糞便微生物叢療法とプロバイオティクスによる胃腸症状の改善におけるドナーとレシピエントの特異性と年齢依存性

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公開日：2023年08月03日
糞便微生物叢療法とプロバイオティクスによる胃腸症状の改善におけるドナーとレシピエントの特異性と年齢依存性

https://www.nature.com/articles/s41522-023-00421-4?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Qinglong Wu, Prapaporn Boonma, ...Tor C. Savidge 著者一覧を見る
バイオフィルムとマイクロバイオーム第9巻、記事番号：54（2023） この記事を引用する

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メトリクス詳細

概要
糞便微生物叢移植（FMT）は、成人および小児患者の再発性クロストリジオイデスディフィシル（Clostridioides difficile）感染症（rCDI）に対する有効な治療法であることが証明されている。しかし、小児においてはマイクロバイオームの発達が重要な因子であるため、成人の糞便ドナーが小児患者において年齢に応じた機能回復をもたらすことができるかどうかは依然として不明である。この問題を解決するために、我々は統合システムアプローチを実施し、成人および小児のrCDI患者において、代謝産物の回復とともに、一致したドナー株の生着がFMTの転帰と関連することを見出した。FMT後の機能回復は株特異的ではないが、成人糞便ドナーを用いた場合、小児患者では特殊な代謝機能が保持される。さらに、成人の過敏性腸症候群患者および小児の自閉症スペクトラム障害患者において、プロバイオティクス菌株の生着と胃腸症状の改善とを関連付けることにより、高分解能バリアントコーリングの広範な有用性を実証した。我々の知見は、プロバイオティクスや微生物叢に基づく治療薬の有効性を評価する際に、菌株レベルでの同定が重要であることを強調している。

はじめに
クロストリジオイデス・ディフィシル感染症（CDI）は、米国で最も一般的な医療関連感染症であり、米国疾病管理予防センターの脅威レベル緊急病原体である1,2。CDIの一次治療には抗生物質バンコマイシンが最も一般的に使用されているが3,4、その広域スペクトル特性は腸内細菌異常を悪化させ、患者を再発しやすくする4。さらに、腸内細菌叢を広範囲に破壊する抗生物質は、バンコマイシン耐性腸球菌5など、他の重要な多剤耐性病原体のコロニー形成とその後の同時感染を引き起こす可能性がある。したがって、腸内細菌叢の回復と維持は、感染症を有するCDI患者の臨床管理において極めて重要である。糞便微生物叢移植（FMT）は、患者の〜80〜90％において再発性（r）CDIの予防に非常に有効な治療法であることは注目に値する6,7。

FMTに対する臨床反応を理解するためには、腸内細菌叢の回復の特徴を明らかにすることが極めて重要である。先行研究では主に、アルファ多様性指標、Bray-Curtis非類似度指標、および分類学的存在量プロファイルを用いた16S rRNAベースの解析に依存してきた。これらは、FMT後のドナーの微生物叢生着をモニターするために、97％類似度ベースの操作分類学的単位（OTU）表から作成されたものである8,9,10。しかし、これらの方法ではドナー固有の細菌株を同定できないため、生着シグネチャーを正確に定義することはできない。全ゲノムシーケンス（WGS）は、菌株レベルでゲノムを検出し、アセンブルすることができるため、ショットガンメタゲノムデータは、FMT後のドナー特異的生着を解析するための強力なアプローチである11,12,13,14。類似度97％ベースの操作分類学的単位（OTU）では不可能な、16Sアンプリコンデータから同一種の異なる株を同定するための代替ツールは、アンプリコン配列変異解析（ASV）15である。しかし、ASVは、FMTコホートにおける糞便ドナー株の追跡にはまだ利用されていない。

ほとんどのFMT試験は成人のrCDIを対象としているが、小児のrCDIにおける臨床効果や微生物叢の回復を検討した研究は少ない。小児では腸内細菌叢がまだ発達途上であるため16、健康な成人の糞便ドナーを用いてFMTを行う場合、小児患者における腸内細菌叢の回復について発達に特異的な側面を考慮することが極めて重要である。本研究では、小児rCDIにおけるFMTの臨床的転帰に関連する重要な特徴を同定するために、包括的なマルチオミクス研究を実施し、成人のFMTコホートで検証された詳細なマイクロバイオーム解析と機能解析を行った。また、成人の過敏性腸症候群および胃腸症状に苦しむ自閉症スペクトラム障害の小児におけるプロバイオティクス生着の臨床的有効性を評価するために、ASVによって決定される株レベルの分解能の有用性を評価した。

結果
成人FMTドナーにおけるマイクロバイオームの変動性
健康なドナーからのFMTに使用された糞便材料におけるマイクロバイオームの変動性と安定性を評価することは、レシピエントにおけるドナーのマイクロバイオームの再構成を確認する上で、特に複数回のFMTを行う場合には極めて重要なステップである。以前のFMT研究では、3人の成人糞便ドナーを用いて、幅広い年齢層（2～18歳）の小児rCDI症例を大腸内視鏡による移植で治療した17。D2およびD3の2種類の万能ドナーは、rCDI（n＝17）または潰瘍性大腸炎（UC；n＝4）の小児21人の治療に使用され、D5の自己指定ドナーは家族性レシピエント1人の治療に使用された（図1）。縦断的なドナー検体のメタゲノムシークエンシングと組成分析から、万能ドナーのD2とD3はバクテロイデス（Bacteroides）に安定的に支配されているのに対し、D5はプレボテラ（Prevotella）に富んでいることが明らかになった（図2A）。これらの組成の違いは、ASVレベルでの距離ベースの非制約順序解析によって確認され、3つのドナーの間で明確なクラスタリングが示された（図2B）。対照的に、各ドナーについて、最低7ヶ月間収集された個体内検体は緊密にクラスタリングされており（図2A, B）、我々の研究でUCおよびrCDI患者の治療に繰り返し使用された2人の万能ドナーのマイクロバイオーム組成が安定していることを示している。

図1：成人ドナーからFMTを受けた小児の再発性CDIおよび潰瘍性大腸炎患者。
図1
rCDIを呈した18人の小児患者には、最初に抗生物質、特にバンコマイシンを投与し、大腸内のC. difficile植物細胞を減少させた。続いて、小児患者の再構成のために成人ドナーからの健康な微生物叢を利用した大腸内視鏡によるFMTが行われた。主要評価項目は、rCDI患者については8週間後の下痢の消失であり、潰瘍性大腸炎（UC）患者についてはFMT中の無下痢状態が主要評価項目であった。

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図2：一塩基バリアントプロファイリングはFMTドナーを区別する。
図2
A3人の糞便ドナーのファミリーランクにおける分類学的存在量は、7ヵ月間にわたって優勢なバクテロイデス（D2およびD3）とプレボテラ（D5）の安定性を示している。ベン図は3人のドナーの間で共有されているASVと共有されていないASVを示している。ドナーにおけるASVの存在は、そのドナーから採取されたすべての縦断的便検体の少なくとも50％において検出されたことによって決定された。B 一塩基分解能のアンプリコン解析（ASV）は個々のドナーを区別する。β-多様性解析は、存在量重み付けJaccardメトリック距離プロファイルを用いた主座標分析で行った。veganパッケージのenvfit関数を用いて有意なドナー特異的ASVを同定した（フィルターパラメーター：r2 > 0.8; Benjamini-Hochberg調整p値 < 0.02）。同じspecies call（BLCA annotation score cut-off of 85 using 98% identity and 98% coverage for alignment）を持つASVのみが図示されている。C 個々のドナーを一貫して区別するASVの相対的存在量。D WGSデータのmOTUs SNVプロファイリングによるBacteroides vulgatusの2つのシングルコピー・マーカー遺伝子の代表的対立遺伝子頻度。E WGSデータにおけるBacteroides vulgatusパンゲノムのPanPhIAN3検出プロファイリングは、ドナーD2とD3におけるドナー特異的Bacteroides vulgatus株の異なる遺伝子含量を安定的に示している。

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ドナーD2とD3はともにバクテロイデス属に富んでいたが、特定の優性ASVがこれらの標本を区別していた。例えば、バクテロイデス・プレベウスと注釈されたASV7、40、168はドナーD2にのみ存在した（図2C）。例えば、ASV6とASV27はBLASTn検索の結果、100%の配列アラインメントカバレッジと同一性を示し、Bacteroides vulgatusと注釈された（図2B）。メタゲノムリードをmOTUsデータベースの10種類のユニバーサルマーカー遺伝子に一塩基変異（SNV）マッピングした結果、ドナーD2およびD3にB. vulgatusの異なる配列変異体が存在することが確認された（図2D）。B.vulgatusのパンゲノムを用いたPanPhlAn3解析により、D2およびD3のB.vulgatusの異なる遺伝子含量がさらに検証され（図2E）、2つのドナーにおける菌株変異の安定的な存在が支持された。また、SameStrパイプライン18（補足データ）を用いて、ドナーD2とD3間の安定した株の違いも確認された。ASVとメタゲノム配列を解析することで、ドナーに特異的なマイクロバイオームシグネチャーを種および菌株のランクで発見し、異なる合併症を有し、かなりの発育年齢範囲（幼児から青年期）にわたる複数のFMTレシピエントにおけるドナー由来の生着性を特徴付けるのに役立った。

配列バリアントプロファイリングによりFMTレシピエントにおけるドナー特異的マイクロバイオーム生着が同定される
各試験対象者は単一の万能ドナーからFMTを受けたため、異なる疾患レシピエントにおけるドナー特異的分類群の生着状況を追跡することが可能となった。ASVの分類学的存在量プロファイリングは、FMT後とドナーの糞便サンプルの間に高い類似性を示したが（補足図1）、種ランク以上の分類学的冗長性により、ドナー特異的な生着率を正確に割り出すことができなかった。しかし、ASVプロファイルのβ多様性解析を用いてドナーとレシピエントの組み合わせを層別化することで、ドナー特異的な生着率を示すことができました（図3A）。この知見は、対応するドナーの材料を受け取ったFMTレシピエントにおいて、上位にランクされたドナー特異的ASVの生着率によって確認されました（図2B、Cおよび補足図2）。各FMTレシピエントにおけるすべてのドナーASVを追跡することで、これらのドナーASVの大部分が、FMT前の異種生物コンソーシアムを置き換えてレシピエントに生着したことが示された（補足図3）。

図3：FMTを受けたrCDI患者におけるドナー特異的微生物叢の生着。
図3
A rCDIレシピエントにおけるドナー特異的微生物叢の生着は、存在量重み付けJaccard距離プロファイルを用いて作成した主座標を用いたβ多様性解析で明らかである。B ショットガンメタゲノムデータのmOTUs 10マーカー遺伝子ベースのSNVプロファイリングによるβ多様性解析。mOTUs SNVプロファイルを用いて2値Jaccard距離プロファイルを算出した。C Anvi'oプラットフォームを用いたゲノムのメタゲノミックアセンブリ（MAGs）により、ドナー特異的マイクロバイオーム生着を検証した。ドナー特異的MAGビンの検出プロファイル（表示：mean_coverage_Q2Q3）は、階層的クラスタリング解析によって示されている。患者P07およびP15のショットガンメタゲノムデータは、高品質のDNAの収量が不十分なため、利用できない。

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注目すべきは、サンプルのクラスタリングは、使用した制約のない順序付け方法（PCoA vs NMDS）によって大きく異なり、一般的な距離メトリクスは大きな違いを示したことである（補足図4）。例えば、4つのβ多様性指標は、rCDIレシピエントにおけるドナー特異的な微生物叢の移植を示したが、2つの一般的な方法-加重UniFrac距離によるPCoAとBray-Curtis距離によるNMDS-は、この所見を再現できなかった。この不一致の原因となっている（キメラではない）偽のASVの可能性を排除するため、0.01％という厳格な存在量フィルターの閾値を設定した（その結果、ASVは1039から409に減少した）。このフィルターを適用した後でも、ドナー特異的な生着が観察された（補足図4）。一貫性のない所見をさらに洞察するために、我々はこれらのβ多様性序列化法の包括的評価を行った。(1)Jaccardと重み付けなしのUniFracは稀な特徴を優先的に解析し、Bray-Curtisと重み付けUniFracはサンプル間の豊富な特徴を強調する。(2)順位相関を最大化することに重点を置くNMDSとは異なり、PCoAは順序付けと元の空間との間の一致を確立することを目的とし、それによりサンプルの識別を促進する。全体として、存在量と検出データの両方を考慮して距離を計算する存在量重み付けJaccardメトリックは、rCDI患者におけるドナー特異的ASV生着を同定するための最も効果的なアプローチとして浮上した。その結果、この指標をドナー生着のさらなる解析に採用した（図3A）。

FMTレシピエントにおけるドナー特異的マイクロバイオーム生着を同定するためにASVプロファイリングを用いるという我々のアプローチを検証するために、同一のDNA調製物から作成したショットガンメタゲノム配列を解析した。驚くべきことに、MetaPhlAn3、mOTUs、Kraken2によって生成された菌種プロファイルを用いても、存在量重み付けJaccard距離測定法によるドナー特異的生着を同様に示すことはできなかった（補足図5）。このASVプロファイリングとの乖離は、これらの方法ではサンプル間の系統の違いを区別できないため、種レベルでの分類学的冗長性に起因している可能性がある。この可能性をさらに追求するため、分類学にとらわれないSNVsプロファイリングを行った。メタゲノム対立遺伝子頻度プロファイルは、あらかじめ組み込まれた10種類の普遍的細菌シングルコピー参照遺伝子を用いて、mOTUsパイプラインを用いて作成した。SNVプロファイリングにPCoAに基づく2値Jaccard距離メトリックを用いた制約のない順序付けを用い、ドナー特異的マイクロバイオーム生着、すなわちドナー検体はFMT前検体と比較してFMT後検体で有意にクラスタリングされることを実証し、ASVの所見を確認した（図3B）。われわれは、以前に報告された2つのFMTコホート11,12において、ドナー特異的マイクロバイオーム生着を独立して証明することにより、われわれのメタゲノミクスアプローチを検証し（補足図6）、ドナー生着が臨床的FMT有効性にどのように関連するかを決定するために菌株レベルの検出を使用することを支持した。

メタゲノムSNVsプロファイリングはリファレンスベースの戦略を用いるため11,12,18、このアプローチの潜在的な限界は、未培養種が解析に含まれないことである。この限界を評価するために、Anvi'oプラットフォーム19を使用して、分類学にとらわれない、リファレンスフリーの、メタゲノムデータのde novo共集合とビニングを行った。階層的クラスタリング解析により、FMTコホートにおけるメタゲノム集合ゲノム（MAG）の2つのスーパークラスターと3つのサンプルクラスターが同定された。MAGスーパークラスターIは、小児健常対照者、ドナーD2およびそのFMTレシピエントを支配していたが、ドナーD3およびそのレシピエントはMAGスーパークラスターIIに支配されていた（図3C）。全体として、我々の結果は、小児FMTレシピエントでは使用されていないバイオインフォマティクスアプローチとしてのメタゲノム解析の使用を含む複数の方法によって、FMTレシピエントにおけるドナー特異的マイクロバイオーム生着を実証している。

ドナー特異的ASV生着は臨床的FMT反応と関連する
ドナーに特異的な微生物叢の生着がFMTの転帰と相関するかどうかを評価するために、我々はASVに基づくβ多様性指標の空間的距離に基づいて2つの新しい生着指標を作成した。移植指標β1およびβ2は、それぞれドナーのASV移植を定性的および定量的に測定するために算出した（図4A；「方法」のセクションの説明を参照）。生着指標の特異性を確立するため、小児FMTコホートにおいて、異なるドナー-レシピエントの組み合わせを測定した。その結果、ドナーとレシピエントのペアを一致させると、不一致のペアよりも生着率が有意に向上することがわかった（図4B）。この知見は、特定のFMTドナーを正確に同定する上で、われわれの生着追跡モデルが実用的である可能性を示唆している。さらに、補助ツールであるSourceTracker2を適用することで、各患者に対応するドナーを一貫して確認することができ、その結果、マイクロバイオームの回復が称賛に値するレベルであることが確認された（補足データ）。

図4：複数のFMT研究におけるドナー特異的微生物叢移植のモデル化。
図4
A ドナー-レシピエントのペアリングを用いたFMT後の相対的（β1）および絶対的（β2）生着指数の計算式。B 一致したドナー-レシピエントペアでは、生着指数のスコアが有意に高い。Wilcoxon検定： ***p < 0.001. C 移植指数は、同じドナーD2便を投与されたUC患者と比較して、rCDIで有意に高いスコアを示した。Wilcoxon検定： ***p < 0.001. D rCDI FMTの5つのコホートについて、ドナー-患者間のペアリングに基づいて算出された移植指数。E移植指数は、FMT後のrCDI患者の縦断的追跡調査中に有意に増加する。Benjamini-Hochberg補正を用いた一対のWilcoxon検定：共通の文字がないイタリック体（a-b）は、群間でp＜0.05であることを示す。F移植指標はFMT後最初の2週間で反応者と非反応者を有意に区別した。Wilcoxon検定： ***p < 0.001.

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FMT前のマイクロバイオームの複雑さがドナー特異的生着に及ぼす影響について洞察するために、我々は、普遍的なドナー材料を受け取ったが、異なるFMT前処置を受けたrCDIおよび潰瘍性大腸炎（UC）患者におけるマイクロバイオーム生着の比較解析を行った。その結果、UC患者とrCDI患者でβ1値に統計学的有意差は認められなかった。しかし、UC患者のPostFMTサンプルでは、rCDI患者のサンプルと比較してβ2値が有意に低く、β1値は0.6を超えていた（図4C）。これらの結果は、UC患者およびrCDI患者のPreFMTサンプルとPostFMTサンプルの間で観察されたβ多様性の距離と一致している（図3A）。以前に報告されたように13、FMT前にバンコマイシンの前処置を受けなかった潰瘍性大腸炎患者では、ドナーの微生物叢の生着効率がかなり低かった（図4C）。このように、我々の生着指数β1は、レシピエント集団内でのドナーASV/株の生着程度を特徴付ける定性的指標として機能する。一方、β2は定量的指標であり、ドナーに起因する特定の生着についての指標を提供する。

私たちの小児科研究のサンプルサイズでは、厳密な統計解析のための検出力はないが、臨床的なFMTの成功は、β1＞0.6またはβ2＞0.2の生着指数スコアと関連し、一方、低い生着スコア（β1＜0.2）はFMTの失敗と同定されることがわかった（図4C）。この所見は小児FMTコホート全体で一貫しており、成人のドナーの便が2歳から18歳の小児に効率よく生着することが示された（補足図7）。臨床的なFMT反応を予測する上での生着指標の一般的な有用性を評価するために、マッチしたドナーとレシピエントのペアリング情報が報告されている5つの独立したrCDIコホートにおいて、ドナー特異的ASV生着率を計算した20,21,22,23,24（図4D）。FMTを受けた109例のrCDI患者から得られた縦断的なASVアンプリコンデータを用いると、治療後1週間以内に統計的に有意なドナー生着（β1およびβ2）が証明され、主要臨床エンドポイントである8週間を通じて安定した生着が認められた（図4E）。臨床的FMT反応に基づいて患者を層別化することで、β1 > 0.6またはβ2 > 0.2という生着指数の閾値が、治療2週間後の臨床的有効性を予測するものとして検証された（図4C、F）。

機能性胃腸障害における臨床効果はプロバイオティクス株の生着に反映される
DADA2-ASVとmetaSNVに基づくバリアントコーリングを応用して、rCDI患者におけるドナー特異的マイクロバイオーム生着による臨床効果を実証することに成功したが、同様の方法を、定義されたマイクロバイオータ製品やプロバイオティクスを包含する、より広範な臨床効果の予測に応用できるかどうかは不明である。この可能性を検証するため、我々は以前に報告した2つの介入コホートにおいて、プロバイオティクス菌株の移植による消化管症状の改善スコアのメタゲノム解析を行った25,26。これらのコホートには、過敏性腸症候群（IBS）の成人と自閉症スペクトラム障害（ASD）の小児が含まれ、胃腸症状に苦しんでいた。これらの患者は、それぞれVSL#3またはVISBIOMEを8週間まで毎日経口投与された25,26。FMTの結果とは対照的に、DADA2-ASVおよびmOTUs-metaSNVプロファイリングでは、いずれの介入コホートにおいても、プロバイオティクス投与前と投与後の糞便サンプルを区別することができなかった。これは、16Sレベルで区別できない定義された細菌株の生着追跡や、mOTUsデータベースで提供されている10種類のユニバーサルマーカー遺伝子セットを用いた追跡には限界があることを示している（図5A、Bおよび補足データ）。プロバイオティクス製品を構成する同じ種のアノテーションを含むプロバイオティクス標的ASVにベータ多様性解析を集中させると、処理前検体と処理後検体の区別はわずかに改善した。しかし、有意な分離が検出されたのは小児ASDコホート（Illumina-16Sデータで作成）のみで、成人IBSコホート（454-16Sデータで作成）では検出されなかった。そこで、個々の菌株の遺伝子組成を同定するための菌株レベルのメタゲノムプロファイリングツールであるPanPhIAn3を利用して、患者における特定のプロバイオティクス菌株の生着率を検出した。プロバイオティクス製品と患者サンプルのメタゲノミックデータから検出された全細菌種の遺伝子組成を組み合わせることで、βダイバーシティ解析によるプロバイオティクス前後のサンプルの有意な分離を達成した（図5A, B）。主な特徴は、追跡調査サンプルの大部分において、2つのプロバイオティクス製品からStreptococcus thermophilusが生着していたことである（補足図8および補足データ）。プロバイオティクス菌株の正確な検出により、臨床症状と生着率との相関が明らかになった（図5A、B）。したがって、DADA2-ASVおよびmetaSNVプロファイリングは、プロバイオティクスまたは定義された細菌コンソーシアムの生着率を正確に評価することはできないが、他の菌株レベルのプロファイリングツールを使用することにより、この限界を克服することができる。

図5：プロバイオティクスの菌株追跡は臨床転帰の解釈を改善する。
図5
A 自閉スペクトラム症（ASD）の小児に対するVISBIOMEプロバイオティクス介入。B 過敏性腸症候群（IBS）の成人に対するVSL#3プロバイオティクス介入。プロバイオティクス」ASVは、プロバイオティクス製品に含まれる特定の生物種の一致（100％の同一性と100％のカバレッジを持つBLASTnヒット）に基づいて選択される。ASVプロファイルのβ多様性解析には、アバンダンス加重Jaccard距離メトリックを用い、mOTUs-metaSNV対立遺伝子頻度およびPanPhlAn3遺伝子組成プロファイリングには、バイナリーJaccard距離メトリックを用いた。臨床転帰（PedsQLスコアおよび腹痛エピソード）は、ASVとPanPhlAn3で測定したプロバイオティクス生着率と相関していた。

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微生物叢の生着は機能回復と関連するが、ドナー特異的代謝産物シグネチャーを示すことはできない
我々は、ドナー特異的な微生物叢の生着が起こることを証明したが、ドナーの変異体がFMTレシピエントにおけるユニークな機能シグネチャーを駆動するかどうかは依然として不明である。この疑問を解決するために、我々は偏りのないグローバルメタボロミクスを実施し、マッチさせたFMTドナーとレシピエントにおける糞便代謝物の存在量の差を比較した。便メタボロミクスデータの非制約順序解析と階層的クラスタリング解析を用いて、FMT前後の検体を区別する有意な代謝物スーパークラスターを同定したが、ドナー特異的な機能回復を示すことはできなかった（図6A、B）。これらの知見は、FMTレシピエントに移植されたドナー種と株変異の代謝の冗長性を示している27。特定の代謝物クラスターをFMTの臨床成績に割り当てることで、代謝物クラスターIIIにおいてジペプチドの多様性が高く、FMT成功者および年齢が一致した健常者と有意に関連することが示された（補足図9）。したがって、便のジペプチド多様性のプロファイリングは、多様なタンパク質分解活性および/またはペプチジル活性を反映する健康な宿主微生物叢インタラクトームの機能的バイオマーカーとして有用である可能性がある。この知見は、Procrustesによるマイクロバイオームとメタボロームのシグネチャーのオミックス統合と二部ネットワーク解析によって検証され、FMTの有効性と関連する明確な患者転帰クラスターが同定された（図6C、D）。

図6：糞便メタボロミクスはFMT後の代謝産物の再構成を示したが、ドナー特異的な回復を示すことはできなかった。
図6
A 便中代謝物の主座標分析により、FMT前とFMT後のサンプルを区別。B 階層的クラスタリング解析により、健常者と生物学的異常者を区別する3つの代謝物クラスターが同定された。生着指数β1またはβ2と有意な（FDR < 0.05）スペアマン相関を示した代謝物のみを解析に含めた。C Procrustes解析により、FMT前とFMT後の検体を区別するメタゲノムプロファイルとメタボロームプロファイルの間に高い一致性が認められた。距離の計算にはアバンダンス加重Jaccard距離メトリックを用いた。D ASV-メタボローム二部構造ネットワーク解析により、健康なマイクロバイオームと生物多様性に問題のあるマイクロバイオームが区別された。有意な（FDR < 0.05）スピアマン相関と係数が0.4以上または0.4未満のASVと代謝物のみがネットワーク解析に含まれた。

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FMT後の年齢に依存した代謝産物の回復
rCDIの小児患者において、成人ドナーのマイクロバイオームの特徴が安定的に生着（β1＞0.6）した後、年齢に応じた機能回復があるかどうかを確認するために、成人ドナー便のメタボロミクスプロファイルをFMT前後の検体で比較解析した。その結果、健常な小児FMTレシピエントでは、成人ドナーの便と比較して73種類の代謝物が異なっていることが明らかになった（補足図10）。これらの差分代謝物はさらに代謝濃縮解析を行い、FMTレシピエントにおけるシステインおよびメチオニン代謝、アミノアシルtRNA生合成、パントテン酸およびCoA生合成、バリン、ロイシンおよびイソロイシン生合成および分解を含む5つの年齢依存性代謝機能を同定した（図7Aおよび補足データ）。これらの代謝経路の濃縮は、年齢をマッチさせた健常児でさらに確認され、小児特有の代謝産物の回復が成人の微生物由来のシグナルとは独立して起こることが示された（図7A）。しかし、非機能的なメタゲノミクスプロファイリング（補足図11A）では、これらの経路に有意差は観察されず、代謝プロファイリングとメタゲノミクスプロファイリングの間に強い不一致があることが示唆された。代謝プロファイリングでは、バリン、ロイシン、イソロイシンを含む分岐鎖アミノ酸（BCAA）の小児における分解亢進に反応して、微生物の分岐鎖アミノトランスフェラーゼ（BCAT）の活性が上昇していることも明らかになったが、これはメタゲノムプロファイリングでは検出されなかった（補足図11B）。この観察は、別の独立した健常小児コホートでも検証された（図7B）。

図7：メタボロミクスは、成人ドナーの生着とは無関係に回復する小児特有の経路を同定する。
図7
メタボロームセット濃縮解析により、健常小児（HCおよびPostFMT）で保存されている重要な代謝経路が同定された。健常小児と成人ドナーを区別する上位5経路が強調表示されている（赤）。B分岐鎖アミノ酸分解は、FMT後と健常児で有意に上昇している。ドナー、FMT後（β1 > 0.6）およびHCサンプルについて、BH手順を用いたクラスカル・ワリス検定： *p < 0.05. 表記： BCAT 分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、BCKD 分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ。

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考察
微生物叢の生着率は、rCDIまたは炎症性腸疾患の患者におけるFMTの有効性を評価するためのパラメーターとしてよく認識されている。しかし、これまでに報告されているα多様性、非類似度計算、分類学的存在量を用いた生着率指標では、ドナーに特異的な微生物叢の生着率を正確に特定することはできなかった8,9,10。これらの方法は、16Sアンプリコン配列のクラスタリングに使用される97％の類似性など、上流処理の限界のため、菌株レベルの推論には適していない30。これらの方法は、FMT後のrCDIレシピエントにおけるマイクロバイオーム群集全体の回復、さらには臨床転帰の予測には成功したが、ドナーのマイクロバイオームとレシピエントの生着パターンとの正確な関連性を確立することはできず、菌株レベルのプロファイリングが必要となる。一方、メタゲノミクスに基づく菌株追跡も、深い配列決定と計算集約的な処理を必要とするメタゲノム変異体プロファイリングに依存しているため、問題がある可能性がある11,12,13,14。

菌株レベルの推論に代わるアプローチとしては、16Sアンプリコンデータの配列ノイズ除去を用いる方法があり、ASVの一塩基の違いに基づいて菌株を区別できることが示されている15。数理モデルを用いて、FMTレシピエントにおけるドナーASVの特異的生着を示すことに成功した。さらに、臨床効果と有意に相関する新しい生着指標を開発し、複数のFMTコホートに対してこのアプローチを検証した。われわれのモデルは、ドナーASVの生着に基づいて臨床転帰を予測することができたため、この参照に依存しない分類学にとらわれないアプローチは、FMTの転帰を迅速かつ計算費用効果の高い方法でモニタリングするための臨床的有用性の可能性を秘めている。

ASVアプローチはいくつかの種の株を同定するが、使用されるアンプリコンの長さと単一のマーカー遺伝子によって制限される。詳細な塩基配列を決定したメタゲノムデータを用いた、より高度な菌株レベルプロファイリングツールを用いれば、より正確に同定できる可能性がある。患者の糞便検体からプロバイオティクス製品を同定し定量化することの固有の問題はよく認識されているが、複数の全長標的アンプリコンを生成するロングリードシーケンシング戦略により、菌株レベルの推論を改善できる可能性がある31。我々は、成人および小児の機能性胃腸障害患者におけるプロバイオティクス・コンソーシアの移植の臨床的有効性を評価するために、菌株レベルの解像度を採用することで、広範な有用性を実証した。メタゲノミクス・プロファイリングによりプロバイオティクス菌株を正確に検出することで、症状の緩和と菌の生着との相関がより有意になった。あるいは、これは臨床的に反応しない被験者によるプロバイオティクス製品の摂取コンプライアンス不良を反映している可能性もある。

FMTは、小児のrCDIに対する有効な治療法としても浮上している。しかし、小児のマイクロバイオームの発達は成人のそれとは異なるため、成人の糞便ドナーが小児患者において年齢に応じた効果的な機能回復を提供できるかどうかは依然として不明である。われわれの解析により、小児のrCDIレシピエントでは成人ドナー特異的生着が優勢であり、ドナー特異的菌株の生着と機能的代謝産物の回復との間に高い一致が観察されることが明らかになった。また、われわれの統合システムアプローチにより、代謝産物の回復と一致したドナー株移植が、成人および小児のrCDI患者におけるFMT転帰と関連することが示された。ドナー固有の株移植がFMT転帰を予測する一方で、代謝回復におけるドナーの機能的冗長性が観察された。興味深いことに、筋肉、免疫、脳の発達に有益であることが報告されているBCAA分解の上昇など、加齢に関連した代謝依存性がFMT後に明らかになった32。したがって、成人の糞便ドナーを小児患者の治療に用いても、発達に特異的な代謝機能は保持される。この知見は、小児FMTにおける糞便ドナーの年齢適合の妥当性に関する現在進行中の議論に貢献するはずである。

微生物叢の移植が成功した場合に期待される結果のひとつに、FMT後の酪酸や二次胆汁酸の上昇といった腸内代謝産物の回復がある21,33。小児rCDI患者における成人微生物叢の生着が観察された一方で、本研究のもう一つの強みは、小児特異的形質として同定されたBCAA代謝など、成人ドナーと小児レシピエントとのユニークなメタボローム比較を提供できたことである。C.difficileはStickland反応によってBCAAを利用する可能性があるが34、BCAAはグローバル制御因子CodYのtcdRプロモーター領域への結合を増強し、C.difficileの毒素遺伝子発現を抑制することが示されている35。BCAA代謝は、C. difficileの活動性感染と無症候性保菌の鑑別に関与しており36、若年無症候性小児におけるC. difficileの高い有病率の代替説明となるかもしれない37。さらに、特定の腸内細菌は、IgA関連の免疫恒常性を高める分岐型短鎖脂肪酸（BSCFA）の産生における前駆体としてBCAAを使用する38。全体として、我々の結果は、腸内細菌叢の生着にかかわらず、小児特有の代謝物シグネチャーの存在を浮き彫りにした。

方法
患者コホート
小児rCDIおよび潰瘍性大腸炎患者の治療に使用されたFMTは、ベイラー医科大学のIRB承認インフォームドコンセント（#H-31066）のもと、テキサス小児病院で2013年から2016年まで実施された。16 S rDNAアンプリコンデータに基づくマイクロバイオームの予備的知見が最近報告された17。成人のFMT症例から得られたシークエンスデータは、研究の検証に使用された20,21,22,23,24。成人のIBSおよび小児の自閉症スペクトラム障害におけるプロバイオティクスVSL#3またはVISBIOME治療について、当社が以前に報告した2つの介入研究が、菌株追跡の検証に使用された25,26。

便マイクロバイオームシークエンシング
患者およびFMTドナーから採取した便サンプルは、PowerSoil® DNA Isolation Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて、製造元の指示に従ってDNA抽出を行った。ショットガンメタゲノムシークエンシングは、BGI Genomics Co. (Ltd.（中国、香港）により実施され、最低200 ngのDNAインプットが必要であった。サンプルのQC、ショットガンライブラリーの構築、シーケンシングはすべてBGIのサービスチームが行い、2×150 bpのペアエンドリードを生成した。

16Sアンプリコンデータ解析とFMTデータセットのメタ解析
16Sアンプリコンデータ解析では、vsearch (version 2.9.0)を用いてペアエンドリードをデフォルトパラメータでマージした。その後、DADA2（バージョン1.8.0）15を用いてquality filtering（maxEE=2）と配列ノイズ除去を行い、推奨される手順に従ってamplicon sequence variants（ASVs）プロファイルを作成した。ASV配列の分類学的アノテーションは、RパッケージDECIPHER（バージョン2.6.0）39のIdTaxa関数と、事前に構築された16Sトレーニングデータセット（SILVAリリース132）を用いて行った。NCBI 16S rRNA参照データベースに対して特定のASVについてBLASTn検索を実行し、100%のカバレッジと100%の同一性を持つトップヒットを潜在的な種の注釈に使用した。DECIPHERパッケージのAlignSeqs関数を用いてASVのマルチプル配列アライメントを行い、配列アライメントにはFastTree（バージョン2.1.3）を用いて近似最尤系統樹を構築した。その他の一般公開されている16Sデータセットの解析には、上記に示したように配列ノイズ除去解析を行った。ASV プロファイルの正規化には、ランダムなレアファクション処理を行わない Total Sum Scaling 法を用いた。ノイズ除去アプローチによってシングルトン出現の大幅な減少が達成されたこと、および実世界のマイクロバイオームデータセットの信頼できるグランドトゥルースデータが不足していることから、本研究ではASVアバンダンスフィルタリングまたはASV有病率フィルタリングを採用しないことを選択した。これらの手法には、我々の調査の主な焦点であったドナーを区別する特徴的な特徴を排除する可能性がある。しかし、ドナー特異的な生着における（キメラではなく）偽のASVの寄与を調べるベンチマーク目的で、"filter_otus_from_otu_table.py "スクリプトを使用し、"-min_count_fraction "パラメータを0.01%に設定したabundance filteringを実施した。

ASVカウント情報を用いて、SourceTracker240を用いてCDI-FMTサンプルを解析した（ドナーおよびPreFMTサンプルはソース、PostFMTサンプルはシンクとラベル付け）。主座標分析（PCoA）または非計量多次元尺度法（NMDS）を用いた非拘束順序解析は、ASV相対存在量プロファイルについて計算された二値Jaccard距離、存在量加重Jaccard距離、加重および非加重UniFrac距離、およびBray-Curtis非類似度指数を含む異なる距離測定基準で実行された。999の並べ替えを用いて2つ以上のサンプルグループ間の有意差を統計的に測定するために、距離プロファイルについてveganパッケージのanosim関数を用いて類似性分析（ANOSIM）検定を行った。因子（すなわちASV）の2次元順序プロット（最初の2つの座標）へのフィッティングは、veganパッケージ（バージョン2.6-2）のenvfit関数を用いて達成した。フィットした因子の有意性は、envfitの実行で999の並べ替えを用いて確立した。Cytoscape41ツールで、Edge-weighted Spring Embedded Layoutアルゴリズムを用いて、患者-ASV二分子ネットワークを作成した。

ショットガンメタゲノムデータ解析
vsearch (version 2.9.0)を用いて、maxEEを1、最小長を100塩基としてペアエンドリードのQuality Trimmingを行い、さらにbbmap (version 38.34)を用いて再ペアリングを行った。次に、リードマッピングに基づく3つの分類学的プロファイリングツール、MetaPhlAn3（バージョン3.0.7）42とその構築済みデータベース（mpa_v30_CHOCOPhlAn_201901）、mOTUs（バージョン2.6）43とそのデフォルトデータベース、およびKraken2（バージョン2.08）44とその構築済みデータベース（minikraken2_v2_8GB_201904_UPDATE）を、デフォルトパラメータを使用してショットガンメタゲノム解析に適用した。HUMAnN3（バージョン3.6）は、MetaCycおよびKEGGデータベース42を用いた代謝パスウェイおよび遺伝子ファミリーのプロファイリングに使用した。

mOTUs (version 2.6)43に実装されているメタゲノムバリアントコーリングパイプラインmetaSNV (version 1.0.3)を使用して、カスタムパラメータ(-fb 0.01 -fd 0.001 -fm 1 -fc 0.001)でバリアントコーリングプロファイルを作成し、置換を高感度に検出した。フィルタリングされた対立遺伝子頻度表は、バイナリJaccard距離を計算するための入力行列として扱われ、PCoA解析が続いた。また、PanPhlAn3を用いて、事前に構築した特定生物種のパンゲノムデータベースに配列リードをマッピングし、カスタムパラメータ（-min_coverage 1 --left_max 1.70 --right_min 0.30）を用いてプロファイリングするステップにより、別の菌株検出解析を行った。汎ゲノム遺伝子テーブルのリードカウントは、バイナリJaccard距離を計算するための入力マトリックスとして扱われ、その後PCoA解析が行われた。veganパッケージのanosim関数を用いて、バイナリーJaccard距離プロファイルに対してANOSIM検定を行い、999の並べ替えを用いて統計的にグループ差を評価した。MetaPhlAn3データベースを使用する第3のメタゲノム菌株追跡ツールSameStr（バージョン1.2023.04-1）18は、デフォルトのパラメータを使用して採用した。

ヒト配列リードをbowtie2（バージョン2.3.4.3）とヒトリファレンスゲノム（バージョンhg19）を用いてフィルターし、その後、bbmap（バージョン38.34）のスクリプトbbnorm.shを用いてカスタムパラメータ（target=40 min=5）でデジタル正規化した。全サンプルの正規化リードを、カスタムパラメーター（-min-contig-len 2000）を用いて、megahit（バージョン1.1.4）でde novo共アセンブルするために連結した。メタゲノム解析は、Anvi'o プラットフォーム（バージョン 7）19 を用いて、通常のメタゲノム解析ワークフローに記載されている手順に従って行った。具体的には、anvi-cluster-contigs コマンドに実装されている metabat2 を選択し、この大規模なデータセットのメタゲノミックビニングを行い、冗長性の高い（10%以上）1つのメタゲノミックビンに対してさらにガイド付き精密化を行った。遺伝子コールはanvi-get-sequences-for-gene-callsコマンドで、機能アノテーションはEggNOG-mapper（バージョン2.0.1）で行った。anvi-estimate-scg-taxonomyコマンドは、シングルコピーのコア遺伝子を同定した後、メタゲノムBin（redundancy<10%）の分類学を推論するために使用された。anvi-summarizeコマンドは出力プロファイルの生成に使用され、Anvi'o view - detection profile（コンティグ内で少なくとも1倍以上カバーされているヌクレオチドの割合）は、ユークリッド距離とWardクラスタリングアルゴリズムを使用した下流の階層的クラスタリング解析に使用された。

FMT生着指標の作成
ドナーとレシピエントのペアリング情報は、マッチングされたFMT前後のドナーの糞便サンプルを比較する生着指標を計算するために不可欠な要件である。我々のアプローチでは、ASVプロファイリングのβ多様性解析を利用して、FMTレシピエントにおけるドナー特異的微生物叢の移植を決定する。β多様性解析から得られたPCo1とPCo2の値を利用して、FMT前後のサンプル間の距離D1と、ドナーとFMT後の座標間の距離D2を計算する。FMT後座標とドナー座標からそれぞれ計算されたθ1とθ2は、2つの生着指標を生成するために利用される：

$${\upbeta}1 = \frac{{{{{\mathrm{D}}}}1}}{{{{{\mathrm{D}}}}2}} \times {{mathrm{cos}}}}left( {left| {{uptheta}1 - {uptheta}2}} ㊟right|} ㊟right)$$.
β1値はドナー特異的生着率の定性的尺度を提供し、値が1.0であればドナー微生物叢によるFMTレシピエントの生着率が100%であることを示す。一方、β2値は、ドナー特異的な微生物叢の生着率の定量的な指標を表し、同時にFMT前後の検体間の微生物叢の違いを表す。β2値が高いほど、より有意な微生物叢移植を意味し、ドナーの微生物叢移植に対するレシピエントの受容性が高いことを反映している。

便メタボロミクス
凍結乾燥した糞便検体をMetabolon Inc.に転送し、グローバルHD4代謝物プロファイリングを実施した。メタボロミクスシグネチャーについて、存在量重み付けJaccard距離を算出し、続いて主座標分析を行った。マイクロバイオーム（ASV）および代謝物データは、共通のβ多様性指標および順序付け法を用いて処理され、独立したオミックスデータセットの一致する構成（形状）を評価するためにProcrustes解析が使用された。階層的クラスタリング解析はpheatmapパッケージ（バージョン1.0.12、デフォルトパラメータ）を用いて行った。統計解析はメタボロミクスプロファイルに対して行い、データの正規化や変換を行わずに群間差を評価した。メタボロームセット濃縮解析は、Human Metabolome Database（HMDB）に掲載されている化合物を参照し、MetaboAnalyst（バージョン5.0）を用いて行った。代謝物セットの濃縮解析には、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイデータベースを代謝物セットライブラリとして利用した。

統計解析
群間比較にはWilcoxon検定およびKruskal-Wallis検定を適用した。多重比較を調整するため、Benjamini-Hochberg 偽発見検定を 0.05 の閾値に設定した。スピアマンの順位相関係数はRの基本関数cor.test()を用いて計算した。ボックスプロットはggplot2パッケージを用いて作成した：ボックスプロットで表現されるデータは、25％から75％の四分位範囲を持つ中央値として表示される。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照されたい。

データの入手可能性
我々のFMTコホート（アクセッション番号PRJNA735699）、5つの公開FMTコホート（PRJNA238042、PRJNA221789、PRJNA303184、PRJEB19996、PRJNA311224）、および我々の2つのプロバイオティクス介入コホート（PRJNA941891およびPRJNA941893）の16Sアンプリコン配列データは、NCBI Sequence Read Archive（SRA）データベースに寄託された。FMTコホート（PRJNA765331）、2つのパブリックFMTコホート（PRJEB23524およびPRJNA678737）、および2つのプロバイオティクス介入コホート（PRJNA725223およびPRJNA940472）のディープショットガンメタゲノム配列データもNCBI SRAデータベースに寄託した。

コードの利用可能性
16Sアンプリコンデータのバリアントコーリング解析、生着インデックスの生成、メタゲノムSNP解析およびde novoメタゲノムco-assembly解析のコードおよびスクリプトはhttps://github.com/qinglong89/FMT_engraftment。

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参考文献のダウンロード

謝辞
本研究は、米国国立衛生研究所からの助成金R01-AI10091401、R01 NR05337、P30-DK56338、RO1-DK130517、P01-AI152999、およびU01-AI24290、キングモンクット工科大学ラカバン校医学部アカデミック・メルティング・ポット・プロジェクトの下でのキングモンクット工科大学ラカバン校研究・イノベーション基金、およびタイ科学研究・イノベーションからの資金援助を受けている： 基礎基金、タイ科学研究・イノベーション基金、篤志家基金 また、Brock Wagner家、Klaasmeyer家、Frugoni家およびGutsy Kids基金を支援するその他の寛大な寄付者からの慈善寄付もある。

著者情報
著者および所属
米国テキサス州ヒューストン、ベイラー医科大学病理学・免疫学教室

Qinglong Wu、Prapaporn Boonma、Shyam Badu、Nazli Yalcinkaya、Sik Yu So、Tor C. Savidge

米国テキサス州ヒューストン、テキサス小児病院病理部、テキサス小児マイクロバイオームセンター

Qinglong Wu、Prapaporn Boonma、Shyam Badu、Nazli Yalcinkaya、Sik Yu So、Tor C. Savidge

タイ、バンコク、キングモンクット工科大学ラカバン校医学部

プラパポーン・ブーンマ

米国テキサス州ヒューストン、ヒューストン大学薬学部、薬学実践・トランスレーショナルリサーチ学科

ケビン・W・ガリー

米国オハイオ州コロンバス、オハイオ州立大学・ネーションワイド小児病院小児科

ケント・ウィリアムズ

オハイオ州立大学精神医学・行動衛生学部（米国オハイオ州コロンバス

L. ユージン・アーノルド

米国テキサス州ヒューストン、ベイラー医科大学・テキサス小児病院小児科

ロバート・J・シュルマン、リチャード・ケラーマイヤー

貢献
Q.W.とT.C.S.が本研究の概念化とデータ解釈を主導し、Q.W.、P.B.、S.B.、N.Y.、S.Y.S.がデータ収集と解析を行い、K.W.G.、K.W.、P.B.、L.E.A.、R.J.S.、R.K.が結果について批判的な討論を行い、Q.W.とT.C.S.が原稿を執筆した。

責任著者
Tor C. Savidge宛。

倫理申告
競合利益
T.C.S.はMerck社、Nivalis社、Cubist社、Mead Johnson社、Rebiotix社、BioFire社、Assembly BioSciences社から研究資金を受領し、Rebiotix社とBioFire社の顧問委員を務めている。K.W.G.はAcurx社、Paratek社、Seres Health社から研究助成を受けた。それ以外の著者は利害関係を明らかにしていない。

その他の情報
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Wu,Q.,Boonma,P.,Badu,S.他. 便中微生物叢療法とプロバイオティクスによる胃腸症状の解消におけるドナー-レシピエント特異性と年齢依存性. npj Biofilms Microbiomes 9, 54 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00421-4

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受理
2023年3月24日

受理
2023年7月20日

掲載
2023年08月03日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41522-023-00421-4

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バイオフィルムとマイクロバイオーム (npj Biofilms Microbiomes) ISSN 2055-5008 (online)

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