。

糖鎖切断が免疫細胞の活性化に及ぼす影響を調べるため、未成熟樹状細胞に野生型ピロリ菌と糖鎖切断変異体を接触させ、フローサイトメトリー解析により相対的な免疫応答を測定した。細菌との共培養で24時間後、iDCを分離し、抗CD80抗体と抗CD86抗体でプローブし、フローサイトメトリーで蛍光を測定した（図4A）。蛍光が高いほどバイオマーカー発現レベルが高いことを示し、これはiDCによる免疫反応の亢進に対応する。フローサイトメトリー解析から、細菌にチャレンジした樹状細胞は、チャレンジしていない樹状細胞と比較して、CD80とCD86バイオマーカー発現が有意に増加することが明らかになった（図4；補足図S2）。野生型ピロリ菌でチャレンジしたiDCのフローサイトメトリーヒストグラムは、糖鎖変異体でチャレンジしたiDCと密接に重なった（図4）。野生型ピロリ菌と糖鎖変異体との比較では、iDC上のCD80とCD86のレベル、あるいは高発現レベルの細胞の割合に有意差はなかった（補足図S2）。これらの所見は、試験したピロリ菌糖鎖変異体に対する細胞介在性免疫応答のアップレギュレーションが、野生型ピロリ菌によって刺激された活性化と同等であったことを示している（図4B、C；補足図S2）。

図4
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図4 未熟樹状細胞は、野生型ピロリ菌および糖鎖変異体でチャレンジすると活性化した。(A）野生型と比較して、糖鎖変異型細菌にチャレンジした際のiDC活性化を評価するための実験ワークフロー。画像はBioRenderを用いて作成した。(B,C）フローサイトメトリーヒストグラムから、iDCのCD80およびCD86発現は、細菌を処理しない（CTRL）iDCと比較して、糖鎖変異体および野生型ピロリ菌のチャレンジにより増加することが明らかになった。データは独立した反復実験の代表値である（n > 3）。

次に、野生型ピロリ菌と糖鎖変異体との24時間接触に応答した樹状細胞によるサイトカイン分泌レベルを測定した（図5A）。野生型ピロリ菌と変異型ピロリ菌に暴露されたiDCは同程度に活性化されたが、野生型ピロリ菌と糖鎖変異型ピロリ菌ではサイトカイン分泌量が著しく異なった（図5）。炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1β、IL-6、および抗炎症性サイトカインであるIL-10のiDCによる分泌は、1回の実験で変異体サンプル間でチャレンジに対するサイトカイン分泌レベルの相対的パターンが類似していることが明らかになった（図5B-E、G、I）。すべての実験において、LPS変異体ΔwaaLとΔwzkは、野生型チャレンジと比較して、樹状細胞からより低いIL-6分泌を誘導し（図5C、G）、ΔwaaLによって分泌されたレベルは、TNF-α（図5B、F）とIL-1β（図5D、H）について野生型誘導分泌と同程度であった。対照的に、糖タンパク質変異体Δ579は、野生型と比較してTNF-αとIL-6の分泌を有意に増加させた（図5B, C）。この傾向は、LPS非存在下で炎症性サイトカインの分泌が減少していることを示唆しており、胃上皮の炎症性サイトカイン調節から得られた知見を反映している。対照的に、抗炎症性サイトカインIL-10の分泌レベルは、野生型チャレンジと比較して、糖鎖変異体で処理しても一貫した方法で変化しなかった（図5E、I）。

図5
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図5 H. pylori糖鎖変異体によるチャレンジで変化した未熟樹状細胞サイトカイン分泌。(A）糖鎖変異体または野生型細菌で24時間チャレンジした後のiDCからのTNF-α、IL-6、IL-1β、およびIL-10分泌を評価するために用いた実験ワークフロー。画像はBioRenderを用いて作成した。2つの異なるiDCチャレンジ実験からのデータセットが示されており、(B-E)は1つの実験で収集され、(F-I)は2つ目の実験で収集された。Δ580.1とΔ580.2、Δ1179.1とΔ1179.2は、同一株の異なる凍結ロットを示す。エラーバーはテクニカルレプリケートを示す。Tukeyの多重比較検定一元配置分散分析を用いた。(*P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001, ns, not significant)。

これらの研究結果を総合すると、樹状細胞はピロリ菌の糖鎖変異体によって活性化され、サイトカイン分泌の程度は糖鎖の発現プロファイルによって異なることが示された。胃細胞の結果と同様に、炎症性サイトカイン応答は、切断型LPS（ΔwaaLおよびΔwzk）を有する細菌との共培養ではやや減少し、完全に精製されたLPSを示すが糖タンパク質は減少した変異体（Δ579）との共培養では亢進する。注目すべきことに、欠損した糖鎖を持つ全ての変異型ピロリ菌は、野生型病原体と同等に未熟な樹状細胞の免疫認識と活性化を誘導する。糖鎖変異体によって誘導されるiDCサイトカイン分泌、特にIL-6とIL-10のレベルの変化は、糖鎖構造が下流の分極化と下流のCD4応答を調節している可能性を示唆している。

AGS細胞を用いたチャレンジ実験で観察されたCXCL-8分泌の変動（図3D-I）と同様に、樹状細胞サイトカイン分泌の相対レベルにおいても、生物学的複製間で高い変動性が観察された（図5）。同じ実験において、異なるロットのΔ1179（Δ1179.1およびΔ1179.2）でiDCをチャレンジすると、これらのロットのIL-6およびIL-10分泌は、互いに相対的に（図5G、I）、また野生型細菌と相対的に（図5）、実験間で大きな差が生じた。さらに微妙なことに、同じ実験において異なるロットのΔ580（Δ580.1およびΔ580.2）でチャレンジすると、それらのロットのiDCからのIL-6分泌は、相対的に有意に異なった（図5C）。さらに、Δ580は、野生型細菌チャレンジに対するサイトカイン分泌の明確な傾向はなく、実験間で変動するサイトカイン分泌を誘発した（図5）。胃細胞モデルおよび樹状細胞モデルの両方における複製物間のばらつきは、糖鎖エピトープの発現における相変化、変異体集団の不均一性、Cag T4SS活性のようなビルレンス因子のばらつき、または技術的な問題に起因する可能性がある。H.ピロリ菌における糖鎖構築の相異性に関する確立された文献を考慮すると、共培養時の変異型糖鎖発現のさらなる評価が正当化されると考えた。

3.3 免疫応答はLPS O-抗原精製の程度と相関する
胃と樹状細胞の共培養（図3D-I, 5）において、糖鎖変異体によって誘導されるサイトカイン分泌が様々であったことから、糖鎖エピトープの相異なる発現が、実験間で一貫性のない免疫応答を引き起こしている可能性について検討した。相変化は多くの原核微生物の特徴であり、世代間でタンパク質の選択的遺伝子発現を行う。要するに、相変化とは「オン」と「オフ」の間の可逆的なスイッチであり、クローン集団の微生物における1つ以上のタンパク質の発現レベルを操作する（van der Woude and Bäumler, 2004）。ピロリ菌とその関連病原体では、相変化がよく知られている。LPS上のルイス血液型抗原の発現は、LPS生合成に関与するフコシルトランスフェラーゼ遺伝子の高頻度のオン／オフスイッチングの結果として、ピロリ菌の単一株内で変動する可能性がある（Wang et al.）我々は、Δ580、Δ1179、ΔwaaLによるチャレンジに応答した宿主細胞の様々な炎症性サイトカイン分泌は、チャレンジ時の糖鎖構造を反映している可能性があると仮定した。

ルイスYは確立された相変化エピトープであり、その発現レベルはピロリ菌のフコシルトランスフェラーゼ活性を制御する鎖スリップイベントに関連している。免疫チャレンジ実験に用いたグリコシル化変異体におけるルイスY四糖の発現に興味を持った我々は、樹状細胞チャレンジ実験に用いた変異体のルイスY抗原の相対発現を測定した（図5）。ウェスタンブロット解析の結果、ルイスYの発現はH. pylori株によって大きく異なることが明らかになった（補足図S3A）。Δ579株とΔ580.2株の2株は強固なルイスY発現を示した（図6A）。逆に、Δ580.1、Δ1179、ΔwaaLおよび野生型細胞は最小限のルイスY発現しか示さなかった（図6A）。これらの結果は、野生型H. pyloriのLPS構造上でルイスY発現が変動することと一致している（Simoons-Smitら、1996；Bergmanら、2006）。

図6
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図6 免疫細胞によるサイトカイン分泌とルイスYの発現およびLPSの精製がどのように相関するかを評価するために、グリコカリックスをプローブした。(A）ウェスタンブロット解析により、Δ579とΔ580.2におけるルイスYの強固な発現が明らかになった。B,C）ゲル電気泳動によるLPSの解析から、ΔwzkとΔwaaLは野生型ピロリ菌と比較して切断された低分子量のLPSのみを合成するのに対し、Δ579は野生型ピロリ菌よりも高分子量（例えば29kDa以上）のバンドがやや目立つLPSを合成することが明らかになった。(Δ580.1とΔ580.2は同一菌株の異なる凍結ロットを示す。(C）補足図S3に示したデータセットについて、樹状細胞チャレンジ実験に使用した菌株サンプルのゲル電気泳動によるLPSの解析。Δ1179.1とΔ1179.2は同じ株の異なる凍結ロットを表し、同等のLPSフィンガープリントを持つようである。

注目すべきことに、Δ580糖タンパク質変異体の2つの凍結ロット、Δ580.1とΔ580.2はルイスYの発現レベルが明らかに異なっていた（図6A）。このような同一糖鎖変異体のロット間の変異は、ピロリ菌の糖鎖が単一株または臨床分離株内で抗原変異を示すという以前の証拠と一致している（Wirth et al.）例えば、野生型H. pyloriは同じ株であっても、ルイスYの発現が相変化する(Wirth et al., 1999)。従って、Δ580.1とΔ580.2におけるルイスY発現の違いは、位相変動によるものと考えられる。さらに、これらのデータは、免疫認識と応答に影響を及ぼす相変化エピトープの可能性と一致している。しかしながら、樹状細胞モデル系で同じサンプルからのルイスY発現と相対的サイトカイン分泌の相関を精査したところ、明確な傾向は観察されなかった。特に、Δ579とΔ1179は、それぞれ異なるルイスY発現を示したが（図6A）、未成熟樹状細胞チャレンジ実験（図5）では、両者とも炎症性サイトカイン分泌を亢進させた。同様に、Δ580.1とΔ580.2（図6A）のルイスY発現は劇的に異なっていたが、IL-1βとIL-10の分泌レベルは、互いや野生型細菌と比較して同程度であった（図5）。これらの結果から、ルイスYの発現は樹状細胞からの炎症性サイトカイン分泌を促進する主要な因子ではないことが示唆される。他のエピトープがより重要である可能性が高い。

LPS構造はピロリ菌のグリコカリックスでも同様に相変化を起こし、O-抗原の精製を担う糖転移酵素の発現がオンまたはオフになる可能性がある（Appelmelk and Vandenbrouck-Grauls, 2003; Lukáčová et al.） LPSがピロリ菌の環境における相互作用のメディエーターであることを理解した我々は、免疫応答と糖鎖構造を関連付ける新たなパラメーターとして、免疫チャレンジ時に変異型および野生型細菌が産生するLPSの精製の程度を調べようとした。共培養時のLPS精製の程度が免疫応答のレベルと相関するという仮説を立てた。図5B-Eおよび5F-Iの樹状細胞実験で使用した細菌サンプルから粗LPSを単離し、ピロリ菌LPSの文献フィンガープリント（Li and Benghezal, 2017）と比較した。簡単に説明すると、細菌溶解物をクマシー染色で分析して同等のタンパク質ローディングを確認し（補足図S3）、プロテイナーゼKで処理して粗LPSを得た。LPSサンプルを電気泳動し、その分子量分布を大腸菌LPS標準品とともに可視化した（図6B、C）。Δ579LPSフィンガープリントは、野生型H. pyloriよりも高い分子量（例えば、29 kDa以上）のバンドを示し、この変異体がより精巧なO-抗原を合成していることを示唆した。この株はまた、より高いCXCL-8レベルを誘導した（図3）。おそらく、より精巧なO-抗原の提示が、より高いCXCL-8レベルに関与しているのであろう。Δ579の高分子量O-抗原に対応するバンドは、野生型H. pyloriが産生する低分子量O-抗原よりも目立たなかったことから、異なる相タイプを持つΔ579の不均一な集団が存在する可能性が示唆された。Δ579が産生する精巧なLPSとは対照的に、ΔwaaLとΔwzkが産生するLPSは、脂質Aコアに相当する14 kDa未満の顕著なバンドに限られていたことから、LPS生合成が切断されていることが確認された（図6B, C）。しかしながら、糖タンパク質変異体Δ580は、高分子量O-抗原の相対的産生量に差があり、LPSの精製にばらつきがあった（図6B, C）。

免疫応答のデータから、LPS精製の程度と誘発されるサイトカイン分泌の程度には明らかな相関があることがわかった。例えば、Δ579は比較的高分子量のLPS構造を示し（図6B, C）、チャレンジした宿主細胞から促進性および抗炎症性のサイトカイン分泌を高めた（図3B, 5B, C, E）。対照的に、ΔwzkとΔwaaLは切り詰められたLPSを示し（図6B、C）、チャレンジした宿主細胞からのIL-6分泌をやや緩和した（図5）。これらのデータを総合すると、LPSの相対的な精緻化が樹状細胞による免疫認識と免疫応答の程度に関与している可能性が示唆されるが、この主張を完全に裏付けるためには、LPS分析のより詳細な方法を開発する必要がある。免疫応答の調節におけるピロリ菌の一般的なタンパク質グリコシル化システムの役割については、あまり明らかではない。

4 考察
ピロリ菌は免疫系との関連において研究すべき魅力的な病原体である。これまでの研究で、ピロリ菌はLPS構造の末端にルイス抗原エピトープを組み込むことが示されており、その糖鎖が宿主環境において自己を装っていることが示唆されている（Wang et al.）類似の病原体による免疫刺激においてLPSが果たす役割が確立されていること、またピロリ菌の糖鎖が宿主細胞への結合や菌の体力に果たす役割が明らかにされていることから、本研究ではピロリ菌の細胞表面糖鎖付加が宿主免疫細胞のシグナル伝達や応答に果たす役割を調べることを目的とした。ここで我々は、糖鎖生合成に関与する遺伝子の挿入的不活性化（Moulton et al. 我々のデータは、ピロリ菌のLPS産生の程度が宿主の免疫応答の程度に関係していることを示唆しており、糖タンパク質の産生はそれほど明確な役割を果たしていない。この研究は、宿主の免疫認識および免疫応答を調節するピロリ菌の糖鎖生合成の役割を評価する新しいアプローチを提供するものである。

図7
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図7 糖タンパク質および／またはLPSの生合成に欠損を持つピロリ菌の糖鎖変異体によるチャレンジで誘発された免疫応答のまとめ。効果は、同じ実験で野生型ピロリ菌にチャレンジした場合に惹起された免疫応答に対する相対値である。データは生物学的複製（n > 3）に基づく。「Truncated "糖タンパク質は野生型に対する糖タンパク質生合成の減少を、"Truncated "LPSは野生型よりも生合成された分子量の低いLPSを、"Higher MW "LPSは野生型よりも生合成された分子量の高いLPSを、"Intact "LPSは野生型と同様の分子量パターンを持つLPSを示す；「増加」は野生型に対する有意な増加を、「減少」は野生型に対する有意な減少を、「同じ」は野生型に対する同等レベルを、「変動」は複製によって効果が異なり、有意な増加と減少が観察されたことを示す。

胃上皮細胞は、精製LPSを合成する糖タンパク質変異体Δ579でチャレンジすると、炎症性サイトカインCXCL-8のレベルを高めた（図3B）。対照的に、LPSと糖タンパク質を切断したΔwzkは、野生型細菌に比べてCXCL-8の発現を減少させた。これらのデータは、細菌のLPS刺激による上皮細胞のサイトカイン産生を原因とする以前の知見を支持するものである（Lotzら、2007）。ピロリ菌感染時に胃細胞からCXCL-8が産生されることはよく知られている（Eftangら、2012）。さらに、CXCL-8は胃がんの増殖に関連しており、慢性炎症を促進し、感染を伝播する（Waugh and Wilson, 2008; Liu et al.）実際、CXCL-8レベルは胃がん患者の臨床転帰不良と正の相関があり、CD8+ T細胞浸潤を減少させ、マクロファージ上の免疫抑制プログラム死リガンド1（PD-L1）発現を増加させる（Linら、2019）。同時に、LPSは消化管におけるカンナビノイド受容体1の有意なアップレギュレーションを刺激し、がん細胞の増殖を促進することが判明している（Sedighzadehら、2020年）。他の研究では、LPSが癌の免疫抑制に関与しており、肺癌においてLPSがT細胞の疲弊に寄与し、PD-L1をアップレギュレートすることが示されており、胃癌におけるこの関連を調べる必要性が確立されている（Liuら、2021；Shiら、2022）。我々のデータは、ピロリ菌のLPSがCXCL-8のアップレギュレーションに関与していることで、これらの報告にニュアンスを加え、病原体、慢性感染、感染に伴うがん発生における糖鎖構造の役割の可能性を示唆している。

我々の研究は、ピロリ菌の細胞表面上の糖鎖構造の変化や切断が、未成熟樹状細胞の活性化やそれに伴うCD80やCD86の発現を妨げないことを示しており（図4）、バイオマーカーのアップレギュレーションを介してiDCの活性化を測定した過去の報告とも一致している（Kranzer et al.）糖鎖の改変と切断により、iDCからのサイトカイン発現プロファイルに違いが生じることがわかった（図5）。これらの結果は、CD4 T細胞の下流の活性化および極性化が、異なる糖鎖変異体間で異なる可能性を示している。このように、糖鎖構造、引き起こされる適応免疫応答のタイプ、および下流の応答が細胞外病原体に対して有用であるか宿主に有害であるかを評価することには価値があるかもしれない。追跡研究により、宿主に有益な方法でCD80/CD86発現の上昇を維持しながら、炎症性サイトカインシグナル伝達と下流の免疫応答を調節する糖鎖標的が明らかになるかもしれない。

我々の研究において交絡となる観察は、同じ糖鎖変異体の複数の凍結ロット、あるいは生物学的複製における同じ変異体（例えば、Δ580、Δ1179、ΔwaaL；図3、5）間でサイトカインシグナル伝達反応が変動することであった。これらの結果から、ルイスYの発現と相対的な免疫応答との間に相関関係があるかどうかを評価するために、ピロリ菌変異体におけるルイスYの発現の相異を調べることになった。これまでの報告では、ピロリ菌の免疫調節、回避、病原性には四糖類の血液型抗原であるルイスYが関与している（Mandrell and Apicella, 1993; Appelmelk et al.）ピロリ菌のコロニー形成が持続し、宿主と病原体の間で恒常性が保たれているのは、ルイス血液型抗原の相異なる発現のためであるとする説もあり、日和見病原性のための常在菌由来であることが示唆されている（Bergman et al.）ルイスYの変異が変異免疫応答データに及ぼす影響を調べるため、iDCチャレンジ実験に用いた細菌溶解液中のルイスY発現を調べた。その結果、ルイスY発現とサイトカイン分泌との間に明確な相関関係は見られなかった（図5、6）。この結果は、樹状細胞上のDC-SIGNに関与して免疫応答を抑制するルイスYの役割が報告されている（Bergman et al.）我々のデータは、ルイスYがH. pyloriによる炎症反応を制御する唯一の主役ではないようであり、他の遺伝子も相変化現象によって制御されていることを示唆している。

LPSの精製と免疫原性の間には、より直接的な関係があるように思われる。これまでの研究で、ピロリ菌のLPSは他の細菌と比較して内毒性が低いことが示されているが、病原体の修飾された脂質AおよびO-抗原は、特定の宿主レセプター分子との結合を選択的に可能にし、細菌の持続性を可能にしていると考えられている（Cullen et al.）今回の結果は、細胞全体におけるピロリ菌LPSの役割について新たな知見を与えるものである。特に、Δ579上に存在する精巧なLPSは、CXCL-8（図3）、TNF-α、IL-6（図5）を含む炎症性サイトカインの増加と相関しているようである。さらに、LPS部位の切断は、チャレンジした宿主細胞からのサイトカイン分泌（IL-6など）をいくらか緩和することに相関する（図3、5）。

精製されたLPSや糖タンパク質を持つピロリ菌が免疫受容体に関与する正確なメカニズムは、今回の研究では明らかにされなかった。ピロリ菌の糖鎖の構造と、それらが免疫の認識と反応に及ぼす影響についての理解を深めることで、病原体が免疫受容体に関与する構造と、それに対応する生合成酵素を突き止めることができるであろう。さらに、単一のH. pylori集団における糖鎖の相対的な不均一性を決定し、相補的な株の表現型を評価し、独立した変異体によって誘発される免疫応答を調べることは重要な将来の方向性である。さらに、野生型細菌と糖鎖修飾変異体における糖鎖修飾タンパク質抗原の総数を調べ、糖鎖修飾事象がタンパク質の抗原性、相対的なタンパク質の安定性、タンパク質の存在量にどのような影響を与えるかを調べることは、ピロリ菌の一般的なタンパク質糖鎖修飾系が宿主の免疫応答に影響を与える分子機構を解明する上で重要なステップとなるであろう。我々の結果は、ピロリ菌の細胞表面上の選択的な糖鎖を標的とすることで、宿主の免疫寛容と活性化を操作し、胃炎や胃癌に特徴的な炎症反応を抑制する一方で、適応免疫系のアップレギュレーションに必要な樹状細胞の活性化を維持できる可能性を示唆している。最後に、我々の結果は、ピロリ菌LPSが免疫応答の刺激に重要な役割を果たしていることを示している。

5 結論
ピロリ菌は、免疫系によるクリアランスを回避する腸内病原体である。ピロリ菌の糖鎖は、ピロリ菌が消化管に定着し増殖する上で重要な役割を果たしている（Radら、2002；Schirmら、2003；Linaら、2014；Moultonら、2020）。本研究では、ピロリ菌に対する宿主の免疫応答の調節における細胞表面糖鎖の役割を調べ、胃炎や胃がんにつながる重篤な感染において、糖鎖構造を選択的に摂動することで炎症性応答を抑制できる可能性を示す。これらの研究は、ピロリ菌の糖鎖構造および抗原提示と関連した免疫応答データに関する知見を提供するものである。大まかに言えば、ピロリ菌の糖鎖特異的ターゲティングは、細胞媒介性適応免疫系のアップレギュレーションを維持しながら、慢性炎症反応を弱める手段になり得ることを示唆している。

データの利用可能性に関する声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより、不当な予約なしに入手可能である。

倫理声明
商業的に入手可能な樹立細胞株のみを使用したため、ヒトを対象とした研究に関しては、現地の法律および施設要件に従った倫理的承認は必要なかった。

著者の貢献
KB：形式的解析、調査、方法論、検証、可視化、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。FK: 概念化、形式分析、調査、方法論、検証、執筆-レビューと編集。WS: 形式分析、調査、方法論、検証、視覚化、執筆 - レビューと編集。AM：調査、方法論、ライティング - レビューと編集。KM: 調査、方法論、プロジェクト管理、監督、執筆-校閲・編集。DD：概念化、資金獲得、プロジェクト管理、監督、執筆-原案、執筆-校閲・編集。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または出版のために財政的支援を受けたことを表明する。米国国立衛生研究所の助成金番号P20GM103423およびR15GM109397、アーノルド＆メイベル・ベックマン財団、ボウディン大学のリトルフィールド賞およびフォール研究賞。本書で報告された研究は、DDに対する米国国立衛生研究所（NIH）の助成金番号R15GM109397、助成金番号P20GM10342のInstitutional Development Award（IDeA）、Arnold and Mabel Beckman FoundationからKBに対するBeckman Scholar Award、Bowdoin CollegeからWSに対するFall Research AwardおよびLittlefield Summer Research Awardの支援を受けた。

謝辞
C.イザベラ、D.カレス、A.マクブライド、およびサポートと指導をいただいた研究室のメンバーとの洞察に満ちた会話に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2024.1377077/full#supplementary-material からオンラインで入手できる。

略語
H. pylori、ヘリコバクター・ピロリ；LPS、リポ多糖；AGS、腺がん由来胃上皮細胞；IL-8またはCXCL-8、インターロイキン8；Cag-T4SS、IV型分泌系； iDC、未熟樹状細胞；WT、野生型；ELISA、酵素結合免疫吸着測定法；PD-L1、プログラム死リガンド1；HBA、馬血液寒天；Ac4GlcNAz、過アセチル化N-アジドアセチルグルコサミン； Phos-FLAG、ホスフィン-FLAG結合体；MOI、感染多重度；ATCC、American Type Culture Collection；PBS、リン酸緩衝生理食塩水；H20、水；FITC、フルオレセインイソチオシアネート；PE、フィコエリトリン；HRP、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；SDS、ドデシル硫酸ナトリウム；PAGE、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；TBS、トリス緩衝生理食塩水。

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キーワード: 糖鎖, 免疫学, 糖鎖変異体, 相変異, ヘリコバクター・ピロリ, 代謝標識

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受理：2024年1月26日 2024年1月26日；受理された：受理：2024年1月26日; 受理：2024年3月11日；
発行：2024年3月20日

編集：クリストファー・W・リード

クリストファー・W・リード（ブライアント大学、米国
査読者

アンナ・カトリーナ・ウォルダック（チャールズ・スタート大学、オーストラリア
ティモシー・カバー、ヴァンダービルト大学、米国
キャサリン・グライムズ（デラウェア大学、米国
Copyright © 2024 Barrett, Kassama, Surks, Mulholland, Moulton and Dube. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責：ダニエル・H・デュベ Danielle H. Dube, ddube@bowdoin.edu

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