ヒト腸内細菌叢におけるアシルホモセリンラクトンを介した細菌クオラムセンシングに対するIBDに伴うディスバイオーシスの影響

2022年12月9日 11:11

ヒト腸内細菌叢におけるアシルホモセリンラクトンを介した細菌クオラムセンシングに対するIBDに伴うディスバイオーシスの影響
Nathan Grellier 1ORCID、Marcelino T. Suzuki 2ORCID、Loic Brot 1、Alice M. S. Rodrigues 3、Lydie Humbert 1、Karine Escoubeyrou 3ORCID、Dominique Rainteau 1、Jean-Pierre Grill 1、Raphaël Lami 2ORCID and Philippe Seksik 1, *ORCIDによる
1
サンアントワン研究センター、パリ公共衛生研究所、サンアントワン病院、消化器科、ソルボンヌ大学、F-75012 Paris、France
2
微生物多様性・生物工学研究所、CNRS、ソルボンヌ大学、UAR3579、F-66650 Banyuls-sur-Mer、France
3
バニュルス・シュル・メール海洋観測所、CNRS、ソルボンヌ大学、FR3724、F-66650 Banyuls-sur-Mer, France

著者名
Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(23), 15404; https://doi.org/10.3390/ijms232315404
受理：2022年10月28日 2022年10月28日 / 改訂：2022年11月25日 / 受理：2022年11月29日 / 発行：2022年12月6日
(本論文は、「炎症性腸疾患の病態と治療」特集号に属しています）。
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要旨
腸内細菌の異常は、炎症性腸疾患（IBD）の病因の重要な特徴である。アシルホモセリンラクトン（AHL）は細菌の定足数感知代謝物であり、IBDで観察される宿主細胞-腸内細菌叢相互作用の変化に関与している可能性がある。本研究の目的は、IBD発症中のヒト腸内生態系におけるAHL合成酵素および受容体遺伝子の存在と発現を調査することである。クローン病（CD）患者（n = 50）、潰瘍性大腸炎（UC）患者（n = 27）および非IBD患者（n = 26）の便から得た細菌メタゲノムおよびメタトランススクリプトームデータからなる炎症性腸疾患マルチオミックスデータベースにin silicoアプローチを適用しました。既知の推定AHL合成酵素遺伝子は同定されなかったが、いくつかの推定LuxR受容体が観察された。これらの受容体遺伝子の発現に関して、Bacteroides dorei由来のluxR遺伝子は、非IBD患者、特にCD患者（p = 0.02）と比較して、IBD患者で発現が低下していた（p = 0.02）。ディスバイオーシス状態では、Bacteroides fragilis由来の1つのLuxR受容体遺伝子が、ディスバイオーシスでない患者のそれと比較して過剰発現しているように見えた（p = 0.04）。クオラムセンシングのLuxR受容体を標的とすることは、IBDの腸内細菌叢を調節するための新しいアプローチとなるかもしれない。
キーワード：炎症性腸疾患、クオラムセンシング、アシルホモセリンラクトン、腸内細菌叢、メタゲノム、インシリコ

はじめに
腸内細菌叢は、消化管に存在するすべての微生物と定義される。腸内細菌叢は、消化管内全域で1013個近くの細菌から構成されると推定される。これらの細菌は、3つの主要な系統に分類される。ファーミキューテス、バクテロイデテス、プロテオバクテリアの3つの門に分布しています [1]。腸内細菌叢は、炭水化物および脂質代謝、病原体のコロニー形成に対するバリア機能、宿主免疫系の成熟における役割など、ヒトにおいていくつかの生理的機能を有している[2,3,4]。これらの機能の一つまたは複数に障害が生じると、炎症性腸疾患（IBD）などの腸疾患を発症するリスクが生じます。IBDの発症にはいくつかの要因がありますが [5]、現在では、腸内細菌叢の組成と機能の不均衡と定義されるディスバイオーシスが、炎症の発症と持続を促すと認識されています [6,7,8]。IBDでは、ファーミキューテス門の減少と、大腸菌（E. coli）などのバクテロイデーテス門やプロテオバクテリアの増加が観察されます[7]。これらの変化は、トリプトファンとその誘導体、短鎖脂肪酸（SCFA）、胆汁酸、活性酸素種などの細菌代謝物の変化をもたらす[9,10,11,12]。これらの代謝産物以外にも、私たちのチームは、生命の3つの領域で生理反応を調節することが知られているクオラムセンシング（QS）と呼ばれる、腸内細菌が用いるコミュニケーションシグナル機構を調査しています。
この細菌間の広範なコミュニケーション機構は、さまざまな種類のシグナルによって媒介されます。これは密度依存的なメカニズムであり、細菌集団が遺伝子発現や生理機能を調整することを可能にしています[13]。グラム陰性菌では，複数の自己誘導シグナルが存在する：自己誘導シグナルタイプ1（AI-1），タイプ2（AI-2）およびタイプ3（AI-3）．その中でも、アシルホモセリンラクトン（AHL）駆動型QS（AI-1）は、最も研究が進んでいるものの一つである。AHLは、ラクトン骨格と長さや飽和度が変化する炭素鎖からなる分子で、細菌の合成酵素タンパク質によって生産されます。最も一般的な合成酵素はLuxIファミリーであり、Aliivibrio fischeriで初めて報告された[14]。これらの両親媒性分子は、受動的に環境中に拡散し、近傍の細菌細胞のLuxRファミリーの細胞質受容体に到達することができる。AHLと受容体の結合は、病原性因子の発現、細菌の成長、バイオフィルムの形成を促進する転写因子として作用する[13]。この機構は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） [15] だけでなく、コレラ菌（Vibrio cholerae）やチフス菌（Salmonella typhimurium）などの消化器系の病原菌も利用しています [16]．消化管の常在菌については、Human Microbiome Project 1データベースを用いて、健康な被験者でLuxI/LuxRのカップルを持つ細菌が3株のみ同定されている[17]。それにもかかわらず、腸内細菌科の細菌は、SdiAと呼ばれるLuxR様受容体を単独で持つことが知られています。これらの細菌はAHLを合成することはできませんが、環境中のAHLを感知してQSを介した機能を発現することができます（盗聴と表現される現象です）[18,19]。
私たちのチームは、ヒトの消化管にAHLが存在することを実証しましたが、健常者とIBD患者との間でAHLの存在に差があることも明らかにしました[20]。健常者はIBD患者と比較して、便中のAHLの濃度と多様性が高いことが分かりました。新しいAHLである3-オキソ-C12:2ホモセリンラクトン（3-oxo-C12:2）は、IBD患者と比べて健常者で、特に病気のフレアステージで過剰に存在することが分かりました。その後、この分子はマクロファージモデルにおいて炎症性条件下でのin vitro抗炎症作用を示しただけでなく、腸管上皮モデルにおけるバリア機能維持の活性も示しました[21,22,23]。これらの以前の結果は、ヒトの腸内生態系におけるAHLを介したQSシグナルにIBDに関連するディスバイオーシスが与える影響についての疑問を提起している。
この疑問に答えるため、我々は、オープンアクセスのInflammatory Bowel Disease Multi'omic Database (IBDMDB) を用いたin silicoアプローチにより、非IBDコントロールとIBD患者におけるQS関連遺伝子の存在と発現を調査しました。また、このアプローチを補完するために、当センターの非IBD対照者およびIBD患者の便サンプル中のAHLを高速液体クロマトグラフィー質量分析計（HPLC-MS/MS）を用いて検索しました。
結果
2.1. コントロールとIBD患者の腸内細菌叢におけるAHLの存在
IBD患者および非IBD対照者の腸内生態系におけるAHLの存在を説明し確認するために、HPLC-MS/MS検出器を用いてAHLスペクトルのシグネチャーを同定した。消化器系疾患の既往のない健常者（非IBDコントロール）10名と再発性クローン病（CD）患者2名から糞便サンプルを採取しました。患者の詳細な特性は、補足表S1に記載されている。
Cataldiら[24]が記述しているように、AHLの同定は、同じ保持時間における前駆体イオンと2つの可能な生成物イオンの存在によって定義されました。HPLC-MS/MSは、推定AHL分子に対応するm/zを検出した。1サンプルあたり1グラムの凍結乾燥糞便を使用し、13種類のAHLが検出されました。AHL濃度の定量には、内部標準を使用しました。サンプル間のAHLの分布をヒートマップで表しました（図1）。
Ijms 23 15404 g001 550Figure 1. 非 IBD コントロールと IBD 患者における推定 AHL プロファイルのヒートマップ。グレーのカラーバーの強度は、ゼロ（白）から最高濃度（黒）までのAHL m/z積算ピーク面積を示す。IBD: 炎症性腸疾患患者。数字とアルファベットはサンプル名を表す。
合計で、非IBD対照群では13種類のAHLが、IBD群では7種類のAHLが観察されました。例えば、被験者1の糞便には13種類のAHLがすべて含まれていましたが、IBD患者Bの糞便には4種類しか含まれていませんでした。非IBDとIBDの状態によると、AHLの多様性はLandmanらによる以前の研究[20]と同様でした。非IBDのコントロールはAHLの濃度が高く、特に抗炎症作用を示す3-oxo-C12:2が高かった[21,22]。要約すると、この最初の研究で、我々はヒトの腸内細菌叢におけるAHLの存在を確認したのである。
2.2. ヒト腸内細菌叢におけるQS関連遺伝子の存在
2.2.1. インシリコ研究対象者の特徴
腸内細菌叢におけるQS関連遺伝子を探索するために、Inflammatory Bowel Disease Multi'omics Database [25]のデータを使用した。この対象者は132名で、決められたプロトコールに従って2週間ごとに52週間にわたって糞便のサンプリングが行われた。全コホートの132人のうち、103人は、同じ時点でマイクロバイオータのメタゲノム配列とメタトランススクリプトーム配列の決定を受けたので、本研究に含まれている（ただし、フォローアップ中に被験者によって異なる可能性がある）。我々は、各被験者について1つの糞便サンプルを分析した。26人の非IBD対照者と77人のIBD被験者（50人のCDと27人のUC）がいました。人口統計学的および臨床的データは表1に示す通りである。詳細なメタデータは、補足表S2に掲載されている。
表1. 患者の特徴 IBD。炎症性腸疾患；CD: クローン病；UC: 潰瘍性大腸炎、F：女性、M：男性、SEM：平均値の標準誤差。* 小児：18歳未満の患者、新規診断：コホート組み入れ時のIBDの診断、抗生物質：サンプリング2週間前の抗生物質への曝露、ステロイド：サンプリング2週間前のステロイドへの曝露、HBI：ハーベイ-ブラッドショー指数スコア、SCCAI：単純臨床大腸炎活動指数、など。
表
ほとんどの症例が臨床的に寛解していた。CD群では，Harvey-Bradshaw Index（HBI）によると，34例（68％）が非活動性（HBI＜4），11例（22％）が軽度活動性（HBI≦4-8≦），1例（2％）のみが中等度活動性（HBI＜8-12≦），重度の活動性（HBI＞12）は皆無であった．CD患者4人はサンプリング時のHBIが不明であった[26]。UC群では、簡易臨床大腸炎活動性指標（SCCI）によると、19名（73％）が非活動性（SCCAI 0-2≦）、7名（27％）が軽度活動性（≦3-5≦）、中等症・重症はなく、1名はサンプリング時にSCCAI不明であった[27]。生物学的活性（C-reactive protein）および内視鏡的活性はサンプリング時点では不明であった。
2.2.2. 疾患表現型に応じた微生物叢の構成
3群（非IBD対照、CD、UC患者）間の微生物叢組成と多様性分布は、オープンアクセス分類学プロファイルを使用して評価した[25]。各群の多様性と微生物叢組成を図2に示す。
Ijms 23 15404 g002 550Figure 2. 疾患表現型に応じた微生物叢の構成。(A）細菌微生物相のα多様性を記述する観察種数とShannon指数（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。(B) 疾患の表現型に応じて各サンプルを色分けしたBray-Curtis距離の主座標分析。PCoA1およびPCoA2は、距離の大部分を捉えた上位2つの主座標を表している。その座標が捉えた距離の割合は、パーセンテージで示されている。グループはペルマノバ法を用いて比較した。(C,D) 細菌微生物相の系統および種レベルのグローバルな組成。非炎症性腸疾患対照群（非IBD）および患者サブグループをX軸に示し、各グループのメタゲノムにおける相対的存在量として表した。すべてのパネルで、ns：有意ではない、 p < 0.05、CD: CD: クローン病、UC: 潰瘍性大腸炎。
アルファ多様性については、CD患者は非IBD患者（p = 0.025）およびUC患者（p = 0.020）と比較して、観察された種の数で低い豊かさを持っていた。シャノンインデックスは3群間で有意な差はなかった（p = 0.21）。疾患表現型に応じたβ多様性については、ペルマノバ解析により3群間に有意差は認められなかった（p = 0.49）。門レベルでは、Verrucomicrobia門がIBD患者で過剰発現していたが（p = 0.006）、Firmicutes（p = 0.97）、Bacteroidetes（p = 0.79）、Proteobacteria（p = 0.24）では有意差はなかった。種レベルでは、Akkermansia muciniphilaはCD患者でより高い相対量を示し（p = 0.004）、Alistipes putredinisは非IBD対照群で過剰発現していた（p = 0.04）。その他の種については、有意な差は見られなかった。詳細な解析結果は、補足表S3に掲載されている。結論として、非IBDコントロールとIBD患者は、微生物叢の構成と多様性の点で顕著な差はなかった。
2.2.3. QS関連遺伝子
本研究では、AHL合成酵素とAHL受容体からなるQS関連遺伝子の探索を行った[28]。推定遺伝子のカタログを作成した。合成酵素遺伝子はDobervaら[29]のluxI-homologuesを使用し、603個の合成酵素遺伝子を示した。10個のluxR相同受容体遺伝子が用いられた[17,30,31,32,33,34]。全ての遺伝子の配列とアクセッション番号を補遺ファイルS1〜S4に記載した。補足表S4には、遺伝子とその機能をまとめた。
2.2.4. 相同なQS関連遺伝子の存在
QS関連遺伝子の存在を示す可能性を高めるため、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [35] を、期待値 (e-value) < 10-20 で、ID制限なしにtblastnモードで使用した。その結果、サンプルのアセンブルされた遺伝子ファイルには合成酵素遺伝子は見つからなかった。受容体遺伝子に関しては、sdiA相同遺伝子が患者7名、CD患者5名、非IBD対照者2名で見つかった。大腸菌由来のsdiAとの平均同一性割合は90.7%±4.7SEMであった。その他、Bacteroides fragilis (B. fragilis) またはBacteroides dorei (B. dorei) 由来のホモログに近いluxR様遺伝子をすべてのサンプルで見いだした。詳細なヒット数は、補足表S5に掲載した。
2.2.5. 疾患表現型に応じたAHL受容体遺伝子の存在
LuxR受容体ホモログの存在以外にも、メタゲノムからの生リードに対するblastnを用いて各遺伝子の相対量を、メタトランススクリプトームからの生リードに対してその発現量を定量した(図3)。
Ijms 23 15404 g003 550図3. 疾患表現型に応じたレセプター遺伝子luxR1 バクテロイデス・ドレイ（B. dorei）。(A）サンプル中の総リード数に対するblastn検索で回収した遺伝子リードの比率で表したluxR1 B. doreiの相対的存在量（Mann-Whitney U検定）。(B) メタゲノム中の遺伝子リード数に対するトランスクリプトーム中のblastn検索で回収した遺伝子リード数の比率で表したluxR1 B. doreiの発現量（Mann-Whitney U test）。すべてのパネルにおいて、ns：有意でない、 p < 0.05、CD: クローン病、UC：潰瘍性大腸炎、non-IBD：コントロール、MGX：メタゲノム、TR：トランスクリプトーム。
デフォルトのBLASTパラメータ（全同一率、全期待値）で生リードに対してblastnを使用しても合成酵素遺伝子のアライメントは見つからず、我々の参照遺伝子は我々のサンプルに存在しなかったことを意味する。受容体遺伝子については、すべてのサンプルでluxR遺伝子のリードを発見した。しかし、メタゲノム中の相対的な存在量については、非IBD対照、CD、UC患者の間で有意な差はなかった。B. doreiの受容体遺伝子luxR1は、IBD患者では非IBD患者と比較して発現量が少なかった（p = 0.023）。CD患者においては、非IBD患者と比べて発現が低下していたが（p = 0.023）、UC患者においては非IBD患者と比べて発現が低下していなかった（p = 0.11）。詳細なヒット数を補足表S6に、各群の解析結果を補足表S7に示す。
2.2.6. IBDに関連するディスバイオーシスの状態によるQS関連遺伝子の変化
すでに観察されているように[25]、ディスバイオーシスはIBDと体系的な相関がない。我々の結果をディスバイオーシスの状態に関連して評価するために、IBDに関連するディスバイオーシスの状態に焦点を当てて分析を行った。それを定義するために、非IBDコントロールとIBD患者間の識別細菌種を同定するために、希薄化データを用いた線形判別分析効果量（LEfSe）法を使用しました[36]。4つの細菌種が同定され、ディスバイオーシス状態の定義に使用されました（図4およびセクション4参照）。2つのサンプルは、Akkermansia muciniphilaの相対的な存在量が異常に高い（外れ値）ため、解析から除外されました。異種生物群には47サンプル（非IBD4、CD24、UC17）、非異種生物群には54サンプルが含まれた。この2つのグループのαおよびβ多様性を図4に示す。
Ijms 23 15404 g004 550Figure 4. 非IBDコントロールとIBD患者間の細菌種の判別とディスバイオーシスによる多様性。(A) IBD患者と非IBDコントロールの間の4つの主要な識別種のLEfSe。(B）ディスバイオーシスによるα多様性指数（Mann-Whitney U test）。(C) 疾患表現型に応じて各サンプルを色分けしたBray-Curtis距離の主座標分析。PCoA1およびPCoA2は、距離の大部分を捉えた上位2つの主座標を表す。その座標が捉えた距離の割合は、パーセンテージで示されている。グループはペルマノバ分析で比較された。すべてのパネルにおいて、* p < 0.05, ** p < 0.005. ND：非不生物、D：不生物。
ここで、dysbiotic群では、種数が少なく、Shannon indexが低いことが観察された（それぞれp = 0.003, p = 0.014）。ベータ多様性は、一元的なPermanova分析を用いて、2つのグループ間で有意に異なっていた（p = 0.034）。上記と同じblastnベースの方法を用いて、luxR様遺伝子の相対的な存在量と発現量を定量した。異なるグループとサブグループを使用した。ND（non-dysbiotic）（n＝54）；D（dysbiotic）（n＝47）；ND-non-IBD（dysbiotic non-IBD）（n＝20）；ND-IBD（ndysbiotic IBD）（n＝34）；D-IBD（ysbiotic IBD）（n＝41）．
試験したすべての遺伝子の相対的な存在量に有意な差は見られなかった。発現に関しては、B. fragilis [34]のluxR4のみが、非生理的活動に比べて生物的活動不全群で過剰発現しているように見えた（p = 0.038）（図5）。この結果はサブグループ解析でも確認されました：ディスバイオティクスIBD患者（D-IBD）はすべての非ディスバイオティクス被験者（ND）と比較して（p = 0.043）、ディスバイオティクスIBD患者（D-IBD）は非ディスバイオティクスIBD（ND-IBD）被験者と比較して（p = 0.035）、です。B. dorei の luxR1 の発現に関しては、有意な差は認められなかった。各遺伝子および各群の詳細な解析結果は、補足表S8に掲載されている。
Ijms 23 15404 g005 550図5. luxR4 バクテロイデス・フラジリス（B. fragilis）のディスバイオシス状態による相対的存在量と発現量。(A) サンプル中の総リード数に対する遺伝子リード数の比率で表したluxR4 B. fragilisの相対的存在量（Mann-Whitney U test）。(B) メタゲノム中の遺伝子リード数に対するトランスクリプトーム中の遺伝子リード数の比率で表したluxR4 B. fragilisの発現量（Mann-Whitney U test）。全てのパネルにおいて、ns: non-significant; * p < 0.05, ND: non-dysbiotic, D: dysbiotic, D-IBD: dysbiotic IBD, ND-IBD: non-dysbiotic IBD, MGX: metagenome, TR: transcriptome.
考察
ヒトの腸内生態系のバランスにおけるAHLを介したQSの関与に関する情報はほとんどない[37]。私たちのチームは、以前、炎症経路における注目すべき代謝物としてのAHLの役割を強調しました。今回発表した結果は、ヒトの腸管内腔におけるAHLの存在を確認したことに加え、Bacteroides属のLuxRの発現がIBDに関連するディスバイオーシスと関連する可能性を示したものです。これらの結果は、インシリコアプローチから得られたものであり、IBDにおける微生物叢調節の新たなターゲットとしての可能性を示しています（図6）。
Ijms 23 15404 g006 550Figure 6. IBDに関連するディスバイオーシスがLuxR受容体に与える影響。https://BioRender.com で作成（2022 年 10 月 26 日アクセス）。
タンパク質配列による柔軟な検索条件を用いても、塩基配列による厳密な検索条件を用いても、合成酵素遺伝子を同定することはできなかった[17,29,35]。これらの結果は、ヒトの腸内細菌叢におけるAHL合成酵素遺伝子の存在という根本的な問題を提起している。メタボロミクスの結果から、合成酵素遺伝子はヒトの腸内に見つかっているはずである。第一の仮説は、アライメントに用いた合成酵素遺伝子は、ヒトの腸内に存在する可能性のあるものとは全く異なる可能性があるということです。同じ方法を用いた先行研究[17]を参照すると、同定されたLuxI/LuxRペア遺伝子を持つ細菌（Hafnia alvei ATCC 51873, Edwardsiella tarda ATCC 23685, Ralstonia sp.5_7_47FAA ）は腸内生態系の一般細菌ではありません。本研究では、クエリとして用いた合成酵素遺伝子は、海洋生態系（Vibrio属またはAeromonas属）およびPseudomonas aeruginosaやCitrobacter rodentiumなどの病原細菌に多く含まれており（補足ファイルS1およびS2）、腸内細菌叢における遺伝子を見逃した可能性がある。また、より可能性の高い説明としては、より稀なAHL産生菌を含めるには配列決定の深さが不十分であったということが考えられる。もしそうであれば、それらの遺伝子はメタゲノムにほとんど現れず、ヒトの腸内生理におけるAHLの顕著な役割の可能性が疑われることになる。合成酵素遺伝子が存在しないことに加え、受容体遺伝子の存在は、ヒトの腸内におけるAHLの存在の代理人と見なすことができるかもしれない。実際、もしLuxR受容体が腸の生態系に存在し、AHLをその主な活性化シグナルと考えれば、LuxR受容体がAHLの存在を間接的に証明している可能性があることを示す。したがって、AHL合成酵素遺伝子を発見するためには、他の方法を用いることが極めて重要であると思われる。例えば、ウェットラボ実験を行い、AHLを大量に含む細菌群に挑戦すれば、他のQSシグナルで示されているように、合成酵素遺伝子の過剰発現（自己誘導シグナル）を誘導し、腸内細菌叢を再構築することができるかもしれない[38]。
我々の研究にはいくつかの限界がある。第一に、選択された患者のほとんどが臨床的寛解状態にあったことである。この問題はIBDMDBの研究者によって報告されているが、このコホートはもともと疾患活動性によって層別化するようにデザインされていない[25]。第二に、非IBDとして選択された対照群は、消化器症状で受診した患者であり、その場合、消化器内視鏡検査と病理所見はIBDを支持しないものであった。言い換えれば、厳密には健常者ではなかった。このことが、非IBD患者とIBD患者の間の微生物相の多様性のわずかな差を説明する可能性がある。最後に、103人の患者を選び、同じサンプルでメタゲノムおよびメタトランススクリプトームシーケンスを行い、包含条件とした。この条件により、当初ではなくコホートの異なるタイムラインでサンプルを選択せざるを得ず、IBD患者における低活性（治療曝露）および微生物叢組成の小さな差異に結果がゆがむことになりました。これらの3つの要因、すなわち、軽度の活動性疾患、非厳格な健常者、および我々の対象基準は、疾患表現型だけでなく、dysbiosisを考慮して我々の結果を分析する動機となった。我々は、コントロールグループとIBD患者との間の細菌種発現の差に基づきディスバイオーシスを定義し[36]、2つのグループを区別することを可能にした。ディスバイオーシス群は、非ディスバイオーシス群に比べ、細菌種の豊富さ、多様性が低かった。これは、IBDに関連するディスバイオーシスに関する文献と一致し、我々の選択を確認するものであった[39]。この定義から、B. fragilis由来のluxR遺伝子の興味深い発現差異を得ることができた。
受容体遺伝子については、Bacteroides属のluxR受容体遺伝子は、C6-HSLを作用させると、バイオフィルム形成、菌体増殖、抗生物質耐性獲得に関与することが明らかにされている[34]。本研究では、これらの受容体遺伝子のうち1つが、ディスバイオシス群と非ディスバイオシス群で発現量に差があった。LuxRファミリータンパク質の構造を詳しく見ると、アミノ末端の自動誘導結合ドメインとカルボキシ末端のDNA結合ドメインという2つの機能ドメインが存在することがわかった[28]。LuxR1 B. doreiとLuxR4 B. fragilisは、それぞれ転写調節因子GerEとDNA結合応答調節因子と推定される（セクション4参照）。両タンパク質配列には、自動誘導結合領域は存在しない。実際、我々の研究で使用した遺伝子は、細菌のDNAと結合し、転写因子として働くタンパク質領域に対応している。Pumbweらは、AHL添加培地で調整したB. fragilisにおいて、それらの過剰発現を示したことに注目されたい[34]。このことから、AHLの存在下では、自動誘導ドメインを持たないLuxRタンパク質は、別のメカニズムで活性化または抑制される可能性があると推測される。他の細菌種、例えばVibrio harveyiでは、LuxRタンパク質は、LuxRタンパク質を抑制する定足数制御小RNA（Qrr）を介して、他のQSシステムに関与することができる[28]。これらのQrrは、タイプ2自己誘導シグナル（AI-2）のような他の自己誘導シグナルに依存している。我々は、DNA 結合のみを含む LuxR タンパク質も、非正規の AHL シグナル経路を通じて活性化され得ると仮定することができる。これらのLuxR、AHL、その他のQSシグナルの相互作用を探るために、in vitroでの機構的研究が可能であろう。Bacteroides属に関しては、腸内毒素原性B. fragilisがIBDと関連することが報告されているが、B. doreiがIBDの病態生理に関与しているという証拠はない[40,41]。腸管毒素原性株は通常IBDの腸内細菌叢と関連しているが、我々のアプローチでは腸管毒素原性株と非毒性B. fragilis株を区別することはできなかった。我々は、細菌群の動態がLuxR転写因子によって影響される可能性を信じているが、ディスバイオシスにおけるLuxRの役割に関する研究が不足しているため、この考えを検討することにした。図6は、IBDに関連するディスバイオーシスがLuxR受容体に与える影響をまとめたものである。
結論として、今回の研究成果は、IBD腸内細菌叢におけるAHL駆動型QSに関する新たな知見を提供し、B. doreiとB. fragilisにおけるLuxR受容体の発現がディスバイオシスによって調節されることを示している。しかしながら、LuxRファミリータンパク質の反応機構を解明し、IBDに関連するディスバイオシスとの関わりを理解することが必要である。
材料と方法
4.1. HPLC-MS/MS 試料の前処理および AHL 抽出
IBD 患者のサンプルは、フランス、パリの Saint-Antoine 病院の消化器科に由来する。それらは2022年9月に収集された。すべての患者は、Suivitheque研究の一環として、便の提供について書面による同意を与えた（Institutional Review Board 00003835）。便は-80 ℃で冷凍保存された。各サンプルは、便全体のサンプルを48時間以上凍結乾燥させ、ホモジナイズした。各サンプルの抽出には、1グラムの凍結乾燥便を使用した[20]。詳細なAHL抽出プロトコルは、補足ファイルS5で入手可能である。2.5mMの濃度の2マイクロリットルの内部標準N-ヘキサノイル-L-ホモセリンラクトン-d3 (C6d3-HSL, Cayman Chemical) をチューブ当たりインターン標準として使用した。質量分析には、抽出した試料を1mlのアセトニトリルに取り込んだ後、2μLで注入した。
4.2. HPLC-MS/MSによるAHL検出
サンプルは、QTRAP 5500 四重極リニアイオントラップ MS/MS 分光器システム (SCIEX, Vaughan, ON, Canada) と組み合わせた LC-20ADXR クロマトグラフィーシステム (Shimadzu, Kyoto, Japan) で分析された。MS検出は、装置のMRM（Multiple Reaction Monitoring）機能を用いて、ポジティブモードでエレクトロスプレーイオン化（ESI）により行われました。スペクトルデータの取得は、Analyst ソフトウェア (v1.6.3) を使用して、多重反応モニタリングモードで処理されました。Cataldiらによって記述されたように、AHL（前駆体イオンのm/zによって指定される[M+H]+）の識別は、前駆体イオンと2つの可能な生成イオン（[M+H -101]+, 中性損失および102またはラクトン部分）の同時存在によって定義しました[24]。AHL は相対濃度で表され、内部標準物質 (C6-d3-HSL) に対して正規化されました。定量は、Multiquant ソフトウェア (v3.0.2) (SCIEX, ON, Canada) を用いて行った。
4.3. 炎症性腸疾患マルチオミックスデータベースとサンプル
使用した遺伝子ファイル、生データ、分類学的プロファイルは、https://ibdmdb.org/tunnel/public/summary.html（2022年9月28日アクセス）[25]で自由に利用できる。分類学的プロファイルの相対的存在量は、異なる分類学的ランクを解析するために、bash、awk、sedを使用して解析された。相対的存在量の値に各サンプルの総リード数を乗じることで、各生物種の絶対数を概算した。Qiime2を用いて、各サンプルに含まれる細菌種を1サンプルあたり50,000配列に希釈し、α-diversity indicesとβ-diversity valuesを算出した[42]。希薄化した細菌種データは表S9に掲載。
4.4. ディスバイオーシスの定義
ディスバイオーシスの定義は，希少化したデータ上の細菌種を用いたLEfSe法を用いて決定した[36]．LDAスコアが2以上の菌種を識別性があるとみなした（p < 0.05）。103名のうち、小児CD患者2名はAkkermansia muciniphilaの相対存在度が高かった：HSMA33NQで75.9％、HSM5MD5Pで8.5％であった。小児CD患者では、この種の存在量が減少していることが報告されている。dysbiosisの定義を歪めないために、これらの2人の患者はLEfSe解析から除外された[43]。すべてのdysbiosis解析は、101人の患者に対して行われた。4つの細菌が同定されると、受信者動作特性曲線（ROC曲線）を用いて特異性の閾値が決定され、各状態に対して最も特異的な種が使用された。サンプルは、4つの識別細菌種のうち少なくとも3つを有していなければ、dysbioticと分類されなかった。ROC曲線はSupplement Figure S1に掲載されている。DysbioticサンプルリストはSupplementary File S6に掲載されている。
4.5. QS関連遺伝子
B. fragilis の異なる luxR 遺伝子（luxR1, luxR2, luxR3, luxR4）を区別するための番号は任意に決定した。luxR1 B. dorei は luxR1 B. fragilis と相同な遺伝子で、一致率は94%である。表2にluxR番号とそれに対応するアクセッション番号を示す。
表2. Bacteroides fragilisとBacteroides doreiの遺伝子リスト。
表
4.6. 配列のアライメント
タンパク質配列を用いてアセンブルした遺伝子ファイルに対して、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [35] を tblastn モードで使用し、目的遺伝子の有無を評価した。塩基配列を用いた遺伝子リードの定量にはblastnモードを使用した。tblastnのパラメータは、e-valueが<1020で、ID%は全て同一であった。メタゲノムrawファイル、メタトランススクリプトームrawファイルに対するクエリーは、blastnで我々の参照するQS関連遺伝子の塩基配列を用いて行われました。blastnのパラメータはe-value < 1030で、ID%は可変であった。luxR1 B. fragilisについては、B. fragilisに特異的であるように、ID%は80%以上であった。luxR2〜luxR4 B. fragilisについては、B. fragilisがNCBI GenBankにこれらの遺伝子を有する唯一の細菌種であるため、すべてのID％値を使用した。luxR1 B. doreiについては、B. doreiに特異的であるため、97%より高い閾値を使用した。遺伝子の相対的な存在量は、遺伝子のリード数をサンプルの総リード数で正規化した値で表した。QS関連遺伝子の発現は、遺伝子の相対的な存在量に対して、メタトランススクリプトーム中の遺伝子リード数をサンプル中の総リード数で正規化した値で表現した。メタゲノム中の遺伝子リードがないサンプルは、遺伝子発現の解析に使用しなかった。
4.7. 統計解析
すべての解析およびグラフ作成にGraphPad Prism V.8.0.1 (San Diego, CA, USA)を使用した。すべてのグラフデータについて、結果は平均値±SEMで表し、統計解析は両側ノンパラメトリックのMann Whitney U検定またはDunnの多重比較検定によるKruskal-Wallis検定を用いて実施した。Qiime2 を用いて、各サンプルに含まれる細菌種を 50,000 塩基配列に希釈し、α-多様性指数とβ-多様性を算出した[42]。群集の種の多様性を特徴付けるために用いられる希薄化データ（深さ＝5万リード／サンプル）を用いて、観察された種の数とシャノン多様性指数を算出した。ベータ多様性解析のためのサンプルグループ分けの統計的有意性は、Bray-Curtis非類似度を用いたPermanova法（9999順列）を用いて実施した。β多様性解析にはPaleontological Statistic Package (PAST) V4.03 softwareを使用した[44]。p値＜0.05の差は有意とみなした。差分解析は線形判別分析効果量（LEfSe）パイプラインを用いて行った[36]。
補足資料
以下の補足資料は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms232315404/s1 でダウンロードできる。
著者による貢献
概念化、N.G.、P.S.、M.T.S.、方法論、N.G.、P.S.、D.R.、M.T.S、ソフトウェア、M.T.S、バリデーション、 L.B.,K.E.,J.-P.G.,N.G., L.H.,R.L.,D.R.,A.MM.S.R.., P.S.およびM.T.S.；正式解析、N.G.およびM.T.S.；リソース、R.L.およびD.R.；データキュレーション、N.G.およびM.T.S.；執筆-オリジナル原稿作成、N.G.およびP.S.；執筆-レビューと編集、D.R., 執筆-原案作成：N.G., P.S., D.R., M.T.S., R.L., 可視化：N.G., 監督：P.S., M.T.S., プロジェクト管理： R.L., P.S., 資金獲得： N.G., P.S. 全員、本原稿に目を通して同意しています。
資金提供
本研究は、医学研究基金（助成番号EQU2020030171）およびフランソワ・オペティ協会（AHLに関する研究プロジェクト2019および2021）の助成を受けて実施したものである。N. GrellierはCentre Hospitalo-Universitaire de PoitiersおよびAgence Régionale de Santé Nouvelle-Aquitaineの助成を受けた。
施設審査委員会の声明
本試験はヘルシンキ宣言に基づき実施され、イル・ド・フランス第4区個人保護委員会（IRB 00003835, Suivitheque study, 登録番号 2012/05NICB）の地方倫理委員会の承認を得た。
インフォームドコンセントの記述
Suivitheque研究に参加したすべての被験者からインフォームドコンセントを取得した。
データの利用可能性に関する声明
本研究で提示されたデータは、対応する著者から要請があれば入手可能である。
謝辞
François Aupetit 協会の揺るぎない支援、Nathalie Rolhion の Bio-Render ライセンスの提供、Christine Silvain の支援に謝意を表する。
利益相反について
P. P. Seksik は、武田薬品、Merck MSD、Biocodex、Ferring、Janssen、Amgen、Pfizer、Pileje、Fresenius Kabi、Abbvie から講演料および顧問料を得ているが、この研究に関連した利益相反はないと宣言している。他の著者は、競合する利害関係を表明していない。
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共有と引用

MDPIおよびACSスタイル
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AMAスタイル
Grellier N, Suzuki MT, Brot L, Rodrigues AMS, Humbert L, Escoubeyrou K, Rainteau D, Grill J-P, Lami R, Seksik P. Impact of IBD-Associated Dysbiosis on Bacterial Quorum Sensing Mediated by Acyl-Homoserine Lactone in Human Gut Microbiota.（ヒト腸内細菌の菌体センサーに関するIBD関連異常の影響）。International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23(23):15404. https://doi.org/10.3390/ijms232315404

シカゴ／トゥラビアンスタイル
Grellier, Nathan, Marcelino T. Suzuki, Loic Brot, Alice M. S. Rodrigues, Lydie Humbert, Karine Escoubeyrou, Dominique Rainteau, Jean-Pierre Grill, Raphaël Lami, and Philippe Seksik. 2022. "Impact of IBD-Associated Dysbiosis on Bacterial Quorum Sensing Mediated by Acyl-Homoserine Lactone in Human Gut Microbiota" International Journal of Molecular Sciences 23, no. 23: 15404." https://doi.org/10.3390/ijms232315404

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