腸内細菌叢組成が勃起不全の指標となる可能性
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アプライド・マイクロバイオロジー・インターナショナル
微生物バイオテクノロジー第17巻第1号e14403
研究論文
オープンアクセス
腸内細菌叢組成が勃起不全の指標となる可能性
https://ami-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.14403
Yu Qiao, Jianhuai Chen, Yongsheng Jiang, Ziheng Zhang, Heng Wang, Tao Liu, Zhaoxu Yang, Guangbo Fu, Yun Chen
初出：2024年1月16日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14403
Yu QiaoとJianhuai Chenは共同筆頭著者である。
概要
セクション
要旨
勃起不全（ED）は身体的・精神的疾患と考えられている。腸内細菌叢と健康や疾患との間には様々な関連性がある可能性が見出されている。本研究では、健常対照群とED患者の腸内細菌叢を比較することで、EDと腸内細菌叢の関係を検討した。その結果、ED群では対照群と比較してバクテロイデス、フソバクテリウム、ラクノクロストリジウム、エシェリヒア・シゲラ、メガモナスの相対量が有意に高く、ビフィドバクテリウムの相対量が有意に低いことが明らかになった。腸内細菌叢の異常は、腸管バリア、心臓血管系および精神衛生に影響を及ぼすことによって、EDの発症および進行に関与しており、EDの病態生理を理解する上で新たな視点を提供した。さらに、我々はいくつかの重要な腸内細菌叢を同定した。16S rRNAシーケンスと機械学習技術を組み合わせることで、EDの早期発見における腸内細菌叢の重要な価値と影響を明らかにすることができた。
はじめに
性機能障害（SD）とは、性的行動や感覚に影響を及ぼし、性的刺激に対する反応が異常であったり不十分であったりする障害のことである。調査によると、40～70歳の男性の約52％が何らかのSDを経験している（Cho & Duffy, 2019）。男性のSDの最も一般的なタイプの1つはEDであり、これは満足な性交渉のために十分な陰茎勃起を達成し維持することができないことと定義される（Saloniaら、2021）。EDはその病因に基づいて、心理的ED、器質的ED、混合性EDに分類することができる。心理学的および生理学的な観点から、EDは身体的および精神的な病気であると考えられている。男性の自尊心、自信、キャリア形成、対人コミュニケーションに有害な影響を及ぼす可能性がある。さらに、不妊の原因になったり、配偶者間の感情的な調和を乱すこともあります。男性の性機能に悪影響を及ぼす危険因子には、高齢、肥満、喫煙、運動不足、高血圧、心血管疾患（CVD）、糖尿病、高脂血症、メタボリックシンドローム、不安、うつ病など様々なものがある（Gengら、2021；Russoら、2023）。International Index of Erectile Function-5 (IIEF-5)は、男性の勃起機能を評価するための自己報告式のスクリーニングツールとして広く用いられている(Rosen et al., 1999)。IIEF-5は高感度であることが証明されており、EDの重症度を評価するための主要な検査として推奨されている(Rhoden et al., 2002)。
ヒトの腸内細菌叢は、人体最大の生態系と考えられており、微生物群集から構成されている。微生物臓器」として機能する腸内細菌叢は、恒常性の維持に重要な役割を果たしており、健康と疾患の両方に密接に関連している（Zhang et al.） ディスバイオーシスとは、健康な個体と比較して、疾患を持つ個体における微生物叢の組成と機能の変化を指す。この変化には、有益な微生物の減少と潜在的に有害な微生物の増加が関与している可能性がある（Tiffany & Bäumler, 2019）。炎症性腸疾患、関節炎、がん、神経精神疾患、心血管疾患、肥満、2型糖尿病、不妊症など、数多くの疾患が腸内細菌叢と関連している（Badranら、2020；Fabozziら、2022；Papadopoulosら、2022；Sonaliら、2022；Zhouら、2020）。炎症反応、心血管疾患、精神障害は、腸内細菌叢に関連する疾患の中でもEDの重大な原因および危険因子である（Gengら、2021；Russoら、2023）。したがって、腸内細菌叢とEDの発生・発症との間には相関関係があるという仮説を立てた。本研究では、臨床データを用いて健常対照者とED患者の腸内細菌叢を比較することにより、この相関関係を探ることを目的とする。さらに、本研究では、ED予防のための潜在的な診断ツールとしての腸内細菌叢プロファイルについても調査する。
実験手順
被験者の募集
2023年に南京中医薬大学附属病院男性科と南京医科大学附属淮安第一人民病院生殖センター科からEDと診断された男性患者計53名を募集した。また、対照として性機能が正常な男性32人を登録した。本研究は、南京中医薬大学附属病院および南京医科大学附属淮安第一人民病院の倫理委員会の審査・承認を得た。参加者は全員、同意書に署名することでインフォームド・コンセントを得た。アンケートと電子カルテにより、人口統計学的情報と臨床情報を収集した。参加者はBDI、BAI、IIEF-5評価ツールを用いて評価を受けた。分析のため、参加者全員から血清と糞便サンプルが採取された。本研究の対象者は以下の通りである： 中等教育または高等教育を修了している者、②異性愛者であり、少なくとも6ヵ月間、単一の安定したパートナーと定期的に性行為を行っている者、③外性器の発達が正常である者。以下の基準のいずれかに該当する参加者は本研究から除外した： 過去3ヵ月以内に抗生物質、プロバイオティクス、ホルモン剤、インスリン、プロトンポンプ阻害剤、漢方薬による治療を受けた者、②過去3ヵ月以内に放射線治療、化学療法、消化管手術、胃内視鏡検査を受けた者、③自己免疫疾患、悪性腫瘍、慢性下痢症、便秘症の者。
EDの判定
IIEF-5を用いてEDの重症度を評価した。21点以上は正常な勃起機能を示し、このカットオフ値以下はEDの存在を示した。診断は少なくとも2人の主治医によって確認された。
臨床的特徴の統計解析
本研究では、データの処理と分析にSPSS23.0統計ソフトを利用した。正確さを期すため、連続変数の各グループについて正規性検定を行った。正規分布の測定データについては、結果をX±Sで示し、2群間の比較にはt検定を用いた。非正規分布の測定データは、M（P25、P75）を用いて表示した。2群間の比較にはノンパラメトリックのMann-Whitney U検定を用いた。カテゴリーデータは度数で示した。比率はχ2検定またはFisher exact検定を用いて比較した。p値が0.05未満を統計的に有意とみなした。
糞便サンプルの収集
本研究では、すべての参加者から滅菌プラスチックスプーンを用いて糞便サンプルを採取し、滅菌プラスチックチューブに保存した。サンプルは速やかに-20℃の冷蔵庫に入れ、24時間以内に-80℃の冷蔵庫に移して保存した。
DNA抽出とPCR増幅
糞便サンプルから腸内細菌叢の全DNAを得るために、E.Z.N.A.® stool DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）を使用し、製造者の指示に従った。プライマーペア338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を用いて、ABI GeneAmp® 9700 PCRサーモサイクラー（ABI、米国カリフォルニア州）を用いて、細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4可変領域を増幅した。この研究で使用したPCRサイクリングパラメーターは以下の通りである：最初の変性ステップを95℃で3分間、続いて変性ステップを95℃で30秒間、アニーリングステップを55℃で30秒間、伸長ステップを72℃で45秒間からなるサイクルを27回行った。増幅混合物量は20μLで、5×FastPfuバッファー4μL、2.5mM dNTPs 2μL、Forward Primer (5 μM)0.8μL、Reverse Primer (5 μM)0.8μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、BSA 0.2μL、Template DNA 10ngを含む。
シーケンス処理
ペアエンドシーケンスは、Illumina Miseq PE300プラットフォーム（Illumina, San Diego, USA）を用いて行った。生データはスクリーニングを受け、200 bpより短い配列、低品質スコア（≤20）、あいまいな塩基、プライマー配列およびバーコードタグに一致しない塩基は除去された。イルミナシーケンスから得られた適格なPEリードは、重複関係に基づきFLASH（バージョン1.2.7）を用いてマージした。配列は97%の類似度閾値に基づいて操作分類学的単位（OTU）にグループ化され、Silvaデータベース（v138）と比較された。
バイオインフォマティクス解析
α-多様性を評価するために、Shannon index、Ace index、Chao index、Simpson indexを利用した。β多様性の検討には、主座標分析（PCoA）と非計量多次元尺度法（NMDS）を用いた。Wilcoxon順位和検定を用いて、門レベルおよび属レベルでの2群間の差異を検討した。2群間で発現量の異なる細菌を同定するために、LDAの閾値を3.5とした線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）を採用した。IL-6の血清レベルとIIEF-5、ベック抑うつ目録（BDI）、ベック不安目録（BAI）の総スコアとの相関を分析した。スピアマン相関ヒートマップを用いて、腸内細菌叢と臨床指標との関連を示した。
ランダムフォレスト分類器の構築
分類モデルは、randomForest Rパッケージのランダムフォレスト法を用いて構築した。コホート全体をランダムに訓練コホートと検証コホートに分割した。これらの2群間で精度が低下した上位15位までの変数を同定した。モデルの予測性能は、受信者動作特性（ROC）曲線下面積を用いて評価し、曲線下面積（AUC）を算出した。
結果
参加者の人口統計学的データと臨床データ
表S1に示すように、年齢、肥満度（BMI）、高血圧、糖尿病などの人口統計学的特性は、対照群とED群で有意差はなかった。さらに、性ホルモン（Tとプロラクチン（PRL））の血清レベルと生化学的指標を両群間で比較した。PRL、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、尿素濾過酵素（UREA）、クレアチニン（CREA）、総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、インターロイキン-1β（IL-1β）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、トリメチルアミンオキシド（TMAO）、5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）の血清レベルは、両群間に有意差は認められなかった。しかし、対照群ではED群と比較して血清中のT濃度が高く、対照群のIL-6と尿酸（UA）濃度はED群と比較して低かった（Table S1）。表S1において、BDIとBAIの合計得点は、対照群と比較してED群で有意に高かった。一方、IIEF-5の総得点は、対照群と比較してED群で有意に低かった。
対照群とED群の腸内細菌組成、α多様性、β多様性
ベン図を用いて2群間の重複OTUデータを表示した。分析の結果、619のOTUが全サンプルで共有されていることが示された。具体的には、ED群では約140のOTUが同定され、対照群では約56のOTUが同定された（図1A）。
詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
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腸内細菌叢組成のα多様性は、Shannon index、Ace index、Chao index、Simpson indexを用いて分析した。結果を図1B-Eに示す。その結果、シャノン指数は対照群と比較してED群で高いことが示された（p = 0.04082）。
Bray-Curtis距離に基づいて多次元データを可視化し、主座標を求めるために、PCoAを実施した。PCoAの結果、対照群とED群では細菌群集に有意差が認められた。NMDSの結果からも、対照群とED群では微生物群集の分布が異なることが示された。
図2Aは、両群の主要な腸内細菌叢の門レベルでの相対的な存在量を示したものである。その結果、両群間に有意差が認められた。具体的には、図2Bに示すように、ED群では対照群に比べ、バクテロイデス門、プロテオバクテリウム門、フソバクテリウム門、デスルホバクテリウム門、ベルコミクテリウム門の相対存在量が有意に高かった。
詳細は画像に続くキャプションを参照。
図2
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図2Cは、2群の主要な腸内細菌叢の属レベルでの相対的存在量を示している。対照群はED群と比較して、ビフィズス菌の相対存在量が有意に高いことがわかった。さらに、対照群では、バクテロイデス、エシェリヒア・シゲラ、ラクノクロストリジウム、ロゼブリア、メガモナスなど様々な細菌の相対量が有意に減少した、 unclassified_f__Lachnospiraceae、Coprococcus、Anaerostipes、Butyricicoccus、Fusobacterium、Eubacterium_ventriosum_group、CAG-56、Parabacteroides、norank_f__Ruminococcaceaeなどである（図2D）。
EDに関連する細菌分類群と優勢菌を同定するために、LEfSe解析を行った。その結果、図2E,Fに示すように、ED群では対照群と比較して、バクテロイデス属、メガモナス属、エシェリヒア・シゲラ属、ラクノクロストリジウム属、ロゼブリア属、フソバクテリウム属、コプロコッカス属の相対量が増加していた。
血清IL-6値および腸内細菌叢と臨床指標との関連性
IL-6の血清レベルはIIEF-5の総スコアとは負の相関を示したが、BDIおよびBAIの総スコアとは正の相関を示した。BDIとの相関は統計的に有意であった（図3A-C）。
詳細は画像に続くキャプションを参照。
図3
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腸内細菌叢と性ホルモン値、生化学的指標、スケールスコアなどの臨床指標との関係を調べるため、属レベルでのスピアマン相関ヒートマップ解析を行った（図3D）。
分析の結果、IL-1βとIL-6の血清レベルは、ビフィドバクテリウムの相対的存在量と負の相関を示し、バクテロイデスの相対的存在量とは正の相関を示した。さらに、血清TMAOレベルとLachnoclostridiumおよびBacteroidesの相対存在量との間には正の相関があった。さらに、BDIの総スコアはビフィドバクテリウムの相対量と統計学的に有意な負の相関を示したが、バクテロイデス、エシェリヒア・シゲラ、ラクノクロストリジウム、メガモナスの相対量とは正の相関を示した。
腸内細菌マーカーに基づくEDの診断可能性
ランダムフォレストアルゴリズムを用いて、ED患者の反応予測分類法を開発した。トレーニングデータセットを作成するために、10重クロスバリデーションを用いて特定の属マーカーを選択した。その後、ランダムフォレスト分類器を訓練し、15属の特徴の重要性を決定し、モデルへの寄与に基づいてランク付けした。モデルによって同定された重要な属は、平均減少精度を用いて説明した（図4A）。トレーニングデータセットから得られたAUCは0.719（95%信頼区間（CI）、0.509-0.929）であった（図4B）。テストセットでは、AUCは1.000（95％CI、1.000-1.000）であり（図4C）、ED患者と健常者をうまく区別できたことを示している。
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図4
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考察
対照群とED群では腸内細菌叢に違いが認められた。ベン図を見ると、各群に固有の分類群があり、異なる腸内細菌叢が浮き彫りになった。我々の知見では、α多様性（シャノン指数）が対照群と比較してED群で高いことが示されたが、これは以前の研究（Gengら、2021年）と矛盾するものであった。これは、有益な細菌が減少し、潜在的に有害な細菌が増加したためと考えられる。さらに、我々の研究では、2群間の微生物群集構造（β-多様性）の違いが明らかになり、対照群とED群の明確な棲み分けが示された。LEfSe分析では、ED患者の腸内微生物生態系の崩壊が示された。具体的には、対照群ではビフィドバクテリウムの相対存在量が高かったのに対し、ED群ではバクテロイデス、メガモナス、エシェリヒア・シゲラ、ラクノクロストリジウム、ロゼブリア、フソバクテリウム、コプロコッカスの相対存在量が高かった。
腸管バリアは、腸内の有害物質や微生物から身を守る役割を果たしており、ヒトの健康維持に極めて重要である（Martelら、2022）。正常な腸内細菌叢とその代謝産物は、腸の完全性と透過性の維持に重要な役割を果たしている（Papadopoulosら、2022）。腸内細菌叢のバランスが崩れると、腸管バリアが損傷し、リポ多糖（LPS）のような毒素が循環系に漏出するようになる。この漏出は、単球をリクルートしToll様受容体を活性化することにより、全身性炎症を誘発する（Badranら、2020；Sunら、2016）。炎症反応はEDの発症機序のひとつと考えられている（Vlachopoulosら、2007）。本研究では、炎症性サイトカインのレベルを2群間で比較した。その結果、IL-6濃度は対照群と比較してED群で顕著に高かった。さらに、相関分析により、IL-6の血清レベルとIIEF-5の総スコアとの間に負の相関があることが示された。さらに、IL-1βとTNF-αのレベルもED群で高かったが、その差は統計的に有意ではなかった。IL-6はサイトカインストームと直接関連しており、内皮細胞の機能障害時に上昇した。IL-6はEDのマーカーとなりうる（Sivritepeら、2022）。IL-1βとIL-6の血清レベルは、ビフィドバクテリウムの相対的存在量と負の相関を示し、バクテロイデスの相対的存在量とは正の相関を示すことがわかった。日和見病原体であるバクテロイデスは、腸管バリアが損なわれると、腸から炎症と菌血症を引き起こすようになることが示された（Lim & Shin, 2020）。フソバクテリウムも日和見感染を引き起こし、炎症性サイトカインの発現を誘導する日和見病原体として同定されている（Richarteら、2021）。一方、ビフィズス菌はIL-6のような炎症性サイトカインを抑制し、IL-10のような抗炎症性サイトカインを誘導することによって免疫系を調節する能力を有し、それによって炎症を抑え、感染症を予防する役割を果たす（Brennan & Garrett, 2019）。短鎖脂肪酸（SCFAs）は、腸内細菌叢による食物繊維の発酵によって産生され、酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレレートなどが含まれる。SCFAは血圧の調節、脂肪蓄積の防止、抗炎症作用、腸管バリアの完全性の維持に重要な役割を果たしている（Badranら、2020；Papadopoulosら、2022）。腸内細菌叢の異常はSCFA産生菌の減少につながることに注意することが重要である。ビフィズス菌はSCFAの産生に関与することが知られている（Abdiら、2022）。
CVDはEDの原因として広く認識されている。腸内細菌叢のアンバランスもCVDの発症と進行に関連している（Caiら、2022；Papadopoulosら、2022）。TMAOとして知られる腸内細菌叢由来の特定の代謝産物のひとつは、アテローム性動脈硬化プラークの形成、血管壁における炎症、活性酸素種の発生、コレステロール逆輸送の阻害に重要な役割を果たすことが判明している（Sunら、2016）。TMAO濃度の上昇は、動脈硬化の独立した危険因子として同定されており、CVDの発生および進行と正の相関がある（Caiら、2022；Chenら、2021）。血清TMAO濃度の上昇は、血管の炎症と海綿体の内皮および平滑筋細胞の損傷を引き起こし、最終的にEDの発症に寄与する（Wang & Xie, 2022）。興味深いことに、ラクノクロストリジウムはコリンをTMAOの前駆体となるTMAに効率よく変換することが観察されている。さらに、ラクノクロストリジウムは、アテローム性動脈硬化症の患者において、そうでない人に比べてより多く存在することが判明している（Cai et al.） バクテロイデスはCVDの潜在的な病原体として同定されている（Liuら、2019）。さらに、バクテロイデス類と血漿TMAとの間に正の相関が観察されている（Wangら、2022年）。バクテロイデスの存在量は、高脂肪食や糖尿病の患者で増加することが判明している（Qinら、2012；Wanら、2019）。我々の研究でも、血清TMAOレベルとラクノクロストリジウムおよびバクテロイデスの相対的存在量との間に正の相関があることを発見した。
腸内細菌叢は、神経経路、免疫経路、代謝経路など様々な経路を通じて脳とコミュニケーションをとることができる。このコミュニケーションは微生物叢-腸-脳軸と呼ばれている。この軸は、宿主の認知、気分、行動機能に影響を与える重要な役割を担っている。さらに、心身症の発症にも関与している可能性がある。さらに、心理的要因もEDに関与している可能性がある。抑うつと不安のレベルを評価するために、BDIとBAI尺度が一般的に用いられている。これらの尺度の得点が高いほど、うつ病や不安症が重症であることを示す。研究の結果、BDIとBAIの合計得点は、対照群と比較してED群で有意に高かった（p<0.05）。さらに、BDI総スコアとビフィズス菌相対量との間に負の相関が認められた。うつ病患者は、リボフラビン、ニコチン、葉酸の合成に不可欠なビフィズス菌の量が少なかった。これまでの研究で、葉酸レベルと抑うつ症状の重症度の間には負の相関関係があることが示されている（Barandouziら、2020；Beydounら、2010；Kwakら、2016）。研究では、大うつ病性障害の男性患者においてバクテロイデスの相対量が増加していることが示されている（Chen et al.） 他の研究でも、うつ病グループは非うつ病患者と比較してバクテロイデス、エシェリヒア・シゲラ、ラクノクロストリジウムのレベルが高いことが示されている（Liang et al.、2023；Radjabzadeh et al.、2022）。さらに、注意欠陥・多動性障害、自閉症スペクトラム障害、うつ病などの精神疾患では、メガモナス値が高いことが観察されている（Zafar & Saier, 2021; Zou et al.） 我々の研究では、BDI総スコアとBacteroides、Escherichia-Shigella、LachnoclostridiumおよびMegamonasの相対存在量との間に正の相関関係も見いだした。
先行研究では、乳酸桿菌とビフィズス菌はEDと負の相関を示し、放線菌はEDと正の相関を示した（Andersenら、2023；Kangら、2023）。我々の研究では、様々な微生物叢の相対的存在量においてより多くの差異が観察されたが、乳酸桿菌と放線菌の相対的存在量においては、ED患者と健常人との間に差異は認められなかった。この食い違いは、人種、食事、地理的な場所、個人差によるものかもしれない。
EDの原因は様々であるが、診断や治療方法は限られているのが現状である。腸内細菌叢と宿主の間には常に双方向のコミュニケーションがあることに注意することが重要である。腸内細菌叢は宿主の健康問題の引き金にもなり、またそれに対する反応にもなる（Turjeman & Koren, 2022; Zhang et al.） 従来の検査と比較して、腸内細菌叢を分析することは、ED患者の健康状態を評価するためのより包括的で非侵襲的なアプローチを提供し、大きな利点と有望な展望を提供する。我々の研究では、腸内細菌叢プロファイルに基づくED診断のための予測分類法を開発した。その結果、15属がED発症の予測因子として同定され、AUC値は訓練コホートで71.9％、検証コホートで100％であった。この結果から、腸内細菌マーカーはED発症を予測する可能性があり、ED予防のための有効なツールとして活用できる可能性が示唆された。一方、腸内細菌叢を調整することは、EDの治療または改善のための潜在的なアプローチである可能性がある。一つの方法として、勃起機能が正常な男性の糞便から機能性細菌叢を抽出し、ED患者の腸内に移植することが考えられる。これは、大腸内視鏡検査や、交配培養後の経口カプセルによって行うことができる。そうすることで、患者の腸内微小生態系を回復させ、治療効果をもたらす可能性がある。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、サンプル数が少なかったため、より大規模な多施設サンプルを用いて研究結果のさらなる検証が必要である。第二に、SCFA、トリプトファン由来代謝産物、胆汁酸などの特定の腸内微生物代謝産物は検出されなかった。このギャップを解決するために、今後の実験を実施すべきである。第三に、EDの発症と進行における腸内細菌叢の役割をさらに検討するために、糞便微生物叢移植（FMT）に関する動物実験を行うことが推奨される。
結論
本研究により、腸内細菌叢とEDの潜在的関連性が明らかになった。腸内細菌叢のディスバイオーシスは、腸管バリア、心血管系および精神衛生に影響を及ぼすことにより、EDの発症および進行に関与していた。本研究では、EDに関連するいくつかの重要な腸内細菌叢を同定し、ED患者の診断と治療に新たな知見と科学的基盤を提供した。将来的には、腸内微生物の生態系を強化することが、EDの予防と治療の両方に対する新たなアプローチとなる可能性がある。
著者貢献
Yu Qiao： 構想（対等）、方法論（対等）、プロジェクト管理（対等）、執筆-原案（対等）、執筆-校閲・編集（対等）。Jianhuai Chen: データキュレーション(均等); プロジェクト管理(均等)。Yongsheng Jiang: データキュレーション（支援）。Ziheng Zhang： 執筆 - 査読と編集（同等）。王恒： 執筆-校閲・編集（同等）。Tao Liu: 執筆-校閲・編集（同等）。楊昭旭： 執筆-校閲・編集（同等）。傅光博： 監修（対等）。Yun Chen：資金獲得（リード）、監修（対等）。
謝辞
江蘇省中医薬医院プロジェクト（Y21008）、江蘇省衛生委員会重点プロジェクト（ZDA2020025）、中国国家自然科学基金（81871154）、南京中医薬大学自然科学基金（XZR2020003）、江蘇省中医薬医院革新発展基金特別プロジェクト（Y2021CX24）、淮安保健研究プロジェクト（HAWJ202007）。
利益相反声明
著者らは、本研究に関連する利害の対立はないことを宣言する。
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Volume 17, Issue 1 e14403
RESEARCH ARTICLE
Open Access
Gut microbiota composition may be an indicator of erectile dysfunction
Yu Qiao, Jianhuai Chen, Yongsheng Jiang, Ziheng Zhang, Heng Wang, Tao Liu, Zhaoxu Yang, Guangbo Fu, Yun Chen
First published: 16 January 2024
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14403
Yu Qiao and Jianhuai Chen are the co-first authors.
Abstract
Erectile Dysfunction (ED) is considered a physical and mental illness. A variety of potential associations between gut microbiota and health or disease have been found. By comparing the gut microbiota of healthy controls and ED patients, our study investigated the relationship between ED and gut microbiota. The results revealed that the ED group exhibited a significantly higher relative abundance of Bacteroides, Fusobacterium, Lachnoclostridium, Escherichia-Shigella and Megamonas, while showing a significantly lower relative abundance of Bifidobacterium compared to the control group. The dysbiosis of gut microbiota played a role in the onset and progression of ED by influencing the gut barrier, cardiovascular system and mental health, which provided a novel perspective on understanding the pathophysiology of ED. What is more, we had identified several key gut microbiota. By combining 16S rRNA sequencing with machine learning techniques, we were able to uncover the significant value and impact of gut microbiota in the early detection of ED.
INTRODUCTION
Sexual dysfunction (SD) is a disorder that affects sexual behaviour and sensation, resulting in abnormal or insufficient responses to sexual stimuli. Research suggests that approximately 52% of men between the ages of 40 and 70 experience some form of SD (Cho & Duffy, 2019). One of the most common types of male SD is ED, which is defined as the inability to achieve and maintain a sufficient penile erection for satisfactory sexual intercourse (Salonia et al., 2021). ED can be categorized into psychological ED, organic ED and mixed ED based on its aetiology. From both psychological and physiological perspectives, ED is considered a physical and mental illness. It can have detrimental effects on men's self-esteem, self-confidence, career development and interpersonal communication. Additionally, it can lead to infertility and disrupt the emotional harmony between spouses. There are various risk factors that can negatively impact male sexual function, including old age, obesity, smoking, physical inactivity, high blood pressure, cardiovascular disease (CVD), diabetes, hyperlipidaemia, metabolic syndrome, anxiety and depression (Geng et al., 2021; Russo et al., 2023). The International Index of Erectile Function-5 (IIEF-5) is a widely used self-report screening tool for assessing male erectile function (Rosen et al., 1999). It has been proven to have high sensitivity and is recommended as the primary test for evaluating the severity of ED (Rhoden et al., 2002).
The human gut microbiota, considered as the largest ecosystem in the human body, is composed of a microbial community. Functioning as a ‘microbial organ’, the gut microbiota plays a crucial role in maintaining homeostasis, which is closely linked to both health and disease (Zhang et al., 2023). Dysbiosis refers to a change in the composition and function of the microbiota in individuals with a disease, as compared to healthy individuals. This change may involve a decrease in beneficial microorganisms and an increase in potentially harmful microbes (Tiffany & Bäumler, 2019). Numerous diseases, including inflammatory bowel disease, arthritis, cancer, neuropsychiatric disorders, cardiovascular disease, obesity, type 2 diabetes and infertility, have been linked to the gut microbiota (Badran et al., 2020; Fabozzi et al., 2022; Papadopoulos et al., 2022; Sonali et al., 2022; Zhou et al., 2020). Inflammatory response, cardiovascular disease and psychological disorders are significant causes and risk factors for ED among the diseases associated with the gut microbiota (Geng et al., 2021; Russo et al., 2023). Therefore, we hypothesize that there is a correlation between gut microbiota and the occurrence and development of ED. This study aims to explore this correlation by comparing the gut microbiota of healthy controls and ED patients using clinical data. Additionally, the study also investigates gut microbiota profiles as a potential diagnostic tool for preventing ED.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Recruitment of study subjects
We recruited a total of 53 male patients diagnosed with ED from the male department of the Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine and the department of reproductive centre of the Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University in 2023. In addition, we enrolled 32 men with normal sexual function as controls. The study was reviewed and approved by the Ethics Committees of the Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine and the Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University. All participants provided informed consent by signing consent forms. Demographic and clinical information was collected through questionnaires and electronic medical records. The participants underwent evaluations using the BDI, BAI and IIEF-5 assessment tools. Serum and faecal samples were collected from all participants for analysis. The study's inclusion criteria for participants were as follows: ① individuals who had completed middle school or higher education; ② individuals who identified as heterosexual and had engaged in regular sexual activity with a single, stable partner for at least six months; ③ individuals with normal external genital development. Participants who met any of the following criteria were excluded from the study: ① individuals who had received antibiotics, probiotics, hormones, insulin, proton pump inhibitors or traditional Chinese medicine treatment within the past three months; ② individuals who had undergone radiotherapy, chemotherapy, gastrointestinal surgery or gastroenteroscopy within the past three months; ③ individuals who had autoimmune diseases, malignant tumours, chronic diarrhoea or constipation.
Determination of ED
The IIEF-5 was used to evaluate the severity of ED. A score above 21 indicated normal erectile function, while a score at or below this cutoff indicated the presence of ED. The diagnosis was confirmed by at least two attending physicians.
Clinical characteristics statistical analysis
In this study, we utilized SPSS23.0 statistical software to process and analyse our data. To ensure accuracy, we conducted a normality test for each group of continuous variables. For normally distributed measurement data, we presented the results as X ± S and used the t-test to compare between two groups. The measurement data of non-normal distribution were presented using M (P25, P75). To compare between two groups, the non-parametric Mann–Whitney U-test was utilized. Categorical data were presented as frequencies. Proportions were compared using either χ2 or Fisher exact tests. A p value of less than 0.05 was considered statistically significant.
Faecal sample collection
The study collected faecal samples from all participants using a sterile plastic spoon and stored them in sterile plastic tubes. The samples were promptly placed in a −20°C refrigerator and then transferred to a −80°C refrigerator within 24 h for preservation.
DNA extraction and PCR amplification
To obtain the total DNA of the gut microbiota from faecal samples, we used the E.Z.N.A.® stool DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.) following the manufacturer's instructions. We amplified the V3-V4 variable regions of the bacterial 16S rRNA gene using primer pairs 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) and 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) with an ABI GeneAmp® 9700 PCR thermocycler (ABI, CA, USA). The PCR cycling parameters used in this study were as follows: an initial denaturation step at 95°C for 3 min, followed by 27 cycles consisting of denaturation at 95°C for 30 s, annealing at 55°C for 30 s and extension at 72°C for 45 s. We performed a single extension step at 72°C for 10 min, followed by cooling to 4°C. The amplification mixture volume was 20 μL, containing 4 μL of 5 × FastPfu buffer, 2 μL of 2.5 mM dNTPs, 0.8 μL of Forward Primer (5 μM), 0.8 μL of Reverse Primer (5 μM), 0.4 μL of FastPfu Polymerase, 0.2 μL of BSA and 10 ng of Template DNA.
Sequencing processing
Paired-end sequencing was conducted using the Illumina Miseq PE300 platform (Illumina, San Diego, USA). Raw data underwent screening, with sequences shorter than 200 bp, low quality scores (≤20), ambiguous bases or those not matching primer sequences and barcode tags being removed. The qualified PE reads obtained from Illumina sequencing were merged using FLASH (version 1.2.7) based on their overlapping relationship. The sequences were grouped into operational taxonomic units (OTUs) based on a 97% similarity threshold and compared to the Silva database (v138).
Bioinformatics analysis
To assess the α-diversity, we utilized the Shannon index, Ace index, Chao index and Simpson index. For the examination of β-diversity, we employed principal coordinates analysis (PCoA) and non-metric multidimensional scaling (NMDS). The difference between the two groups on the phylum and genus level was explored using the Wilcoxon rank-sum test. To identify differentially abundant bacteria between the two groups, we employed the linear discriminant analysis (LDA) effect size (LEfSe) with an LDA threshold of 3.5. We analysed the correlation between the serum level of IL-6 and the total scores for IIEF-5, beck depression inventory (BDI) and beck anxiety inventory (BAI). We utilized a Spearman correlation heatmap to illustrate the connection between gut microbiota and clinical indicators.
Random forest classifier construction
The classification model was constructed using the random forest method in the randomForest R package. The entire cohort was randomly divided into a training cohort and a validation cohort. We identified the variables that showed the top 15 highest accuracy decreases between these two groups. The prediction performance of the model was evaluated using the area under the receiver operating characteristic (ROC) curve and the area under curve (AUC) was calculated.
RESULTS
Participant's demographic and clinical data
There were no significant differences in demographic characteristics, such as age, body mass index (BMI), hypertension and diabetes mellitus, between the control group and ED group, as shown in Table S1. Additionally, we compared the serum levels of sex hormones (T and prolactin (PRL)) and biochemical indicators between the two groups. The serum levels of PRL, aspartate transaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), ureophil (UREA), creatinine (CREA), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), Interleukin-1β (IL-1β), Tumour necrosis factor-α (TNF-α), Trimetlylamine oxide (TMAO) and 5-Hydroxytryptamine (5-HT) showed no significant differences between the two groups. However, the control group had a higher serum level of T compared to the ED group, while the level of IL-6 and the uric acid (UA) in the control group were lower than those in the ED group (Table S1). In Table S1, it was found that the total scores for BDI and BAI were significantly higher in the ED group compared to the control group. On the other hand, the total score for IIEF-5 was significantly lower in the ED group compared to the control group.
Gut microbial composition, α-diversity and β-diversity between the control group and ED group
A Venn diagram was used to display the overlapping OTU data between the two groups. The analysis indicated that 619 OTUs were shared by all samples. Specifically, approximately 140 OTUs were identified in the samples of the ED group, while around 56 OTUs were found in the samples of the control group (Figure 1A).
FIGURE 1
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The alpha diversity of the gut microbiota composition was analysed using the Shannon index, Ace index, Chao index and Simpson index. The results were presented in Figure 1B–E. Our findings indicated that the Shannon index was higher in the ED group compared with the control group (p = 0.04082).
The indices of β-diversity was displayed in Figure 1F,G. To visualize multidimensional data based on Bray–Curtis distance and obtain principal coordinates, a PCoA was conducted. The results of the PCoA indicated a significant difference in bacterial communities between the control group and ED group. NMDS also showed that the distribution of the microbial community in the control group was different from that of the ED group.
Figure 2A illustrated the relative abundance of the major gut microbiota on phylum level of the two groups. The results revealed significant differences between the two groups. Specifically, the ED group had a significantly higher relative abundance of Bacteroidota, Proteobacteria, Fusobacteriota, Desulfobacterota and Verrucomicrobiota compared to the control group, as shown in Figure 2B.
FIGURE 2
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Figure 2C shows the relative abundance of the major gut microbiota on genus level of the two groups. It was found that the control group had a significantly higher relative abundance of Bifidobacterium compared to the ED group. Additionally, the control group showed a significant decrease in the relative abundance of various bacteria, including Bacteroides, Escherichia-Shigella, Lachnoclostridium, Roseburia, Megamonas, unclassified_f__Lachnospiraceae, Coprococcus, Anaerostipes, Butyricicoccus, Fusobacterium, Eubacterium_ventriosum_group, CAG-56, Parabacteroides and norank_f__Ruminococcaceae, compared to the ED group (Figure 2D).
To identify the bacterial taxa and predominant bacteria associated with ED, we conducted LEfSe analysis. Our findings revealed that the ED group exhibited an increase in the relative abundance of Bacteroides, Megamonas, Escherichia-Shigella, Lachnoclostridium, Roseburia, Fusobacterium and Coprococcus when compared to the control group, as depicted in Figure 2E,F.
Associations of the serum level of IL-6 and gut microbiota with clinical indicators
The serum level of IL-6 showed a negative correlation with the total score of IIEF-5, but a positive correlation with the total scores of BDI and BAI. The correlation with BDI was found to be statistically significant (Figure 3A–C).
FIGURE 3
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To investigate the relationship between the gut microbiota and clinical indicators such as sex hormone levels, biochemical indexes and scale scores, we conducted a spearman correlation heatmap analysis on genus level (Figure 3D).
The analysis revealed that the serum levels of IL-1β and IL-6 were negatively correlated with the relative abundance of Bifidobacterium, while positively correlated with the relative abundance of Bacteroides. Furthermore, there was a positive correlation between the serum TMAO level and the relative abundance of Lachnoclostridium and Bacteroides. Additionally, the total score of BDI showed a statistically significant negative association with the relative abundance of Bifidobacterium, while it was positively correlated with the relative abundance of Bacteroides, Escherichia-Shigella, Lachnoclostridium and Megamonas.
Diagnostic potential of ED based on the gut microbial markers
We utilized the random forest algorithm to develop a response-prediction classifier for patients with ED. To create a training dataset, we employed 10-fold cross-validation to select specific genera markers. The random forest classifier was then trained by determining the feature importance of 15 genera, which were ranked based on their contribution to the model. The significant genera identified by the model were described using the mean decrease accuracy (Figure 4A). The AUC obtained from the training datasets was 0.719 (95% confidence interval (CI), 0.509–0.929) (Figure 4B). In the test set, the AUC was 1.000 (95% CI, 1.000–1.000) (Figure 4C), indicating a successful distinction between patients with ED and healthy individuals.
FIGURE 4
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DISCUSSION
We observed differences in the gut microbiota between the control group and the ED group. The Venn diagram revealed unique taxa in each group, highlighting distinct gut microbiota. Our findings demonstrated that the α-diversity (Shannon index) was higher in the ED group compared to the control group, contradicting a previous study (Geng et al., 2021). This could be attributed to a decrease in beneficial bacteria and an increase in potentially harmful bacteria. Furthermore, our study revealed differences in the microbial community structure (β-diversity) between the two groups, indicating a clear separation between the control and ED groups. LEfSe analysis showed a disruption in the intestinal microecology of ED patients. Specifically, the relative abundance of Bifidobacterium was higher in the control group, while the ED group exhibited higher relative abundance of Bacteroides, Megamonas, Escherichia-Shigella, Lachnoclostridium, Roseburia, Fusobacterium and Coprococcus.
The gut barrier serves as protection against harmful substances and microorganisms in the gut, which is crucial for maintaining human health (Martel et al., 2022). Normal gut microbiota and their metabolites play a vital role in preserving intestinal integrity and permeability (Papadopoulos et al., 2022). An imbalance in the intestinal microecology can lead to damage to the gut barrier, allowing toxins like lipopolysaccharide (LPS) to leak into the circulatory system. This leakage triggers systemic inflammation by recruiting monocytes and activating Toll-like receptors (Badran et al., 2020; Sun et al., 2016). The inflammatory response is considered one of the pathogenic mechanisms of ED (Vlachopoulos et al., 2007). In this study, we compared the levels of inflammatory cytokines between two groups. We observed that IL-6 levels were notably higher in the ED group compared to the control group. Furthermore, the correlation analysis indicated a negative association between the serum level of IL-6 and the total score for IIEF-5. Additionally, the levels of IL-1β and TNF-α were also higher in the ED group, although the difference was not statistically significant. IL-6 was directly associated with cytokine storms and was elevated during endothelial cell dysfunction. IL-6 could serve as a marker of ED (Sivritepe et al., 2022). The serum levels of IL-1β and IL-6 were found to have a negative correlation with the relative abundance of Bifidobacterium, while having a positive correlation with the relative abundance of Bacteroides. Bacteroides, which is an opportunistic pathogen, showed a shift from the gut to cause inflammation and bacteraemia when the gut barrier was compromised (Lim & Shin, 2020). Fusobacterium has also been identified as an opportunistic pathogen that can cause opportunistic infections and induce the expression of pro-inflammatory cytokines (Richarte et al., 2021). On the other hand, Bifidobacterium has the ability to regulate the immune system by inhibiting pro-inflammatory cytokines like IL-6 and inducing anti-inflammatory cytokines such as IL-10, thereby playing a role in reducing inflammation and preventing infections (Brennan & Garrett, 2019). Short chain fatty acids (SCFAs) are produced through the fermentation of dietary fibre by gut microbiota, which includes acetic acid, propionic acid, butyric acid and valerate. SCFAs play a vital role in regulating blood pressure, preventing fat accumulation, providing anti-inflammatory effects and maintaining the integrity of the gut barrier (Badran et al., 2020; Papadopoulos et al., 2022). It is important to note that gut microbiota dysbiosis can lead to a decrease in SCFA-producing bacteria. Bifidobacterium is known to be involved in the production of SCFAs (Abdi et al., 2022).
CVD has been widely recognized as a cause of ED. An imbalance in gut microbiota has also been linked to the development and progression of CVD (Cai et al., 2022; Papadopoulos et al., 2022). One specific metabolite derived from the gut microbiota, known as TMAO, has been found to play a significant role in the formation of atherosclerotic plaque, inflammation in the vascular wall, generation of reactive oxygen species and inhibition of cholesterol reverse transport (Sun et al., 2016). Increased levels of TMAO have been identified as an independent risk factor for atherosclerosis and have been positively associated with the occurrence and progression of CVD (Cai et al., 2022; Chen et al., 2021). The elevation of serum TMAO levels can lead to vascular inflammation and damage to the endothelium and smooth muscle cells of the cavernosa, ultimately contributing to the development of ED (Wang & Xie, 2022). Interestingly, it has been observed that Lachnoclostridium efficiently converts choline to TMA, which serves as a precursor to TMAO. Furthermore, Lachnoclostridium has been found to be more abundant in patients with atherosclerosis compared to individuals without the condition (Cai et al., 2022). Bacteroides has been identified as a potential pathogen of CVD (Liu et al., 2019). Additionally, a positive correlation has been observed between Bacteroides and plasma TMA (Wang et al., 2022). The abundance of Bacteroides has been found to increase in patients with a high-fat diet or diabetes (Qin et al., 2012; Wan et al., 2019). In our study, we also discovered a positive correlation between the serum TMAO level and the relative abundance of Lachnoclostridium and Bacteroides.
The gut microbiota can communicate with the brain through various pathways, such as neural, immune and metabolic pathways. This communication is referred to as the microbiota-gut-brain axis. The axis plays a crucial role in influencing the cognitive, mood and behavioural functions of the host. Additionally, it may contribute to the development of psychosomatic diseases. Furthermore, psychological factors may also play a role in ED. To assess the levels of depression and anxiety, the BDI and BAI scales are commonly used. Higher scores on these scales indicate more severe depression and anxiety. The study revealed that the total scores of BDI and BAI were significantly higher in the ED group compared to the control group (p < 0.05). Additionally, a negative correlation was found between the total BDI score and the relative abundance of Bifidobacterium. Depressed patients exhibited lower levels of Bifidobacterium, which is essential for synthesizing riboflavin, nicotine and folate. Previous studies have shown a negative correlation between folate levels and the severity of depressive symptoms (Barandouzi et al., 2020; Beydoun et al., 2010; Kwak et al., 2016). Research has indicated an increased relative abundance of Bacteroides in male patients with major depressive disorder (Chen et al., 2018). Other studies have also demonstrated that the depressive group had higher levels of Bacteroides, Escherichia-Shigella and Lachnoclostridium compared to non-depressive individuals (Liang et al., 2023; Radjabzadeh et al., 2022). Moreover, a higher level of Megamonas has been observed in some psychiatric conditions such as attention-deficit/hyperactivity disorder, autism spectrum disorder and depression (Zafar & Saier, 2021; Zou et al., 2020). Our study also found a positive correlation between the total BDI score and the relative abundance of Bacteroides, Escherichia-Shigella, Lachnoclostridium and Megamonas.
Previous studies have shown a negative correlation between Lactobacillus and Bifidobacterium with ED, while Actinomyces has been found to be positively correlated with ED (Andersen et al., 2023; Kang et al., 2023). In our study, we observed more differences in the relative abundance of various microbiota, but no differences were found in the relative abundance of Lactobacillus and Actinomyces between ED patients and healthy individuals. This discrepancy may be attributed to variations in race, diet, geographic location and individual differences.
Although there are various causes of ED, the diagnosis and treatment methods are currently limited. It is important to note that there is constant bidirectional communication between the gut microbiota and the host. The gut microbiome can both trigger host health problems and react to them (Turjeman & Koren, 2022; Zhang et al., 2023). Compared to traditional examinations, analysing the gut microbiota provides a more comprehensive and non-invasive approach to assessing the health status of patients with ED, offering significant advantages and promising prospects. Our study developed a predictive classifier for diagnosing ED based on gut microbiota profiles. We found that 15 genera were identified as predictors for the development of ED, with an AUC value of 71.9% in the training cohort and 100% in the validation cohort. Our results suggested that gut microbial markers had the potential to predict the development of ED and could be utilized as effective tools for preventing ED. On the other hand, regulating gut microbiota may be a potential approach for treating or improving ED. One possible method is to extract the functional flora from the faeces of men with normal erectile function and transplant them into the intestines of ED patients. This can be done through colonoscopy or oral capsules after mating culture. By doing so, it is possible to restore the intestinal microecosystem of patients and potentially provide therapeutic benefits.
Several limitations of our study should be acknowledged. Firstly, the sample size was small, and further validation of the research findings is necessary using a larger multicentre sample. Secondly, we did not detect certain intestinal microbial metabolites such as SCFAs, tryptophan-derived metabolites and bile acids. Future experiments should be conducted to address this gap. Thirdly, it is recommended to conduct animal experiments on faecal microbiota transplantation (FMT) to further investigate the role of gut microbiota in the onset and progression of ED.
CONCLUSIONS
Our study had revealed a potential link between gut microbiota and ED. The dysbiosis of gut microbiota played a role in the onset and progression of ED by influencing the gut barrier, cardiovascular system and mental health. In this study, we had identified several key gut microbiota that were related to ED, providing new insights and a scientific foundation for the diagnosis and treatment of patients with ED. In the future, enhancing the intestinal microecology could potentially serve as a novel approach to both prevent and treat ED.
AUTHOR CONTRIBUTIONS
Yu Qiao: Conceptualization (equal); methodology (equal); project administration (equal); writing – original draft (equal); writing – review and editing (equal). Jianhuai Chen: Data curation (equal); project administration (equal). Yongsheng Jiang: Data curation (supporting). Ziheng Zhang: Writing – review and editing (equal). Heng Wang: Writing – review and editing (equal). Tao Liu: Writing – review and editing (equal). Zhaoxu Yang: Writing – review and editing (equal). Guangbo Fu: Supervision (equal). Yun Chen: Funding acquisition (lead); supervision (equal).
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors funding from Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine Project (Y21008), Key project of Jiangsu Provincial Health Commission (ZDA2020025), National Natural Science Foundation of China (81871154), Natural Science Foundation of Nanjing University of Chinese Medicine (XZR2020003), Special Project of Innovation and Development Fund of Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine (Y2021CX24) for carrying out the research, Huaian Health Research Project (HAWJ202007).
CONFLICT OF INTEREST STATEMENT
The authors declare no competing interest that pertain to this work.
Open Research
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REFERENCES
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