クローン状に拡大したGPR15発現病原性エフェクターTH2細胞は、好酸球性食道炎と関連している

2023年7月10日 10:35

https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.abi5586?utm_medium=ownedSocial&utm_source=Twitter&utm_campaign=SciImmunology

DUNCAN M. M. MORGAN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-3253-1362, BERT RUITER HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-3945-3202, [...], AND J. CHRISTOPHER LOVE HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-0921-3144 +7著者著者情報・所属機関
科学免疫学
10 8月 2021
第6巻 62号
DOI: 10.1126/sciimmunol.abi5586
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病原性食道TH2細胞
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病原性食道TH2細胞
好酸球性食道炎（EoE）は、食物由来のアレルゲンへの曝露によって引き起こされるアレルギー性疾患であり、慢性の2型食道炎症によって特徴づけられる。Morganらは、EoE患者から採取した食道、末梢血、十二指腸の各サンプルについて、1対のシングルセルRNAとTCRシークエンシングを用いて、EoEの根底にある組織特異的免疫応答を調べた。NF-κBシグナル伝達経路に富む好酸球とクローン状に増殖した病原性エフェクターTヘルパー2（peTH2）細胞が活動性疾患患者の食道で上昇していた。末梢血では、ケモカイン受容体GPR15の発現がミルク反応性T細胞とpeTH2クローン型に富み、食道でも検出された。これらの結果は、特定の食物抗原特異的T細胞が食道にホーミングする態勢を整えていることを示唆し、EoEにおけるTH2細胞応答のクローン性特徴に関する知見を提供するものである。
要旨
好酸球性食道炎（EoE）は、食道への好酸球の動員を特徴とするアレルギー疾患であり、慢性炎症を引き起こす。我々は、EoE患者の組織生検に存在する細胞集団を理解し、これらの細胞集団が活動期と寛解期でどのように変化するかを明らかにしようとした。この目的のために、我々は、活動性疾患または寛解と診断されたEoE患者の食道生検、十二指腸生検、および末梢血から得られた細胞を、単一細胞RNAおよびT細胞受容体（TCR）配列決定で解析した。活動性疾患患者の食道生検に存在する病原性エフェクターTH2（peTH2）細胞は、エイコサノイドの合成に関連する明確な遺伝子シグネチャーを発現していた。食道組織常在のpeTH2集団はまた、抗原特異的活性化を示唆するクローン性増殖を示した。末梢CRTH2+CD161-およびCRTH2+CD161+メモリーCD4+ T細胞は、それぞれ従来のTH2表現型またはpeTH2表現型のいずれかに富んでいた。これらの細胞はまた、実質的なクローン拡大とTCR配列の収束を示し、決められた抗原セットに反応して拡大することが示唆された。食道ホーミング受容体GPR15は、食道でも検出された末梢のpeTH2クローン型によってアップレギュレートされた。最後に、GPR15+ peTH2細胞は、牛乳が引き金となって発症した患者の牛乳反応性CD4+ T細胞の中で濃縮されていたことから、これらの細胞は食道ホーミング能が増強された、食物抗原特異的な集団であることが示唆された。
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はじめに
好酸球性食道炎（EoE）は、好酸球の顕著な動員を伴う慢性食道炎を特徴とするアレルギー疾患であり、嚥下困難、食物詰まり、食道機能障害をもたらす(1, 2)。臨床的には、EoEはしばしば抗原特異的疾患として現れ、特定の食物由来アレルゲンへの暴露が食道炎症を誘発する(3)。EoEにおける炎症には、好酸球の動員や活性化を促進するインターロイキン5（IL-5）や、上皮バリア機能障害を悪化させるIL-13というサイトカインを産生するTヘルパー2（TH2）細胞が関与している(2, 4, 5)。しかし、利用可能な転写および遺伝学的データの多くは、疾患発症の中心に上皮ユニットの調節異常があるように思われる(5-7)。さらに、EoE患者は末梢で高度に極性化した病原性エフェクターTH2（peTH2）細胞の増加を示すが、これらの細胞はIL-25やIL-33のレセプターの発現などの「生得的な」表現型特性を有しており、特異的抗原刺激がなくても持続的な炎症を引き起こす可能性がある(8, 9)。
最近の単細胞RNA配列決定研究により、このようなpeTH2細胞がEoE患者の食道組織に存在することが確認されたが、回収されたこれらの細胞の数が限られていたため、この集団内のクローン関係を包括的に評価することはできなかった(9)。結局のところ、peTH2細胞の食道への動員を導くシグナル伝達経路や、これらの細胞が好酸球の動員や慢性食道炎症を媒介するメカニズムの全容は不明なままである。さらに、これらの細胞のクローン性や抗原特異性もまだ明らかにされていない。
EoEの根底にある細胞機序をよりよく理解するために、我々はEoE患者の食道生検、十二指腸生検、末梢血に存在する細胞の種類と機能の単一細胞ゲノム解析を行った。その結果、peTH2マーカーを発現し、活動性の疾患患者の食道生検で濃縮されたT細胞集団が同定された。この集団は、TH2サイトカインや脂質代謝関連遺伝子の発現を上昇させ、抗原依存的な活性化と一致するクローン性増殖を示した。同じ患者の末梢血では、組織で検出されたものと共通のpeTH2表現型を持つクローン型が検出された。食道でも検出された末梢のpeTH2クローン型は、食道ホーミング受容体GPR15の遺伝子をアップレギュレートしていた。これらの結果から、EoEにおけるGPR15+ peTH2細胞は、食道ホーミング能を増強した抗原特異的集団であることが示唆された。
結果
EoEの単一細胞エコシステムのマッピング
まず、10人のEoE患者から採取した組織生検から解離した細胞を解析した。これらの患者のうち6人は生検時に活動性の疾患と診断され、4人は寛解期の疾患と診断された（表S1）。各患者から、食道と十二指腸から最大6個の生検を行った。これらの生検から回収した細胞をSeq-Well（図1A）を用いて単一細胞RNA配列決定のために処理した（10, 11）。これらの組織生検から、500以上のユニークな遺伝子が検出された合計28,816個の高品質な単一細胞トランスクリプトームを回収した（図S1）。
図1. EoE患者の食道および十二指腸生検の単一細胞RNA配列決定。
(A）生検処理パイプラインの概略図。EoE患者10人（6人は疾患活動中、4人は寛解期）の生検を酵素的に単細胞懸濁液に解離し、Seq-Wellを用いて単細胞RNAシーケンス用に処理した。 B）EoE患者10人の食道および十二指腸生検から得られた28,816細胞のUMAPを細胞の表現型別に色分けした。(C) 各細胞表現型に対する選択マーカー遺伝子のドットプロットで、各遺伝子の平均発現と発現頻度を示す。(D) 食道と十二指腸の生検から得られた細胞のUMAPを組織と患者の診断別に色分けしたもの。(E）各患者の食道生検と十二指腸生検から得られた細胞の表現型の相対頻度を示す棒グラフ。
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得られた遺伝子発現行列は次元削減を用いて処理され、uniform manifold approximation and projection（UMAP）（12）を用いて可視化された。グラフベースのクラスタリングを用いて、異なる細胞型に対応する9つの主要なクラスタを同定した（図1B）。これらのクラスターはマーカー遺伝子の発現によって注釈され、T細胞、形質細胞、顆粒球、肥満細胞、骨髄球、線維芽細胞、内皮細胞、食道上皮細胞、十二指腸上皮細胞に対応した（図1C、図S2およびS3、データファイルS1）。いくつかの細胞集団の頻度は、食道と十二指腸で大きく異なっていた。各組織におけるこれらの細胞集団の頻度における患者間のわずかなばらつきは、年齢などの患者固有の違いや、細胞の生存率や組織の解離過程のばらつきなどの技術的要因に起因すると考えられる（図1、DおよびE）。上皮細胞は食道と十二指腸の両方の生検で予想より頻度が低かったが、これはこれらの細胞のサイズが大きいため、Seq-Wellアレイのウェルに入りにくく、サイズの小さい集団が濃縮された可能性を示唆している。このような技術的要因にもかかわらず、CCL26、POSTN、CAPN14のような上皮関連転写産物を含むEoEの古典的マーカー遺伝子は、活動性疾患患者の食道生検でアップレギュレートされており、シングルセルシーケンスデータの忠実度が高いことを裏付けている（図S4）。
活動性疾患の食道における好酸球はκB核因子が制御する経路を活性化する。
食道における好酸球の存在は、EoEの診断の第一の基準である(1, 2, 4)。より高分解能で見ると、顆粒球のクラスターは主に好酸球で構成されているだけでなく、好中球の小さな集団も含んでいた（図2、AおよびB）。好酸球は、表面マーカーであるSIGLEC8、CCR3、PTGDR2、IL5RAの遺伝子と、CLC（ガレクチン-10）やRNASE2（好酸球由来神経毒）などの顆粒成分をコードする遺伝子を発現していた（図2C）。対照的に、好中球は表面マーカーであるCXCR2、FCGR3A、FCGR3Bの遺伝子を高レベルで発現していた（図2C）。PRG2（主要塩基性タンパク質）、EPX（好酸球ペルオキシダーゼ）、およびRNASE3（好酸球カチオン性タンパク質）を含む他の顆粒関連タンパク質は好酸球では強く発現していなかったが、これはこれらのタンパク質が主に好酸球の成熟期に合成され、その転写産物が成熟好酸球では発現しないという先行報告と一致している(13, 14)。
図2. 好酸球は活動性疾患の間、食道で濃縮され活性化される。
(A）顆粒球クラスターのUMAPを組織および疾患の状態別に色分けしたもの（n＝679細胞）。(B）顆粒球クラスターのUMAPを顆粒球のタイプ別に色分けしたもの。(C) 好酸球と好中球が発現する選択した表面マーカーと炎症エフェクターのドットプロットで、各遺伝子の平均発現と発現頻度を示す。(D)疾患または寛解期にある患者の食道または十二指腸生検から得られた好酸球と分類された細胞の単一細胞データにおける割合。P値は両側Wilcoxon順位和検定を用いて計算した（*P < 0.05）。(E）組織学的染色で決定された食道組織の高倍率視野あたりの好酸球数と、単細胞RNA配列決定で食道生検から回収された好酸球の割合との相関。Spearmanの相関係数とP値を示す。(F) 十二指腸の好酸球と比較して、活動性疾患患者の食道組織に存在する好酸球で発現が増加しているパスウェイ。P値は両側Wilcoxon順位和検定で計算され、Bonferroni補正で調整されている。(G）NF-κBのサブユニットによって制御されるモジュールについてSCENICが作成した転写因子モジュールスコア。
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食道中の好酸球の割合は、回収された全単一細胞の割合として計算され、活動性の患者では有意に増加していたが、寛解期の患者では好酸球の頻度がわずかに増加していた（図2D）。活動性の患者の食道生検から回収された単細胞の平均4.7％が好酸球であった。好酸球は10人全員の十二指腸生検でも検出されたが、その頻度は活動期と寛解期で有意差はなかった（Fig.）組織染色による好酸球数と単細胞データセットにおける好酸球の割合との間には相関が認められ、単細胞RNAシーケンスによる観察と組織染色による観察との間に一致が認められた（図2E）。
好酸球がEoEで産生される炎症シグナルにどのように反応するかを明らかにするために、炎症が通常組織学的に明らかでない十二指腸の好酸球と比較して、疾患活動中の食道の好酸球によって発現が上昇する経路を同定した(15)。その結果、"IL-2/STAT5シグナル伝達"、"NF-κBを介したTNFシグナル伝達"、および "炎症反応 "を含むいくつかの炎症促進経路が、活動性疾患時に食道好酸球によって発現上昇することがわかった（図2F）。これは、EoEで食道に動員された好酸球が活動性疾患時に活性化されることを示している。EoEにおける好酸球の活性化を媒介すると考えられる遺伝子制御ネットワークを明らかにするために、転写因子と共発現し、転写因子のシス制御モチーフに富む遺伝子モジュールを同定するために、単一細胞制御ネットワーク推論とクラスタリング（SCENIC）を用いた(16)。転写経路の解析と一致して、NFKB1、NFKB2、REL、RELBを含む核内因子κB（NF-κB）サブユニットによって制御される遺伝子モジュールは、活動性疾患中の食道常在好酸球で最も濃縮されたモジュールの一つであった（図S5およびデータファイルS2）。好酸球におけるNF-κBの活性化は、EoE発症に関与すると考えられているサイトカインIL-5とIL-33によるシグナル伝達と以前から関連しており、アポトーシスの抑制を介して好酸球の生存を促進することが証明されている(1, 4, 17-19)。NF-κBによって制御される遺伝子モジュールは、疾患活動中の十二指腸でも上昇していたことから、アレルギー性喘息で観察されているように、EoE活動中の炎症シグナル伝達が好酸球の全身的な活性化を促進している可能性が示唆された（図2G）(20)。全体として、これらの観察結果は、NF-κBがEoEにおける好酸球の活性化と生存の重要なメディエーターであることを示唆し、アレルギー性炎症時に好酸球で活性化される遺伝子制御ネットワークについての洞察を与えている。
食道T細胞と十二指腸T細胞の表現型とホーミングマーカー発現パターンの違い
アレルゲン特異的T細胞による抗原認識は、EoEにおける食道への好酸球の動員を導くシグナル伝達カスケードを開始すると考えられている(1, 4)。EoEにおける組織常在T細胞の特性を明らかにするために、食道と十二指腸の生検に存在するT細胞の亜集団を解析した。組織特異的な転写の違いにより、教師なし解析ではT細胞は由来組織ごとに分離した（図S6A）。そこで、食道と十二指腸のT細胞を別々に解析した。これらの細胞をクラスタリングした結果、食道と十二指腸それぞれから6つのT細胞のクラスターが発見された（図3、A、B、およびデータファイルS3）。これらのクラスターには、CD8+組織常在記憶（Trm）細胞（クラスターE1、E2、D2）、TH17細胞（E5、D1）、制御性T（Treg）細胞（E3、D5）、peTH2細胞（E6）、ナチュラルキラー（NK）細胞（E4、D3、D4）、増殖Ki-67+細胞（D6）が含まれていた（図3C）。これらのクラスター注釈は、以前に発表された自然リンパ球とNK細胞の単一細胞RNAシーケンスデータ、およびTヘルパー細胞の表現型を表すキュレーションモジュール（図S6、BおよびC、ならびにデータファイルS4）と一致していた（21）。
図3. 食道と十二指腸に存在するT細胞の表現型。
(A）食道生検から回収したT細胞のUMAPを表現型クラスター別に色分けしたもの（n＝4423細胞）。(B）十二指腸生検から回収したT細胞のUMAPを表現型クラスター別に色分けしたもの（n＝4781細胞）。(C)組織常在T細胞クラスターにおける選択遺伝子のドットプロットで、各遺伝子のスケール化された発現と発現頻度を示す。(D）食道と十二指腸のT細胞クラスターにおける選択ホーミングマーカーのドットプロット。(E）組織常在細胞表現型におけるCCR9とGPR15のリガンドであるCCL25とC100orf99のドットプロット。(F）EoE患者の食道生検におけるGPR15とGPR15Lの免疫組織化学染色。スケールバーは200μm。結果はn = 3患者の代表値。(G) フローサイトメトリーで測定した、EoE患者の食道生検から単離したメモリーCD4+ T細胞上のGPR15発現。結果はn = 3実験の代表値。(H) 食道生検から得られたメモリーCD4+ T細胞中のGPR15+細胞の割合。
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次に、食道と十二指腸のT細胞間の表現型の関係を解析した。一般に、食道のT細胞は十二指腸のT細胞よりも活性化レベルが高く、食道のTH17細胞はIL26、IL17A、IL17Fを、食道のCD8+細胞はIFNG、GZMB、GNLYを高レベルで発現していた（図S6、D〜F、およびデータファイルS5）。また、食道と十二指腸のT細胞間で、選択されたホーミングマーカーの発現が異なっていた。具体的には、両組織のT細胞はITGA4とITGB7に広く陽性であった。ITGA4とITGB7は結合してインテグリンα4β7を形成し、正規の腸管ホーミングマーカーとなる（図3D）(22)。対照的に、十二指腸のT細胞はCCR9を発現していたが、食道は発現しておらず、食道のCD4+ T細胞のみがGPR15を発現していた。これらの結果は、これらのマーカーの差次的発現が、食道または十二指腸へのT細胞の特異的ホーミングを促進する可能性を示唆している。この仮説と一致して、CCR9とGPR15のリガンドをコードする遺伝子であるCCL25とC10orf99の発現が、それぞれ十二指腸上皮または食道上皮でのみ検出された（図3E）(23, 24)。タンパク質の発現は、EoE患者の食道生検の免疫組織化学によって確認され、GPR15を発現するリンパ球と基底上皮に集中するGPR15Lの発現が同定された（図3F）。EoE患者から採取した食道生検のT細胞のフローサイトメトリーでも、食道常在メモリCD4+ T細胞にGPR15が頻繁に表面発現していることが示された（図3、G、H、および図S7、A～C）。これらの結果は、GPR15が食道のCD4+ T細胞で選択的に発現上昇する、これまで同定されていなかった食道ホーミングのマーカーであることを示唆している。
peTH2細胞はEoE時に食道で濃縮される
次に、食道常在T細胞クラスターと各患者のEoE診断との関係を調べた。その結果、食道から回収された全T細胞の割合として計算されるpeTH2クラスター（E6）の相対的な大きさは、活動性の疾患患者において有意に高いことがわかった（図4A）。クラスターE6の相対的な大きさは、各患者の食道生検で検出された好酸球の頻度とも相関しており、peTH2細胞の存在と食道への好酸球の動員との関係が示唆された（Fig.）
図4. EoE患者の食道におけるpeTH2細胞の性質。
(A）各食道T細胞クラスターの相対的な大きさ。P値は両側Wilcoxon順位和検定を用いて計算した（*P < 0.05）。(B）クラスターE6におけるT細胞の割合と高倍率視野（hpf）あたりの好酸球数との相関。スピアマンの相関係数と関連するP値を示す。(C）各食道T細胞クラスターにおけるプロスタグランジン合成または脂質代謝に関連する遺伝子の発現を示すドットプロット。(D) 好酸球とpeTH2細胞の間で選択的に発現が上昇すると決定された経路におけるレセプターとリガンドの発現を示すリガンド-レセプター経路解析。示された全ての経路は統計的に有意であると判断された（Materials and Methods）。
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EoEにおけるpeTH2細胞の表現型をさらに解析するために、食道における他のT細胞と比較してpeTH2細胞によって発現が上昇するパスウェイを同定した。EoEや喘息における組織常在TH2細胞の先行研究と一致して、peTH2細胞で有意に発現が上昇した経路は、アラキドン酸代謝、脂質代謝、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPAR-γ）シグナル伝達、エイコサノイド産生などであった（図S8、AおよびB）（9, 27）。脂質代謝異常がEoEにおける組織レベルの炎症をどのように媒介するかをさらに調べるために、peTH2細胞における遺伝子の発現をアラキドン酸代謝のネットワークに直接マッピングした。その結果、peTH2細胞で過剰発現している3つの遺伝子が同定された： PLA2G16、PTGS2、およびHPGDSである。これらの遺伝子は一緒になって、膜関連リン脂質に貯蔵されたアラキドン酸を完全に処理して、プロスタグランジンD2（PGD2）を形成することができる（図4C）。peTH2細胞はまた、長鎖および超長鎖脂肪酸の処理に関与する様々な酵素の遺伝子を過剰発現しており、そのうちのいくつかは、アラキドン酸由来の代謝産物に特異性を持つことが報告されている（28-30）。また、EoEの先行研究から得られた単一細胞データセットや、アトピー性皮膚炎患者の皮膚吸引水疱および慢性鼻副鼻腔炎患者の鼻腔掻爬から作成されたデータセット（図S9）（9, 31, 32）からも、peTH2細胞のこれらの特徴が検出されたことから、これらの特徴は、複数の組織や疾患背景にわたって保存されているpeTH2細胞の機能を表していることが示された。これらの結果は、複数のアレルギー疾患にわたる組織常在peTH2細胞の基本的な特徴が、PGD2の産生を促進する脂質代謝の調節障害であることを示唆している。
食道組織に存在するpeTH2細胞が、好酸球のリクルートと活性化をどの程度まで直接仲介しているのかを明らかにするために、受容体-リガンド相互作用の解析を行い、組織常在好酸球とpeTH2細胞の間に存在する情報伝達軸を予測した。簡単に言えば、順列に基づくアプローチと受容体-リガンド相互作用のデータベースを用いて、peTH2細胞が選択的に発現するリガンドと対になる好酸球に選択的に発現する受容体を同定した。予測されたpeTH2細胞と好酸球の相互作用には、TH2サイトカインであるIL-13、IL-4、IL-5や、エイコサノイドとDP2受容体（PTGDR2）の相互作用が含まれた（図4D）。マスト細胞はこれらの受容体の多くを好酸球と共通して発現しており（図4D）、EoEにおけるpeTH2細胞によるマスト細胞と好酸球の活性化は、同様の経路で媒介されている可能性が示唆された。これらの結果から、EoEにおける組織常在型peTH2細胞の特徴は、PGD2の産生を促進する脂質代謝の変化であり、TH2サイトカインに加えて、PGD2がEoE時の食道における好酸球のリクルートと活性化を媒介する役割を担っている可能性が示唆される。
組織に常在するpeTH2細胞はクローン的にレパートリーを拡大している
次に、組織常在T細胞の表現型間のクローン型の関係を理解しようとした。われわれは、10人の患者のうち9人から、個々のT細胞についてT細胞受容体α（TCRα）とTCRβの対になる配列を得た(33)。合計すると、50.3％のT細胞でTCRβ配列が、32.5％のT細胞でTCRα配列が、21.5％のT細胞でTCRβとTCRαの両方の配列が得られた（図S10A）。T細胞のすべてのサブセットは、ある程度のクローン性拡大を示し、これらの表現型が組織常在記憶T細胞の集団を含むことを示している（図5、A～E）。peTH2クラスターから複数のTCRが回収された活動性疾患患者4人のうち3人から、共通のα鎖またはβ鎖の相補性決定領域3（CDR3）配列を共有する複数の細胞として定義されるクローン拡大したpeTH2細胞が検出された（図5F）。これらの結果は、EoEにおける組織常在peTH2細胞のレパートリーが、抗原特異的応答の重要な特徴であるクローン性拡大を示すことを示している。
図5. 食道および十二指腸におけるT細胞のクローン型の関係。
(A）食道T細胞および（B）十二指腸T細胞に存在する表現型のUMAP。(C）食道T細胞と（D）十二指腸T細胞のクローンサイズを対応するUMAPにマッピングしたもの。クローンサイズは、あるTCRb配列を共有するある患者の細胞数として定義される。(E)各表現型のクローンサイズを積み重ねた棒グラフ。(F)各患者のpeTH2細胞のクローンサイズの棒グラフ。
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末梢CRTH2+CD161+T細胞はpeTH2表現型に富んでいる
表面マーカーCD161は、アレルギーや蠕虫感染において高度に分化したpeTH2細胞で発現が上昇することが報告されており、末梢CRTH2+CD161+メモリーCD4+ T細胞はEoEと関連している(8, 34, 35)。活動性EoE患者の食道で観察されるpeTH2表現型が、末梢CRTH2+CD4+ T細胞の間でどの程度再現されるかを理解するために、本研究では8人の患者から末梢血単核球（PBMC）を得た。これらのサンプルからメモリーCD4+ T細胞を単離し、これらの細胞をTCR依存的にex vivoで6時間ポリクローナルに活性化した（抗CD3/抗CD28コートビーズ）。その後、メモリーCD4+ T細胞の3つの集団を分離した： CRTH2+CD161+、CRTH2+CD161-、CRTH2-CD161-である（図6A）。寛解期にある患者と比較して、活動期にある患者ではCRTH2+CD161-細胞の頻度が有意に高く、CRTH2+CD161+細胞の頻度が増加する傾向がみられた（図6B）。
図6. 末梢peTH2表現型と食道常在peTH2表現型の比較。
(A）疾患または寛解期にあるEoE患者の末梢血から採取したCRTH2とCD161の代表的染色像。(B）フローサイトメトリーによる、メモリーCD4+CD45RA- T細胞中のCRTH2+CD161+およびCRTH2+CD161-の割合。P値は、片側Wilcoxon順位和検定を用いて算出した（P < 0.05）。(C）ソートされたCRTH2-CD161-細胞、CRTH2+CD161-細胞、およびCRTH2+CD161+細胞のUMAPをソート分画で色分けしたもの（n＝30,635細胞、患者8人）。(D）ソートされた細胞のUMAPを表現型クラスター別に色分けしたもの。(E）各ソート画分内の表現型クラスターの分布。(F)末梢血CD4+T細胞のT細胞と食道生検のクラスターE6におけるpeTH2関連遺伝子のドットプロット。
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我々はまた、これら8人の患者から選別したCRTH2+CD161+、CRTH2+CD161-、CRTH2-CD161- CD4+T細胞を、単一細胞RNA配列決定のために処理した。6664個のCRTH2+CD161+細胞、7597個のCRTH2+CD161-細胞、および16374個のCRTH2-CD161-細胞からなる、合計30,635個の細胞からデータを得た。これらの細胞の中で、末梢血CD4+ T細胞の表現型を表す6つの主要なクラスターを同定した（図6、CとD、およびデータファイルS6）。CRHT2+CD161-集団はクラスター2の細胞に濃縮され、CRTH2+CD161+集団はクラスター2と3の細胞に濃縮された（図6E）。これらのクラスターは、FACSによって定義されたCRTH2+CD161-およびCRTH2+CD161+集団と完全には一致しなかったことから、表面タンパク質の発現によって定義された各集団内には、ある程度の転写異質性があることが示された。クラスター2と3は、サイトカインIL4とIL13を含む、TH2細胞と典型的に関連する特徴を発現した（図6F）。しかし、クラスター3は、TH2サイトカインIL4、 IL5、IL9、IL13を最も多く発現しており、HPGDS や表面マーカーIL17RB、IL1RL1の転写産物など、以前からpeTH2表現型と関連してきた他の特徴も発現していた（8, 34）。これらのデータを総合すると、クラスター2には従来型 TH2（conventionalTH2）細胞が、クラスター3にはpeTH2細胞が含まれていることが示唆される。
次に、各クラスターの組織常在peTH2細胞に関連する遺伝子の発現を解析した。その結果、convTH2細胞ではなく、末梢のpeTH2細胞が、食道常在peTH2細胞で同定された脂質代謝異常に関連する遺伝子の発現をアップレギュレートすることがわかった（図6F）。TH2サイトカインのレベルは末梢peTH2細胞で高かったが、これらの脂質代謝関連遺伝子のレベルは組織常在peTH2細胞で高かったことから、脂質代謝およびエイコサノイド合成の調節異常は、食道組織におけるpeTH2細胞の後天的な機能であることが示唆された。
末梢convTH2細胞とpeTH2細胞はクローン的に拡大し、TCR配列の収束を示す
EoEにおける末梢CRTH2+CD4+T細胞間のクローン型関係を評価するために、選別した細胞からTCRαとTCRβのペア配列を回収した（図S10B）。その結果、convTH2細胞とpeTH2細胞の両方にクローン性の高い拡大が見られたが、非TH2細胞には見られなかったことから、これらの細胞は疾患活動中に抗原に曝露されることで拡大する可能性が示唆された（図7、AおよびB）。クローノタイプ内の細胞がどの程度まで類似した表現型を共有しているかを調べるために、各拡張クローノタイプ内に存在する表現型の分布を調べた。このことは、これらの表現型が、プライミング中に経験した異なる条件のために分岐した、異なるエピトープの認識に関連する可能性のある、異なるクローン系譜を表していることを示している（図7C）。また、peTH2およびconvTH2集団のTCRβ配列の多様性は、非TH2細胞よりも有意に低いことがわかり、これらの表現型が拡大したT細胞クローン型と関連していることがさらに示された（図7D）。
図7. 末梢convTH2細胞とpeTH2細胞のTCRレパートリー。
(A）TCRβを用いて計算したクローンサイズをUMAP上に重ねたもの。(B）非TH2、convTH2、peTH2表現型間のクローンサイズの分布。(C）拡大したクローン型内の非TH2、convTH2、peTH2表現型の分布。各患者から回収された最も拡大した7つまでのクローン型が表示されている。ヒートマップは、ある表現型を持つクローン型の細胞の割合によって色分けされている。(D）非TH2、convTH2、peTH2細胞のシャノン多様性。回収されたTCRβ配列が10個未満のサンプルは除外した。P値は両側Wilcoxon順位和検定を用いて計算した（**P < 0.01）。(E）各表現型におけるCDR3配列間の最近接ハミング距離の分布。P値は両側カイ二乗比例検定を用いて計算した（P < 0.001およびP < 0.0001）。(F) GLIPH2によって同じ患者由来の別のTCRβ配列と関連している、各表現型におけるTCRβ配列の割合。回収されたTCRβ配列が10個未満のサンプルは除外した。P値は片側Wilcoxon順位和検定により算出した（*P < 0.05）。(G) 末梢血と食道で共有されるpeTH2クローンタイプ。ヒートマップは各クローノタイプについて末梢血に存在する表現型の分布を示す。太字でハイライトされた配列は食道と末梢血で共有されている。(H）食道組織で検出されたクローン型によって、他のすべての末梢peTH2細胞に比べて発現が上昇した遺伝子。P値は両側Wilcoxon順位和検定を用いて計算され、Bonferroni補正で調整されている。(I)ミルクトリガー疾患患者のCD154+およびCD154-メモリーCD4+ T細胞の代表的染色。(J) ミルク抗原で培養した後のCD154+細胞およびCD154-細胞中のCRTH2+CD161+細胞の頻度。P値は、paired two-sided Wilcoxon rank sum testを用いて算出した（P < 0.01）（K）牛乳抗原で培養後のメモリーT細胞サブセット中のGPR15+細胞の頻度。P値は、ペアの両側Wilcoxon順位和検定を用いて算出した（*P < 0.05およびP < 0.01）。
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convTH2集団とpeTH2集団の間で異なるTCRクローン型が、どの程度共通のエピトープを認識する可能性があるのかを明らかにしようとした。各患者から回収されたすべてのTCRβCDR3アミノ酸配列について最近傍ハミング距離を求めたところ、convTH2集団とpeTH2集団のクローン型は、非TH2細胞に比べて、1アミノ酸置換に相当するハミング距離1以内の最近傍を持つ可能性が有意に高く、これらのクローン型間でTCR配列が収束していることが示された（図7E）。また、共通のエピトープを共有すると予測されるTCRの「特異性グループ」を定義するパラトープホットスポット解析によるリンパ球相互作用のグループ化も行った(36)。convTH2細胞とpeTH2細胞のクローン型は、非TH2細胞よりも別のTCRβ配列と特異性グループに属する可能性が有意に高く、これらの集団の中で異なるクローン型が共通のエピトープを共有している可能性が高いことがさらに示された（図7F）。さらに、最近傍ハミング距離が1であるクローン型やGLIPH2特異性グループに属するクローン型は、これらの特徴を持たないクローン型よりも拡大していることが観察され、支配的なオリゴクローナル抗原特異的反応が示唆された（図S11、AおよびB）。クローン拡大、多様性、TCR配列の収束の傾向は、FACSで得られたタンパク質で定義されたCRTH2+CD161-画分およびCRTH2+CD161+画分よりも、転写的に定義されたconvTH2クラスターとpeTH2クラスターの間でより顕著であり、CD161マーカーはクローン拡大したpeTH2の転写状態に対して完全な感度も特異性もないことを示している（図S11、C〜F）。全体として、これらの結果は、EoE患者の末梢convTH2およびpeTH2細胞が、実質的なクローン型の拡大とTCR配列の収束を示すことを示しており、そのレパートリーは、定義されたエピトープのセットに対して選択されることを示唆している。
食道に常在するpeTH2クローン型は、末梢CRTH2+CD4+細胞の中に存在し、GPR15をアップレギュレートする。
T細胞クローン型が末梢peTH2細胞と食道peTH2細胞の間で共有されているかどうかを調べるため、食道組織由来のpeTH2細胞と末梢血由来のpeTH2細胞のTCR使用率を比較した。その結果、食道常在peTH2細胞でも検出されたTCRβまたはTCRα配列を発現する細胞が2人の患者から合計26個見つかり、食道常在peTH2クローン型が組織と末梢血のCRTH2+CD4+細胞の間で同時に検出されることが示された（図7G）。同じ患者から採取したこれら2つのクローン型のTCRβ CDR3配列は、たった1個のアミノ酸置換（Gly ⟄ Ser）で異なっていたことから、これら2つの食道吸引性peTH2クローン型は同じエピトープを認識している可能性が高いことが示唆された。合計すると、食道常在peTH2細胞から検出されたクローン型に属する末梢細胞の84.6％（26個中22個）がpeTH2表現型を有しており、末梢peTH2細胞のサブセットが食道常在peTH2細胞と表現型とクローン型の両面で同一性を有していることが示された。
食道関連peTH2細胞と末梢血の他のpeTH2細胞とを区別する表現型の特徴があるかどうかを調べるため、2つの集団間で発現が異なる遺伝子を同定した。GPR15という遺伝子は、食道組織で見つかったpeTH2クローン型において最も有意に発現が上昇した転写産物であった（図7HおよびデータファイルS7）。GPR15転写産物の発現が検出可能な末梢peTH2細胞は全体のわずか1.04％であったが、食道生検でも検出された末梢peTH2クローン型の23％（26個中6個）でGPR15転写産物が検出された（図S12、AおよびB）。この結果は、GPR15がEoE時のpeTH2細胞の食道への輸送を促進する機能を持ち、GPR15がEoE患者の末梢血中の食道関連peTH2細胞のマーカーとして機能している可能性を示唆している。
牛乳誘発性EoE患者のpeTH2細胞は牛乳反応性を示す
最後に、EoEにおける食道ホーミングpeTH2細胞が、どの程度疾患関連抗原に反応するかを調べるために、牛乳誘発性のEoE患者9人からPBMCを得た。この細胞を乳タンパク質で22時間刺激し、フローサイトメトリーを用いて細胞を分析した（図S13A）。活性化マーカーCD154（CD40L）を用いて抗原反応性CD4+ T細胞を検出した(37)。抗原反応性CD154+ T細胞は、CRTH2+CD161+細胞が安静時CD154-細胞と比較して有意に濃縮されており、EoE患者の末梢peTH2細胞の相当な割合が食物抗原に反応していることを示している（図7、IおよびJ、ならびに図S13B）。加えて、GPR15はCD154+ T細胞に濃縮され、CD154+ CRTH2+CD161+ T細胞の一部に発現していたことから、抗原反応性peTH2細胞のサブセットは食道ホーミング能を増強している可能性が示唆された（図7、IおよびK、ならびに図S13B）。EoEにおけるpeTH2細胞のマーカーとして以前に報告された遊離脂肪酸レセプター3（FFAR3）は、CD154-細胞に対してCD154+細胞にも濃縮されていたが、GPR15よりもメモリーCD4+細胞の割合が低かった（図S13C）。全体として、これらの結果は、かなりの割合のpeTH2クローン型が疾患関連食物抗原に反応することを示し、EoEにおける抗原反応性peTH2細胞とGPR15の関連を確認するものである。
考察
ここで我々は、EoE患者の食道生検、十二指腸生検、および末梢血から得られたpeTH2細胞の転写特性とTCRレパートリーを解析した。これら3つの組織におけるpeTH2細胞の特徴を比較することで、食道へのpeTH2細胞の動員を導く経路、好酸球性炎症を媒介するこれらの細胞の能力、この集団の間に現れるクローン関係など、EoEにおける炎症を促進するメカニズムに関する知見を得ることができる。
これまでのシングルセルシークエンシングに基づく研究では、好酸球やその他の顆粒球はRNA含量が低く、リボヌクレアーゼの濃度が高いため、検出能力に限界があった(32)。Seq-Wellを用いて、臨床生検における好酸球数と相関する好酸球数を回収した。その結果、食道常在好酸球はNF-κBによって制御される遺伝子の発現が亢進しており、これらの細胞はEoEで産生される炎症シグナルに反応し、炎症の活性メディエーターである可能性が高いことが示された。好酸球におけるNF-κBの活性化は好酸球の生存を増加させることが証明されており、IL-5およびIL-33シグナル伝達と関連している(17-19)。
本研究では、食道のCD4+細胞、特にpeTH2細胞にGPR15マーカーが特異的に濃縮発現していることを見出した。GPR15の発現は、食道組織でも検出された末梢血のpeTH2クローン型でも増加し、牛乳が引き金となって発症した患者では、牛乳に反応するpeTH2細胞で発現が上昇することがわかった。これらのデータは、GPR15の発現がEoEにおけるpeTH2細胞の食道ホーミングを促進し、GPR15がEoE患者の末梢血における食道トラフィッキングpeTH2細胞のマーカーとして機能する可能性を示唆している。様々な臨床症状を呈する患者を増やし、この所見をさらに調査することで、この集団がEoEの病態にどのような影響を及ぼすかについての理解が深まる可能性がある。
また、食道組織と末梢血の両方で、peTH2細胞のクローン性増殖の存在を証明した。さらに、TCR配列の収束を示すクローン型の拡大を検出した。この観察は、共有の表現型を採用する複数のクローン型によるオリゴクローナル反応の存在を示唆しており、患者内で少数のエピトープが支配的である可能性がある。クローン型は通常、peTH2またはconvTH2のいずれかの転写状態を好むことが示され、それぞれの表現型は、認識される特定の抗原の性質やプライミング中に経験した異なる条件のために分岐した可能性のあるクローン系統の別個の集合を表していることが示唆された。最後に、peTH2表現型は、牛乳が引き金となり発症した患者の牛乳反応性T細胞に非常に濃縮されていることから、EoEにおいてpeTH2細胞が認識する主要なエピトープは、疾患関連アレルゲンに由来することがさらに示唆された。EoE患者におけるアレルゲン特異的peTH2細胞の検証を含む今後の研究により、EoEにおいてpeTH2細胞が認識するアレルゲン由来の正確なエピトープを同定することが可能になり、重要なアンメット・クリニカル・ニーズである回避食を経験的に評価することなく、EoEに関連する食物誘発を診断できるようになる可能性がある。
peTH2細胞はもともと、IL-5というサイトカインを産生する能力が増強された、convTH2細胞とは異なるTH2細胞の好酸球性サブセットとして報告された(38, 39)。表面マーカーCD161、IL-25R、IL-33R、CCR8、FFAR3の発現の増加、酵素HPGDS、転写因子PPAR-γの発現の増加など、peTH2細胞のさらなる特徴が、幅広いアレルギー疾患にわたって提唱されている(8, 9, 34, 40, 41)。本研究では、脂質代謝に関連する遺伝子のアップレギュレーションや、エイコサノイドPGD2の完全な合成経路の発現など、この表現型に関連するこれまで報告されていなかった特徴を明らかにした。食道組織で転写活性を示すレセプターとリガンドのペアリングを解析した結果（図4D）、peTH2細胞はPGD2の産生を介して組織に存在する好酸球に直接影響を与えることが予測された。この機能は末梢のpeTH2細胞でも検出されたが、convTH2細胞では検出されなかった。これらの知見は、peTH2細胞の病原性がPGD2の産生に直接起因している可能性を示唆しており、peTH2細胞の分化と挙動を解析するさらなる研究の動機付けとなる。このような研究は、EoEや他のアレルギー疾患に対するメカニズムや介入的治療法に情報を与える可能性がある。さらに、EoEは食物アレルギーの経口免疫療法（OIT）を受けている患者の有害事象として報告されており(42-44)、OITを受けている患者における食物アレルゲン特異的CD4+ T細胞の間にも、同様の特性が発現している可能性が示唆される。
EoEにおけるアレルゲン誘発性の炎症は、peTH2細胞による抗原の認識によって引き起こされることが示唆されている(1, 4)。この仮説は、本研究で組織常在および末梢peTH2細胞間でTCR配列のクローン拡大と収束が検出されたことにより、さらに支持された。これらのpeTH2細胞はIL-5およびIL-13というサイトカインを発現しており、それぞれ好酸球の動員を促進し、上皮バリア機能障害に寄与することによってEoEにおける炎症を促進することが観察された（1, 4, 5）。さらに、食道常在性のpeTH2細胞もPGD2の産生に関与している証拠が報告された。PGD2の放出は、好酸球、肥満細胞、peTH2細胞自体の走化性と活性化を含む正のフィードバックループを生み出すことにより、炎症を促進する可能性がある。この正のフィードバックループは、IL1RL1を発現する好酸球やpeTH2細胞のさらなる活性化を誘導する、損傷した上皮細胞からのIL-33放出などの他の炎症シグナルによってさらに増幅される可能性がある。これらの因子に加え、EoE患者の食道生検で観察されている(45)group 2 innate lymphoid cell (ILC2s)もIL-5やIL-13の産生を介してEoEの炎症に関与している可能性がある。単細胞RNAシークエンシングではILC2は検出されなかったが、これはこれらの細胞が稀少であることと、本研究で得られた生検が比較的少量であったことに起因しているのかもしれない。
要約すると、我々はEoE患者の食道および十二指腸生検において、組織常在好酸球およびpeTH2細胞を含む主要なアレルギー性メディエーターをプロファイリングした。我々は、組織常在peTH2細胞は、エイコサノイドシグナル伝達を伴う独特の表現型と関連するクローン的に拡大した集団であることを見出した。これらの細胞は、EoE患者の食物アレルゲン反応性CD4+ T細胞の中で濃縮され、食道ホーミングを促進するGPR15のアップレギュレーションを示す。peTH2細胞の発生、他のアレルギー性メディエーターとの相互作用、およびこれらの細胞によって認識される抗原に関するさらなる知識は、EoEおよび他のアレルギー性疾患や好酸球性疾患の理解、診断、および治療の進歩に不可欠である。
材料と方法
研究デザイン
本研究の目的は、EoE患者の食道生検と末梢血に存在する細胞の種類と機能を理解し、これらの細胞が活動期と寛解期でどのように変化するかを明らかにすることであった。組織生検と末梢血から得られた細胞は、フローサイトメトリーだけでなく、対になったシングルセルRNAとTCRシークエンシングを用いて分析された。本研究は、マサチューセッツ総合病院のPartners HealthCareのInstitutional Review Board（プロトコル番号2010P002087および2011P001159）により承認された。サンプルサイズは生検サンプルの入手可能性に基づいて決定された。シングルセルRNAシーケンスおよびフローサイトメトリー実験を行った研究者は、患者の診断について盲検化されていた。活動性EoEおよび寛解期EoEの診断は医師によって行われ、高倍率視野あたりの好酸球数および顕微鏡的病理所見の他の特徴、EoE Endoscopic Reference Score (EREFS)スコアリング(46)によって評価された内視鏡検査時の食道の外観、および現在の患者の症状などの要因が考慮された(表S1)。
食道生検の採取と処理
各患者から近位、内側、遠位の食道または十二指腸から合計6個までの生検を採取した。生検片はメスで〜1mm2の断片に切断し、RPMI1640培地（Gibco, Waltham, MA）中で、コラゲナーゼA（2mg/ml）とデオキシリボヌクレアーゼI（100μg/ml）（ともにMilliporeSigma, St. 残った組織片を遠心分離（100g、2分間）で除去し、上清の細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーで濾過し、冷染色バッファー（リン酸緩衝生理食塩水＋0.5％ウシ血清アルブミン＋2mM EDTA）で2回洗浄してから使用した。生検サンプルをフローサイトメトリーで解析するために、複数の患者からの単細胞懸濁液をプールし、BUV395標識抗CD3（クローンUCHT1）、アロフィコシアニン-Cy7（APC-Cy7）標識抗CD4（RPA-T4）、およびフィコエリトリン（PE）-Cy7標識抗CD45RA（HI100）（すべてBD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）で標識した； LIVE/DEAD Fixable Blue stain（L23105; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）、PE標識抗GPR15（SA302A10; BioLegend, San Diego, CA）。サンプルはBD LSRFortessa X-20装置（BD Biosciences）で解析し、データはFlowJo v10ソフトウェアで解析した。
末梢血T細胞集団の活性化と選別
組織常在単一細胞解析に含まれる10人の患者のうち8人からの凍結保存PBMCを解凍し、EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit（STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada）を用いてメモリーCD4+ T細胞を分離した。T 細胞を AIM-V 培地（ギブコ）で 6 時間培養し、48 ウェルプレートに 1 ウェル当たり 0.5 ml の培地中で、ヒト T-Activator CD3/CD28 ビーズ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）をビーズと T 細胞の比率が 1：3 となるように入れ、2 × 106 の密度で培養した。採取後、BUV395標識抗CD3、APC-Cy7標識抗CD4、PE-Cy7標識抗CD45RA、ペリジニンクロロフィルタンパク質（PerCP）-Cy5.5標識抗CRTH2（BM16; BD Biosciences）、eFluor 450標識抗CD161（HP-3G10; Thermo Fisher Scientific）、LIVE/DEAD Fixable Blue染色で細胞を標識した。生きたCD3+CD4+CD45RA- CRTH2+CD161+、CRTH2+CD161-、およびCRTH2-CD161- T細胞をFACSAria Fusion装置（BD Biosciences）で選別した。
末梢血ミルク反応性CD4+ T細胞の解析
牛乳または乳製品が引き金となったEoE患者9人（単細胞解析に含まれる患者と重複はない）の凍結保存PBMCを解凍し、24ウェルプレートに1ウェルあたり培地1ml中5×106の密度で、牛乳タンパク質（75μg/ml；M7409；ミリポアシグマ社製）を添加または無添加のAIM-V培地で22時間培養した。Fluorescein isothiocyanate (FITC) - conjugated anti-CD154 (clone TRAP1; BD Biosciences)を、最後の3時間、培養液に添加した（1ウェルあたり20μl）。採取後、細胞をBUV395標識抗CD3、APC-Cy7標識抗CD4、PE-Cy7標識抗CD45RA、FITC標識抗CD154、PerCP-Cy5. 5標識抗CRTH2、eFluor 450標識抗CD161、PE標識抗GPR15、APC標識抗FFAR3（LS-C214200; LSBio, Seattle, WA）、LIVE/DEAD Fixable Blue染色。フローサイトメトリーデータはFACSAria Fusionで収集し、FlowJo v10ソフトウェアで解析した。
単細胞RNA配列決定
食道生検、十二指腸生検、および末梢血CD4+メモリーT細胞の選別サブセットからの単細胞懸濁液は、以前に記載されたように(10, 11)、セカンドストランドケミストリーを用いたSeq-Wellプラットフォームを用いて単細胞RNA配列決定のために処理された。ライブラリーは、Nextera XT Kit（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてバーコード化および増幅し、NovaSeq 6000（Illumina）で配列決定した。
ペアシングルセルTCRシーケンスおよび解析
ペアTCR配列決定およびリードアライメントは、Tuら(33)の記載に従って行った。簡単に述べると、各サンプルの全トランスクリプトーム増幅産物を、ヒトTRACおよびTRBC領域用のビオチン化プローブと磁性ストレプトアビジンビーズを用いてTCR転写産物について濃縮した。この濃縮産物を、ヒトV領域プライマーとNexteraシーケンスハンドルを用いてさらに増幅した。その後、ライブラリーをIllumina MiSeqまたはNextSeqでシングルエンドリードを用いてシーケンスした。CDR3コンセンサス配列は、先に概説したようにアライメントした。ハミング距離補正に起因する可能性のあるセルバーコード間の衝突を防ぐため、同じCDR3配列を持つすべての分子を集約し、これらの配列のユニーク分子識別子（UMI）をハミング距離に従って最大距離2でクラスター化し、総リード数が最も多い単一のUMIを保持した。CDR3のコンセンサス頻度が80%未満のUMIは解析から除外した。GLIPH2解析は、Huangら(36)の記述に従い、ヒトデータ用に提供されたリファレンスのデフォルトパラメータとバージョン2を用いて行った。
シングルセルデータの処理と可視化
シングルセルRNAシーケンスリードの生リード処理は、Macoskoら(47)の研究に従って行った。簡単に言うと、リードはhg38参照ゲノムにアライメントされ、細胞バーコードとUMIで折りたたまれた。食道と十二指腸の生検から作成されたデータセットについては、検出されたユニーク遺伝子が500個未満の細胞、および5個未満の細胞で検出された遺伝子をフィルターアウトし、末梢CD4+メモリーT細胞のデータセットについては、検出されたユニーク遺伝子が900個未満の細胞、および5個未満の細胞で検出された遺伝子をフィルターアウトした。まず、各細胞のデータをライブラリサイズを考慮して対数正規化した。SeuratのScaleData関数を用いて、各細胞のUMIの数とミトコンドリア遺伝子の割合を回帰し、ポアソンモデルを用いて単位分散になるようにデータをスケーリングした。次に、主成分分析（PCA）を行い、上位10成分を用いてUMAPの可視化を行った。クラスターはSeuratのFindClusters関数を用いて決定した。食道生検から回収された少数の細胞は十二指腸上皮細胞とクラスター化したため、以降の解析から除外された。
SoupXを用いた周囲RNA汚染の補正
SoupX v0.3.0を用いて、Young and Behjati (48)の記載に若干の修正を加えながら、周囲RNAの補正を行った。食道からのサンプルについては、非食道上皮細胞中の遺伝子KRT4、KRT5、KRT13、KRT15、およびKRT6Aを、十二指腸からのサンプルについては、非漿液細胞中の遺伝子IGHA1、IGHA2、IGHM、IGJ、およびIGKCを用いて、細胞コンタミネーションフラクションを推定した。これらの推定値は、calculateContaminationFraction を使用して精緻化し、各細胞の UMI 数と推定コンタミネーション率との間に lowess 曲線を当てはめました。調整されたカウント数は、データのカウントの性質を維持するため、整数に丸められました。アンビエントRNAの補正が完了した後、データは再処理され、上記のように再解析された。
ダブレットの除去と個々の細胞タイプの解析
単一細胞タイプを表すクラスターは、まず上記の「単一細胞データの処理と可視化」のセクションで説明したように処理された。ダブレットクラスターは、複数の細胞集団に関連するマーカー遺伝子を強く発現するクラスターとして同定され、破棄された。その後、解析を開始する前に、前処理ステップをさらに1回行った。
遺伝子モジュールとパスウェイの濃縮解析
Gutierrez-Arcelusら(21)のデータから、各サブセットで差次的に発現した上位30遺伝子を決定することにより、自然免疫T細胞サブセットおよびNK細胞の遺伝子セットを作成した。遺伝子スコアはSeuratのAddModuleScore関数を用いて求めた。好酸球トランスクリプトームの解析には、HallmarksコレクションのMSigDBパスウェイを解析し、peTH2細胞の解析には、Kyoto Encyclopedia of Genes and GenomesおよびBioCartaコレクションのMSigDBパスウェイを解析した。
好酸球のSCENIC解析
PythonパッケージpySCENIC version 0.9.18を用いて、好酸球の遺伝子制御ネットワークを推定した(16, 50)。pySCENICワークフローへの入力は、好酸球として分類された細胞の遺伝子数マトリックスと、hg38ゲノムの転写開始点周辺の遺伝子プロモーターの転写因子モチーフスコアを含むRcisTargetデータベースであった。活動性疾患患者の食道生検の好酸球と全患者の十二指腸生検の好酸球との間で、各転写因子モジュールのAUCellスコアについて両側Wilcoxon順位和検定を行うことにより、活動性疾患中に好酸球で発現が増加する転写因子モジュールを同定した。
免疫組織化学染色
ホルマリン固定パラフィン包埋生検切片を標準プロトコールで調製した。熱媒介エピトープ回収は、Thermo Fisher Scientific社のPTモジュールを用いて、pH6のクエン酸緩衝液を用い、97℃で20分間行った。スライドはThermo Fisher Scientific 360 AutoVision immunohistochemistry stainerを用いた。実行は以下の構成であった：内因性ペルオキシダーゼブロック、10分；プロテインブロック、30分；一次抗体、60分；標識ポリマー、30分；および3,3′-ジアミノベンジジン（DAB）、5分。一次抗体はGPR15 (HPA-013775; MilliporeSigma)とC10orf99 (PA5-62266; Thermo Fisher Scientific)を用いた。
受容体-リガンド経路解析
食道組織におけるpeTH2細胞と好酸球間の受容体-リガンド相互作用を同定するために、受容体-リガンドペアの公開データベース(51)から「既知」および「文献支持」として注釈付けされたパスウェイを使用した。食道生検から得られた他の細胞に比べて好酸球で受容体が選択的に発現上昇し、他のT細胞サブセットに比べてpeTH2細胞でリガンドが選択的に発現上昇するような受容体-リガンドのペアを同定することを目的とした。好酸球またはpeTH2細胞は、そのクラスター内の細胞の少なくとも10％がそのレセプターまたはリガンドの転写産物を発現していれば、そのレセプターまたはリガンドを「発現している」と定義した。好酸球とpeTH2細胞の両方が対応するレセプターとリガンドを発現している全てのパスウェイについて、レセプターまたはリガンドをコードする遺伝子の平均正規化発現値に等しい「レセプタースコア」と「リガンドスコア」を定義した。次に、食道生検から回収した細胞の細胞タイプラベルを10,000通り並べ替え、レセプタースコアとリガンドスコアの両方を再計算することにより、レセプタースコアとリガンドスコアのヌル分布を作成した。次に、このヌル分布を用いてレセプタースコアとリガンドスコアのP値を計算し、各レセプター-リガンドペアのP値をレセプタースコアのP値とリガンドスコアのP値の最大値と定義した。
文献データセットの再解析
Wenら(9)、Bangertら(31)、Ordovas-Montanesら(32)のデータは、GSE126250とGSE153760、およびOrdovas-Montanesらの補足データから得た。Bangertら(31)については、アトピー性皮膚炎患者の皮膚吸引水疱のデータを使用した。全てのデータセットにおいて、検出されたユニーク遺伝子が500個以下の非T細胞とT細胞は除外された。BangertらとOrdovas-Montanesらのデータは、上述の方法で処理した。Wenらのデータは、まず100万あたりの転写産物を計算して正規化した。その後、SeuratのFindVariableGenes関数を用いて可変遺伝子を選択し、SeuratのScaleData関数を用いてスケーリングした。PCAを実行した後、いくつかの主成分をエルボープロットから選択し、各データセットのUMAPを生成するために使用した。すべてのデータセットについて、SeuratのFindClusters関数を用いてクラスターを決定した。Ordovas-Montanesらのデータセットでは、T細胞とラベル付けされた細胞の小さなクラスターが好酸球を表しているように見えたため、解析から除外した。
統計解析
統計解析はRソフトウェアバージョン3.5.1で行った。特定のパラメトリックおよびノンパラメトリック統計検定は図の凡例に示した。P値<0.05は統計的に有意とみなされた。差次的遺伝子発現解析では、調整P < 0.001、平均対数倍変化が0.25を超える遺伝子を統計的に有意とみなした。
謝辞
本研究の臨床コーディネーターであるM. DavilaとA. Swensenに感謝する。資金提供本研究の一部は、米国国立がん研究所（NIH）のKoch Institute Support（中核）助成金P30-CA14051およびKoch Institute-Dana-Farber/Harvard Cancer Center Bridge Projectの支援を受けた。本研究は、Broad InstituteのFood Allergy Science InitiativeおよびNIH（1UL1TR001102）からも助成を受けた。FACSの支援を行ったMGH Department of Pathology Flow and Image Cytometry Research Coreは、NIH Shared Instrumentation Program（1S10OD012027-01A1、1S10OD016372-01、1S10RR020936-01、および1S10RR023440-01A1）から資金援助を受けた。著者貢献： W.G.S.、J.C.L.、D.M.M.、B.R.が研究の構想を練った。Q.Y.とN.V.-H.は患者のリクルートと表現型決定、臨床サンプルの入手を行った。D.M.M.、B.R.、N.P.S.、B.E.S.が実験を行った。D.M.M.、A.A.T.、B.M.がバイオインフォマティクス解析を行った。D.M.M.、B.R.、W.G.S.、J.C.L.が原稿を執筆・編集した。競合利益： W.G.S.、J.C.L.、D.M.M.、B.R.は、マサチューセッツ総合病院で出願中の特許の発明者である。W.G.S.はAimmune Therapeutics社、Allergy Therapeutics社、FARE社のSABメンバーであり、ALK社、Merck社、Nestle社、Novartis社、Regeneron社、Sanofi社のコンサルタントを務める。J.C.L.はHoneycomb Biotechnologiesの顧問であり、共同設立者でもある。J.C.L.の利害関係は、MITの潜在的利益相反ポリシーに基づき審査・管理されている。データおよび資料の入手：食道生検、十二指腸生検、末梢血の全トランスクリプトームおよびTCRシーケンスデータはGEOで入手可能（アクセッション番号GSE175930）。図と解析のソースデータファイルは、github.com/duncanmorgan/EoE_SciImmunolまたはZenodo（10.5281/zenodo.5047633）で入手できる。
補足資料
概要
図S1からS13
表S1
データファイル S1～S8
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参考文献と注釈
1
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パブコメ
ISI
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4
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