IgDクラススイッチングは微生物によって開始され、マウスの粘膜関連リンパ組織に限定される

IgDクラススイッチングは微生物によって開始され、マウスの粘膜関連リンパ組織に限定される
Jin Huk Choi, Kuan-wen Wang, Duanwu Zhang, +15, and Bruce Beutler Bruce.Beutler@UTSouthwestern.eduAuthors Info & Affiliations
Bruce Beutler寄稿、2016年12月28日（2016年12月11日送付、David NemazeeとDavid J. Rawlingsによる査読あり）。
2017年1月30日付
114 (7) e1196-e1204
https://doi.org/10.1073/pnas.1621258114
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意義
免疫グロブリンには、それぞれ異なるエフェクター機能を発揮するいくつかの型（アイソタイプ）が存在する。B細胞は、抗体応答の過程で、クラススイッチ組換え（CSR）により、免疫グロブリンのアイソタイプを切り替えることができる。IgDへの切り替えは、他のアイソタイプへの切り替えと比較して稀であり、その制御は十分に理解されていない。我々は、DNA損傷応答タンパク質53BP1を欠損したマウスが、他の免疫グロブリンクラスが欠損しているにもかかわらず、高IgD症候群を示すことを報告する。これらのマウスの研究から、53BP1変異マウスおよび野生型マウスにおけるIgDに対するCSRは、無傷のマイクロバイオームとToll様受容体シグナルに依存し、解剖学的に粘膜関連リンパ組織のB細胞に限定されていることを発見した。
概要
クラススイッチ組換え（CSR）は、抗体のアイソタイプを変化させ、抗体のエフェクター機能を多様化させる。IgDのクラススイッチ組み換えは稀な現象であり、その制御は十分に理解されていない。我々は、DNA損傷応答タンパク質である53BP1を欠損させると、粘膜関連リンパ組織のB細胞でのみIgD CSRが増加し、年齢依存的に分泌型IgDの過剰産生を引き起こすことを報告した。IgDの過剰生産は、活性化によって誘導されるシチジンデアミナーゼ、造血器MyD88の発現、および循環するIgD（IgMではなく）に対して反応性を示す無傷の微生物群に依存することが明らかになった。IgDの再結合は、非相同末端結合と相同組換えの両方の経路を経由して行われた。微生物群に依存するIgD CSRは、WTマウスの鼻関連リンパ組織でも検出された。これらの結果は、WTマウスに存在し、53BP1欠損マウスで亢進する、微生物がToll様受容体を介してIgD CSRを誘発するシグナル伝達経路を特定するものである。
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IgMとIgDは、単一の交互スプライシング転写産物に由来し、抗原特異性を共有し、抗原を持たない成熟B細胞によって同時に発現される。抗原による活性化後、B細胞はDNA編集酵素とDNA二本鎖切断（DSB）修復タンパク質を介した古典的クラススイッチ組み換え（cCSR）を行い、Igh CμまたはδエキソンがCγ、CεまたはCαに置換されてIgアイソタイプを変化させる。これは、Cμの前のスイッチ領域（Sμ）と、σδとして知られるCδの5′の非正規スイッチ様領域を標的とした組換えによって起こるもので、頻度は少ないが、活性化B細胞はIgDへのクラススイッチングを行う。
IgDのCSRの制御はcCSRのそれとは明らかに異なっており（1）、いくつかのプロセスにおいてIgMと機能的に冗長であるIgDの生物学的重要性は十分に解明されていない（2, 3）。本発表では、DNA損傷応答タンパク質p53-binding protein 1（53BP1）の欠損による高IgD症候群について検討し、IgD CSRが特定の解剖学的部位に限局していること、マイクロバイオームからのTLR活性化シグナルに依存するなど、これまで知られていなかった基本特性を明らかにしたことを報告する。
研究成果
Trp53bp1変異によるB細胞内在性年齢依存性高IgD症候群。
リンパ球形成に関与する遺伝子を同定するために、N-ethyl-N-nitrosourea（ENU）誘発変異を有するマウスで前方遺伝子スクリーニングを実施した。19,913遺伝子のコード領域またはスプライスジャンクションに90,151の非同義語変異を有する1,725匹のG1孫マウスから生まれた49,825匹のG3マウスをスクリーニングした。16,061の遺伝子の66,681の変異がホモ接合状態で3回以上検査され、これらには5,300の遺伝子の一つ以上の推定ヌル対立遺伝子が含まれていた。発見された表現型のうち、3つの祖先の血統のうち2つの血統のマウスは、末梢血B細胞における表面IgDの発現が野生型（WT）マウスと比較して低かった（図1 A、B、挿入図）。この表現型はlentilと名付けられ、劣性遺伝する。
図1.

ENU誘発Trp53bp1変異マウスによる加齢依存性高IgD症候群。(A) WT C57BL/6Jマウス（WT）、または単一のENU変異誘発雄マウスの3世代（G3）子孫の血統で、Trp53bp1の遺伝子型がREF (+/+)、HET (+/lentil) またはVAR (lentil/lentil) であるものの末梢血B細胞における表面IgD免疫染色度 (IgD MFI)：MFI (MFP/IgD-FI)。データは、実験時の年齢をマッチさせたC57BL/6マウスの平均IgD MFIに正規化した。(B) Manhattan plot. -発症した血統の3つのG1ファウンダーで同定された変異の染色体位置に対する対数10P値のプロット。 挿入）ホモ接合体レンズ豆マウスとWTリターメイトの末梢血B細胞によるIgD発現のフローサイトメトリー解析の代表例。(C）CRISPR/Cas9システムにより作製した12週齢のTrp53bp1-/-またはPla2g4b-/-マウスの末梢血B細胞におけるIgDのMFI。(D）示した年齢と遺伝子型のマウスからの末梢血B細胞上のIgD MFI。細胞は血清の存在下で染色した。(E）12週齢のTrp53bp1-/-およびWT同腹子の末梢血B細胞におけるIgD MFI；細胞は、血清存在下または非存在下で染色した。(F) 血清存在下での免疫染色後のWT末梢血B細胞におけるIgDのMFIを示した。(挿入図）各血清条件下でのIgD発現の代表的なフローサイトメトリー解析。(G) 示した年齢と遺伝子型のマウスにおける血清中のIgD濃度。AおよびC-Gにおいて、データポイントは個々のマウスを表す。C-Gにおいて、P値はスチューデントのt検定により決定され、他に示されない限り、標識群とWTとの間の差に対応する。結果は、n = 5-23マウス/遺伝子型または系統の2〜3回の独立した実験の代表的なものであり、エラーバーはSDを示す。
スーパーペディグリーマッピング（同一または非同一の対立遺伝子変異を持つ複数の血統を組み合わせて遺伝子型と表現型の関連を解析する手法）により、レンズ豆の表現型はDNA損傷応答タンパク質である形質転換関連53BP1をコードするTrp53bp1の変異と相関した（Fig. 1B）。罹患した血統に存在するレンズ豆の変異は、エクソン8のスプライシングに障害があり、フレームシフトと早期終結をもたらすと予測された。ホモ接合型レンズ豆変異体では、53BP1タンパク質の発現が著しく低下していた（図S1）。ホスホリパーゼA2、グループIVB（Pla2g4b）およびGタンパク質共役型受容体176（Gpr176）の点突然変異も、レンズ豆の表現型のマッピングに貢献した（図1B）。Pla2gb4ではなく、Trp53bp1のCRISPR/Cas9標的ヌルアレルを発現するマウスは、レンズ豆の表現型を再現し、Trp53bp1変異が原因であることが確認された（図1C）。
図S1.

レンズ豆の変異の性質。(A) Uniprotの注釈に基づく1,969-aaのマウス53BP1タンパク質の図。レンズ豆のA317S変異体の位置は赤で示されている。KBD、キネトコア結合ドメイン；OLIGO、オリゴマー化ドメイン；GAR、グリシン／アルギニンリッチ領域；UDR、ユビキチン依存性リクルートメントモチーフ；NLS、核局在シグナル；BRCT、BRCA1 Cターミナス。phosphoinositide 3-kinase-like kinase (PIKK) S/TQ リン酸化部位（Ser6, Ser25, Ser29, Ser166, Ser176/Ser178, Thr302, Ser452, Ser831, Ser1219）、ユビキチン化部位（Lys1523）は標識されている。(B) エクソン6-9にまたがるプライマーを用いたC57BL/6Jおよびレンコン血液中のTrp53bp1スプライシングのRT-PCR分析。レンズ豆の血液から増幅されたcDNAの配列分析では、167bpのエクソン8内に106bpの欠失があることが示された（ENSMUST00000110648）。(C)予測される切断型変異53BP1lentilタンパク質の図。エクソン8内の106bpの欠失は、エクソン11に早発停止コドンを作るフレームシフトを引き起こすと予測される（285位以降の異常なアミノ酸、362位以降のトランケーション）。(D）レンズ豆、Trp53bp1-/-、およびC57BL6Jマウスから分離したB細胞における53BP1発現を示すイムノブロット。
Trp53bp1-/-マウスの末梢B細胞における表面IgD発現の減少は、年齢依存性が強く、6週齢以降に徐々に起こった(Fig. 1D)。Trp53bp1-/-マウスの骨髄（BM）、脾臓、腹腔内のB細胞は、WT同腹子と比較して表面IgDおよびIgMの発現に有意差は認められなかった（図S2 A-C）。これらの知見は、Trp53bp1の異なるヌル対立遺伝子を持つマウスの脾臓およびリンパ節のB細胞における正常なIgMおよびIgD発現という以前の報告と一致する（5）。特に、血清存在下で免疫染色を行った場合にのみ、Trp53bp-/-末梢血B細胞におけるIgD免疫染色の平均蛍光強度（MFI）の低下が観察された（Fig. さらに、WT、Trp53bp1-/-;Rag2-/-、Trp53bp1-/-;Ighm-/-マウスの血清存在下で染色したWT B細胞ではIgD MFIの低下が検出されたが、WT、Trp53bp1-/-、およびIghm-/-マウスの血清では検出されなかった（図1F）。これらの結果は、Trp53bp1欠損B細胞から分泌される可溶性因子が、B細胞上のIgD発現を低下させることを示唆している。
図S2.

Trp53bp1欠損は、末梢血B細胞以外のB細胞サブセットにおける表面IgDおよびIgMの発現に影響を及ぼさない。12週齢のTrp53bp1+/-マウス、Trp53bp1-/-マウスおよびWT同腹子から分離したBM、脾臓および腹腔（PC）のB細胞サブセットにおけるIgD MFI（A）およびIgM MFI（B）。B細胞の同定には、以下の表面マーカーを使用した。プレB (B220+IgD-IgM-), 未熟B (B220+IgD-IgM+), プロB (B220+IgDmedIgM+), 成熟再循環B (B220+IgD+IgM+), T1 (CD19+B220+CD93+IgM+CD23-), T2 (CD19+B220+CD93+IgM+CD23+)．T3（CD19+B220+CD93+IgMlowCD23+）、辺縁帯B（CD19+CD21highCD23low）、濾胞B（CD19+CD21lowCD23high）、B1（CD19+B220low）、B2（CD19+B220high）の細胞が存在する。(C) 表示された年齢と遺伝子型のマウスの末梢血B細胞におけるIgM MFI。Trp53bp1+/-、Trp53bp1-/-、WTの同腹子の間に有意差は認められなかった(A-C)。(D) 12週齢のTrp53bp1-/-マウスとWT同腹子のIgM, IgG1, IgG2b, IgA, IgEの血清中濃度。データポイントは個々のマウスを表す。P値はStudentのt検定により決定した。結果は、少なくともn = 3マウス/遺伝子型による3回以上の独立した実験の代表的なものである。エラーバーはSDを示す。
これまでの報告と同様に、Trp53bp1欠損マウスはIgh cCSRを欠損していることが確認された（図S2D）。驚くべきことに、Trp53bp1-/-マウスは血清IgDの年齢依存的な増加を示した（図1G）。この表現型は混合BMキメラでも確認された(図S3)。これらの結果から、Trp53bp1-/-の末梢血B細胞におけるIgDのMFIが明らかに低いことを再解釈することになった。我々は、年齢による末梢血B細胞上のIgD MFIの低下は、過剰な血清IgDによる蛍光標識IgD抗体の中和に対応すると結論付けた。したがって、Trp53bp1-/-マウスは高IgD表現型である。
図S3.

BMキメラにおけるhyper-IgD症候群の再現。(A）致死的放射線照射（WTは15 Gy、Trp53bp1-/-は9 Gy）から救済されたBMキメラの末梢血B細胞上のIgD MFI。細胞は血清存在下で染色した。(B）BM移植後14週目に測定した混合BMキメラの末梢血B細胞上のIgD MFI。黒丸はCD45.1+WT細胞上のIgD MFI、白丸はCD45.2+Trp53bp1-/-細胞上のIgD MFIを表す。C）混合BMキメラマウスにおけるWT（CD45.1+）またはTrp53bp1-/-（CD45.2+）由来のB細胞上の表面IgD発現の代表的フローサイトメトリー解析。実験に使用したすべてのマウスは、少なくとも95％の造血生着を示した。(D）BM移植後14週目のキメラマウスにおける血清IgD濃度。データポイントは個々のマウスを表す。P値はStudentのt検定により決定した。Aにおいて、P値は、印をつけたグループとWT BMのWTレシピエントとの間の差に対応する。結果は、n = 3-5マウス/群での2つの独立した実験の代表である。エラーバーはSDを示す。
Trp53bp1-/-マウスにおける活性型IgD CSRは粘膜関連リンパ組織で発生する。
メバロネートキナーゼ（MvK）またはIgH 3′調節領域（3′RR）欠損（1, 6-8）を除いて、高IgD症候群の他の分子的原因は現在までに確立されていない。Trp53bp1-/-マウスで観察された高IgDの表現型は、Tnfsf13b、Cd40、Dock8、Aicda、Atmのヌル対立遺伝子ホモ接合体のマウスなど他の免疫不全状態では見られなかった（図2 AおよびB）。そこで、53BP1がIgD産生を制御する特別な機能を理解することを目指した。
図2.

MALTのTrp53bp1欠損B細胞は、IgD CSRを受ける。(A、C、F）Tnfsf13b、Cd40、Dock8のENU誘発変異をホモ接合で持つマウス、またはAicda、Atm、Trp53bp1、Trp53bp1;Aicda、Trp53bp1;Atmの変異を欠損したマウスの末梢血B細胞上のIgD MFI。 REF、WT対立遺伝子ホモ接合；VAR、変異型対立遺伝子ホモ接合。細胞は血清の存在下で染色した。(B, D, G) 指定された系統または遺伝子型の14週齢のマウスにおける血清IgD濃度。結果は2つの独立した実験の代表値であり、n = 2-13 マウス/遺伝子型または系統。(E）14週齢のTrp53bp1-/-（KO）、Trp53bp1-/-;Aicda-/-（DKO）およびWT同腹子のBM、脾臓、MLN、気管支肺洗浄液（BAL）、NALT（MALTのサブタイプ）およびSMLNからのB細胞におけるSμ-δ結合のサザンブロット解析。結果は、指定された遺伝子型のマウスからプールされたサンプルを用いた3回の独立した実験の代表的なものである。
分泌型IgDは、CµおよびCδエクソンを含むプレmRNAの代替スプライシング、または活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）を必要とするSµ-σδ CSRから産生される（9）。Iμ-CδおよびIμ-Cμ転写物の定量的RT-PCR分析により、Trp53bp1-/-B細胞ではIμ-Cδ転写物を生成する過剰な代替スプライシングが起こっていないことが検証された（図S4 AおよびB）。Trp53bp1-/-B細胞における高IgD表現型がSμ-σδCSRイベントの増加と関連しているかどうかを調べるために、CRISPR/Cas9システムを用いてTrp53bp1-/-;Aicda-/-マウスを作成した。AIDの欠損はTrp53bp1-/-マウスの高IgD表現型を完全に抑制した（図2 CおよびD）。
図S4.

Trp53bp1-/-マウスのB細胞における正常なIμ-Cδおよび膜Cμの転写レベル、およびサザンブロット分析によるSμ-σδ接合部の検出の概略図。(AおよびB）Trp53bp1-/-およびWT同腹子のBM、脾臓および末梢血から分離したB細胞において、定量RT-PCRにより測定したIμ-Cδ（分泌型）転写物（A）およびIμ-Cμ（膜型Cμ）転写物の相対存在量（B）。赤線はIμ-CδおよびIμ-Cμ mRNAの平均±SEMレベル（Pax5で正規化）を、任意の単位で表したものである。データポイントは個々のマウスを表す。P値はStudentのt検定を用いて決定した。結果は、n＝6〜9マウス／遺伝子型による3つの独立した実験の代表である。(C) Sμ-σδ CSR前後のIghmエクソン構造の部分図。AID開始のSμ-σδCSRイベントは、以前に記載したように、ネスティッドタッチダウンPCRプロトコルを用いて検出した(1, 7)。ゲノムDNAは、様々な組織のB細胞から抽出し、PCR増幅し、そして5′Cδプローブとハイブリダイゼーションさせた。可変サイズ（0.5-2kb）のSμ-σδ接合は、今回の実験プロトコールで予想されたものである。矢印はPCR反応のためのプライマー結合部位を示す。プローブ結合部位は赤で強調表示されている。
我々は、IgD CSRを受けているB細胞の局在を決定するために、常在菌に接触する粘膜に関連したものを含む一次および二次リンパ組織からB細胞を分離し、5′Cδプローブを用いてSμ-σδ接合部のサザンブロット分析を行った（図S4C）。その結果、粘膜関連リンパ組織（MALT）のサブタイプである鼻関連リンパ組織（NALT）、密着した顎下リンパ節（SMLN）、および腸関連リンパ組織（MALTの別のサブタイプ）に近接した腸間膜リンパ節（MLN）に存在するTrp53bp1-/-B細胞で、広範囲なS μ-σδ CSRが生じていることがわかった（Fig.2E）。2E). この活発なSμ-σδCSRは、Trp53bp1-/-;Aicda-/-マウスで損なわれていた（図2E）。これらのデータは、53BP1欠損によりcCSRが失われると同時に、解剖学的に定義された部位においてAID依存性のµ-σδCSRが増加し、cCSRの損失を補って余りあるものであることを示している。
53BP1がない場合、Igh遺伝子座のAIDによるDNA損傷は、細胞周期のG1期ではATM依存の代替非相同末端接合（A-NHEJ; canonical NHEJによって抑制）により、S-G2/M期では相同組み換え（HR）により修復される(10-13)。HRにおける広範なDNA鋳型切除は、ATM活性を抑制し、A-NHEJを介した染色体転座の形成を抑制する(14)。高IgDの表現型の発現に必要なDSB修復経路を知るために、我々はTrp53bp1-/-;Atm-/-マウスを作製した。ATM欠損により、Trp53bp1-/-マウスの血清IgD値は部分的に抑制された（図2 FおよびG）。
ヒト呼吸器粘膜B細胞におけるSμ-σδCSRは、IgD産生形質芽細胞の生成をもたらし、呼吸器細菌に反応するIgDを分泌する(9)。我々は、Trp53bp1-/-マウスの腸粘膜B細胞が産生する分泌型IgDは、腸内細菌叢に由来する抗原を標的としているのではないかと仮定している。フローサイトメトリー法により、IgMやIgDを産生しないIghm-/-マウスから分離した腸内細菌と、Rag2-/-マウスと同レベルのIgAに対するTrp53bp1-/-マウス由来の血清IgDの結合を測定した。Trp53bp1-/-B細胞が産生する分泌型IgDは腸内細菌を認識した（図3A）。一方、WTあるいはTrp53bp1-/-マウスの分泌型IgMは腸内細菌に結合することができなかった。一方、Trp53bp1-/-マウスやWTマウスの分泌型IgMは腸内細菌に結合しなかったが、Trp53bp1-/-マウスの分泌型IgAも腸内細菌に結合した。Ighm-/-マウス，Trp53bp1-/-マウス，WTマウスの血清で培養するとIgD+菌は検出されなかったので，染色はIgDに特異的であった．In vivoでは，WT，Ighm-/-，Trp53bp1-/-，Trp53bp1-/-;Ighm-/-マウスでIgD結合大腸菌量は同等だったが，WT，Ighm-/-，Trp53bp1-/-マウスでIgDコート小腸菌がより多く検出された（Fig. 3B）．一方、Trp53bp1-/-マウスのIgA被覆腸内細菌はWT同腹子に対して有意に減少していた（図3C）。これらのデータは、Trp53bp1-/-マウスの血清IgDが腸内細菌に反応することを示し、常在菌に対するIgD反応が小腸で顕著であることを示唆している。
図3.

Trp53bp1欠損B細胞が産生するIgDは腸内細菌を認識する。(A) 血清中のIgD、IgM、IgAと腸内細菌の結合。12-14週齢のTrp53bp1-/-, Ighm-/-, Trp53bp1-/-;Ighm-/-, WT同腹子の血清をIghm-/-マウスの腸から分離した細菌とin vitroでインキュベーションした。結合していない抗体は広範な洗浄によって除去し、IgD結合細菌はフローサイトメトリーによって染色し測定した。(BおよびC）12～14週齢の標記マウス系統のIgD結合菌（B）およびIgA結合菌（C）の腸内細菌をフローサイトメトリーにより解析した。Trp53bp1-/-マウスの血清IgA濃度はWTマウスより低いが、Ighm-/-マウスの血清IgA濃度より高い。データポイントは個々のマウスを表す。P値はStudent's t testにより決定した。結果は2回の独立した実験の代表であり、n = 4-11マウス/遺伝子型または系統である。エラーバーはSDを示す。
腸内細菌叢に由来するシグナルはIgD産生を制御する。
Sµ-σδ CSRは、T細胞依存性およびT細胞非依存性（TI）免疫応答経路の両方によって刺激される（9）。我々は、WT;IghB1-8+あるいはTrp53bp1-/-;IghB1-8+マウスを用いて、免疫に対する抗体反応を測定した。IghB1-8+トランスジェニックマウスは、内在性の3′Igh-D要素（DQ52）とIgh-J要素の代わりに4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl（NP）ハプテン結合抗体由来の組み換え可変領域を発現し（15）、NP抗原に対して高い親和性の抗体を生産し、その結果NP特異的に強い抗体応答を起こすことができる。WT;IghB1-8+ または Trp53bp1-/-;IghB1-8+ マウスにTI型抗原であるリポポリサッカライド (NP-LPS) と結合したNPハプテンを免疫すると、Trp53bp1-/-の血清中に同量のNP特異的IgM（CSR不要）、NP特異的IgG（cCSR必須） が誘導されることが判明した。 IghB1-8+ マウスでは、予想通り、免疫後14日目にはWT;IghB1-8+マウスの血清中と比較して、NP特異的IgMは同程度の量になり、NP特異的IgGは減少した（Fig. 4A). しかし、血清中のNP特異的IgDは、Trp53bp1-/-;IghB1-8+マウスでWT;IghB1-8+マウスに比べ上昇した。このことから、Trp53bp1-/-マウスにおけるIgDの自然産生に関しては、微生物叢の成分が免疫と同様の方法でドライバーとして働いている可能性が考えられた。Trp53bp1-/-マウスは、病原体のないバリア施設で意図的に外来抗原に曝露されることはなかったが、潜伏期間（出生から4-6週齢まで）を経て検出可能なレベルの分泌型IgDを産生するようになり、その間IgD産生量の変化は検出されなかった。以上のことから、潜伏期における内因性刺激または環境抗原への曝露が、MALTのB細胞におけるSμ-σδCSRを駆動する可能性が浮上した。そこで、Trp53bp1-/-マウスにおいて、腸内細菌叢からの信号がSμ-σδCSRに寄与しているかどうかを検証した。広域抗生物質による腸内細菌叢の枯渇（図4B）は、Trp53bp1-/-マウスの血清IgD濃度を低下させた（図4C）。
図4.

Trp53bp1-/-マウスのIgD産生亢進には微生物叢が必要である。(A) NP-LPS免疫後14日目に測定した血清NP特異的IgG、IgM、IgD力価。IghB1-8+トランスジェニックマウスは、内因性3′Igh-D要素（DQ52）およびIgh-J要素（15）の代わりにNP結合抗体由来の組換え可変領域を発現している。(BおよびE）従来型飼育（CNV）マウス、広域抗生物質処理（Abx）マウス、GF-Rag1-/-レシピエントから新鮮に分離した便サンプル中の細菌数。サンプルは希釈し、BHI血液寒天培地プレートにプレーティングした。(C) 10週齢のCNVマウスおよびAbx投与マウスの血清IgD濃度 (D）微生物叢のコロニー形成前後のCNVおよびGF-Rag1-/-レシピエントにおける血清IgD濃度。GF-Rag1-/-レシピエントは、BM移植後8週目に正常な腸内細菌でコロニー形成された。(FおよびG）3つの独立した産仔からTrp53bp1+/-マウス、Trp53bp1-/-マウスおよびWT産仔の小腸から採取した糞便試料を16S rRNAメタゲノム配列決定に供した。(F)常在菌の相対的存在量の倍率のヒートマップ。遺伝子型によって異なる上位20の常在菌属を示した。(G)糞便微生物叢の主座標分析プロット。A-Eにおいて、P値はスチューデントのt検定により決定した。結果は、n = 3-11マウス/遺伝子型または系統の2つの独立した実験の代表的なものである。エラーバーはSDを示す。
次に、微生物学的に無菌で腸内細菌叢を持たない無菌（GF）マウスを用いた。WTまたはTrp53bp1-/-BMを従来型飼育（CNV）またはGF-Rag1-/-マウスに養子縁組した。予想通り、Trp53bp1-/-BMを移植したCNV.Rag1-/-マウスは、BM移植後8週目に早くも血清IgDの上昇を示し、その表現型は時間の経過とともに顕著になった（Fig. 4D）。一方、Trp53bp1-/-BMを移植されたGF-Rag1-/-マウスは、WT BMで再構成されたCNV.Rag1-/-マウスと同程度の血清IgDレベルを示した（Fig. 4D）。これらのGF-Rag1-/-レシピエントをGF条件下で8週間飼育した後、正常な腸内細菌叢でコロニー形成した（図4E）。Trp53bp1-/-BMを移植した従来型のGF-Rag1-/-レシピエントは、WT BMを再構成した従来型のGF-Rag1-/-レシピエントに比べて、血清IgDレベルの有意な上昇を示した(図4D)。以上より、gnotobiotic技術を用いたデータは、腸内細菌叢からのシグナルがTrp53bp1-/-マウスのSμ-σδ CSRを駆動することを示している。
次に、16S rRNAメタゲノム解析により、Trp53bp1-/-マウスにおけるIgD産生の上昇が腸内細菌の異常と関連しているかどうかを検討した。Trp53bp1-/-マウスの腸内常在菌の生態は、生涯同居させたTrp53bp1+/-またはWT同胞と顕著な差はなかった（図4Fおよび図S5A）。微生物群集全体の構造を可視化するために行った主座標分析では、WT、Trp53bp1+/-、およびTrp53bp1-/-マウスで同様の傾向が見られた（図4G、図S5B）。これらの結果は、腸内細菌群の変化がTrp53bp1-/-マウスのIgD産生の増加を引き起こさないことを示唆している。
図S5.

Trp53bp1-/-マウスの大腸における微生物叢の組成。Trp53bp1+/-、Trp53bp1-/-、WTの3匹の独立した同腹子の大腸から分離した糞便サンプルは、16S rRNAメタゲノム配列決定に供された。(A)常在菌の相対的存在量の差のヒートマップ。遺伝子型によって異なる上位18の常在菌属を示した。(B)糞便微生物相の主座標分析プロット。
微生物はSμ-σδCSRを駆動するのに重要であるため、我々は微生物叢主導のシグナルが高IgD症候群を引き起こす分子機構を調べた。Trp53bp1-/-ドナーのBMで再構成したTlr4Lps3/Lps3およびTicam1Lps2/Lps2;Irak4otiose/otioseホストではB細胞IgD MFIも血清IgDレベルもWTレベルまで回復していないことから、造血系外のTLRシグナルはTrp53bp1-/-B細胞によるIgD産生の上昇に必要でないことが分かった（図5 AとB）。一方、Trp53bp1-/-バックグラウンドでCRISPR/Cas9ターゲティングにより誘導されたMyD88のヌル変異は、B細胞のIgD MFIが検出可能になるまでの潜伏期間を延長し、IgD MFIの低下の大きさを減少させ（図5C）、Trp53bp1-/-コントロールマウスで認められた血清IgD上昇を一部抑止した（図5D）。Ticam1の変異はこれらのパラメータに影響を与えなかった（図5CおよびD）。これらのデータは、53BP1欠損による高IgD症候群は、造血器内在性のMyD88発現に部分的に依存していることを示す。
図5.

Trp53bp1-/-B細胞によるIgD産生には、造血器内在性のMyD88の発現が必要である。(A) 致死的放射線照射から救済されたBMキメラの末梢血B細胞におけるIgD MFI。WT、Tlr4lps3/lps3、Ticam1lps2/lps2;Irak4otiose/otiose変異体レシピエントの再構成にWTまたはTrp53bp1-/-BMが使われた。キメラ性はコンジェニックCD45マーカーを用いて評価した。実験に使用したすべてのマウスは、少なくとも95％の造血系移植を示した。細胞は血清存在下で染色した。(B）BM移植後14週目の標記キメラマウスにおける血清IgD濃度。(C) 年齢および遺伝子型を示したマウスの末梢血B細胞におけるIgD MFI。細胞は血清存在下で染色した。(D) 示した遺伝子型の10週齢のマウスの血清IgD濃度。P値はスチューデントのt検定により決定され、所定の時点における標識グループとWTレシピエントとの間の差に対応する。Aでは、P値のアスタリスクは、緑、黄、赤のデータポイントに同様に適用される。Cでは、P値の黒いアスタリスクは、白とオレンジのデータポイントに同様に適用される。データポイントは個々のマウスを表す。結果は、n = 3-10マウス/遺伝子型または系統の2つの独立した実験の代表的なものである。エラーバーはSDを示す。
微生物相は、WT NALT B細胞におけるIgD産生を制御する。
ヒトの呼吸器粘膜に存在するB細胞は、IgD+IgM-プラズマブラストを生成し、IgDを循環系に分泌することから(9)、我々はWTマウスのNALTにおけるB細胞に注目した。具体的には、WTマウスのNALTにおいて、通常の環境下でSμ-σδCSRが起こるかどうか、また、それが微生物叢に依存するかどうかを明らかにしたいと願った。その結果、NALT B細胞は検出可能なSμ-σδ接合体を形成し（図2E）、WTマウスの血液中で測定された血清IgD力価（図1-5）は、Trp53bp1-/-マウスに比べ低いレベルではあったが、おそらくその原因であることがわかった。
我々は、WT NALTのSμ-σδCSRとB細胞によるIgD産生における微生物叢の必要性を検討した。GF条件下で予想されるように（16, 17）、GF-WTマウスではCNV.WTマウスと比較して血清IgEが上昇し、53BP1欠損マウスではcCSRがないことと一致して、この上昇を抑制した（図S6）。CNV.WTマウスとGF-WTマウスのNALTから分離したB細胞のフローサイトメトリー解析では、B220とCD19の発現が低いIgD+IgM-細胞の頻度がGF-WTマウスに比べ、有意に高いことが示された（図6 AおよびB）（図6DおよびE）。また、CNV.WTマウスではGF-WTマウスに対して血清IgDが有意に増加していることを確認した（図6C）。Sµ-σδ 接合をサザンブロットで解析したところ、GF-WTマウスのNALTのB細胞には検出可能なレベルのSµ-σδ CSRが生じなかった（図6F）。しかし、WTまたはTrp53bp1-/- BMを移植した従来型GF-Rag1-/-レシピエント（ex-GF-Rag1-/-）はNALTのB細胞でSµ-σδCSRが見られた（図6F）。このように、WTマウスのNALTにおけるIgD産生B細胞の発生は、微生物叢に依存していることがわかった。また、Trp53bp1-/-BMを移植したex-GF-Rag1-/-マウスはMLNとSMLNのB細胞にSμ-σδ CSRを示したが、WT BMを移植したマウスでは見られなかった(Fig. 6F)。また、従来から飼育されている生殖細胞系Trp53bp1-/-マウスのMLNとSMLNのB細胞は、WTマウスではなく、Sμ-σδCSRを示した（図2E）。
図6.

IgD分泌B細胞発生における微生物叢の必要性。(A) CNVおよびGF C57BL/6JマウスのNALTにおけるIgD+IgM-細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。細胞はまずIgM-細胞、次にIgD+細胞でゲーティングされた。各ゲートにおける細胞のパーセンテージが示されている。(B）NALTから分離したIgD+IgM- B細胞の割合。(C) 12週齢のマウスにおける血清IgD濃度。(DおよびE） CNVおよびGF WTマウスのNALTからのIgD+IgM- B細胞におけるB220、CD19、CD23、CD138、BAFF-RおよびTACI発現のフローサイトメトリー解析。代表的なFACSプロットを(D)に示す。(F) GF-Rag1-/-マウスにTrp53bp1-/-またはWT BMを移植し、8週後に正常腸内細菌をコロニー形成し、その後5ヶ月間従来の方法で飼育した（元GF-Rag1-/- + 表示BM)。指定されたマウスのMLN、NALT、およびSMLNからのB細胞におけるSμ-σδ接合のサザンブロット分析。データポイントは個々のマウスを表す（B、C、E）。P値はスチューデントのt検定により決定した。結果は、n = 3-14マウス/遺伝子型または系統の3回の独立した実験の代表的なものである。エラーバーはSEMを示す。
図S6.

GF-WTマウスおよびキメラGF-Rag1-/-レシピエントにおけるコンベンショナル化前後の血清IgE濃度。(A）CNVマウスおよびGF WTマウスの血清IgE濃度。(B）BMキメラ（CNV、GF、またはコンベンショナル化後のGFマウス）の血清IgE濃度。GF-Rag1-/-マウスにTrp53bp1-/-またはWT BMを移植し、8週後に正常腸内細菌をコロニー形成させた。その後、5ヶ月間、従来の方法で飼育した（元GF-Rag1-/-＋表示BM）。P値はスチューデントのt検定により決定した。エラーバーはSEMを示す。
考察
我々の発見は、これまで認識されていなかったSµ-σδCSRを制御する経路の存在を証明するものである。53BP1欠損マウスにおけるこの経路の過活性化は、通常cCSRによって産生される抗体アイソタイプの欠如に対する代償反応であり、したがって保護効果をもたらす可能性がある。cCSR (5, 18) とは異なり、Sµ-σδCSRは53BP1がなくても機能する。これはおそらく53BP1が短距離DNA末端結合に必要でないためと考えられる (11, 12)。53BP1は、cCSRの際にDNA末端切除を阻害し、それによってNHEJを促進することが知られている。逆に、53BP1欠損状態では、HRによるスイッチ内組み換えが有利になる (13, 19)。53BP1欠損状態およびcCSRを欠く他の変異マウスにおけるIgD CSRの機構的な推進力は、まだわかっていない。我々は、53BP1欠損と3′RR欠損の共通点は、DSB末端の適切なシナプスをサポートしないことであり（11、12、20）、これはHRにつながるDNA末端切除を可能にするかもしれないことに気がついた。また、もう一つのDNA末端切除の抑制因子であるH2AXの欠損は、機構的に類似した高IgD表現型になる可能性がある(21, 22)。
我々のデータは、53BP1欠損B細胞におけるIgD CSRの増加には、A-NHEJとHR経路の両方が貢献していることを示唆している。このことは、A-NHEJが依存しているATMに対するHRの過程で生じるDNA末端切除の既知の負の制御作用と一致する。重要なことは、短距離のスイッチ間Sμ-σδCSRが、HRによって強固にサポートされることを立証したことである。
Sµ-σδ CSRが常在菌の刺激に応答して活性化することを明らかにした。Sµ-σδ CSRはマウスMLNやヒト扁桃のB細胞で観察され、WTマウスではMALTに、53BP1欠損マウスではNALTとMLN/SMLNに限定されているという我々の観察と一致している。NALTに比べMLN/SMLNでは微生物由来の抗原が少ないため、WTマウスでは検出可能なレベル以下の数のIgD CSR事象が発生し、同じ数の抗原によって引き起こされる過度のIgD CSRが、Trp53bp1-/-マウスでは検出可能レベルのS μ-σδ 接合になると思われる。重要なことは、Sμ-σδCSRが、常在菌を検出する少なくとも一つの自然界感知経路、すなわちToll様受容体（TLR）シグナルに応答して活性化されることを示したことである。
TLR依存的なµ-σδCSRを活性化する分子シグネチャーの性質は、MyD88からのシグナル伝達がµ-σδCSRを促進するメカニズム同様、まだ解明されていない。このことは、TLR4依存性の炎症性サイトカイン分泌がIL-1受容体依存的に上昇するMvK欠損による高IgD症候群に照らして興味深い知見である(23)。どうやら、TLR4シグナルの異常（高すぎる、あるいは低すぎる）と高IgDの間には、まだ解明されていない関連性がありそうです。
分泌型IgDは好塩基球に特異的に結合し、B細胞活性化因子、抗菌因子、炎症性サイトカインの好塩基球産生を活性化することが報告されており、これらの機能は自己免疫疾患において制御不能になる可能性がある(9)。我々は、分泌型IgDが常在菌の認識とは別の役割を持ち、CSRによる産生がマイクロバイオームからのシグナルに依存する限り、微生物群集の恒常性制御に寄与している可能性があると仮定している。
材料と方法
マウス
ジャクソン研究所から購入した8-10週齢の純粋なC57BL/6J背景の雄を、先に述べたようにENUで変異原化した(24)。変異原化したG0雄をC57BL/6J雌と交配し、得られたG1雄をC57BL/6J雌と交配してG2マウスを作製した。G2雌はG1雌に戻し交配してG3マウスを得、表現型についてスクリーニングした。全ゲノム配列決定とマッピングは、以前に記載したように行った(4)。
Rag1-/-、Rag2-/-、Ighm-/-、Atm-/-、Ightm2Cgn (IghB1-8) トランスジェニックマウスはThe Jackson Laboratoryから購入した。Tlr4lps3/lps3、Ticam1lps2/lps2、Irak4otiose/otiose、CD40bluebonnet/bluebonnet、Tnfsf13bfrozen/frozen、およびDock8snowdrop/snowdrop株は、オンライン（mutagenetix.utsouthwestern.edu）の記述に従ってENU突然変異誘発により生成し、突然変異マウス地域資源センターから利用可能となるようにした。Trp53bp1-/-;Rag2-/-, Trp53bp1-/-;Ighm-/-, Trp53bp1-/-;IghB1-8, Trp53bp1-/-Atm-/-, Trp53bp1-/- Ticam1lps2/lps2, 及び Ticam1lps2/lps2;Irak4otiose/otiose マウスはマウス系統間の交配により生成したものである．
無胚葉C57BL/6およびRag1-/-マウスは、University of Texas Southwestern Medical CenterのGnotobiotic Mouse Facilityから提供された。従来飼育されていたマウスは、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの特定の病原体を含まない条件下で飼育され、すべての実験手順は、機関によって承認されたプロトコルにしたがって実施された。
CRISPR/Cas9 システムを用いたノックアウトマウス系統の作製。
単一ノックアウトマウス系統を作製するために、雌のC57BL/6Jマウスを、妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（EMD Millipore）6.5Uの注射により過排卵し、48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（Sigma-Aldrich）6.5Uを注射することにより実施した。その後、過排卵したマウスをC57BL/6J雄マウスと一晩交配させた。翌日、卵管から受精卵を採取し、体外転写したCas9 mRNA（50ng／μL）とTrp53bp1またはPla2g4b小塩基対向ガイドRNA（50ng／μL；Trp53bp1: 5′-TTTGACCAGAGTAGTAAAACAGG-3′； Pla2g4b：5′-GGCACTGGCCAACCTATGAGG-3′） を胚の細胞質または前核に注入した。二重ノックアウト株（Trp53bp1-/-;Aicda-/-, Trp53bp1-/-;MyD88-/-） の作製には、AicdaまたはMyD88 small base-pairing guide RNA（50 ng/μL; Aicda: 5′-CGGTGAAAATCCTCAGGCTGAGG-3′；MyD88：5′-GCTCCTTCAGTATCCTCACGG-3′) とin vitroで転写したCas9 mRNAをTrp53bp1-/-胚に注入した．注入した胚は，M16培地（Sigma-Aldrich）を用いて，37℃，5％CO2で培養した．変異マウスの作製は、2細胞期胚を仮妊娠Hsd:ICR（CD-1）雌マウス（ハーラン研究所）の卵管膨大部に移植した（卵管当たり10〜20個の胚）。
BMキメラ。
レシピエントマウスに、ガンマ線（X-RAD 320; Precision X-Ray）により9Gy（Trp53bp1-/-マウス）または15Gy（WTマウス）を致死的に照射した。その後、マウスにそれぞれのドナーの脛骨と大腿骨に由来する5×106個のBM細胞をi.v.投与した。BM細胞移植後4週間、マウスは抗生物質で管理された。移植後4週目から隔週でキメラを採血し、FACSで表面IgDの発現を評価した。キメラはコンジェニックCD45マーカーで評価した。移植後14週目に採血し、ELISA法により血清IgD値を測定した。
抗生物質処理。
マウスには、実験期間中（最大7週間）、アンピシリン（1mg／mL）、バンコマイシン（500μg／mL）、ネオマイシン（1mg／mL）、メトロニダゾール（1mg／mL）、およびストレプトマイシン（1mg／mL）を含むまたは含まないオートクレーブ水を飲料水中のアドリブ投与により継続的に投与した。すべての抗生物質はSigma-Aldrichから入手した。微生物相の枯渇は、10％（vol/vol）の子牛血液を含む脳心筋梗塞（BHI）寒天培地（Sigma-Aldrich）上で腸管内容物を培養することにより確認された。
無菌マウス実験。
8週齢のTrp53bp1-/-およびWT同腹子からの新鮮な単離BM細胞を、12週齢のGV-Rag1-/-およびCNV.Rag1-/-レシピエントにin v. 移植（2 × 107 cells/マウス）した。レシピエントは8週間、GFまたは従来のマウス施設に収容された。レシピエントはBM生着後4週目から隔週で採血した。BM移植後8週目に、GF-Rag1-/-レシピエントの毛皮にWTマウスの糞便を撒き、正常腸内細菌叢をコロニー形成させ、その後、従来の飼育マウスと一緒に飼育した。従来型GFマウスにおける細菌負荷は、BHI血液寒天培地プレート上にマウス糞便内容物をプレーティングすることにより評価した。
フローサイトメトリー。
BM細胞、脾臓細胞、腹腔内細胞を分離し、赤血球（RBC）溶解バッファーを加えて赤血球を除去した。細胞を、マウス細胞表面マーカーCD3, B220, CD21, CD23, IgM (BD Pharmingen); IgD (Biolegend); CD19 and CD93 (eBiosicence) に特異的なマウス蛍光色素標識モノクローナル抗体で1：200希釈、抗マウスCD16/32抗体 (Tonbo Biosciences) 存在下で4℃、1時間染色をした。
末梢血B細胞上の表面IgD発現の検出のために、100μLの血液を、血清存在下、等量のCD3、B220、IgM、IgD、CD45.1、CD45.2、およびCD16/32抗体（1：200希釈）を含む抗体混合物で4℃で1時間、染色した。赤血球溶解後、細胞を洗浄し、FACSで解析した。さらに、同量の血液をRBC溶解に供し、残った細胞を氷冷PBSで3回洗浄して血清を除去した。その後、同じ条件下で同じ抗体混合液で細胞を染色した。
血清置換実験では、WT血球100μLを1,500×gで5分間スピンし、50μLの血清をピペットで除去した。次に、Trp53bp1-/-、Trp53bp1-/-;Rag2-/-、Trp53bp1-/-;Ighm-/-、またはWT同腹子の新鮮な分離血清を50μL、WT血液ペレットに添加した。ペレットを再懸濁し、37℃で2時間インキュベートした。次に、抗体混合物を血清置換したWT血液に添加し、その後4℃でさらに1時間インキュベートした。染色後、赤血球を溶解し、残った細胞を洗浄し、FACSにより表面IgDの発現を解析した。データはLSRFortessaセルアナライザー（BD Bioscience）で取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて解析した。
フローサイトメトリーによる抗体被覆細菌の検出は、Ighm-/-マウスから分離した糞便内容物10mgを100μLの滅菌PBSに懸濁してホモジナイズし、600×gで5分間2回遠心分離して糞便中の大きな粒子を除去した。上清を9,000×g、5分間遠心分離し、細菌をペレット化した。このペレットをTrp53bp1-/-，Ighm-/-，Trp53bp1-/-；Ighm-/-，WT同腹子の新鮮な分離血清に37℃で2時間再懸濁させた。その後、菌体を滅菌PBSで3回広範囲に洗浄し、非結合免疫グロブリンを除去した。細菌ペレットを、等量のIgD、IgMおよびIgA抗体を含む蛍光標識抗体混合物で4℃で45分間染色した後、洗浄してPBS中の2.5 μg/mL DAPI中に再懸濁した。DAPIで染色された事象はすべて細菌とした。測定は、LSRFortessaセルアナライザー（BD Bioscience）を用いて、前方散乱および側方散乱閾値を最小設定200に設定し、流速を遅くして実施した。
免疫化。
B細胞受容体トランスジェニックマウス（WT；IghB1-8またはTrp53bp1-/-；IghB1-8）に、前述（25）のように0日目にNP-LPS（50μg；バイオサーチテクノロジー）で i.p. 免疫を施した。免疫後14日に、血液をMiniCollect Tubes (Mercedes Medical)に採取し、1,500×gで遠心分離し、血清を分離した。
抗原特異的IgMおよびIgG応答のELISA分析のために、Nunc MaxiSorp平底96ウェルマイクロプレート（Thermo Fisher Scientific）を5μg/mL NP8-BSA（Biosearch Technologies）で4℃にて一晩コートした。その後、BioTek マイクロプレートウォッシャーを用いて、洗浄バッファー [0.05% (vol/vol) Tween-20 in PBS] で4回洗浄し、1% (vol/vol) BSA で室温で1時間ブロッキングした。血清試料を1% (vol/vol) BSAで連続的に希釈した後、1:50および1:150希釈液を調製したELISAプレートに添加した。2 時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄液で 8 回洗浄し、HRP 標識ヤギ抗マウス IgM または IgG と共に室温で 1 時間インキュベートした。プレートを洗浄液でさらに8回洗浄した後、SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateとTMB Stop Solution（KPL社製）で現像した。吸光度は Synergy Neo2 Plate Reader (BioTek) で 450 nm で測定した。抗NP IgGおよびIgMの基底レベルは、前免疫血清を使用して決定した。抗原特異的IgGおよびIgMは、個々のマウスについて、免疫後のOD値から免疫前のOD値を引いた値として決定された。表示されたすべてのELISAデータは、1:150血清希釈を表す。
抗原特異的血清IgDレベルは、NP8-BSAコーティングした96ウェルマイクロプレート上で測定した。希釈血清（1％BSAで1：2希釈）を添加し、その後2時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化抗マウスIgDとインキュベートし、次にストレプトアビジン結合HRPとインキュベートした。プレートを現像し、抗原特異的IgDを上記のように測定した。
血清抗体アイソタイプレベルの決定のために、新鮮な単離血清を製造者の指示書に従ってサンドイッチELISA分析に供した（eBiocience；MyBioSource）。
Sµ-σδ ジャンクションのサザンブロット分析。
BM、脾臓、MLN、気管支肺胞洗浄液、NALT、及びSMLN中のB細胞を、マウスパンB細胞分離キット（Miltenyi Biotech）を用いて負に濃縮した。分離したB細胞から、QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）を用いて、製造元の説明書に従ってゲノムDNAを抽出した。Sμ-σδ接合部は、先に記載したように、タッチダウンPCR、続いて5′Sμ及び3′Cδを標的とするプライマーを用いたネステッドPCRを用いて増幅された(1)。タッチダウンPCRのプライマーは、5′-CAGTTGAGGCCAGCAGGT-3′および5′-CCAATTACTAAACAGCCCAGGT-3′（98℃で3分間の1サイクル；98℃で30秒、64℃で40秒、および72℃で90秒の3サイクル；98℃で30秒、62℃で40秒、および72℃で90秒の3サイクル。25 cycles at 98 °C for 30 s, 60 °C for 40 s, and 72 °C for 90 s; and one cycle at 72 °C for 7 min), and nested PCR for primers were 5′-CAGGTCGCTGGACTAACTC-3′ and 5′-CAGCCCAGGTTTATCTTTTCA-3′（1 cycle at 98 °C, 3 min; 98℃、30秒、65℃、40秒、72℃、90秒の35サイクル、および72℃、7分の1サイクル）。Sμ-σδ接合部のハイブリダイゼーションは、イントロン5′からCδ（5′-CCCAGAACCTGAGAAGGAAG-3′）およびCδエクソン（5′-CAGCCCAGGTTTATCTTCA-3′）からPCR断片としてクローニングしたビオチン化プローブ（460bp）を使用して行った。プローブはDetector PCR DNA Biotinylation Kit (KPL)を用いてビオチン化した。Sμ-σδ接合部にハイブリダイズしたプローブを、製造者の指示に従い、Detector HRP Chemiluminescent Blotting Kit（KPL）を用いて可視化した。460bpのプローブ配列を包含するPCR増幅断片がアッセイの陽性対照として機能した。
Iμ-CμおよびIμ-Cδ転写物についての定量的RT-PCR分析。
TRIzol Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて、BM、脾臓、血液から製造者の指示に従いトータルRNAを単離した。DNase処理とクリーンアップは、DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて行った。ここで、1μgのRNAをSuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Life Technologies)を用いてcDNAに逆転写させた。Iμ-Cμ（膜Cμ）およびIμ-Cδの転写レベルは、Step One Plus Real-Time PCR System（Life Technologies）上でiTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad） を用いて、前述（1）のように以下のプライマーを用いて分析した。Iµ-Cµ: 5′-TGGAACTCCGGAGAGACCTA-3′および5′-TTCCTCCTCAGCATTCACCT-3′；Iµ-Cδ：5′-CTGGCCGAGACCTA-3′。5′-CTCTGGCCCTGCTTATTGTTG-3′および5′-GCTCCCAGCTGATTTTCAGT-3′である。相対発現量は、Pax5プライマー（5′-CGAGTCTGTGACAATGACTGTGC-3′および5′-CAGGATGCCACTGATGGAGTATG-3′）を用いてΔΔCt標準化法で計算された。
16S rRNAメタゲノミクス解析。
Trp53bp1-/-マウスとその生涯同居させたヘテロ接合体またはWT同腹子の小腸と大腸から便サンプルを採取し、以下のプロトコルで細菌DNAを抽出した。便サンプルは氷冷したPBSに懸濁し、短時間遠心分離して大きな糞便内容物を除去した。清澄な上清にリゾチーム（5 mg/mL）を加え、37 ℃で30分間インキュベートした。この溶液をLysing Matrixビーズチューブ（0.1mmガラスビーズ；MP Biomedical社）に移し、ビーズを5回ボルテックス（最高速度で1分、氷上で2分）して、細菌の溶解を効率的に行った。その後、16,000×gで1分間回転させ、上清を滅菌済み2mLマイクロフュージチューブに移した。等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを加え、10秒間激しく振盪した後、16,000×gで2分間遠心分離し、水相を清浄なマイクロフュージチューブに移して、等量のクロロホルムで抽出を行った。その後、再度16,000×gで2分間遠心分離し、クロロホルム抽出を繰り返した。水相を清潔なマイクロフュージチューブに移し、0.3M酢酸ナトリウム（pH7.0）および2.5容量のイソプロパノールを加えて核酸を沈殿させた。20℃で2時間インキュベートした後、16,000×gで30分間遠心分離を行った。沈殿した核酸を700μLの70%エタノールで1回洗浄し、16,000×g、10分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを室温で 10 分間乾燥させた。核酸をヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、MinEluteスピンカラム（Qiagen）上で洗浄した。
次に、50 ngの精製DNAをIon 16S Metagenomics Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて、製造者の説明書に従って調製した。簡単に言うと、PCRで増幅した細菌の16S領域の超可変領域をQuant-iT PicoGreen Assay (Invitrogen)を用いて定量し、正規化した。サンプルはIon PGM System (Thermo Fisher Scientific) で製造者の指示に従って配列決定し、結果はIon ReporterソフトウェアIon 16S Metagenomics Kit analyses module (Thermo Fisher Scientific) を用いて解析した。各サンプルの微生物分類群の相対的割合とS/N比は、シングルトン（1つのサンプルにのみ存在する分類群）と低カバレッジ分類群（総リード数が20未満の分類群）をフィルタリングした後、以前に述べたように組み立てた(26)。Ssignal-to-noise ratioは、Rソフトウェアで作成したヒートマッププロットおよびIon Reporterソフトウェアで作成した主成分分析で描かれている。
統計解析。
群間の差の統計的有意性は、GraphPad Prismを使用して、示された統計的検定を実行して解析した。グループ間の生値の差は、P < 0.05のとき、統計的に有意であるとみなした。P値は以下のように表記した。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns, P > 0.05で有意でない。
謝辞
この研究は、National Institutes of Health Grants U19 AI100627およびR37 GM067759の支援を受けて行われた。
参考資料
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参考資料
1
P Rouaud, et al., Elucidation of the enigmatic IgD class-switch recombination via germline deletion of the IgH 3′ regulatory region.（IgH3′調節領域の生殖細胞欠失を介した謎のIgDクラススイッチ組み換えの解明）。J Exp Med 211, 975-985 (2014).

Crossref
PubMed
Google Scholar
2
C Lutz, et al., IgDはB細胞におけるIgM機能の喪失をほぼ代替することができる。Nature 393, 797-801 (1998).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
3
J Roes, K Rajewsky, 免疫グロブリンD（IgD）欠損マウスは、抗原を介したB細胞の動員におけるIgDの補助受容体機能を明らかにした。J Exp Med 177, 45-55 (1993).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
4
T Wang, et al., マウスの表現変異を引き起こす点変異のリアルタイム解像度. Proc Natl Acad Sci USA 112, E440-E449 (2015).

クロスリファレンス
PubMed
グーグルスカラー
5
JP Manis, et al., 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination(53BP1はDNA損傷応答経路と免疫グロブリン重鎖クラススイッチの組換えを結びつける)。Nat Immunol 5, 481-487 (2004).

クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
6
JP Drenth, et al., メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の変異は高IgDと周期性発熱症候群を引き起こす。Nat Genet; International Hyper-IgD Study Group 22, 178-181 (1999).
参考文献へ
Crossref
PubMed
Google Scholar
7
EJ Hager, et al., メバロン酸キナーゼ（Mvk）対立遺伝子1個の欠失により、高IgD症候群のマウスモデルが得られた。J Inherit Metab Dis 30, 888-895 (2007).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
8
A Saintamand, JC Lecron, F Morel, M Cogné, Y Denizot, Comment on "IgH chain class switch recombination: mechanism and regulation". J Immunol 194, 2039-2040 (2015).
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クロスリファレンス
PubMed
グーグルスカラー
9
K Chen, et al., 免疫グロブリンDは、好塩基球の抗菌、炎症、B細胞刺激プログラムを活性化することにより、免疫監視を強化する。Nat Immunol 10, 889-898 (2009).

クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
10
A Bothmer, et al., 53BP1によるDNA末端結合、切除、免疫グロブリンのクラススイッチ組換えの制御. Mol Cell 42, 319-329 (2011).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
11
A Bothmer, et al., 53BP1 regulates DNA resection and the choice between classical and alternative end joining during class switch recombination.（53BP1はクラススイッチ組換えにおけるDNA切除と古典的末端接合と代替的末端接合の選択を制御する）. J Exp Med 207, 855-865 (2010).

クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
12
S Difilippantonio, et al., 53BP1 は V(D)J 組換え時に長距離 DNA 末端結合を促進する。Nature 456, 529-533 (2008).

クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
13
A Yamane, et al., RPA accumulation during class switch recombination represents 5′-3′ DNA-end resection during the S-G2/M phase of the cell cycle.細胞周期におけるクラススイッチ組換え時のRPA蓄積は、5′-3′DNA末端切除を意味する。Cell Reports 3, 138-147 (2013).

クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
14
B Shiotani, L Zou, 一本鎖DNAは、DNA切断時にATMからATRへの切り替えを制御する。Mol Cell 33, 547-558 (2009).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
15
TA Shih, M Roederer, MC Nussenzweig, T cell-independent antibody response in vivo, Role of antigen receptor affinity. Nat Immunol 3, 399-406 (2002).

クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
16
J Cahenzli, Y Köller, M Wyss, MB Geuking, KD McCoy, Intestinal microbial diversity during early-life colonization shapes long-term IgE levels. Cell Host Microbe 14, 559-570 (2013).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
17
DA Hill, et al., Commensal bacteria-derived signals regulate basophil hematopoiesis and allergic inflammation. Nat Med 18, 538-546 (2012).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
18
IM Ward, et al., 53BP1 is required for class switch recombination. J Cell Biol 165, 459-464 (2004).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
19
B Reina-San-Martin, J Chen, A Nussenzweig, MC Nussenzweig, Enhanced intra-switch region recombination during immunoglobulin class switch recombination in 53BP1-/- B cells. Eur J Immunol 37, 235-239 (2007).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
20
A Saintamand, et al., Elucidation of IgH 3′ region regulatory role during class switch recombination via germline deletion.（生殖細胞欠失を介したクラススイッチ組換え時のIgH 3′領域の調節的役割の解明）。Nat Commun 6, 7084 (2015).
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クロスリファレンス
PubMed
グーグルスカラー
21
B Reina-San-Martin, et al., H2AX is required for recombination between immunoglobulin switch regions but not for intra-switch region recombination or somatic hypermutation. J Exp Med 197, 1767-1778 (2003).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
22
BA Helmink, et al., H2AXは、G1期リンパ球におけるCtIPを介したDNA末端切除と異常修復を防ぐ。Nature 469, 245-249 (2011).
参考文献へ
クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
23
M Stoffels, et al., 高免疫グロブリン血症Dと周期性発熱症候群におけるTLR2/TLR4依存性のサイトカイン産生の過大化. Rheumatology (Oxford) 54, 363-368 (2015).
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クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
24
P Georgel, X Du, K Hoebe, B Beutler, マウスにおけるENU変異誘発。Methods Mol Biol 415, 1-16 (2008).
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パブコメ
Google Scholar
25
CN Arnold, et al., A forward genetic screen reveals role for Nfkbid, Zeb1, and Ruvbl2 in humoral immunity.前方遺伝学的スクリーニングにより、体液性免疫におけるNfkbid、Zeb1、およびRuvbl2の役割が明らかになった。Proc Natl Acad Sci USA 109, 12286-12293 (2012).
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クロスリファレンス
PubMed
Google Scholar
26
JR Lukens, et al., Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease（マイクロバイオームの食事調節は自己炎症性疾患に影響を与える）。ネイチャー 516, 246-249 (2014).
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研究論文2017年1月30日号
類人猿における強い選択的掃射の割合が集団の大きさとともに増加することの証拠
キウォン・ナム、カスパー・ムンク、[...]ミッケル・ハイデ・シエルプ