腸におけるIgA+形質細胞の代謝適性にはDOCK8が必要である

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腸におけるIgA+形質細胞の代謝適性にはDOCK8が必要である

https://www.mucosalimmunology.org/article/S1933-0219(23)00097-1/fulltext

ビヤン・ジャン
シュテン・チェン
Xiangyun Yin
エリス・リュウ
ステファニー・C・アイゼンバース
アダム・ウィリアムズ
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脚注を表示するオープンアクセス掲載:2024年1月17日DOI:https://doi.org/10.1016/j.mucimm.2023.12.001

DOCK8（Dedicator of cytokinesis 8）変異は、消化管感染症の再発と抗体応答の低下を伴う原発性免疫不全を引き起こすが、逆説的に食物抗原に対するIgEは亢進することから、DOCK8が腸管における免疫恒常性の中心的役割を担っていることが示唆される。Dock8欠損マウスを用いて、ピーナッツやコレラ毒素を含む複数のT細胞依存性抗原に対する粘膜IgA産生にDOCK8が必要であることを見出した。しかし、DOCK8はT細胞ではこの表現型には必要ではなかった。代わりに、B細胞内在性のDOCK8が、腸管固有層における抗原特異的IgA分泌形質細胞（PC）の維持に必要であった。予想外なことに、DOCK8は初期のB細胞の活性化、遊走、IgAクラスの切り替えには必要ではなかった。偏りのないインタラクトーム・スクリーンにより、代謝とアポトーシスに関与する新規のタンパク質パートナーが明らかになった。DOCK8欠損IgA+ B細胞は、細胞呼吸が損なわれ、解糖が適切に行われなかった。これらの結果から、IgA+ PCコンパートメントの維持にはDOCK8が必要であることが示され、腸管IgA+ PCは、固有な代謝要件を持ち、lamina propriaでの長期生存に必要であることが示唆された。
グラフィカル抄録
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はじめに
腸は、常在微生物や食事からの外来抗原に対する耐性を維持すると同時に、病原体の侵入を防御するユニークな組織である。このバランスが乱れると、感染症、炎症性腸疾患、食物アレルギーなどを引き起こす可能性がある。厚い粘液層、抗菌タンパク質、粘膜抗体、特にIgAなどの物理的バリアは、共生常在菌を保持しながら病原性細菌を防御する1, 2, 3。腸管IgAは細菌を制御する以外にも、毒素を中和するのに重要であり、食物を排除するという仮説もある4, 5, 6, 7。しかし、IgAがどのようにして誘導されるのか、またその機能については、根本的な疑問が残されている8。われわれは、ほとんどの小児および成人が腸内でアレルゲン特異的IgAを産生することを発見したが、抗食物アレルゲンIgAが耐性のマーカーであるかどうかについては疑問がある9。そこで我々は、食物特異的IgA誘導の細胞メカニズムを明らかにすることに取り組んでいる。
IgAは血液中と粘膜部位の両方に存在する。主な産生部位は、形質細胞（PC）による腸管固有層（LP）である。IgA産生の多くの細胞的、分子的側面は、主に細菌や毒素に対する反応を評価することによって確立されてきた8, 10。大まかには、IgAはT細胞依存的またはT細胞非依存的に産生され、腸間膜リンパ節（MLN）、パイエル板（PP）、単離リンパ濾胞で誘導される。食物アレルゲン、コレラ毒素（CT）、キーホールリンペットヘモシアニンなどのT細胞依存性抗原に対するIgA応答は、B細胞上のCD40活性化を必要とする11, 12。一方、T細胞非依存性のIgAスイッチングは、増殖誘導リガンド（APRIL）やB細胞活性化因子（BAFF）13, 14, 15に応答して起こりうる。腸管における抗共通性IgAの大部分に対するT細胞の寄与については、まだ議論の余地がある8。トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）は、IgAクラススイッチングの主要なサイトカインであり、B細胞上のTGF-β受容体II（TGF-βRII）の単離欠損は、CT特異的血清および分泌性腸管IgAを有意に障害する16, 17。In vitroでは、インターロイキン(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-21、およびレチノイン酸(RA)はすべて、TGF-β10とともにIgAスイッチングに寄与することが証明されている。
DOCK8変異を持つ患者は、消化管の感染症や重度の食物アレルギーに特に罹患しやすいことから、DOCK8が腸管IgAの促進において独自の役割を担っているかどうかを調べることになった。DOCK8はDOCK180スーパーファミリーに属する非定型グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）で、多くの免疫調節プロセスにおいて基本的な役割を果たしている18, 19。DOCK8は、特に免疫系の細胞において、細胞移動、シグナル伝達、接着など無数の生物学的機能に関与している20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27。DOCK8はまた、全身性の抗体応答を長期にわたって維持するためにも重要であるが、そのメカニズムは正確には明らかになっていない。これまでに提唱されているメカニズムとしては、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（WASP）やCD19を介したB細胞受容体（BCR）シグナルの促進、B細胞免疫学的シナプスの安定化、MYD888を介したTLR9シグナルの増強などが挙げられる28, 29, 30。DOCK8欠損症は、マウスでは長寿命体液性応答の欠損、ヒトではワクチン応答の不良と関連しているが、ほとんどの研究は全身性の抗体応答に焦点を当てており、粘膜抗体に対するDOCK8欠損症の影響についてはあまり知られていない20, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34。患者において、DOCK8欠損症は健常人と比較して血清IgA値が高値、正常値、低値と変動するが、便中IgA値については報告されていない20, 21, 32, 33, 34。これらの患者は再発性の細菌感染症のために抗生物質を服用していることが多いため、便中IgAの研究から得られたデータの解釈に潜在的な障害をもたらしている。Dock8欠損マウスの最近の報告では、M（microfold）細胞の発達に障害があり、これが便中IgAの障害と関連していることが明らかになった31。このような管腔内容物を採取する能力の障害が、DOCK8遺伝子変異を持つ患者に観察される腸管感染症や食物アレルギーに対する感受性をもたらすのか、あるいはその代わりに免疫細胞内在性の欠陥によるものなのかは未解決の問題である。
細胞特異的DOCK8欠損マウスを用いて、毒素、細菌、食物アレルゲンを含む外来抗原に対する腸液性免疫反応におけるDOCK8の役割を調べた。その結果、DOCK8は毒素、食物、特定の細菌に対する腸管IgAに不可欠であることがわかった。T細胞ではなく、B細胞におけるDock8の特異的欠失（B-Dock8-/-）は、IgAの消失を再現した。しかし、MLN、PP、骨髄（BM）の抗原特異的B細胞を評価したところ、IgA+ B細胞のプライミングと抗体分泌細胞への分化は損なわれていなかった。その代わりに、LPの抗原特異的IgA+ PCだけが欠損していた。DOCK8が細胞遊走とSTAT3シグナル伝達に関与していることが知られており、その両方がLPにおける抗原特異的IgA+ PCの消失に寄与している可能性があるにもかかわらず、Dock8欠損B細胞は正常な遊走とIL-21シミュレーションによる正常なSTAT3リン酸化を示した。TurboIDを使ってDOCK8のタンパク質相互作用を解析したところ、細胞骨格のリモデリング、シグナル伝達、GTPaseの制御に関与するタンパク質が濃縮されていることがわかった。意外なことに、DOCK8はアポトーシス、オートファジー、細胞代謝に関与するタンパク質とも相互作用することがわかった。CD40Lで活性化されたDock8欠損IgAスイッチB細胞を用いたin vitro研究では、呼吸障害が確認され、代謝経路の制御を通じて抗原特異的IgA+ PCの生存を制御するDOCK8のこれまで知られていなかった役割が支持された。これらの結果は、DOCK8が、摂食に伴う腸LPで説明される変動する代謝環境へのPCの適応を可能にしている可能性を示唆している35。この新しい知見は、DOCK8欠損患者が消化管感染症に罹患しやすいことを説明するのに役立つだけでなく、代謝経路を介した腸管におけるPC維持の新たな側面に光を当てる可能性がある。
研究結果
Dock8欠損マウスは腸管IgAの産生が障害されている
Dock8欠損が粘膜抗体に及ぼす影響を調べるため、Dock8欠損（Dock8-/-）マウスの便中の総IgA、IgG、IgM、IgEを定常状態で測定した。Dock8-/-マウスと同腹仔のDock8+/+およびDock8+/-コントロールマウスの便中抗体アイソタイプを比較したところ、DOCK8欠損マウスでは遊離糞便中IgAが有意に減少していたが、IgG、IgGサブタイプ、IgMは減少していなかった（図1A、図S1A-B）。また、Dock8-/-マウスでは性別に関係なく一貫したIgAの欠損が見られた（S1A）。以前の研究と同様に、野生型（WT）C57BL/6マウスの便では、IgAが優勢な抗体アイソタイプであり、IgGとIgMがそれに続いたが、定常状態で検査したすべてのマウスの便では、IgEは我々のアッセイの検出限界以下であった（図1A、図S1C）12。便中抗体のデータと一致して、Dock8-/-マウスの血清中IgAの減少が観察され（図S1D）、これはおそらく腸からのIgAの損失を反映している36, 37, 38。私たちの以前の研究と一致して、完全なDock8欠損マウスでは血清中の総IgEは正常で低レベルであった39（図S1D）。
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図1Dock8欠損マウスは、腸内の広範な抗原標的に対するIgA産生が障害されている。WT（Dock8+/+；閉じた丸）、Dock8ヘテロ接合体（Dock8+/-；半分塗りつぶした丸）、Dock8ノックアウト（Dock8-/-；閉じた四角）同腹子の定常状態における（A）総便IgA、IgG、IgMのELISA定量。(B）Dock8+/+マウス、Dock8+/-マウス、Dock8-/-マウスの全糞便細菌（プレソート）、ソートされたIgA+およびIgA-糞便細菌の加重UniFrac距離の主座標分析（PCoA）および（C）クラドグラム。スケール範囲： 0.02. (D)SFB単独コロニー化マウスの糞便ペレットから分離し、Dock8+/-またはDock8-/-同腹仔の糞便上清とインキュベートした分割フィラメント細菌(SFB)のIgA結合頻度。点線は、SFBフリー施設で飼育したWTマウスの糞便上清とインキュベートしたSFBのIgA結合頻度を示す。Dock8+/+、Dock8+/-およびDock8-/-同腹仔における、ピーナッツおよびCTによる6週目の胃内（i.g.）免疫の1週間後の（E）便中ピーナッツ特異的IgAおよび（F）便中コレラ毒素（CT）特異的IgAのELISAによる定量。点線は1.56任意単位の検出限界を示す。(A, E-F)データは4-10匹のDock8+/+マウス、4-10匹のDock8+/-マウス、および4-20匹のDock8-/-マウスを用いた3回の独立した実験の代表値である。(B-C）データは1群あたり5-10匹のマウスを用いた2回の独立した実験の代表値である。(D) 1群あたり5-8匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのプールデータ。統計学的検定：（A）クラスカル・ワリス分析とダンのポストホック（D-F）マン・ホイットニーのU検定、それぞれ*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、ns = 有意でない、nd = 検出不能。エラーバーはSDを示し、各シンボルは個々のマウスを示す。
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大量の腸内IgAは常在細菌に対して指向性であり、マイクロバイオームの多様性と組成の形成に関係している40, 41。そこで、Dock8/-マウスの便におけるIgAの消失が腸内微生物の組成を変化させるかどうかを検討した。フローサイトメトリーを用いて、Palmとde Zoeteら42の記載に従って、便サンプル中のIgA結合細菌の頻度を評価した（図S2A）。Dock8+/-とDock8-/-の同腹子の総IgA結合細菌を解析した結果、IgAコート細菌の頻度に差はなかった（図S2B）。16S rRNA配列決定データからも、Dock8+/-とDock8-/-同居同腹仔の間で細菌ファミリーの相対的存在量に大きな変化は見られなかった（図S2C）。しかしながら、LEfSe解析の結果、Dock8-/-マウスでは、同腹のコントロールと比較して、分節性フィラメント細菌（SFB）を含む特定の細菌が増加していることが明らかになり、これは別のDock8欠損マウス系統におけるKunimuraらの観察結果と一致した（図S2D）31, 43。
Dock8-/-マウスで観察されたSFBの拡大と腸内IgAの減少を踏まえて、次に「IgA-Seq」42を用いてDock8-/-マウスと対照同腹仔マウスの腸内細菌のIgAコーティングの程度を評価した。主座標解析を行うことでベータの多様性を比較したところ、IgA+菌とIgA-菌および全菌（選別前）の分離は予想されたが、遺伝子型による分離は見られなかった（図1B）。これらのデータをクラドグラムで表すと、マウスの遺伝子型にかかわらず、IgA+菌はIgA-菌とプレソート菌の両方から分離していた（図1C）。Dock8+/+、Dock8+/-、Dock8-/-のIgA+便画分とIgA-便画分の両方における細菌種の豊富さを示すChao1指標を用いてマイクロバイオームの多様性をさらに評価したところ、α多様性に大きな変化は見られなかった（図S2E）。細菌に対するIgAにもっと微妙な違いが存在するかもしれないことを検出するために、モノコロナイズマウスから単離したSFBを用い、SFB+施設に収容したDock8+/-あるいはDock8/-マウスの便上清とインキュベートした。IgAフローから、SFB特異的IgAの産生にわずかな欠損が認められたことから（図1D）、Dock8欠損マウスでは特異的IgAの産生が選択的に障害されている可能性が示唆された。
常在細菌のほかに、食物抗原も腸における外来抗原の主要な供給源である。CTは最も一般的に使用される腸粘膜アジュバントのひとつであり、共投与すると食物に対して高レベルのIgAを誘導する12。Dock8欠損が食物抗原に対するIgA反応に影響を及ぼすかどうかを調べるため、Dock8+/-マウスとDock8/-同腹仔マウスにピーナッツとCTを免疫した。腸管ピーナッツ特異的IgA（PN IgA）は免疫したDock8-/-マウスでは検出されなかった（図1E）。大腸菌由来の熱-毒素（LT）は、タンパク質抗原に対する抗原特異的IgA応答を誘導するもう一つの効果的な粘膜アジュバントであることが示されている44, 45。この代替アジュバントを用いて、マウスにピーナッツを免疫したところ、Dock8/-マウスでは便中のピーナッツIgAが同様に減少した（図S1E）。CTはアジュバントとして働くだけでなく、それ自身に対するT細胞依存性IgA応答も誘導することがよく知られている5, 46。そこでCTに対するIgA反応（CT IgA）を測定したところ、Dock8-/-マウスでは完全に消失していた（図1F）。総合すると、Dock8の欠損はIgAが制御する微生物の多様性に大きな変化をもたらすことはなかったが、選択的な細菌、細菌毒素、食物抗原に対するIgAの産生を障害した。これらのデータは、T細胞の助けを必要とする腸管IgA応答におけるDOCK8の限定的な役割を示唆している。
DOCK8の欠損はIgAを介したCTからの防御を損なう
J鎖および高分子Igレセプターノックアウトマウスはともに、二次暴露時のCT誘発下痢に対する防御能が低下しており、主に防御に重要な腸管内腔の分泌IgAに影響を及ぼしている47, 48。CT IgAの産生障害により毒素誘発下痢症からの防御に失敗したかどうかを調べるため、免疫後10-14日目にマウスにCTを投与した。Dock8+/-マウスでは免疫後のCTに対するIgA産生が強固であったが、Dock8-/-マウスではそうではなかった。CTで免疫したDock8欠損マウスは、腸内の体液蓄積により腸重量が増加したが、これはCTでチャレンジした免疫していないマウスと同程度であった（図2C）。盲腸への体液蓄積の差が最も顕著であったことから、Dock8-/-マウスでも盲腸重量の有意な増加が観察された（図2C）。したがって、DOCK8は腸における毒素中和IgAの産生に不可欠である。
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図2DOCK8非存在下でのT依存性IgAの消失は、毒素からの腸の防御を損なう。(A)腸液蓄積の定量化(B)盲腸に蓄積した腸液の代表的な画像、および(C)小腸重量または(D)盲腸重量の定量化ナイーブDock8+/-マウス(CT 1° imm -)またはCT免疫化(CT 1° imm +)Dock8+/-およびDock8/-同腹仔の経口CTチャレンジ後12時間のマウス。CT免疫マウスは週2回CTをi.g.投与され、10-14日後にチャレンジされた。統計検定：（A、C-D）Kruskal-Wallis分析とDunn's posthoc検定、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = 有意でない。エラーバーはSDを示す。(A-D)1群3-4匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのプールデータ。
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抗原特異的IgA産生はT細胞のDOCK8に依存しない
T細胞におけるDOCK8の欠損は、Tヘルパー17（Th17）、T濾胞ヘルパー、制御性T細胞（Treg）など、複数のT細胞サブセットにおける分化障害や機能異常と関連している27, 39, 49, 50。これらのT細胞サブセットは腸管IgA応答の促進および制御に関与していることから、T細胞依存性IgAの消失がT細胞におけるDOCK8の本質的な消失によるものかどうかを理解したいと考えた51, 52。Cd4-Creマウスと我々が作製したDock8欠損マウス（Gowthamanらによって以前に報告されている39）を交配させ、T細胞に対するDock8欠損を分離したところ、ピーナッツに対する便中IgA（図3A）は無傷であった。これらのデータから、DOCK8はT細胞依存性のIgA産生に特に重要かもしれないが、T細胞におけるDock8の発現はこのIgAの産生には必要ないことが示唆される。
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図3B細胞内在性のDock8欠損は、T細胞依存性抗原に対する腸管IgA産生を障害する。ピーナッツおよびCTを経口免疫したマウスにおける便中ピーナッツ特異的IgAのELISA定量：（A）Ctrl（Dock8flox/flox）およびT-Dock8-/-（Cd4creDock8flox/flox）同腹子（B）1： B細胞欠損muMt（Ighm-/-）と野生型（WT）またはDock8欠損（Dock8-/-）骨髄細胞の1：1混合、または（C）Ctrl（Dock8flox/flox）とB-Dock8-/-（Cd23creDock8flox/flox）同腹子の同居。(D) ピーナッツ/CTを免疫したCtrl (Dock8flox/flox)およびB-Dock8-/- (Cd23creDock8flox/flox)同腹子の便中CT特異的IgAのELISA定量。ピーナッツおよびCT特異的IgAは、ピーナッツおよびCTによる6週目のi.g.免疫の1週間後に測定した。(E）免疫したCtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の便中IgAのELISA定量。(F）CtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の小腸LP（SiLP）におけるELISpotによるIgA分泌細胞（ASC）の代表的な画像と定量。(G）Ctrl（Dock8flox/flox）およびB-Dock8-/-同腹子の6週目のNP19-OVAおよびCTによる経口免疫の1週間後の便中NP15特異的、NP7特異的、およびNP7/NP15 IgAの比率のELISAによる定量。点線はCT IgA、ピーナッツIgA、NP7およびNP15 IgAアッセイの検出限界（標準に対する1.56任意単位）を示す。統計検定：(A-G) Mann-Whitney U 検定、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, **** < 0.000, ns = 有意でない。エラーバーはSDを示す。(A-G)各群3-5匹のマウスを用いた2-3回の独立した実験からのプールデータ。(F)の解析から、生存細胞数の少ない固有層調製物は除外した。
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B細胞内在性Dock8欠損は食物抗原に対する腸管IgA産生を障害する
Dock8欠損B細胞は、BCRおよびTLR9シグナル伝達だけでなく、免疫学的シナプス形成の欠損の結果として、長期生存の全身性抗体応答が損なわれることが、いくつかのグループによって以前に証明されている28, 29, 30。そこで我々は、Dock8-/-マウスにおけるT細胞依存性IgA応答の失敗には、B細胞内在性の欠陥が関与しているのではないかと考えた。Dock8-/-とmuMt-/-（Ighm-/-）のドナーBMを1：1の比率で再構成した混合キメラを用いて、B細胞に対するDock8欠損を分離し、ピーナッツに対する腸管IgA産生障害を見出した（図3B）。
Cd23-CreマウスとDock8欠損マウス（B-Dock8-/-）を交配し、B細胞におけるDock8の条件的欠失を作製した。Cd23-Creは未熟なB細胞の亜集団、移行部、辺縁帯、濾胞B細胞すべてで活性を示すので、B細胞リンパ球形成後期の遺伝子の条件的欠失に用いられる53。精製した脾臓濾胞B細胞のイムノブロットでは、B-Dock8-/-マウスではDOCK8タンパク質が消失していたが、コントロールマウスでは消失していなかったことから、DOCK8が効率的に欠失されていることがわかった（図S3A）。B-Dock8-/-マウスにおける脾臓B細胞および濾胞B細胞の頻度および数を解析したところ、B細胞の発達はほぼ正常であった（図S3B-C）。しかし、B-Dock8-/-マウスでは、Dock8-/-マウスの全細胞における過去の報告30, 54と同様に、辺縁帯B細胞が障害されていた（図S3C）。ヒトの辺縁帯B細胞とは異なり、ネズミの辺縁帯B細胞は脾臓に限局しているという文献が豊富にあることから、Dock8-/-マウスの腸管におけるT細胞依存性抗原に対するIgAの消失に、辺縁帯B細胞の消失が関与しているとは考えにくい55。
キメラマウスと同様に、B-Dock8-/-マウスは、全Dock8-/-マウス（図1）と同程度ではないものの、便ピーナッツ特異的IgA応答（図3C）およびCT特異的IgA応答（図3D）が障害されていた。完全Dock8-/-マウスとは対照的に、B-Dock8-/-マウスの総便中IgAレベルは同腹のコントロールと同等であった（図3E）。このことは、酵素結合免疫スポット（ELISpot）法で測定したB-Dock8/-マウスの小腸固有層（SiLP）における総IgA分泌細胞のレベルが正常であったことからも裏付けられる（図3F）。腸管におけるIgAに対するPPの重要性56と、M細胞の発達不全によるDock8-/-マウスのPPの消失を示した先行研究31を考慮し、Dock8-/-マウスとB-Dock8-/-マウスのPP細胞性を比較した。実際、DOCK8の完全欠損ではPPが低形成となったが（図S3D）、B細胞におけるDOCK8の単独欠損ではPPの細胞性は変化しなかった（図S3E）。したがって、全Dock8-/-マウスでは、複数の細胞欠損により、腸管IgA産生の大部分が失われることになる。対照的に、B細胞だけにおけるDOCK8の特異的欠損は、複数の抗原標的に対するIgA応答に障害をもたらした。B細胞におけるDOCK8の欠損が高親和性IgAと低親和性IgAに異なる影響を及ぼすかどうかを理解するために、B-Dock8-/-マウスと同腹仔マウスにハプテン化抗原NP-OVAとCTを免疫した。B-Dock8-/-マウスは、中親和性IgAと高親和性IgAの両方で減少を示した（図3G）。そこで我々は、食物特異的IgAの産生におけるB細胞のDOCK8の役割を理解することに焦点を当てた。
B細胞内在性のDock8欠損は、B細胞の遊走、腸管ホーミング、MLNおよびPPの構造を変化させない
DOCK8はアクチンネットワークの制御に重要であり、CX3CR1+単核食細胞、樹状細胞、CD8 T細胞の遊走を障害することが以前に示されていた22, 23, 24, 25, 26。このことから、T細胞依存性抗原に対する腸管IgA応答の障害は、1）T細胞依存性IgA産生の主要な誘導部位であるMLNおよびPPへのB細胞の遊走障害、または2）抗原特異的IgA+ PCs57のエフェクター部位であるSiLPへの抗原特異的B細胞の遊走障害によるものである可能性が考えられた。
B-Dock8-/-と同腹仔のMLNとPPにおけるIgA+ B細胞の頻度を比較したところ、有意差は認められなかった（図S3F）。抗原特異的IgA応答の障害は、MLNやPP内でのB細胞の不適切な局在に起因している可能性がある。例えば、CCR6の発現は、CT特異的IgA応答のために上皮下ドームにおけるB細胞の適切な位置決めに必要である56。これを評価するために、免疫蛍光顕微鏡を用いたところ、B-Dock8-/-マウスでは、同腹仔マウスと比較して、PPとMLNの両方に無傷の免疫学的構造と組織が認められた（図4A-B）：無傷のIgD+ナイーブB細胞ゾーン、IgD-胚中心（GC）、T細胞ゾーン、上皮下ドームとT細胞ゾーンに分布するCD11c+樹状細胞。IgA+B細胞もGCの内外に見られた。これらのデータを総合すると、DOCK8を欠損したIgA+ B細胞は、定常状態ではMLNとPPに適切に存在できることが示唆される。
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図4B細胞内在性のDock8欠損は、B細胞の移動、腸管ホーミング、MLNとPPの構造を変化させない。CtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の定常状態における（A）PPまたは（B）MLNにおけるTCRβ+（白）、IgD+（緑）、IgA+（赤）、またはCD11c+（青）細胞の局在を示す代表的な免疫蛍光画像。GC＝胚中心、SED＝上皮下ドーム、TCZ＝T細胞ゾーン、点線はBCZ＝B細胞ゾーンを示す。スケールバー、10倍像および4倍像では100μm。(C-D）Ctrl（Dock8flox/flox）およびB-Dock8-/-同腹子の（C）PPおよび（D）MLNにおける生きたIgA+ B細胞中の表面CCR9+およびα4β7+細胞の頻度と代表的フローサイトメトリープロット。(E）CCL25に対するCtrlおよびDock8欠損IgA+ CCR9+ B細胞のトランスウェル遊走アッセイ。 F）CCL25に対する3Dコラーゲンゲル内でのCtrlおよびDock8欠損in vitro分化IgA+ B細胞の遊走距離の定量化。統計学的検定：（C-D）Mann-Whitney U検定または（E-F）Paired t検定；ns＝有意ではない。エラーバーはSDを示す。(A）各群3匹のマウスを用いた3回の独立した実験から得られた代表的な画像。(C-D）1群3-5匹のマウスを用いた2つの独立した実験からの代表的データ。(E-F)2つの独立した実験からの複合データ。
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B細胞のSiLPへの腸管ホーミングは、主にケモカイン受容体CCR958によって媒介される。さらに、α4β7と粘膜血管アドレシンMAdCAM-1との相互作用は、粘膜部位への細胞輸送に必要である59。Dock8欠損IgA+細胞が粘膜部位、特にSiLPへのホーミングに欠損を有するかどうかを調べるために、IgA+ B細胞におけるα4β7とCCR9の発現を比較したところ、IgA+ B細胞集団におけるCCR9とα4β7の二重陽性細胞の頻度は、コントロールマウスとB-Dock8-/-マウスのPPとMLNで同等であることがわかった（図4C, D）。さらに、MLNから分離したIgA+細胞がCCR9リガンドであるCCL25に反応する能力を、トランスウェル遊走アッセイを用いて試験した。コントロールとDock8欠損のCCR9+ IgA+ B細胞は同程度の割合でCCL25に遊走した（図4E）ことから、Dock8欠損IgA+ B細胞ではCCL25の走化性が正常であることが示された。最後に、DOCK8を欠損したT細胞や骨髄系細胞は正常な走化性を示すが、三次元（3D）コラーゲンゲルマトリックス中で遊走する際に細胞分裂を起こすことが示されているので22, 26、in vitroで分化したIgA+ B細胞が3Dコラーゲンゲル中でCCL25に向かって遊走する能力を試験した。その結果、Dock8を欠損したIgA+ B細胞は、移動距離の点では正常であり、細胞分裂の形跡も見られなかった（図4F）。これらのデータを総合すると、Dock8欠損IgA+ B細胞は腸管ホーミングケモカインレセプターを発現し、2Dおよび3Dマトリックス中で腸管ホーミングケモカインシグナルに応答して移動できることが示された。このことから、B細胞におけるDOCK8の欠損は、その遊走能力を損なわず、IgA産生障害に寄与する可能性は低いことが示唆される。
B細胞内在性のDock8欠損は、PP、MLN、BMではなく、LPにおける抗原特異的IgA+ PCの減少をもたらす
B細胞内在性のDOCK8欠損がどのようにT細胞依存性腸管IgAを障害するかを明らかにするために、B-Dock8-/-マウスにおいて、T細胞依存性抗原、ピーナッツ、CTによる免疫後のIgA産生に寄与するMLN、PP、SiLPの様々なB細胞集団を調べた。T濾胞ヘルパー細胞(Tfh)ノックアウトマウスでは、同じ免疫条件下でピーナッツ特異的IgAが正常に産生されることを示した我々の以前の研究12と、図4A-Bで観察されたGC染色を考慮すると、GCにおけるIgA+ B細胞の欠損が我々の表現型を説明するとは予想しなかった。実際、IgA+ではなくIgG1+のGC B細胞の頻度は、MLNとPPの両方で有意に減少していた（図S4A-D）。初期形質芽細胞（PB）とその後のPC分化のマーカーとしてCD138を用いると、B-Dock8-/-マウスのMLNでは正常レベルのIgA+ PB/PCが観察され、PPではIgA+ PB/PCのわずかな減少が観察された（図S4E-F）。しかし、この軽度の欠損は、B-Dock8-/-マウスのSiLPにおける総IgA+ PB/PCの減少をもたらさなかった（図S4G）。これらの所見は、B-Dock8-/-マウスの総便中IgAが正常であった理由であろう（図3E-F）。
我々は、免疫後にMLNとPPの両方でB細胞総数を調べたが、腸管IgAの大部分は細菌に対するものであり、我々の免疫原に特異的なIgA+ B細胞はごく一部であった。ELISpotアッセイを用いると、B-Dock8-/-マウスのSiLPでは、CT IgAとピーナッツIgA ASCの両方が、同腹の同胞と比較して有意に減少していた（図5A）。しかし、この減少はMLNやPPでは見られなかった（図5B-C）。このことは、CTやピーナッツIgAを分泌するPBへのB細胞分化の初期段階はそのままであるが、PB/PCがSiLPで生成されなかったり、持続しなかったりすることを示している。もう一つのPCニッチであるBMを調べたところ、ピーナッツ特異的IgA分泌細胞の数は正常であった（図5D）。したがって、抗原特異的IgA+ PCの産生はDOCK8非存在下でも維持されるが、LPでは選択的に維持されない。異なるニッチにおけるIgA+ PCを比較した最近のデータから、BMとLPのIgA+ PCはクローナリティが関連しており、起源を共有していることが示唆されるが、2つの集団は組織特異的な遺伝子シグネチャーを発現している38。したがって、これらのデータは、BMとsiLP内で抗原特異的PCを維持するための要件が異なるというモデルを支持している。
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図5B細胞内在性のDock8欠損は、PP、MLN、骨髄（BM）ではなく、固有層膜における抗原特異的IgA+ PCの減少をもたらす。(A)小腸固有IgA抗体分泌細胞(ASCs)のELISpotによる代表画像。 (B-D)CtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の(B)MLNおよび(C)PP (D)BMにおけるピーナッツ固有IgA ASCsの数。(E)CD19-Lin-細胞（NK1.1- CD3- TCRβ- F4/80- IgD-）で事前にゲーティングしたLPにおけるNP特異的IgA+CD138+ PCの頻度。(F-G)CtrlおよびB-Dock8-/-同腹仔の(F)MLNおよび(G)PPにおける、生細胞上で事前にゲーティングしたNP特異的IgA+CD138+ PCの頻度。すべての組織は、(A-D)ピーナッツ+CTまたは(E-G)NP19-OVA+CTによる6週目の経口免疫の8日後に分析した。統計学的検定： Mann-Whitney U検定、*P < 0.05、**P < 0.01、ns = 有意でない。エラーバーはSDを示す。(A-B)1群3-4匹のマウスを用いた3つの独立した実験からのプールデータ。(C-D）1群あたり2-3匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのプールデータ。(E-G）1群あたり3-5匹のマウスを用いた3つの独立した実験からのプールデータ。E）の解析では、生存細胞数の少ない固有層調製物は除外した。点線は、ナイーブマウスにおけるCT特異的またはピーナッツ特異的IgA ASCのベースラインシグナルを示す。
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MLNとPPにおける抗原特異的B細胞の特徴を明らかにする別の方法を用いて、B-Dock8-/-マウスにT細胞依存性抗原NP-OVAとCTを免疫し、MLNとPPにおけるB細胞サブセットをフローサイトメトリーで調べた。ELISpotの結果と一致して、フローサイトメトリーによるNP特異的CD138+ IgA B細胞の検出では、SiLPで障害が確認されたが、PPとMLNでは確認されなかった（図5E-G）。NP特異的CD138+ IgA細胞の消失がPBかPCかを理解するために、Ki67を用いて2つの集団を区別した。Ki67は増殖細胞のマーカーであり、活発に分裂しているPBと長寿命で非増殖性のPCを区別するのに用いることができる60, 61。Ki67+であったNP特異的IgA+ B細胞の割合を比較すると、B-Dock8-/-マウスのSiLPではPBがわずかに増加していたが、統計学的に有意ではなかった（図S4H）。MLNとPPは、LPに見られるIgA+ PCの前駆体を含むことが知られているので61, 62, 63、これらのデータは、B細胞におけるDOCK8の欠損が、プライミング、IgAスイッチング、PB分化を障害するのではなく、SiLP内に特異的なPCの終末分化または維持を障害する可能性が高いことを示唆している。
B細胞におけるDOCK8は、B細胞の活性化、IgAクラスのスイッチング、抗体分泌細胞への分化には必要ではない
SiLPにおけるPCの持続にDOCK8が必要であることの根底にある分子メカニズムをさらに理解するために、T細胞依存性抗原に対するPCの分化に重要ないくつかの鍵となる分子と経路を調べた。B細胞におけるDOCK8の欠損は、Cd19発現の低下によりBCRシグナル伝達を障害することが証明されていたので29、我々のモデルで表面CD19タンパク質の発現を調べたところ、Dock8欠損B細胞と欠損B細胞で同等であった（図S5A）。DOCK8はT細胞においてSTAT3のリン酸化と核内転座を促進する64。STAT3は、PCの発生に関与する3つのサイトカイン、IL-21、IL-6、IL-10の下流にある重要な転写因子である65, 66, 67, 68。特に、IL-21はCD40Lと相乗的にGCとPCの分化をサポートする69。腸内では、IL-21は腸内B細胞によるIgA産生を促進することも示されている70。Il21r欠損マウスでは、定常状態でSFBの拡大、糞便中IgAの低下、PPおよびSiLPにおけるIgA+ PCの減少がみられる71。従って、B細胞におけるDock8の欠損は、STAT3の活性化に異常をきたし、その結果、LPにおける終末PC分化を低下させるという仮説を立てた。CD40はIL-21と相乗的に作用してPC分化を促進するので、まずDock8欠損B細胞上のCD40レベルを調べたところ、WTコントロールと同様であった（図S5B）。次に、IL-21に反応してSTAT3のチロシン705でのリン酸化を調べたところ、IL-21活性化の下流のSTAT3シグナル伝達は無傷であった（図S5C）。
IgAスイッチングに必要な主要サイトカインについては一般的なコンセンサスが得られているが、強固なIgA+ PCをin vitroで作製するのに必要な条件は不明であり、ほとんどの方法ではIgA分泌細胞の作製は限定的である10。 DCがPPのin vivoでのIgAスイッチングに関与していることが示されているので、我々は、in vitroで作製したBM由来DCとPPまたは脾臓から単離したナイーブB細胞を用いて、DC-B細胞共培養系を確立した56, 58。腸管におけるT細胞の活性化をモデル化するため、BMDCの存在下で、CD40Lとα-IgM、さらに偏性サイトカイン、TGFβ、RAを用いてB細胞を活性化した。この系を用いると、多数のIgAスイッチ細胞が得られ、IgA+ PCの生成に必要なDOCK8の分子的要件を理解するのに用いることができた（図S5D-E）。脾臓から単離したナイーブB細胞（図S5D）またはPP（図S5E）の両方を用いたところ、in vivoのデータと一致して、IgAクラススイッチングが無傷であった。
DOCK8はIgA+ B細胞の細胞代謝に関連する分子と相互作用し、正常な細胞呼吸に必要である
DOCK8の機能をより深く理解するために、IgA+ B細胞におけるDOCK8インタラクトームのマッピングを試みた。このために、発現半径10 nm以内でリジンのビオチン化をランダムに行う大腸菌BirAを改良したTurboIDという近接依存的なタグ付け法を利用した72。CRISPR/Cas9を用いて、TurboIDをDock8遺伝子の最後のコードエクソンにインフレームで挿入し、内在性遺伝子座から発現するDOCK8-TurboID融合タンパク質を生成したマウス系統を作製した（図S6A）。in vitroで作製したIgA+ B細胞培養液に50 mMのビオチンを添加すると、DOCK8-TurboID細胞から得られた溶解液では、ビオチンをパルスしたWT対照細胞と比較して、強いビオチン化シグナルが得られた（図S6B）。
DOCK8近接パートナーを同定するために、ビオチンパルスをかけたDOCK8-TurboID細胞と、PP細胞からin vitroで作製したコントロールの非TurboID IgA+ B細胞の溶解液を、ストレプトアビジンアフィニティー精製にかけた後、タンデム質量分析を行った（表S1）。DOCK8-TurboIDサンプルと非TurboIDサンプルの解析から、321のDOCK8近接パートナーの濃縮が同定された（log2 fold change ≥1、false discovery ≤0.05；図S6C-D；表S1）。Gene Ontology (GO)およびIngenuity Pathway Analysis (IPA)解析により、GTPase調節、シグナル伝達、細胞骨格リモデリングなど、DOCK8が関与することが知られているパスウェイから多くのタンパク質が同定された（図6AおよびS6E）。また、アポトーシス、オートファジー、代謝など、これまでDOCK8とは関わりのなかった経路のタンパク質も同定された（図6A）。このことは、DOCK8が多様な細胞機能を持つ可能性を示唆している。
図のサムネイルgr6
図6IgA+B細胞におけるDOCK8インタラクトームと代謝アッセイは、IgA B細胞の呼吸におけるDOCK8の重要な役割を示している。(A）IgA+B細胞は、図S5Eと同様にDOCK8-TurboIDマウスのPPから作製した。ビオチン化標的のプロテオミクス解析から得られたDOCK8の近傍に濃縮されたタンパク質のヒートマップ。選択されたタンパク質は、遺伝子オントロジーとIPA解析に基づいて機能クラスにグループ分けされた。(B）IgA+B細胞培養のB細胞におけるピルビン酸キナーゼM1/2（PKM）とDOCK8間のタンパク質間相互作用を示す近接ライゲーションアッセイ（PLA）。野生型（WT DOCK8）とDOCK8-TurboID（DOCK8-HA）細胞のPLA実験からの代表的な画像（左）と細胞あたりのPLAスポット数の定量（右）。データは2つの独立した実験から得られたプールデータであり、括弧内の数字は各遺伝子型についてスコア化された個々の核の数を示す。エラーバーはSEMを示す。(C）CtrlマウスとDock8欠損マウスからin vitroで作製したIgA+ B細胞の酸素消費率（OCR）と解糖プロトン流出率（glycoPER）の代表プロット。データは2つの独立した実験の代表値。
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最近、B細胞のエフェクター機能の制御における代謝経路の重要性が明らかになった73。特に、終末分化したPCで使われる代謝経路のシフトは、抗体分泌と生存を可能にする74。ナイーブB細胞と腸内のIgA+ PCは異なる代謝経路を使用し、IgA+ PCはATP生成にトリカルボリル酸サイクル（TCA）と解糖の両方に依存しているが、PP由来のナイーブB細胞は主にTCAサイクルを使用している75。我々のTurboIDデータから、DOCK8はPFKL（Phosphofructokinase, Liver Type）、TIGAR（TP53 Induced Glycolysis Regulatory Phosphatase）、PKM（Pyruvate Kinase M1/2）など、解糖経路のいくつかのタンパク質と相互作用する可能性があることが明らかになった（図6AおよびS6D）。PKMはピルビン酸の生成において重要な速度制限酵素であり、代謝ストレス状態において呼吸を支え、長寿命PCの生存を促進するために使われる74。そこで我々は、DOCK8とPKMの分子間相互作用を検証することを目的とした。プロキシミティライゲーションアッセイ（PLA）は、内在性のタンパク質間相互作用を1分子分解能で高い特異性と感度でその場で検出することができる。信頼性の高い抗マウスDOCK8抗体は入手できないので、我々はDOCK8-TurboID融合タンパク質に含まれる単一のHAタグを利用した。in vitroで作製したDOCK8-TurboID IgA+ B細胞のPLAを用いて、DOCK8とPKMの相互作用を確認し、TurboID質量分析データを検証した（Fig.） HAタグを欠くB細胞は抗体ペアの一つでは認識されないはずであり、アッセイの特異性が確認された（Fig.）
最近の研究から、他のコンパートメントでは、主要な転写の違いよりむしろ代謝の違いが長寿命PCと短命PCを区別することが示された73。従って、DOCK8が欠損すると、IgA+ PCのグルコースおよびエネルギー代謝が損なわれる可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、酸素消費速度と、解糖から産生される乳酸産生量を推定するプロトン流出速度（glycoPER）を定量した。Dock8欠損IgA+ B細胞では、基礎的なミトコンドリアの酸素消費と解糖の両方が減少していた（図6C）。ロテノンとアンチマイシンでミトコンドリア呼吸を薬理学的に阻害しても、Dock8欠損細胞は解糖速度の増加で補うことができなかった（図6C）。これらのデータは、DOCK8が基礎的なATP産生と、呼吸が損なわれたときにそれを補うための予備経路に関与するために重要であることを示唆している。このように、siLPの抗原特異的IgA+ PCコンパートメントは、DOCK8がないと、おそらくsiLPに存在する特異的な代謝環境に起因する代謝適性の障害によって、二次的に損なわれる可能性が高い（図解）。
考察
腸管IgA応答の分化と維持を促進するB細胞の外因性因子と内因性因子を理解することは、寛容や、逆に炎症性腸疾患やおそらく食物アレルギーなどの状態における寛容の喪失を理解する上で重要である。毒素や細菌に対する腸管IgAは、防御と恒常性の維持に中心的な役割を果たすが、食物抗原に対するIgAの実際の役割は依然として謎に包まれている9。我々は、Dock8欠損マウスモデルを用いて、腸における食物特異的IgA誘導の細胞メカニズムを明らかにした。
DOCK8が全身の体液性応答を媒介する役割については多くのことが知られているが、粘膜抗体産生におけるその役割についてはあまり研究されていない28, 29, 30, 31。我々は、DOCK8が細菌毒素CTと食事性抗原ピーナッツに対するT細胞依存性IgA応答に必要であることを発見した（図1）。さらに、SFBに対するIgAは障害されたが、常在細菌に対するIgAの総レベルはDock8欠損の影響を受けなかった。この観察結果は、Tcrβ-/-γ-/-マウスにおいて、SFB、Mucispirillum、Helicobacterなど一部の分類群を除き、ほとんどの常在細菌に対するIgA結合が正常であったというデータと一致している42, 76。SFBの制御は、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AID）に依存することが以前に判明しており、T細胞の助けが必要であると考えられている77。実際、Kunimuraら（2019）が作成した16S rRNA配列決定データと同様に、Dock8-/-マウスという異なるモデルを用いたにもかかわらず、我々のデータでもSFBの拡大が明らかになった31。これらのデータを総合すると、DOCK8はT細胞によるIgA応答の際に特異的に必要とされることが示唆される。しかし、IgAの分野では、特にIgAに対するT細胞の助けの性質に関する数多くの基本的な疑問が残されているため、Dock8欠損マウスにおけるこのIgA消失パターンは慎重に解釈されるべきである8。
以前の研究で、全Dock8-/-マウスにおけるPPの欠損と、M細胞の発達障害に起因するIgA応答の障害との関連が示された31。これらの知見と一致して、我々は完全Dock8-/-マウスで小さなPPを観察した。そこで、Dock8を条件付きで欠失させたマウスモデルを作製し、T細胞あるいはB細胞に内在するDOCK8の欠損が、PPの構造を著しく損なうことなくIgA応答の消失に関与しているのかどうかを検討した。Dock8欠損はTreg細胞の機能27, 50とTh17細胞の分化64を障害することが分かっており、これら2つの集団もIgA応答の駆動に関与している51, 52, 78, 79が、T細胞におけるDOCK8の欠損はCTとピーナッツに対するIgA応答を障害しなかった。対照的に、B細胞内在性のDock8欠損では、総IgAではなく特異的IgAが消失した。このことは、特異的IgAは障害されるが、総腸管IgAは比較的正常であるCD40/CD40L欠損マウスの所見と一致している11, 12。このことから、Dock8完全欠損マウスにおける総便中IgAの欠損はB細胞外在性の欠損によるものであり、おそらくPPの数とサイズの減少に起因すると考えられるが、Dock8-/-マウスにおける抗原特異的IgAの欠損はB細胞内在性の欠損によるものであると考えられる。
以前、B細胞におけるDOCK8の欠損は、Cd19発現の低下によりBCRシグナル伝達を障害することが証明された29。しかし、B-Dock8-/-マウスのB細胞における表面CD19の有意な低下は観察されなかった。B細胞におけるDock8欠損の別の研究では、免疫学的シナプスの形成障害に起因する、長期の全身抗体応答の障害が明らかにされ、それによって後期GC応答が機能不全に陥った30。しかし、これが粘膜IgA応答に及ぼす影響については検討されていない。また、Dock8欠損マウスでは、MLNとPPの両方においてIgG1+ GC B細胞の頻度が減少していたが、IgA+ GC B細胞の頻度は低下していなかった。これらの結果は、GC非存在下でも、IgG1ではなくT細胞依存性の粘膜IgAの誘導が起こりうることを示した我々の以前の研究と一致している12。最後に、DOCK8はTLR9シグナル伝達に関与しており28、Tlr9欠損マウスはピーナッツ+CTで免疫した際の血清IgAが低下しているが、PPの数も減少している31, 80。実際、Myd88-/-マウスにCTと抗原を経鼻免疫した後のIgGが正常であったという研究は、CTによって誘導される粘膜IgAはTLR9シグナル伝達を必要としない可能性を示唆している81。B-Dock8-/-マウスのMLNおよびPPにおける抗原特異的B細胞の特徴を調べたところ、MLNおよびPPにおけるピーナッツ特異的IgA分泌細胞数は正常であったが、LPでは有意に減少していた。正常なB細胞の分化と一致して、STAT3依存性のIL-21シグナル伝達もまた無傷であった。これらのデータから、抗原特異的IgA分泌細胞の誘導にはDOCK8は必要なく、LPにおけるIgA+ PCの遊走や維持に障害があることが示唆された。DOCK8は免疫系の複数の細胞の遊走を制御していることから、DOCK8がIgA+ B細胞の遊走に必要かどうかを検証した。腸管ホーミング受容体CCR9とα4β758, 59, 82の発現は、Dock8欠損IgA+ B細胞では正常であり、CCL25に対するin vitroでの遊走は無傷であった。我々は組織を介した遊走を模倣した系を用いたが、in vivoでの遊走にはやはりDOCK8が必要である可能性がある。しかしながら、これらの結果、MLNとPPの正常な細胞構造、およびBMにおける正常なIgA ASCsを考慮すると、遊走／ホーミング不全の寄与は小さいと結論した。
我々は、TurboIDベースの近接ラベリングアッセイを用いて、PP B細胞から作製したIgA+ B細胞におけるDOCK8タンパク質相互作用の偏りのないスクリーニングを行った。このスクリーニングにより、DOCK8の機能として知られているアクチン細胞骨格のリモデリングに関与するタンパク質が同定された。予期せぬことに、DOCK8は代謝やアポトーシスに関与するタンパク質とも相互作用する可能性があることを発見した。イメージングベースのin situ PLAを用いて、DOCK8が解糖の最終律速段階を制御するPKMと相互作用することを検証した。グルコース代謝は、全身的にPCの生存と抗体分泌に必須であることが分かっている73。長寿命のPCは短寿命のPCよりも呼吸能力に余裕があり、グルコースをヘキソサミン生合成経路を介した抗体グリコシル化に使う代わりに、ピルビン酸生成と呼吸代謝のために解糖系経路に回すことができるからである74。腸管では、IgA+ PCが解糖系とTCAサイクルの両方を利用するのに対し、PPのナイーブB細胞はTCAサイクルに依存していることも、Kunisawaら75によって明らかにされた。解糖による酸素消費量とプロトン流出量を測定することにより、Dock8欠損IgA+ PCでは呼吸が減少していることがわかった。
我々は、我々の知見と他の研究者の最近の研究に基づき、PCに課される代謝要求が異なるニッチ（例えば、BMと腸）で異なり、潜在的に長命なPCの寿命に差が生じるというモデルを提案する。BMのPCと比較して、腸のIgA+ PCのターンオーバーはより急速である35, 83, 84。腸管IgA+ PCの機能およびIgA分泌の日内変化は、概日 摂食活動35による栄養の利用可能性の変化によって駆動さ れると考えられている。したがって、LPのIgA+ PCは、この周期的な代謝ストレスに適応しなければならない。Dock8欠損IgA+ PCの代謝適性が損なわれていると、腸内の栄養利用可能性の周期的変化に適応する能力が制限され、LP内での生存が制限される可能性がある。しかし、Dock8欠損IgA+ PCは、より安定した代謝環境を提供する可能性のあるBMのような他の部位で存続し、起源を共有しているにもかかわらずBMから腸へのIgA+ PCの再循環がないことが知られていることと一致する38。また、DOCK8が欠損することによって影響を受ける抗体のパターンから、腸管PCの代謝要件が、T-依存性IgA反応とT-非依存性IgA反応とで異なる可能性も考えられる。全体として、このようなモデルは、T依存性、アイソタイプ（IgGs対IgA）、場所（BM対腸）に基づく抗体産生の寿命の差に潜在的な意味を持つ。
材料と方法
マウス。年齢と性別が一致した6～12週齢のマウスを、ピーナッツと卵を含まないTeklad Global 18% Protein Rodent Diet（2018S、Harlan laboratories）で飼育した。WT CD45.2およびCD45.1 C57BL/6マウスはNational Cancer Instituteから購入した。Dock8ノックアウト（Dock8-/-）マウスおよびDock8 flox（Dock8fl/fl）マウスは既述のように作製した23, 85。MuMT-/-〔B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J〕、Cd4-Cre〔Tg(Cd4-cre)1Cwi/BfluJ〕、Cd23-Cre〔B6. Cg-Tg(Fcer2a-cre)5Mbu/J]53マウスをThe Jackson Laboratoriesから購入し、当研究室で作製したDock8 floxマウスを交配して、記載39にしたがってコンディショナルT細胞（T-Dock8-/-マウス）およびB細胞-Dock8-/-マウス（B-Dock8-/-マウス）のノックアウトマウスを作製した。Dock8-TurboIDノックインマウス対立遺伝子は、マウスの接合体にCRISPR-Cas9試薬を直接導入して作製した。GSGリンカー、TurboID、HAタグ、停止コドンを含む1kbの配列を、Dock8の最終エクソン（Ensembl Gene ID ENSMUSG00000052085）のエクソン48（Ensembl Dock8-201転写物 ENSMUST00000025831.7）の停止コドンのすぐ上流にインフレームで導入した。PCRプライマーはgRNA標的部位に隣接するが、修復テンプレートホモロジーアームの外側にあるものを用い、創始子孫から目的の4.5kb領域を増幅した。PCRアンプリコンをサンガーシークエンスにかけ、正しく標的化された改変を持つ創始者を同定した。正しく挿入されたマウスをC57BL/6Jに戻し交配し、Dock8-TurboID系統を樹立した（詳細な説明は補足方法を参照）。マウスは病原体を含まない特定の条件下で飼育した。この研究で使用されたすべてのプロトコールは、イェール大学医学部またはノースウェスタン大学ファインバーグ医学部のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
免疫。マウスは、(10)から改変したプロトコールに基づき、1匹あたり200μlの0.2M重炭酸ナトリウム緩衝液中で、5mgの粉砕ブランチングピーナッツ（Western Mixers Produce & Nuts）または1mgのNP-オバルブミン（LGC Biosearch）と10μgのCT（List Biologicals, Lot: #10167A2および #10165A1）を経口経口投与により6週間にわたり毎週免疫した。E. B. Norton博士の好意により提供された大腸菌熱-毒素（LT）をCTの代わりに用いた実験もある。
マウスの便の処理。便ペレットは採取と同時にドライアイス上で瞬間凍結した。凍結したペレットを秤量し、100mgの便あたり1mLのPBS（Gibco）で15分間氷上で再水和した。再水和したペレットを、滅菌した木製アプリケーター（McKesson）を用いてホモジナイズし、ボルテックスし、8000 gで10分間、4℃で遠心した。上清を滅菌微量遠心チューブに集め、1%ウシ血清アルブミン（BSA）で一晩プレコートした。上清は分析前に-80℃で保存した。
血清の採取。採取した血液を1時間RTでインキュベートし、生じた凝血塊を除去した。サンプルを1500gで10分間遠心し、血清を回収し、分析前に-80℃で保存した。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）。全抗体、NP-抗体、CT-抗体、またはピーナッツ特異的抗体を測定するために、便および血清サンプルをELISAによって分析した。簡単に言えば、20μg／mLの粗ピーナッツ抽出物（Greer Laboratories；Lot：＃287729）、10μg／mLのNP7／15-BSA（LGC Biosearch）、5μg／mLのCT（List biologicals；Lot．#10165A1および#10167A2）、抗マウスIgA（MP Biomedicals）、抗マウスIgG（Jackson Laboratories）、抗マウスIgMまたは抗マウスIgE（BD Pharmingen）の捕捉抗体を炭酸緩衝液（pH 9. 6）中の捕捉抗体を96ウェルMaxisorpプレート（Thermo Fisher Scientific）に一晩コートした。プレートをPBS中1％BSAで37℃、1時間ブロッキングした後、連続希釈した血清または便サンプルを加え、37℃で2時間インキュベートした。ピーナッツ特異的、CT特異的、NP特異的、または総IgAは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgA（#1040-05）で検出し、総IgG、IgM、およびIgEは、HRP標識ヤギ抗マウスIgG（#1013-05）またはIgE（#1110-05）で検出した； Southern Biotech）またはHRP標識ラット抗マウスIgM（BD Biosciences #550588 ）抗体を用いて37℃で検出した。マウス抗体には、精製マウス IgA、IgM、IgE（BD Biosciences）、精製マウス IgG（Sigma-Aldrich）を標準品として用いた。抗原(Ag)特異的IgA標準品は、免疫強化マウスの血清または便上清をプールしたものを用いた。プレートを安定化発色剤テトラメチルベンジジン（Life Sciences）で現像し、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で450 nmで読み取る前に3N塩酸で停止した。
酵素結合免疫スポット（ELISpot）アッセイ。96ウェルELIspotマルチスクリーンHTSプレート（Merck Millipore）に、20μg/mL粗ピーナッツ抽出物（Greer Laboratories）、5μg/mL CT、または抗マウスIgA（MP Biomedicals）をPBS中、4℃で一晩コートした。プレートを滅菌PBSで洗浄し、完全培地（10％ウシ胎児血清、2％ペニシリン／ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、25mM Hepes緩衝液、55μM β-メルカプトエタノールを含むRPMI）で37℃で2時間ブロッキングした。ピーナッツおよびCTによる6回目の胃内免疫から1週間後のマウスのSiLPから1×105細胞、腸間膜リンパ節（MLN）またはパイエル板（PP）から0.5×106細胞、およびBMから1×106細胞を3連で加え、2回の連続希釈で1：2に希釈した。細胞は37℃で20～22時間培養した。プレートは0.01% Tween 20を加えたPBSで洗浄した。AP標識ヤギ抗マウスIgA抗体（Southern Biotech）を加え、37℃で2時間インキュベートした。抗体形成細胞をblue AP substrate kit（Vector Labs）を用いて可視化し、ImmunoSpot analyzer（Cellular Technology Limited）を用いて定量した。
便中IgAフローサイトメトリーおよびIgA+菌とIgA-菌のソーティング。IgAの選別および配列決定手順は、42. 簡単に説明すると、約100mgの便ペレットを1mLの滅菌PBS（Gibco）と共に30分間インキュベートした後、セラミックビーズ（MP Biomedicals）を含むFast Prep Lysing Matrix Dチューブに入れ、ビーズビーターミニホモジナイザーで7秒間ホモジナイズした。大きな粒子を除去するため、4℃で15分間、50 gで遠心した。便細菌を含む上清100 µLを除去し、1 mLの染色バッファー（1%(w/v)のウシ血清アルブミン（BSA、American Bio社製）を含むPBS）で洗浄した後、8000 g、5分間、4℃で遠心分離し（洗浄ステップ）、1 mLの染色バッファーに再懸濁した。プレソートサンプル（30 µL）を採取し、16S rRNA配列決定前に-80 °Cで凍結した。さらに洗浄後、細菌ペレットを100 µLのブロッキングバッファー（20% Normal Rat Serum (Stem cell technologies)を含む染色バッファー）に氷上で20分間再懸濁し、PE標識Rat抗マウスIgA（eBioscienceクローンmA-6E1）の1:12.5希釈液を含む100 µLの染色バッファーで氷上で30分間染色した。その後、フローサイトメトリー解析または Fluorescence Activated Cell Sorting (FACSAria; BD Biosciences)でIgA+菌とIgA-菌を分離する前に、サンプルを1 mlの染色バッファーで3回洗浄した。各サンプルについて、200万個のIgA+菌とIgA-菌を集めた。
16S rRNA配列決定および統計解析。250μLの0.1mmジルコニア/シリカビーズ（Biospec社製）、300μLのLysis buffer（200 mM NaCl、200 mM Tris、20 mM EDTA、pH 8）、200μLの20% SDS、500μLのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、pH 7.9、Sigma社製）を加える前に、凍結した細菌サンプルを400μLの染色バッファーに再懸濁した。氷上で4分間インキュベートした後、細菌細胞を2ラウンドのビーズビートでホモジナイズし、その間に氷上で2分間インキュベートした後、6000g、4℃で遠心分離した。水相をPhase Lock Gel tube（Light; 5 PRIME）に移し、同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを加えた。室温で3分間、16,100 gで遠心する前にサンプルを混合した。1/10容量の3M NaOAc（pH5.5）と1容量のイソプロパノールを水相に加え、20℃で一晩インキュベートする前にDNA沈殿を行った。DNA沈殿を16,100g、20分間、4℃でペレット化した後、500μLの絶対EtOHで洗浄し、遠心分離を16,100g、3分間、4℃で行った。最後に、DNAペレットを100μLのTEバッファー（pH7）に懸濁し、50℃で30分間インキュベートした。精製前に35 U/ml RNase AをDNAペレットに加え、40 µL Elution Buffer (QIAquick PCR purification; QIAGEN)で溶出した。V4 領域の 16S rRNA シークエンシングと細菌ゲノムシークエンシングは、バーコード付きプライマーを用いて Illumina miSeq で行った。シーケンシングの詳細なプロトコールについては、42. 16Sシーケンスデータの解析はQIIME（バージョン1.9.1）を用いて行った86。
すべてのサンプルは20,000リードまで希釈した。対照水サンプル中の汚染OTUを同定し、filter_otus_from_otu_table.pyスクリプトを用いて全ての解析から除去し、summarize_taxa.py、alpha_diversity.py、beta_diversity_through_plots.pyを用いて分類群サマリー、alpha-diversity表、beta-diversity表、主座標分析（PCoA）を作成した。主座標分析はR v.3.3.2（R Core Team (2016). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/）。クラドグラムはFigTree v1.4.3 http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ を用いて作成した。lefSe解析は43.
16S rRNA配列データの利用可能性。すべての配列リードデータは、NCBI BioProjectデータベース(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/)のBioProjectアクセッション番号GSE198847にリンクして寄託されている。
SFB IgAフロー。IgAコーティングのないSFBを作製するために、SFB-monocolonizedマウス（Ivaylo Ivanov博士より提供）の便を無菌Rag-/-マウスに経口移入した。5日後、Rag-/-マウスから便を採取し、ホモジナイズした。大きな粒子は遠心分離機で除去し、残ったSFBは「便中IgAフローサイトメトリーおよびIgA+菌とIgA-菌のソーティング」の項で述べたように洗浄した。その後、SFBをWTおよびDock8-/-マウスの1:10希釈便上清と1%ラット血清存在下、氷上で1時間インキュベートした。SFBへのIgAの非特異的結合のコントロールとして、SFBフリー施設であるThe Jackson Laboratoriesから購入したばかりのマウスの便上清を単離したSFBとインキュベートし、バックグラウンドIgA染色のベースラインを確立した。洗浄後、SFBペレットを氷上で20分間20%ラット血清でブロックし、APC標識Rat抗マウスIgA（eBioscience #17 -4204-82）の1:50希釈液、SYTO9核酸染色液（Invitrogen #S34854 ）の1:200希釈液、および5μg/ml DAPI（Sigma #D9542 ）で染色した。フローサイトメトリーを用いて、IgAコートSFBの割合を同定した。
LP細胞の単離。LPから細胞を単離するために使用したプロトコールは、これらの前処理が困難であり、しばしば全ての生存細胞を失う結果となるため、この研究の過程で変化した。最もうまくいったプロトコルをここに記す。全ての工程は、1％ペニシリンとストレプトマイシン、1％ L-グルタミン、25mM Hepes、1X非必須アミノ酸、1Xピルビン酸ナトリウ ム、50μMのβ-メルカプトエタノールを添加したRPMI培地（「無 血清RPMI」）を用いて行った。追加の試薬は、以下に記す特定のステップで培地に添加した。
摘出後、胃から1mm、盲腸から1mm上で切断して小腸を摘出した。PPを取り出し、10%FBS添加RPMI中で保存した。小腸を縦に切り開き、ハンクス平衡塩類溶液で繰り返し洗浄し、糞便を除去した。その後のサンプル処理中、洗浄した腸は10%FBS添加RPMI中で氷上保存した。洗浄後、各小腸を1～2cmに切断し、3％FBS、5mM EDTA、0.145mg/mlのジチオスレイトールを添加した室温の無血清RPMIを入れたコニカルフラスコに入れた。サンプルは、5%CO2を含むインキュベーター内で、37℃、600rpmで20分間撹拌した。その後、小腸片を、2mM EDTAを含むSerum-free RPMI中で30秒間激しく振盪しながら3回洗浄した。各洗浄の間に、培地をストレーナーで洗浄し、上皮および上皮内リンパ球画分とともに廃棄し、残りの腸片は新しい培地に回収した。室温の無添加血清RPMIを用いて最終洗浄を行い、試料を新しいストレーナーで洗浄した。その後、小腸を細かく切断し、1 mg/mL Collagenase IV（Worthington Biochemical #LS004189 ）および0.05% DNase I（Sigma-Aldrich #D5025 ）を添加した10 mLの無血清RPMI培地中で、前ステップと同じ条件で撹拌しながらインキュベートした。30分間の消化後、3％FBSを含む10mLの冷血清フリーRPMIで反応を停止させた。その後、1500rpmで遠心する前に、3mLシリンジのプランジャーで70μMセルストレーナーを通してサンプルを粉砕した。ペレットを再懸濁し、40μMのセルストレーナーで再度ろ過した後、1500rpmで遠心した。リンパ球の濃縮は、30%パーコール勾配を用いた細胞分離で行った。遠心分離は2000rpmで行った（加速：4、減速：2、20℃）。得られたペレットにはLPリンパ球が含まれている。時折、赤血球も見えることがあるが、その場合は、さらなる分析の前に赤血球溶解を行う。LP画分からのリンパ球のさらなる染色は、過剰染色を避けるため、FACS Buffer（PBS+2％FBS 1mM EDTA）中、室温で20分間行う。コラゲナーゼIVの使用により表面マーカーの消化が制限されるため、このプロトコールに従えば表面染色と細胞内染色の両方が可能である。
フローサイトメトリーによる細胞分析 ピーナッツ免疫マウスを、ピーナッツおよびCTの6回目の経口投与から8日後に犠牲にした。LP細胞は上記のように単離した。PP、MLNおよび脾臓を採取し、ホモジナイズし、細胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水中の2％ウシ胎児血清に再懸濁した後、フルオロクロム標識抗体カクテルと氷上で30分間インキュベートした。抗マウス B220 (RA3-6B2)、CD19 (6D5)、CD21/35 (7E9)、CD23 (B3B4)、GL7 (GL7)、IgD (11-26c.2a)、CD138 (281-2)、CD40 (3/23)、CCR9 (CW-1.2)、α4β7 (DATK32) 抗体は Biolegend から購入した。抗マウスIgG1（A85-1）、CD69（H1.2F3）、CD95（Jo2）、CD16/32（2.4G2）抗体はBD Biosciencesから購入した。抗マウスIgA（mA-6E1）、Ki67（SolA15）抗体、LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain KitはThermo Fisher Scientific社から購入した。Phospho-Stat3 (Tyr 705) (D3A7) はCell Signaling Technology社から購入した。IgA、IgD、Ki67、およびCD138は、BD Fixation/Permeabilization Solution Kit（BD Biosciences）を用いて、製造元の指示に従い、固定および透過処理した細胞の細胞内を染色した。すべてのフローサイトメトリーサンプルは、BD FACS LSRII（BD Biosciences）またはMACSQuant（Miltenyi）フローサイトメーターでスキャンし、FlowJoソフトウェア（バージョン9.3.2、TreeStar）で解析した。
NPコンジュゲーションと抗原特異的B細胞染色。NPコンジュゲーション法は、以前の報告87を参考にした。簡単に説明すると、R-PE（Anaspec AS-82004）、APC（AAT Bioquest 2554）、および PerCP（AAT Bioquest 2559）を蒸留 H2O で 10 mg/ml に希釈し、H2O に対して透析した後、0.05M NaHCO3 バッファーを加えた。NP-Osu（Biosearch Technologies N-1010-100）を20:1のモル比でタンパク質溶液に添加し、室温で12時間混合した。その後、コンジュゲートしたタンパク質を0.05M NaHCO3緩衝液、次いでPBSで透析した。NPコンジュゲートの染色は、他の抗体を用いて10 nMで1-2時間細胞内で行った。
顕微鏡観察。B-Dock8-/-および同腹仔コントロールのMLNとPPをO.C.T.Compound（Tissue-Tek、サクラ）を用いて凍結成型し、-80℃で保存した。組織を6μmの切片に切り出し、既述の方法で処理した88。簡単に説明すると、凍結切片をプレーンPBSで再水和した後、10％ラット血清1％BSA 0.1％Tween-20, PBS溶液でブロッキングした。スライドを以下の抗体で染色した：抗マウスB220（RA3-6B2）、CD11c（N418）、TCRβ（H57-597）、およびIgA（mA-6E1）。画像は染色直後にNikon eclipse Ti顕微鏡で4xまたは10x対物レンズを使用して取得した。画像解析にはAffinity photo software（Serif）を用いた。
混合BMキメラ。レシピエントWT CD45.1+マウスに600radを3時間間隔で2回照射した。2回目の照射の1時間後、WTマウス（CD45.1.2+）またはDock8-/-マウス（CD45.1.2+）由来のBM細胞5×105個とMuMT-/-マウス（Ighm-/-）由来のBM細胞5×105個を混合したものを、照射したナイーブなWTレシピエントマウスにi.v.注射で養子移入した。BMキメラマウスを用いた実験はすべて、BM移植の8-12週後に行った。
免疫ブロッティング。脾臓B細胞をCD23およびCD19発現に基づいてFACS Aria（BD Biosciences）で選別した。100万個の細胞をプロテアーゼ阻害剤（Roche）入りの免疫沈降アッセイバッファーで溶解し、細胞溶解液をSDS-PAGEしてニトロセルロース膜に転写した。0.1%Tween-20を加えたトリス緩衝生理食塩水中の5%脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした後、膜を抗マウスDOCK8抗体（Takara）と4℃で一晩インキュベートした。1:5000ヤギ抗ウサギIgG(H+L)-HRPポリクローナル検出抗体（Invitrogen）をメンブレンとインキュベートした後、chemidoc imager（Biorad）でECL基質を用いて化学発光シグナルを評価した。ハウスキーピングタンパク質β-アクチンは、タンパク質濃度の標準化に使用した。
In vivo CTチャレンジ マウスは、200μLの重炭酸緩衝液に10μgのCTを入れ、毎週2週間免疫した。最後の免疫から10-14日後、マウスは200μL重炭酸緩衝液中20μgのCTで胃内チャレンジする前に12時間絶食させた。チャレンジの12時間後にマウスを犠牲にし、小腸の重量を評価するために小腸を摘出する前後に体重を測定した。盲腸重量は、小腸から盲腸を取り出して測定した。盲腸に溜まった腸液は、穿刺した盲腸から放出し、回収した腸液の体積を測定した。
In vitro IgA+ B細胞培養。BM細胞は、10％自家製Flt3Lを添加した完全RPMI培地で10日間培養し、このプロトコールに従ってDC分化を誘導した89。脾臓またはPPからナイーブB細胞を、0.8μg/mlのビオチン抗CD43抗体（BD 553269）を用いたB細胞分離キット（STEMCELL Technologies #19854 ）を用いて分離した。ナイーブB細胞を、0.5μg/ml CD40L（R＆D 8230-CL-050）、10μg/ml 抗IgM（Jackson ImmunoResearch 115-006-020）、2ng/ml TGFβ（PeproTech 100-21）、および100nM RA（Sigma R2625）の存在下で、BMDCと1:1の比率で4-5日間培養し、IgAスイッチングおよびPC分化を誘導した。
トランスウェルアッセイ。IgA+B細胞をCtrlマウスおよびB-Dock8-/-マウスのMLNからFACSで分離し、それぞれCFSEまたはCTVで標識した。CtrlマウスとB-Dock8-/-マウスの細胞を1:1の割合で混合し、96ウェルトランスウェルプレート（Corning 3385）の上部のウェルにロードした。250nMのCCL25（Biolegend 589302）を完全培地中、下のウェルに添加した。細胞を37℃、CO2インキュベーターで2時間培養し、遊走させた。底部および上部のウェルにおけるIgA+CCR9+ B細胞の数を数え、フローサイトメトリーで評価した。遊走した細胞のパーセンテージは、底部ウェルの数／（底部ウェルの数＋上部ウェルの数）として計算した。
コラーゲンゲル遊走アッセイ。コラーゲンゲルマトリックスは、PuroCol（Advanced BioMatrix 7626）とNutragen（Advanced BioMatrix 7774）を用いて、1X EMEM（Lonza 12-684F）と0.4％炭酸水素ナトリウムで調製し、完全RPMI培地でそれぞれ1.5mg/mlと3mg/mlに希釈した。CCL25（250nM）を含むマトリックスをチャンバーにロードし、37℃で1時間放置して重合させた。In vitroで切り替えたWTおよびDock8-/-のIgA B細胞をそれぞれCFSEまたはCTVで標識し、コラーゲンゲルの上にロードした。細胞は一晩、37℃でCO2とともに培養され、遊走が認められた。チャンバーはLeica 6000顕微鏡で可視化し、細胞の移動距離はImageJを用いて測定した。
TurboIDタンパク質の単離。WTマウスおよびDock8-TurboIDノックインマウスのPP由来のナイーブB細胞を、前述のようにin vitro IgAスイッチング条件下で培養した。5日後、ビオチンを最終濃度50μMになるように培地に添加し、CO2を含む37℃のインキュベーターで3時間培養した。その後、細胞を回収し、生きたIgA+ B細胞をFACSで選別した。選別された細胞は、50mM Tris-Hcl、500mM NaCl、0.2% SDS、1mM DTT、2% Triton X-100、および1X complete protease inhibitor (Roche 11836170001)を含む溶解バッファーに再懸濁され、超音波処理された。細胞溶解液を16,500 gで10分間遠心し、細胞残屑を除去した。上清を磁性ストレプトアビジンビーズ（Invitrogen #65001 ）と4℃で一晩混合した。その後、サンプルをマグネットラックに乗せた。上清を除去し、磁性ビーズを2% SDSで洗浄した。その後、0.1% デオキシコール酸、1% Triton X-100、1 mM EDTA、500 mM NaCl、50 mM HEPESを含むバッファーでビーズを洗浄し、続いて0.5% デオキシコール酸、0.5% NP-40、1 mM EDTA、250 mM LiCl、10 mM Tris-HClを含むバッファーで洗浄した。
TurboID質量分析サンプルの調製。TurboIDアフィニティー精製プロトコールの最終洗浄後、50mM重炭酸アンモニウム、pH8.2の500μLを用いて追加洗浄を行った。マグネットをかけ、上清を除去し、タンパク質結合ビーズサンプルを100μLのタンパク質分解消化バッファー（50mM重炭酸アンモニウム、pH8.2）に再懸濁した。タンパク質分解バッファーへの再懸濁は、結合したビーズを凍結させる場合、ビーズの完全性を低下させ、凍結後に上清を除去できないため、必須であることに注意。再懸濁したサンプルを瞬間凍結し、ドライアイスで一晩かけてThe Jackson Laboratory Mass Spectrometry and Protein Chemistry Serviceに輸送した。ジチオスレイトールを最終濃度10 mMになるように加え、850 rpmに設定したサーモミキサーで42 °C、30分間インキュベートした（ビーズが沈降しないように必要に応じて調整）。サンプルを室温まで冷却し、アルキル化のためにヨードアセトアミドを最終濃度20 mMまで添加した。その後、サンプルを25℃の暗所で、850rpmに設定したサーモミキサーで30分間インキュベートした（ビーズが沈降しないように必要に応じて調整）。アルキル化後、500 ngのシーケンスグレード修飾トリプシン（Promega, #V511A ）を各サンプルに加え、ビーズが沈降しないように850 rpmに設定したサーモミキサー上で、37℃で16時間（一晩）インキュベートした（ビーズが沈降しないように必要に応じて調整）。16時間後、100 ngのシークエンスグレードの修飾トリプシンを加え、850 rpmに設定したサーモミキサー上で、37℃でさらに4時間インキュベートした。その後、各サンプルに1% TFAを加えてタンパク質分解消化をクエンチした（pHが3～4の間であることを確認し、必要に応じて調整する）。クエンチしたサンプルを、製造元のプロトコールに従って、ミリポアC18ジップチップ（#ZTC18S096）を用いて洗浄した。C18ジップチップ製造業者のプロトコールに従い、湿潤液は100%アセトニトリル、平衡化液と洗浄液は0.1% TFA、溶出液は0.1% TFAを含む60%アセトニトリルを使用した。その後、すべてのペプチド溶出液を真空遠心機で20分間、または乾燥するまで乾燥させた。
TurboID液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）分析。乾燥させたペプチドサンプルを25 µLの98% H2O/2%アセトニトリル/0.1%ギ酸で再構成し、チューブの側面についた液体を最低10回ピペッティングし、30秒間ボルテックスし、22℃のサーモミキサー上で700 rpmで10分間インキュベートした。再構成後、サンプルを卓上低速遠心機で30秒間遠心した。上清を質量分析用バイアルに移し、Ultimate 3000オートサンプラーで4℃に保った。その後、サンプルをThermo Eclipse Tribrid Orbitrap質量分析計（FAIMS Proインターフェース付き）とナノフローUltiMate 3000液体クロマトグラフィーシステム（The Jackson LaboratoryのMass Spectrometry and Protein Chemistry Service）を用いて分析した。メソッド時間は流速300nL/minで、バッファーA（100% H2O、0.1%ギ酸含有）とバッファーB（100%アセトニトリル、0.1%ギ酸含有）のグラジエントを150分間行い、98%A/2%Bを含むバッファーで30分間平衡化した（合計180分間）。Eclipse Tribrid Orbitrapのグローバルパラメータ設定には、ペプチドモード、デフォルトのチャージ状態2、予想ピーク幅30秒、および事前ピーク決定が含まれていた。装置メソッドは、同一であるがFAIMS電圧の異なる2つのノードで構成された；これらの電圧は-40 Vと-50 Vで構成された。各ノードのプリカーサースペクトル検出（MS1）の設定は以下の通り： サイクルタイム＝1秒（各ノード）、検出器＝オービトラップ、オービトラップ分解能＝240,000、スキャン範囲＝375-1200 m/z、RFレンズ％＝40、AGCターゲットを正規化（％）＝250、最大注入時間（ms）＝auto、マイクロスキャン＝1、データタイプ＝プロファイル、極性＝ポジティブ、モノアイソトピックプリカーサー選択＝ペプチド、電荷状態＝2-7、60秒間n＝1のダイナミック排除、最小強度閾値5e+03。ペプチドフラグメント分析（MS2）の設定は、四重極分離モード、分離ウィンドウ（m/z） = 0.7、コリジョンエネルギー（%） = 33（固定）、活性化タイプ = HCD、検出器タイプ = イオントラップ、イオントラップ スキャンレート = turbo、最大注入時間 = 35ms、マイクロスキャン = 1、データタイプ = centroid。
TurboID 質量分析データの解析と統計的比較。RAW 質量分析ファイルは、The Jackson Laboratory の Mass Spectrometry and Protein Chemistry Service の Proteome Discoverer（バージョン 2.5.0.400）を使用して検索および比較しました。Proteome Discovererの処理ワークフローにおいて、個々のThermo .RAWファイルをSequest HTを用いてMus musculusデータベース（sp_tr_incl_isoforms TaxID = 10090）（v2021-02-04）と検索した。検索パラメータは、トリプシン消化、前駆体質量の許容範囲10 ppm、フラグメント質量の許容範囲0.6 Da、動的修飾としてシステインのカルバミドメチル（+57.021 Da）およびメチオニンの酸化（+15.995 Da）、動的修飾としてアミノ末端のアセチル化（+42.011 Da）、最大切断ミス数2、最小ペプチド長 = 6、最大ペプチド長 = 144。ワークフローのPercolatorノードでは、ターゲット/デコイ選択は連結され、バリデーションはq値、最大デルタCn=0.05、すべてのマッチについて偽発見率<0.05に基づいて行われた。Minoraの特徴検出パラメータはThermo推奨のデフォルトに設定した。次に、Proteome Discovererのコンセンサスワークフロー機能を用いて、同定されたすべてのペプチドスペクトルについて、TurboIDサンプルとコントロールサンプルの多重比較を行った。プレカーサースペクトルのアバンダンスは強度に基づき、平均でスケーリングされた総ペプチド量に対して正規化され、比の計算には最大100倍の変化が許容された。タンパク質の存在量の計算には合計存在量を使用し、タンパク質の比率はタンパク質の存在量に基づき、低存在量の再サンプリングインピュテーションが利用され、比較において同定されたターゲットに対してバックグラウンドベースのt検定が実行された。FDR<0.05フィルターおよび厳密なparsimony原則が、比較のためのデータセット内のタンパク質マッチに適用された。追加のパスウェイ解析はIPA（QIAGEN）を用いて、GO解析はg:Profiler90を用いて行った。
PLA。WTマウスおよびDock8-TurboIDノックインマウスの脾臓から採取したナイーブB細胞を、上述のようにin vitro IgAスイッチング条件下で培養した。4日後に細胞を回収し、Poly-L-Lysineコートカバースリップ（Corning）に播種し、37℃で30分間接着させた。カバースリップをPBSで洗浄し、細胞をPBS中4%PFAで室温で10分間固定した後、PBSで3回洗浄した。細胞をPBS中0.1% Triton X-100で室温で10分間透過処理した後、PBSで3回洗浄した。PLA は、Duolink® In Situ Red kit（Millipore Sigma）を用い、製造元の指示に従った。以下の抗体を使用した：抗PKM抗体（Abcam - ab150377 - 1:50希釈）および抗HAタグ抗体（Abcam - ab49969 - 1:500希釈）。PLA抗体染色は4℃で一晩行った。画像はNikon A1R共焦点顕微鏡で取得し、データはImarisソフトウェアを用いて解析した。核とPLAスポットは、手作業による検出の偏りを避けるため、Imarisの3Dボリューム画像で自動スポット検出を用いてカウントした。
解糖速度アッセイ。WTおよびDock8-/-マウスの脾臓からナイーブB細胞を単離した。CD40L、F(ab')2抗IgM、TGFβ、BMDCs、RAで5日間刺激した後、シーホースアッセイのために細胞を回収した。活性化B細胞を、Cell-TakでプレコートしたSeahorse XF細胞培養プレートに、1ウェル当たり50万個播種した。細胞は、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのグルコースを添加したRPMI基本培地pH7.4中、非CO2インキュベーターでアッセイ前に45分間休ませた。解糖速度はSeahorse XF Glycolytic Rate Assay kit（Agilent）を用いて評価した。データ取得は、Seahorse XF96 細胞外フラックスアナライザー（Agilent）で行った。
統計解析。IgA-Seqおよびプロテオミクスデータを除くすべての統計解析は、GraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。データは、Mann-Whitney U検定（2つの実験群）またはKruskal-Wallis検定（3つ以上の実験群）、およびポストホック解析のためのDunn検定で解析した。統計的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001と定義した。IgA-Seqデータ解析は上記の通り。
著者貢献
B.Z.、S.C.、X.Y.、A.W.およびS.C.E.がプロジェクトを立案・設計した。B.Z.、S.C.、X.Y.、C.D.M.、J.A.G.、A.A.B.、B.H.、J.G.、L.X.、E.S.、A.S.、L.H.、J.J.、G.U.、E.L.、A.W.が実験を行い、データを解析した。M.Y.はデータの解析と図の作成を行った。J.T.H.、N.W.P.、E.B.N.は助言と必要な道具を提供した。B.Z.、S.C.、B.H.、A.W.、S.C.E.は図表の作成と論文の執筆を行い、著者全員が本原稿の最終版を確認・承認して掲載した。
資金提供
本研究は、Ira & Diana Riklis Family Research Award in Food Allergy、Food Allergy Research & Education（FARE）、Food Allergy Science Initiative, Inc.の助成金、R01 AI136942（S.C.E.へ）、R56 AI155497（S.C.E.へ）、シンガポール科学技術研究庁の国家科学奨学金（B.Z.へ）、および中国奨学金委員会-エール大学世界奨学金（S.C.へ）の支援を受けた。質量分析には、National Institutes of Health S10 award (1 S10 OD026816-01)により入手したThermo Eclipse Tribrid Orbitrapを用いた。著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを表明している。
利益相反声明
利益相反はない。
謝辞
M. FirlaとJ. Goldsteinの技術協力、J. S. Chen、S. Olyha、D. Liu、J. Anthonypillai、T. A. Rice、L. W. Wang、D. Bhattacharya、J. Gommerman、O. Rojas、W. Khoury-Hanoldの有益な議論と本原稿のレビューに感謝したい。また、本研究の質量分析に貢献してくれたThe Jackson LaboratoryのMass Spectrometry and Protein Chemistry Serviceにも感謝したい。Ivaylo Ivanov博士には、SFB-monocolonizedマウスと専門知識を提供していただいた。Rebecca Boumilおよびジャクソン研究所のGenetic Engineering Technologies Serviceには、本書に記載された作業を専門的に支援していただいた。
付録A. 補足資料
以下は本論文の補足資料である：
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補足図1Ctrl (Dock8flox/flox)とB-Dock8-/- (Cd23creDock8flox/flox)の同腹子の選別脾臓濾胞B細胞（CD19+ CD23+）におけるローディングコントロールβ-ACTINの免疫ブロット。
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図サムネイルfx2
補足図2Ctrl (Dock8flox/flox)とB-Dock8-/- (Cd23creDock8flox/flox)同腹子の選別された脾臓濾胞B細胞(CD19+ CD23+)におけるDOCK8の免疫ブロット。
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図サムネイルfx3
補足図3Dock8-TurboID（TurboID）およびコントロールB細胞からのストレプトアビジンビーズ10％からのストレプトアビジンプルダウンおよび放出後の濃縮ビオチン化タンパク質の代表的イムノブロット。
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図サムネイルfx4
補足図4Dock8-TurboID (TurboID)およびコントロールB細胞からのストレプトアビジンビーズ10%からのビオチン化タンパク質の放出とストレプトアビジンプルダウン後の濃縮ビオチン化タンパク質の代表的イムノブロット。
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スコープス (212)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
小池達夫.
et al.
骨髄における長寿命形質細胞コンパートメントへの進行性分化。
J. Exp. Med. 2023; 220: e20221717
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スコープス (9)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ハプフェルマイヤー S.
et al.
無菌マウスの可逆的微生物コロニー形成により、IgA免疫応答の動態が明らかになった。
Science. 2010; 328: 1705-1709
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日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
カラブロ S.
et al.
橋渡しチャネル樹状細胞は輸血赤血球に対する免疫を誘導する。
J. Exp. Med. 2016; 213: 887-896
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パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
カポラソ J.G.
他
高スループットコミュニティシーケンスデータの解析を可能にするQIIME。
Nat. Methods. 2010; 7: 335-336
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論文リスト
PubMed
クロス
グーグル奨学生
コンバン R.J.
ら
活性化パイエルパッチB細胞は上皮下ドームのM細胞から抗原を直接サンプリングする。
Nat. Commun. 2019; 10: 2423
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スコープス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
カラブロ S.
et al.
樹状細胞サブセットの異なる脾臓内移動が適応免疫を調整する。
Cell Rep.
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PubMed
要旨
全文
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グーグル奨学生
Naik S.H.
他。
最先端：Fms様チロシンキナーゼ3リガンド骨髄培養における脾臓CD8+およびCD8-樹状細胞等価体の生成。
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パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
Raudvere U.
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スコープス (2542)
PubMed
Crossref
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
オンライン公開 2024年1月17日
受理 受理：2023年12月1日
改訂版受理 2023年11月16日
受理：2023年11月16日 受理：2023年7月10日
出版段階
インプレス校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.mucimm.2023.12.001

著作権
© 2023 The Authors. Society for Mucosal Immunologyを代表してElsevier Inc.が発行。
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図
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図1Dock8欠損マウスでは、腸内の広範な抗原標的に対するIgAの産生が障害されている。WT（Dock8+/+；閉じた丸）、Dock8ヘテロ接合体（Dock8+/-；半分塗りつぶした丸）、Dock8ノックアウト（Dock8-/-；閉じた四角）同腹子の定常状態における（A）総便IgA、IgG、IgMのELISA定量。(B）Dock8+/+マウス、Dock8+/-マウス、Dock8-/-マウスの全糞便細菌（プレソート）、ソートされたIgA+およびIgA-糞便細菌の加重UniFrac距離の主座標分析（PCoA）および（C）クラドグラム。スケール範囲： 0.02. (D)SFB単独コロニー化マウスの糞便ペレットから分離し、Dock8+/-またはDock8-/-同腹仔の糞便上清とインキュベートした分割フィラメント細菌(SFB)のIgA結合頻度。点線は、SFBフリー施設で飼育したWTマウスの糞便上清とインキュベートしたSFBのIgA結合頻度を示す。Dock8+/+、Dock8+/-およびDock8-/-同腹仔における、ピーナッツおよびCTによる6週目の胃内（i.g.）免疫の1週間後の（E）便中ピーナッツ特異的IgAおよび（F）便中コレラ毒素（CT）特異的IgAのELISAによる定量。点線は1.56任意単位の検出限界を示す。(A, E-F)データは4-10匹のDock8+/+マウス、4-10匹のDock8+/-マウス、および4-20匹のDock8-/-マウスを用いた3回の独立した実験の代表値である。(B-C）データは1群あたり5-10匹のマウスを用いた2回の独立した実験の代表値である。(D) 1群あたり5-8匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのプールデータ。統計学的検定：（A）クラスカル・ワリス分析とダンのポストホック（D-F）マン・ホイットニーのU検定、それぞれ*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、ns = 有意でない、nd = 検出不能。エラーバーはSDを示す；各記号は個々のマウスを表す。
図サムネイルgr2
図2DOCK8非存在下でのT依存性IgAの消失は、毒素からの腸の防御を損なう。(A)腸液蓄積の定量化(B)盲腸に蓄積した腸液の代表的な画像、および(C)小腸重量または(D)盲腸重量の定量化ナイーブDock8+/-マウス(CT 1° imm -)またはCT免疫化(CT 1° imm +)Dock8+/-およびDock8/-同腹仔の経口CTチャレンジ12時間後のマウス。CT免疫マウスは週2回CTをi.g.投与され、10-14日後にチャレンジされた。統計検定：（A、C-D）Kruskal-Wallis分析とDunn's posthoc検定、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = 有意でない。エラーバーはSDを示す。(A-D)1群3-4匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのプールデータ。
図のサムネイルgr3
図3B 細胞内在性のDock8欠損は、T依存性抗原に対する腸管IgA産生を障害する。ピーナッツとCTを経口免疫したマウスにおける便中ピーナッツ特異的IgAのELISA定量：（A）Ctrl（Dock8flox/flox）とT-Dock8-/-（Cd4creDock8flox/flox）の同腹仔（B）1： B細胞欠損muMt（Ighm-/-）と野生型（WT）またはDock8欠損（Dock8-/-）骨髄細胞の1：1混合、または（C）Ctrl（Dock8flox/flox）とB-Dock8-/-（Cd23creDock8flox/flox）同腹子の同居。(D) ピーナッツ/CTを免疫したCtrl (Dock8flox/flox)およびB-Dock8-/- (Cd23creDock8flox/flox)同腹子の便中CT特異的IgAのELISA定量。ピーナッツおよびCT特異的IgAは、ピーナッツおよびCTによる6週目のi.g.免疫の1週間後に測定した。(E）免疫したCtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の便中IgAのELISA定量。(F）CtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の小腸LP（SiLP）におけるELISpotによるIgA分泌細胞（ASC）の代表的な画像と定量。(G）Ctrl（Dock8flox/flox）およびB-Dock8-/-同腹子の6週目のNP19-OVAおよびCTによる経口免疫の1週間後の便中NP15特異的、NP7特異的、およびNP7/NP15 IgAの比率のELISAによる定量。点線はCT IgA、ピーナッツIgA、NP7およびNP15 IgAアッセイの検出限界（標準に対する1.56任意単位）を示す。統計検定：(A-G) Mann-Whitney U 検定、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, **** < 0.000, ns = 有意でない。エラーバーはSDを示す。(A-G)各群3-5匹のマウスを用いた2-3回の独立した実験からのプールデータ。F）の解析では、生存細胞数の少ない固有層調製物は除外した。
図のサムネイルgr4
図4B細胞内在性のDock8欠損は、B細胞の移動、腸のホーミング、MLNとPPの構造を変化させない。CtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の定常状態における（A）PPまたは（B）MLNにおけるTCRβ+（白）、IgD+（緑）、IgA+（赤）、またはCD11c+（青）細胞の局在を示す代表的な免疫蛍光画像。GC＝胚中心、SED＝上皮下ドーム、TCZ＝T細胞ゾーン、点線はBCZ＝B細胞ゾーンを示す。スケールバー、10倍像および4倍像では100μm。(C-D）Ctrl（Dock8flox/flox）およびB-Dock8-/-同腹子の（C）PPおよび（D）MLNにおける生きたIgA+ B細胞中の表面CCR9+およびα4β7+細胞の頻度と代表的フローサイトメトリープロット。(E）CCL25に対するCtrlおよびDock8欠損IgA+ CCR9+ B細胞のトランスウェル遊走アッセイ。 F）CCL25に対する3Dコラーゲンゲル内でのCtrlおよびDock8欠損in vitro分化IgA+ B細胞の遊走距離の定量化。統計学的検定：（C-D）Mann-Whitney U検定または（E-F）Paired t検定；ns＝有意ではない。エラーバーはSDを示す。(A）各群3匹のマウスを用いた3回の独立した実験から得られた代表的な画像。(C-D）1群3-5匹のマウスを用いた2つの独立した実験からの代表的データ。(E-F）2つの独立した実験からの複合データ。
図のサムネイルgr5
図5B 細胞内在性のDock8欠損は、PP、MLN、骨髄（BM）ではなく、固有層における抗原特異的IgA+ PCの減少をもたらす。(A)小腸固有IgA抗体分泌細胞(ASCs)のELISpotによる代表画像。 (B-D)CtrlおよびB-Dock8-/-同腹子の(B)MLNおよび(C)PP (D)BMにおけるピーナッツ固有IgA ASCsの数。(E)CD19-Lin-細胞（NK1.1- CD3- TCRβ- F4/80- IgD-）で事前にゲーティングしたLPにおけるNP特異的IgA+CD138+ PCの頻度。(F-G)CtrlおよびB-Dock8-/-同腹仔の(F)MLNおよび(G)PPにおける、生細胞上で事前にゲーティングしたNP特異的IgA+CD138+ PCの頻度。すべての組織は、(A-D)ピーナッツ+CTまたは(E-G)NP19-OVA+CTによる6週目の経口免疫の8日後に分析した。統計学的検定： Mann-Whitney U検定、*P < 0.05、**P < 0.01、ns = 有意でない。エラーバーはSDを示す。(A-B)1群3-4匹のマウスを用いた3つの独立した実験からのプールデータ。(C-D）1群あたり2-3匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのプールデータ。(E-G）1群あたり3-5匹のマウスを用いた3つの独立した実験からのプールデータ。E）の解析では、生存細胞数の少ない固有層調製物は除外した。点線は、ナイーブマウスにおけるCT特異的またはピーナッツ特異的IgA ASCのベースラインシグナルを示す。
図のサムネイルgr6
図6IgA+B細胞におけるDOCK8インタラクトームと代謝アッセイは、IgA B細胞の呼吸におけるDOCK8の重要な役割を示している。(A）図S5Eと同様に、DOCK8-TurboIDマウスのPPからIgA+ B細胞を作製した。ビオチン化標的のプロテオミクス解析から得られたDOCK8の近傍に濃縮されたタンパク質のヒートマップ。選択されたタンパク質は、遺伝子オントロジーとIPA解析に基づいて機能クラスにグループ分けされた。(B）IgA+B細胞培養のB細胞におけるピルビン酸キナーゼM1/2（PKM）とDOCK8間のタンパク質間相互作用を示す近接ライゲーションアッセイ（PLA）。野生型（WT DOCK8）とDOCK8-TurboID（DOCK8-HA）細胞のPLA実験からの代表的な画像（左）と細胞あたりのPLAスポット数の定量（右）。データは2つの独立した実験から得られたプールデータであり、括弧内の数字は各遺伝子型についてスコア化された個々の核の数を示す。エラーバーはSEMを示す。(C）CtrlマウスとDock8欠損マウスからin vitroで作製したIgA+ B細胞の酸素消費率（OCR）と解糖プロトン流出率（glycoPER）の代表プロット。データは2つの独立した実験の代表値。
図のサムネイル fx1
補足図1Ctrl（Dock8flox/flox）およびB-Dock8-/-（Cd23creDock8flox/flox）同腹仔の選別脾臓濾胞B細胞（CD19+ CD23+）におけるローディングコントロールβ-ACTINの免疫ブロット。
図のサムネイルfx2
補足図2Ctrl（Dock8flox/flox）およびB-Dock8-/-（Cd23creDock8flox/flox）同腹仔の選別脾臓濾胞B細胞（CD19+ CD23+）におけるDOCK8の免疫ブロット。
図のサムネイル fx3
補足図3Dock8-TurboID（TurboID）およびコントロールB細胞からのストレプトアビジンビーズ10％からのビオチン化タンパク質の放出とストレプトアビジンプルダウン後の濃縮ビオチン化タンパク質の代表的イムノブロット。
図のサムネイルfx4
補足図4Dock8-TurboID（TurboID）およびコントロールB細胞からのストレプトアビジンプルダウンおよび10％ストレプトアビジンビーズからのビオチン化タンパク質の遊離後の濃縮ビオチン化タンパク質の代表的な免疫ブロット。
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