高脂肪摂取はネズミのマイボーム腺における概日トランスクリプトーム・プロファイルと代謝を再形成する

2023年7月13日 10:00

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オリジナル研究論文
Front. 栄養学、2023年3月16日
第10巻栄養と代謝
第10巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fnut.2023.1146916
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クロニュートリションの未決定の含意：医学に欠けているカリキュラム
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高脂肪摂取はネズミのマイボーム腺における概日トランスクリプトーム・プロファイルと代謝を再形成する

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S001448352300194X

Sen Zou1、Jiangman Liu2、Hongli Si2、Duliurui Huang2、Di Qi1、Xiaoting Pei1、Dingli Lu1、Shenzhen Huang1、Zhijie Li1*1
1河南省人民病院河南眼科研究所および河南眼科・視覚科学重点実験室、鄭州大学人民病院、河南大学人民病院、鄭州市、中国
2鄭州大学人民病院眼科、河南省人民病院、鄭州、中国
背景栄養成分や食物成分は末梢時計と代謝を再形成する。しかし、食物チャレンジがマイボーム腺（MG）の概日時計と代謝に影響を及ぼすかどうかについては、十分に検討されていない。本研究は、バランス食または高脂肪食（HFD）を与えたマウスのMGのリズム転写産物および代謝の変化を解析することを目的とした。
方法雄性C57BL/6Jマウスを12/12時間の明暗サイクルで飼育し、普通食（NC）または高脂肪食（HFD）を4週間自由摂取させた。犠牲にした動物から、24時間の概日周期を通して3時間間隔でMGを採取した。高スループットRNA配列決定（RNA-seq）を用いたバイオインフォマティクス的アプローチにより、MGの概日トランスクリプトームを解析した。さらに、MG中の脂質成分の概日振動を解析した。
結果マイボーム腺は強固なトランスクリプトームリズムを示した。HFD摂食は、MGの概日トランスクリプトームプロファイル（組成と位相を含む）を有意に変化させ、濃縮されたシグナル伝達経路に時空間的に影響を与えた。さらに、HFD摂食はMGの脂質成分の正常なリズム振動を有意に変化させた。
結論我々のデータは、HFDがMGのリズムに有意な影響を与えることを示しており、これはMGの時計が食物中の脂質組成に高い感度を持つことを示している。

はじめに
マイボーム腺（MG）は、まぶたの縁にある口蓋板開口部にある皮脂腺である。この腺は、涙の蒸発や溢出を防ぎ、眼球表面の構造的・機能的完全性を維持するために、涙液膜に特殊な脂質を供給し、脂性縁と眼球の間で涙を維持している（1, 2）。この分泌腺から分泌される脂質が様々な理由で質的・量的に変化すると、涙液蒸発量の増加、高浸透圧、涙液膜の不安定性、瞼縁での細菌増殖などを引き起こし、最終的に眼表面の損傷につながる可能性がある（3）。現在、様々な原因によるMGs機能障害は、眼科の臨床現場において最も一般的な疾患の一つとなっている(3-5)。それは患者のQOLに深刻な影響を及ぼしている。しかしながら、MGの構造と生理的機能、およびそれらに影響を及ぼす因子に関する我々の理解は、今日に至るまで極めて限られている(6)。
生物学的進化の原動力を考えると、哺乳動物種の臓器、組織、生理学的プロセスは、地球の1日の明暗サイクルに伴って著しいリズムの変化を受けることが予測できる（7-9）。同様に、眼球組織とその生理活動も、同期的なリズム変化を受ける(10)。我々のチームの一連の研究を含む発表された研究によると、角膜（11-13）、涙腺（14, 15）、網膜色素上皮、網膜（16, 17）はすべて、照明サイクルの位相において強固なリズム変化を示すことが示唆されている。しかしながら、MGの概日リズムパターンとその基礎となるメカニズムについては、これまでほとんど注目されてこなかった（18、19）。脂質の分泌を通じて涙液膜の安定性を維持するMGの重要性を考慮すると、MGの概日リズム活性パターンとその関連メカニズムを理解することは臨床的に重要である。
哺乳類における概日リズムは、臓器、組織、生理学的機能によって異なるパターンを示す(7, 20, 21)。このリズム性は、身体の様々な器官間で密接に協調している(22)。高カロリー食(22)や低酸素症(23)などの多くの要因が、これらの概日リズムやそれぞれのシステム間の相互関係を大きく変化させる。人類の経済・社会活動の加速により、高脂肪を特徴とする欧米型の食生活が世界の隅々まで浸透している。このような食生活は、メタボリックシンドローム、糖尿病、心血管疾患など、多くの全身疾患の発症リスクを高める(24)。同様に、高カロリー食の組成の変化は、眼組織の生理学的機能と疾患の発症に難題を投げかけている(25)。高カロリー食による代謝ストレスは、角膜と涙腺の概日活動、およびこれらの活動を制御するトランスクリプトームの構成を著しく変化させる可能性がある(26)。さらに、高脂肪食（HFD）は涙腺における炎症反応の誘導を通じて、ドライアイの発症と進展を促進することが予備的データから示唆されている（27、28）。しかし、詳細なメカニズムは不明である。したがって、HFDによって誘発されるMGの機能障害とその基礎にある機序を再検討するためには、新しいツールが必要である。
ここでは、バランスのとれた食事とHFDを与えたマウスのMGのトランスクリプトームの変化を比較した。そして、HFDによって生じる代謝ストレスがMGの概日時計に及ぼす影響とその潜在的なメカニズムを、バイオインフォマティクス解析とMG中の脂質滴の日周振動の検出によって探った。その結果、食物中の脂質含量が増加すると、MGの概日トランスクリプトームの特性が劇的に変化し、MGのトランスクリプトームに対してこれまで観察されていなかった影響が生じることを見出した。このことは、食品成分がMGの生理機能にどのような影響を及ぼし、ある種の疾患をもたらすのかを説明する病態生理学的根拠を与えるかもしれない。
材料と方法
2.1. 動物および食餌介入
6週齢の雄性C57BL/6Jマウスを中国の南京大学から入手し、光密閉サーカディアンチャンバー（12/12時間明暗日周期）（Longer-Biotech Co. 時間の記録にはツァイトゲーバー時間（ZT）スケールを用いた： ZT0は点灯時間（午前7時）、ZT12は消灯時間（午後7時）である（30）。マウスは試験期間中、それぞれの飼料を自由に摂取できた。光密閉サーカディアン・チャンバーで2週間順応させた後、すべてのマウス（現在8週齢）を無作為に2群に分けた。ノーマルチョウ（NC）群マウスには、9％kcalの脂肪を含む標準的なNC（Trophic Animal Feed High-Tech Co. HFD群マウスには、前述（26）と同様に、脂肪分60％kcalのHFD（Trophic Animal Feed High-Tech Co.Ltd.、南通、中国）を4週間与えた（図1A）。概日解析用のRNA-Seqデータは、概日周期を通して8時点（3時間間隔）で収集した（図1B）。概日遺伝子の同定と概日トランスクリプトーム解析（位相と振幅）は、Jonckheere-Terpstra-Kendall（JTK）サイクリングアルゴリズムで行った。遺伝子の生物学的プロセスと分子機能は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)、gene ontology (GO)、phase set enhanced analysis (PSEA)、時系列クラスタリング解析、gene set enriched analysis (GSEA)によりアノテーションした（図1C）。MGの脂質滴の概日変化をオイルレッドO（ORO）染色で調べた。すべてのマウスはエーテル吸入後、頚椎脱臼により安楽死させた。
図1
図1. 実験デザイン。(A) 適応後、すべてのマウスを無作為に2群に分けた。NC群とHFD群のマウスには、それぞれ標準的な普通食と高脂肪食を4週間与えた。(B）24時間の概日周期で、3時間間隔（トランスクリプトーム・プロファイリング解析用）または6時間間隔（ORO染色用）で安楽死させたマウスからMGを得た。(C）ハイスループット塩基配列決定（RNA-Seq）はMG採取後に行った。概日遺伝子の同定と概日トランスクリプトーム解析は、Jonckheere-Terpstra-Kendall（JTK）サイクリングアルゴリズムを用いて行った。遺伝子の生物学的プロセスと分子機能は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)、Gene Ontology (GO)、Phase Set Enhanced Analysis (PSEA)、時系列クラスタリング解析、Gene Set Enriched Analysis (GSEA)によりアノテーションした。
2.2. MGの収集、全RNA抽出、およびRNA-seq
NCまたはHFD食餌療法に曝露した後、安楽死させた動物から、NCおよびHFD飼育マウスと同様に、概日周期で3時間間隔で左眼瞼の上下のMGを採取し、結合させた（27, 31）。RNAeasyスピンカラムキット（Qiagen）を用いてMGから全RNAを単離した。各ZTポイントについて、3つの生物学的複製を用いてRNA-Seq解析を行った（15, 30）。MGの全RNAのライブラリー調製と配列決定は、我々の以前の報告（26, 30, 32）に従って行った。簡単に説明すると、全RNAはNanoDrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて定量した。cDNAはPCRで増幅し、生のリードはSOAPnuke（Version v1.5.2）でフィルターした(33)。HISAT2(34)とBowtie2を用いてクリーンリードをアライメントした(参考文献: Mus_musculus, GCF_000001635.26_GRCm38. p6)(35)。NC群とHFD群間の差次発現遺伝子(DEGs)は、RソフトウェアのedgeRパッケージを用いて同定した1。
2.3. リズム遺伝子の解析
MGの概日リズム遺伝子は、以前に記載されたように、RソフトウェアのJTK_CYCLEアルゴリズムを用いて同定した(26, 30, 32)。全MG遺伝子の時間順に並べた100万個のマッピング断片あたりのエクソンモデルのキロベースあたりの断片数（FPKM）をアルゴリズムにインポートした。24時間周期のリズム遺伝子が同定され、リズム遺伝子の振幅を伴う位相も決定された。すべてのMG遺伝子は、低発現遺伝子（FPKM < 0.1）、リズミック遺伝子（FPKM ≥ 0.1、ボンフェローニ調整 P < 0.05）、非リズミック遺伝子（FPKM ≥ 0.1、ボンフェローニ調整 P ≥ 0.05）で構成された。
2.4. KEGG、GO、PSEA、GSEAによる機能アノテーション
MG遺伝子の生物学的過程および分子機能アノテーションは、KEGG、GO、PSEA、およびGSEAを用いて行った。KEGGおよびGO濃縮解析は、北京ゲノム研究所（BGI）が開発したオンラインバイオインフォマティックプラットフォームDr. PSEAソフトウェア(v1.1)を用いて、MSigDB3(30)からダウンロードした参照遺伝子セット(c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt)を用いて、振動位相のレベルでリズム遺伝子のアノテーションを行った。参照遺伝子セット c5.go.bp.v7.2.symbols.gmt および c2.cp.v7.2.symbols.gmt を用いて、MG 遺伝子の生物学的パスウェイを特徴付けるために GSEA ソフトウェア（v3.0）を使用した。解析のQ値またはP値の有意閾値は0.05とした(26, 30, 32)。
2.5. 時系列クラスタリング解析とタンパク質-タンパク質結合ネットワーク
MGのリズム遺伝子の動的な発現傾向を明らかにするために、既述のようにMfuzzパッケージのファジーc平均クラスタリングアルゴリズムを採用した(30)。本論文では、NC-およびHFD-fedマウスのリズム遺伝子のクラスター数を遺伝子発現傾向に基づいて4とし、その他のパラメータはデフォルト値とした。NC-およびHFD-fedマウスにおける脂質代謝遺伝子の遺伝子-遺伝子相互作用を可視化するために、STRING解析によりタンパク質-タンパク質関連ネットワーク（PPAN）解析を行った4。完全なSTRINGネットワークのパラメータは以下の通りである：ネットワークエッジの意味、エビデンス；活性相互作用のソース、実験およびデータベース、クラスタ数を3としてkmeansクラスタリング法。
2.6. MGの免疫組織化学
食餌介入後、NCおよびHFD飼育マウスの右側から眼球とともに眼瞼組織を24時間の概日周期（ZT0, 6, 12, 18）を通して6時間間隔で採取した。簡単に説明すると、MG組織の形態を可視化するためにヘマトキシリン・エオジン染色用のパラフィン組織を採取し、ORO染色（G1016、サービスビオ社）用の凍結切片を作製した。眼瞼組織を矢状切片（厚さ5μm）に切り出した。MG 切片を暗所で 10 分間 ORO 溶液に浸した。ORO 染色は、ImageJ ソフトウェア（バージョン 1.42q；米国国立衛生研究所）を用いて、平均光学濃度により解析した。NC および HFD 飼育 MG の代表的な ORO 染色画像を CaseViewer ソフトウェア（3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungary）を用いて選択した。
2.7. 統計解析およびソフトウェア
統計解析と図の作成はGraphPad Prism 9.3.1を用いて行った。概日遺伝子のヒートマップは、Rソフトウェアの "pheatmap "パッケージを用いて作成した。正規分布を持つデータは、Studentのt検定を用いて統計学的に解析し、NCマウスとHFD飼育マウスの差を比較した。P < 0.05は統計的に有意な差を示した。
結果
3.1. HFDはマウスMGのサーカディアン転写産物の特徴を変える
NC群とHFD群間のトランスクリプトームの違いを可視化するため、ボルケーノプロットを用いてRNA-seqデータの比較発現解析を行った（図2A）。その結果、NC飼育マウスとHFD飼育マウスの全MG遺伝子から、それぞれ1,397個と1,722個のサーカディアン遺伝子（補足表1、JTK_adj P < 0.05）が同定された（図2B、C）。合計で338のサイクリング遺伝子が2つの食事介入間で共有され、1,059はNC-fed MGに固有であり、1,384はHFD-fed MGに固有であった（図2Cおよび補足表2）。HFD介入は、3時間間隔で24時間以内のMGにおける共有リズム遺伝子の振動パターンを有意に変化させなかった（図2D）。MGにおけるNC-ユニークサイクリング遺伝子の発現のピークは概日周期全体であったが、HFD添加MGでは概日リズムの発現パターンは示さなかった（図2E）。対照的に、HFD-ユニークサイクリング遺伝子は主に明期に発現したが、NC MGでは概日リズムパターンを示さなかった（図2F）。
図2
図2. 高脂肪食（HFD）はマウスMGにおける概日リズムのトランスクリプトームの特徴を再プログラムする。(A）NCおよびHFD食MG遺伝子のRNA-seqデータのボルケーノプロット。赤と青の点はそれぞれ、NC-fed MGとHFD-fed MGの間で発現が≧1.2倍または≦0.83倍変化したことを示す。(B）JTK_アルゴリズムで異なる閾値条件下でのNC-およびHFD-fed MGにおけるリズム遺伝子の数。(C）NC-およびHFD-fedマウスのMGの遺伝子セットを示すベン図（JTKアルゴリズム、調整P < 0.05および発現≥ 0.1）。(D)概日周期を通して3時間間隔の異なるZT点におけるNC-マウス（左）とHFD-マウス（右）のMGにおける338の共有リズム遺伝子の発現レベルをヒートマップで可視化した。発現レベルは青から赤のカラーバーで示され、発現範囲は±2に正規化された。 (E) 概日周期を通して3時間間隔で様々なZTポイントにおけるNC-fedマウスのMGにおけるユニークな1,059個のリズム遺伝子の発現レベルを可視化したヒートマップ。(F)HFD飼育マウスのMGに特異的な1,384のリズム遺伝子の発現レベルを、概日周期を通して3時間間隔で様々なZTポイントで可視化したヒートマップ。(G-J)NCおよびHFD飼育マウスのMGにおけるリズム遺伝子の位相解析。グレーの網掛け：暗い位相。(K)NC-およびHFD-fedマウスのMGにおける338の共有リズム遺伝子の位相解析。共有周期遺伝子における位相遅延遺伝子(L)と位相前進遺伝子(M)の位相分布プロット。灰色の網掛け：暗相。
NC特有のリズム遺伝子の発現位相は主にZT6からZT10.5、ZT18からZT22.5と概日周期全体にわたっていた（図2G）。重要なことは、HFD特異的リズム遺伝子の位相はZT6からZT9でピークに達したことである（図2H）。対照的に、共有リズム遺伝子は主にNC処理MGではZT0からZT1.5まで（図2I）、HFD処理MGではZT22.5からZT1.5までであった（図2J）。共有されたサイクリング遺伝子については、63.6％が位相シフトしていたが、36.4％は位相があった（図2K）。位相シフトしたサイクリング遺伝子のうち、30.2%は位相が進み、69.8%は位相が遅れた（図2K-M）。NC飼育マウスとHFD飼育マウスのMGの間で、共有または固有のサイクリング遺伝子の振幅に有意差はなかった（補足図1）。これらのデータを総合すると、恒常性維持条件下では、HFDの介入はマウスMGにおけるリズム遺伝子の構成、数、および振動位相を劇的に変化させることが示唆された。
3.2. HFDはマウスMGにおけるサイクリング遺伝子の機能特性を変化させる
循環遺伝子の生物学的プロセスに対するHFD摂食の影響を評価するために、NCおよびHFD摂食マウスのMG遺伝子についてGOアノテーションを行った。図3Aに示すように、NCおよびHFD特異的な循環遺伝子は、様々な生物学的プロセス、特に免疫系、代謝系、および神経系に濃縮されていた。循環遺伝子のシグナル伝達経路の時空間分布に対するHFD介入の影響を特徴づけるためにPSEA分析を行った。NC食MGで濃縮された経路は概日周期全体に分布していたのに対し、HFD食群では主に明期に位置していた（図3B、C）。重要なことは、NC-fedマウスのMGではより多くの免疫関連経路が濃縮され、HFD-fedマウスのMGではより重要なシグナル伝達経路が明期に濃縮されていたことである（図3B, C）。まとめると、HFDの介入はGOおよびPSEAレベルのリズミカルな活動を有意に再配線し、その結果、HFD食マウスのMGにおいて、これらのリズミカルな遺伝子の潜在的な機能が変化している可能性が示された。
図3
図3. 高脂肪食（HFD）はマウスMGにおける概日リズムのトランスクリプトームプロファイリングの振動特性を変化させる。(A）GOバイオロジカルプロセス解析によるNC特異的（up）およびHFD特異的（down）サイクリング遺伝子の機能注釈（Q < 0.05）。NC食（B）およびHFD食（C）マウスのMGにおける有意に濃縮されたKEGGパスウェイの位相分布（Q < 0.05）。外側の円上の青線（B）と黄線（C）は、様々なフェーズで濃縮されたパスウェイを示す。グレーの網掛け：暗期。
3.3. HFDはクラスター依存性のトランスクリプトームマップを変化させる
HFD介入後のMGのリズム遺伝子のダイナミックな発現傾向を明らかにするために、NC-およびHFD飼育マウスのMGにおける循環遺伝子の時系列クラスタリング解析を行った。NC群またはHFD群におけるピークと谷の位置に基づいて、4つの振動パターンが決定された。クラスター1のピークはZT6に、谷はZT18に位置し、298および459のサイクリング遺伝子がそれぞれNCおよびHFD飼育マウスのMGに濃縮された（図4A, B）。クラスター2のピークはZT18に、谷はZT6に位置し、NC-およびHFD-fedマウスのMGにはそれぞれ337および325のサイクリング遺伝子が濃縮されていた（図4C, D）。クラスター3のピークはZT12に、谷はZT0に位置し、NC-およびHFD-fedマウスのMGにはそれぞれ161および198のサイクリング遺伝子が濃縮されていた（図4E, F）。クラスター4のピークはZT3に、谷はZT15に位置し、NC-およびHFD-fedマウスのMGにはそれぞれ263および402のサイクリング遺伝子が集積していた（図4G, H）。NC-およびHFD-fedマウスのMGの各クラスターにおけるサイクリング遺伝子を補足表3に示す。
図4
図4. 高脂肪食（HFD）はクラスター依存性のトランスクリプトームマップを変化させる。(A,C,E,G)NC食マウスのMG(左)の4つの濃縮クラスターからのリズミカルな遺伝子の正規化発現の振動パターン。各クラスター内の遺伝子に対して濃縮されたKEGGパスウェイ（P < 0.05）を（右）パネルに示す。グレーの網掛け：暗期。(B,D,F,H)4つの濃縮クラスターから得られたリズム遺伝子の正規化発現の振動パターン。各クラスター内の遺伝子に濃縮されたKEGGパスウェイ（P < 0.05）を（右）パネルに示す。グレーの網掛け：暗相。
NC-とHFD-fedマウスのMG間で類似した時間的パターンを持つサイクリング遺伝子のKEGGアノテーション機能は、有意に異なるアノテーションパスウェイを有していた（図4A-H、各パネルの右）。NC-FedマウスのMGのクラスター2のリズミック遺伝子は主に免疫機能に富んでいた（図4C）のに対し、HFD-FedマウスのMGのクラスター4の遺伝子は免疫経路に関連していた（図4H）。NC-fedマウスのMGにおけるクラスター1の循環遺伝子は主に重要なシグナル伝達経路に関連していた（図4A）が、HFD-fedマウスのMGにおける同様の経路はクラスター4に集中していた（図4H）。HFD食マウスのMGにおけるクラスター3の遺伝子は代謝経路、特に脂肪代謝に関連していたが（図4F）、NC食マウスのMGでは代謝機能に関連する経路は少数であった（図4）。これらの結果を総合すると、HFDの介入はリズム遺伝子の振動パターンとそれに対応する機能的経路を再構築することが示唆される。
3.4. HFDはMGのコアクロック非同期を引き起こさない
マウスのMGにおけるコアクロック機構遺伝子の発振パターンに対するHFD介入の影響を調べるため、24時間の概日周期で3時間間隔で、Arntl (Bmal1)、Npas2、Clock、Per1、Per2、Per3、Nr1d1、Nr1d2、Cry1、Cry2を含むコアクロック遺伝子の発現レベルと発振振幅をNC-とHFD飼育マウスのMG間で比較した。その結果、これらのコア時計遺伝子の発現はすべて、NC-およびHFD-飼育マウスのMGにおいて有意な日周リズムを示した（図5）。しかし、コア時計遺伝子の発現の位相分布と振動振幅は、HFD食マウスのMGではNC食マウスのそれと比較して有意な変化は見られなかった（図5）。従って、これらのデータは、HFDの介入はMGにおけるコアクロック機構の同期を妨げないことを示唆している。
図5
図5. 図5. NC-およびHFD-給餌マウスのMGにおけるコアクロック機構遺伝子の発現および振動パターン。NC-およびHFD-飼育マウスの各ZT時点についてスチューデントのt検定を行った。グレーの網掛け：暗期。
3.5. HFDによるMGの脂質代謝障害
マウスMGにおける脂質代謝関連遺伝子およびその潜在的機能に対するHFD介入の影響を検証するために、NC-およびHFD-給餌マウスのMG間で遺伝子の発現レベルの差を比較した（fold change ≥1.2 or ≤0.83、adjust P < 0.05）。図6Aおよび補足表4に示すように、脂質代謝に関連する98のDEGが見出され、そのうち61遺伝子がHFD-fedマウスのMGで発現上昇し、37遺伝子が発現下降した。様々なZT点における発現上昇および発現低下DEGの上位20遺伝子を図6Bに示す。脂質代謝に関連するDEGは、図6Cに示すように、いくつかの脂質代謝経路に富んでいた（Q < 0.05）。特定の分子機能における遺伝子の濃縮を調べるために、PPAN（図6D）とGSEA（図6E-H）による解析を行った。これらのデータから、有意に濃縮されたシグナル伝達経路は、グリセロ脂質／グリセロリン脂質／エーテル脂質代謝、脂質／脂肪酸への応答、脂質貯蔵の制御、脂質の異化／代謝過程など、特定の脂質代謝に関連していることが明らかになった（図6D）。GSEAの結果、トリグリセリド代謝／同化、PPARシグナル伝達経路、脂肪酸代謝過程がHFD飼育マウスのMGに特異的に濃縮されていることが明らかになった（図6E-H）。
図6
図6. 高脂肪食（HFD）誘発MGにおける脂質代謝障害。(A)概日周期を通して3時間間隔で様々なZT点におけるNC-およびHFD-fedマウスのMGにおける脂質関連遺伝子の発現レベルの差（fold change ≥1.2または≤0.83、調整P < 0.05）を可視化したヒートマップ。発現レベルは青から赤までのカラーバーで示し、発現範囲は±3で正規化した。 (B) 様々なZTポイントにおけるNC-HFD飼育マウスとHFD飼育マウスのMGにおける脂質代謝関連遺伝子の上位20のアップレギュレートおよびダウンレギュレートDEGの発現レベルを可視化したヒートマップ。(C）NC-HFD飼育マウスとHFD飼育マウスのMGにおける脂質代謝に関連する98のDGEsの有意なKEGGアノテーション上位10個（Q < 0.05）。(D)NC-およびHFD-fedマウスのMGにおける脂質代謝関連DEGの特定のKEGGアノテーションを持つタンパク質-タンパク質関連ネットワーク(PPAN)および機能クラスター(Q < 0.05)。(E-H)トリグリセリド代謝/同化、PPARシグナル伝達経路、脂肪酸代謝過程のエンリッチメントプロットは、GSEA解析によりHFD飼育マウスのMGにおいて特異的に濃縮された。(I)NC-およびHFD-fedマウスのMGにおける脂質滴の6時間間隔での時間的変化。各NC-およびHFD-fedマウスから3～5個の右側MGを無作為に選択した。NC-およびHFD-fedマウスの各ZT点についてStudentのt検定を行った。***P < 0.001. 灰色の網掛けは暗相を示す。(J）NC-およびHFD-fedマウスのMGにおける平均脂質滴蓄積。NC-およびHFD-fedマウス間のStudent's t-test。***P < 0.001. (K）ZT18におけるNC-マウス（左）とHFD-マウス（右）のMGにおける脂質沈着の代表的なORO染色像。スケールバー 50 μm。
HFD摂食がMGの脂質代謝に及ぼす影響を調べるため、ORO染色を行い、NC-およびHFD-摂食マウスのMGの脂質滴の違いを観察した。その結果、NC飼育マウスのMGでは脂質量が強いリズムを示し、脂質滴はZT12でピークに達し、ZT0で谷になった（図6I）。一方、HFD飼育マウスのMGでは、脂質量はZT18でピークに達し、ZT12で谷になった（図6I）。さらに、HFD食マウスのMG中の脂質量は、NC食マウスのMG中の脂質量よりも有意に高かった（図6J、K）。これらの結果から、HFDの介入はマウスMGにおける脂質代謝を変化させ、MGにおける脂質蓄積を引き起こすことが示唆された。
考察
我々の知る限り、本研究は、高脂肪栄養ストレスがマウスMGの概日性トランスクリプトームに特異的に影響することを示した最初の研究である。我々は、4週間の高脂肪食餌療法が、MGsの概日特性を有意に変化させることを見出した。特に、高脂肪の摂取は、バランス食マウスのMGにおいて明暗サイクルを通して生じる循環遺伝子とその濃縮された機能的シグナル伝達経路を、高脂肪食マウスの明期のみにシフトさせた。これらのデータは、短期間の高脂肪食摂取によってもたらされる栄養上の課題が、MGの概日リズムを再編成することを示唆している。
哺乳類では、概日生理学は視床下部の中心的ペースメーカーである視交叉上核（SCN）によって生成または制御されている（37, 38）。SCNは、ホルモンリズム、交感神経／副交感神経系、中核体温、摂食パターンなどの拡散可能なシグナルを通して、末梢組織細胞の分子時計を制御することにより、出力概日生理活動を生成または制御している(8)。しかし、栄養の変化（42-44）、摂食のタイミング（29, 45）、睡眠・覚醒の変化（46）など、多くの外因性因子（39-41）は、正常な概日リズムを乱し、メタボリックシンドロームや2型糖尿病など、いくつかの疾患の発生を促進する可能性がある（47, 48）。
私たちや他のチームによるこれまでの研究で、短期間のHFD（26）、高フルクトース摂取（32）、時差ボケ（15）、加齢に伴う腸内細菌異常症（14）などの介入が、マウス涙腺のリズムプロファイルを再変形させることが分かっている。同様に、フルクトースの大量摂取は、マウス角膜のトランスクリプトームとそれに関連する生理活動のリズムパターンを有意に変化させる。これらの研究と一致して、本研究は、4週間の高脂肪食レジメンが、マウスのMGに濃縮されたリズミカルなトランスクリプトームの構成とその機能的シグナル伝達経路を時空間レベルで再構築することを確認した。これらの結果は、高脂肪食による栄養チャレンジが、MGsの概日リズムを組織特異的に変化させることを示唆している。したがって、その根底にあるメカニズムのさらなる解明は、おそらく重要な意味を持つであろう。
それぞれの哺乳類細胞には、コア時計遺伝子の機構があり、ゲノム全体に何千もの経路を結合させ、フィードバック制御系を駆動することによって、24時間周期でリズミカルな振動的遺伝子発現とそれに関連する生理的活動を生み出している(49)。コア時計遺伝子は、生物時計システムの中心的なコントローラーである。利用可能なデータは、細胞のコア時計システムは比較的安定したシステムであることを示唆している。網膜視床下部路（RHT）系が妨害されなければ、コアクロック系は定常状態を維持する(50, 51)。この安定性は代謝ストレスだけでなく、老化した臓器や組織にも存在する(51-53)。同様に、高フルクトース摂取を受けた角膜(11)や高脂肪食を受けた涙腺(26)など、栄養的な挑戦を受けた眼球組織においても、同様の安定化現象が観察されている。同様に、この非同期性は栄養障害を受けた肝臓(54)や、いくつかの老化組織(51-53)にも存在する。最近、我々は、睡眠不足処置マウスにおいても、明暗周期を変化させることなく、涙腺のコアクロックが有意に変化しないことを見出したが、出力遺伝子分画は劇的に変化した(55)。これらの研究から、昼夜のサイクルを変化させなくても、コアクロックが強く安定していることがさらに確認された。しかし、前述の栄養ストレスなどで出力遺伝子が変化する原因は、これまで不明であった。最近、Deotaらは、ほとんどの組織における出力遺伝子発現のリズム性は、概日時計によってのみ駆動されているわけではないと推測した。他の要因（例えば、摂食-絶食サイクル）によって生じる全身的シグナルと内因性の時計調節シグナルが組み合わさって、末梢臓器における遺伝子発現のリズムを調節する上で支配的な役割を果たしているのかもしれない(56)。したがって、HFDがコアクロックを下流のコアクロック制御出力系から切り離すことにつながるメカニズムのさらなる探究は、HFDによって引き起こされるMGの構造と機能の病態生理学的変化に対処する上で貴重なものとなる可能性がある。
高スループットRNA-seqデータに基づくバイオインフォマティクス解析は、現在、概日リズム変化の背後にある複雑な分子メカニズムの解明に用いられる主要なツールの一つである。時系列クラスタリング法は、ビッグデータ解析に付随する時間的特徴を評価するための効果的なアプローチを提供する(57)。本研究は、脂質の過剰摂取によるMGの生理的活性の変化パターンについて、別の次元での解析を提供する。角膜（11）や涙腺（26）のような以前に研究された眼球組織と一致して、栄養チャレンジは、遺伝子組成とその濃縮シグナル伝達経路の振動の両方において、概日リズムの出力トランスクリプトームを劇的に変化させた。MGは、主に涙液の脂質層を介して涙液膜の安定性を維持する上で重要な役割を果たしている（3, 58, 59）。そこで我々は、MGsの脂質代謝関連トランスクリプトームおよび時間振動に伴う脂質滴含量に対するHFDの影響を特に分析した。予想通り、本研究は、HFDがMGの脂質代謝関連経路および脂質滴の振動に大きな影響を及ぼすことを確認した。これらのデータは、HFDによって誘発されるMGの機能障害に関する新たな知見を提供するものである。しかし、さらに正確なメカニズムについては、リピドミクス、プロテオミクス、メタボロミクスによるさらなる詳細な解析が必要であろう。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、本研究で用いたC57BL/6マウスは夜行性動物であった。マウスの睡眠覚醒サイクルはヒトのそれとは逆である(60)。従って、ヒトのMGに関するある種の事実は、注意深く解釈されなければならない。第二に、本研究は雄マウスにおけるMGのトランスクリプトーム・プロファイルの変化のみを明らかにしたものであり、雌マウスにおける更なる観察により、特に性特異的な差異に関してより多くの情報が得られる可能性がある（61, 62）。第三に、本研究で用いたC57BL/6マウスはメラトニン欠損マウスモデルであるが（63）、メラトニンはヒトの概日リズムの調節に重要な役割を果たしている（64）。したがって、ヒトで起こるすべての現象に対応できるわけではない。第四に、本論文はHFDがMGのトランスクリプトームリズムに及ぼす影響のバイオインフォマティックな解釈に焦点を当てたものであり、今後の研究では細胞および分子メカニズムにより焦点を当てることを試みる。最後に、このプロジェクトは、MGのバルク転写産物のリズム性に対するHFDの影響のみを提供する。MGの異なる細胞タイプの複雑さと、異なる振動サイクルの存在を考慮すると、将来的にシングルセルRNA-seqシーケンス技術を用いることで、この問題に対する解決策が得られるであろう（65, 66）。
結論
結論として、我々の観察結果は、HFDがMGsの概日リズムのコア時計機構よりもむしろ出力成分を変化させるという概念を支持するものであった（図7）。これらのデータは、MGの健康維持における栄養介入の重要性を強調している。コアクロックと出力成分との間のカップリング機構の喪失を探るか、あるいはそれを標的とすることで、HFDによって誘発されるMGの機能障害を改善できる可能性がある。
図7
図7. 高脂肪食がMGの周期的トランスクリプトーム・プロファイルに及ぼす影響のまとめ。高脂肪食餌療法を受けたマウスでは、光に制御された中枢時計ペースメーカー（SCN）は正常に機能し、正常な睡眠・覚醒および空腹・摂食リズムを発現する。しかし、高脂肪食は、MGの正常な概日リズムのトランスクリプトーム・プロファイルと脂質滴振動を変化させる。
データ利用声明
本研究で発表された原著論文は一般に公開されている。このデータはhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA924579。
倫理声明
本研究におけるすべての動物実験は、河南省人民病院の動物倫理委員会の承認を受け、ARVO Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Researchに記載されているガイドラインに従った。
著者の貢献
ZLとSZが研究を計画し、原稿を執筆した。SZ、ZL、JL、HS、DH、DQはサンプルの収集と準備を行った。SZはXP、DL、SHの協力を得てRNA-seqとバイオインフォマティクス解析を行った。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（82171014および81770962、ZL）、河南省眼科研究所/河南眼科病院基礎科学プロジェクト（21JCZD001、ZL）、河南省眼科研究所/河南眼科病院青少年基礎科学プロジェクト（21JCQN004、 SZ）、河南省人民病院博士研究発展基金（ZC20200229、SZ）、河南省医療科学技術研究共同建設プロジェクト（LHGJ20210079、SZ）。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2023.1146916/full#supplementary-material に掲載されている。
補足図1｜NCおよびHFD飼育マウスのMGにおける共有（up）および固有（down）リズム遺伝子の振幅（AMP）。nsは有意ではない。
補足表1｜図2BのNC-マウス（1,397）とHFD-fedマウス（1,722）の全MG遺伝子のサイクリング遺伝子（JTK_adj P < 0.05）。
補足表2｜図2CのNC-fedマウス（1,059）、HFD-fedマウス（1,384）、および2群間で共有されるサイクリング遺伝子（JTK_adj P < 0.05）。
補足表3｜図4のNC-およびHFD-fed MGの各時系列クラスターにおけるリズム遺伝子。
補足表4｜図6AのNC-およびHFD-fed MGの脂質関連DEGの発現レベル。
脚注
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
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受理された： 2023年1月18日；受理：2023年2月28日；
発行：2023年3月16日
編集：Abraham Wall-Medrano
アブラハム・ウォール・メドラノ、シウダー・フアレス自治大学、メキシコ
査読者
Xiaoye Duan, 首都医科大学宣武病院, 中国
Amruta Naik、ペンシルバニア大学、アメリカ
Copyright © 2023 Zou, Liu, Si, Huang, Qi, Pei, Lu, Huang and Li. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
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