細胞死経路の階層構造により、マウスの赤痢に対する耐性が重層的に形成される

2023年1月27日 00:11

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研究アドバンス
免疫・炎症微生物・感染症
細胞死経路の階層構造により、マウスの赤痢に対する耐性が重層的に形成される
Justin L Roncaioli et al.
2023年1月16日
https://doi.org/10.7554/eLife.83639

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概要
赤痢菌は、大腸の上皮細胞に大腸菌が定着することで発症する重篤な消化器疾患である赤痢を引き起こす。脊椎動物は、侵入してきた腸内病原体を感知し、その細胞内ニッチを排除するプログラム細胞死経路を進化させてきた。以前我々は、そのような経路の一つであるNAIP-NLRC4インフラマソームの遺伝的除去は、経口的なShigella flexneriチャレンジに対してマウスを耐性から感受性に変えるのに十分であると報告した（Mitchell et al.、2020）。ここでは、マウス経口赤痢菌感染時の追加の細胞死経路の防御的役割について検討した。我々は、NAIP-NLRC4非存在下では、赤痢菌LPSを感知するCaspase-11インフラマソームが、赤痢菌の腸管上皮へのコロニー形成を抑制することを見出した。しかし、赤痢菌がカスパーゼ11の活性に拮抗するエフェクターであるOspC3を発現していると、この保護作用は制限される。カスパーゼ8依存性のアポトーシスを活性化するサイトカインであるTNFαも、NAIP-NLRC4とカスパーゼ11の両方を欠損したマウスでは、腸管上皮の赤痢菌コロニー化から強力に保護されることが示された。カスパーゼ-1、-11、-8の複合的な遺伝子欠損は、マウスの経口赤痢菌感染に対する感受性を低下させる。この結果は、消化器系に侵入する病原体が病気を引き起こす能力を制限する細胞死経路の階層構造を明らかにするものである。

編集者からの評価
本論文は、実験的赤痢に対するマウスの抵抗性と感受性を媒介する細胞死経路の役割について、重要な新情報を提供している。結果は、マウスの遺伝子欠損における赤痢菌の結果に関する実験的観察に依拠しており、説得力がある。この結果は、免疫学者、細胞生物学者、感染症研究者にとって興味深いものでしょう。

https://doi.org/10.7554/eLife.83639.sa0
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はじめに
赤痢菌は腸内細菌性病原体の属で、年間〜2億7000万件の赤痢症を引き起こし、そのうち〜20万件が死亡に至る（Khalil et al.、2018）。赤痢は、腹部けいれん、発熱、重症例では血性下痢（赤痢）をもたらす急性炎症性大腸炎として現れる（Kotloffら、2018年）。大腸腸管上皮への細菌の侵入と、それに続く隣接する腸管上皮細胞（IEC）間の播種が、炎症と疾患を促進すると考えられています。赤痢菌の病原性は、タイプ3分泌システム（T3SS）と30以上の病原性因子またはエフェクターをコードする病原性プラスミドによって媒介される（Schnupf and Sansonetti, 2019; Schroeder and Hilbi, 2008）。T3SSは、細菌の侵入、サイトゾルへの脱出、および宿主の自然免疫応答の武装解除を促進し、サイトゾルを複製する赤痢菌のホスピタブルニッチとするために、エフェクターを宿主細胞内に注入します（Ashida et al.、2015年）。また、病原性プラスミドは、細胞質アクチンに基づく運動を促進する細菌表面タンパク質であるIcsAをコードし、近隣のIECへの細菌の拡散に不可欠である（Bernardini et al., 1989; Goldberg and Theriot, 1995; Mattock and Blocker, 2017）。

自然免疫系は、プログラム細胞死を誘導することで細胞内細菌病原体に対抗することができます（Williams, 1994）。プログラム細胞死は、細胞内病原体ニッチを排除し、上皮バリアの完全性を維持し、損傷細胞のクリアランスを促進し、適応免疫系の細胞への外来抗原の提示を強化する（Deetsら、2021；Doranら、2020；Jorgensenら、2017；KochおよびNusrat、2012；Yatimら、2017）。プログラムされた細胞死の3つの主要なモードは、哺乳類細胞に共通している：パイロプトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスである。それぞれは、異なるセンサーと保存された下流の実行因子によって制御され、病原体が細胞内複製を成功させるために回避または破壊しなければならない手ごわい障壁となる。赤痢菌や他の消化器系病原体に特に関連することとして、IECの細胞死は、瀕死の細胞や感染細胞を上皮層から迅速かつ選択的に排出し、それによって病原体の組織深部への侵入を強力に制限する独自の細胞排出プロセスを伴う（Fattingerら、2021；Knodlerら、2014；Rauchら、2017；Sellinら、2014）。

赤痢菌は、宿主の細胞死経路と激しく対立する病原体の一例である（Ashida et al.、2021）。赤痢菌は、ヒト細胞の細胞死を防ぐために複数のエフェクターをコードしており、その中には、カスパーゼ4インフラムソーム活性化を阻止するOspC3（Kobayashi et al, 2021）、IpaH7.8がガスダーミンD依存性のピロプトーシスを阻害する（Luchetti et al., 2021）、OspC1がCaspase-8依存性のアポトーシスを抑制する（Ashida et al., 2020）、OspD3がネクロプトーシスを阻害する（Ashida et al.）これらの経路（およびおそらくまだ発見されていない他の経路）が拮抗し、結果として上皮ニッチを維持することが、ヒトを赤痢菌に感染させやすくするのに十分であるように思われる。しかし、マウスは、赤痢菌が上皮のNAIP-NLRC4依存性の細胞死と排出に対抗できないため、経口赤痢菌チャレンジに耐性がある（Changら, 2013; Mitchellら, 2020）。NAIP-NLRC4インフラマソームを除去すると、マウスは赤痢にかかりやすくなり、in vivoでの口腔感染後の赤痢病原体を解明するための扱いやすい遺伝子モデルとなる (Mitchell et al., 2020)。

ここでは、NAIP-NLRC4欠損赤痢モデルマウスを用いて、生体内の赤痢菌に対する防御におけるプログラム細胞死の役割について検討する。我々は、LPSの細胞質センサーであり、ヒトカスパーゼ-4のマウスオルソログであるカスパーゼ-11（CASP11）（Shiら、2014）が、NAIP-NLRC4不在で赤痢菌感染から適度に保護することを見出した。ヒトと同様に、この経路は赤痢菌エフェクターOspC3によって拮抗され、赤痢菌からospC3を遺伝的に除去すると、CASP11依存的にIECへの細菌のコロニー形成と病原性が著しく減少する。また、TNF受容体1（TNFRI）依存性の外因性アポトーシスを誘導するサイトカインであるTNFα（Piguetら、1998）が、マウスIECを細菌の定着から守り、その後の疾患を制限することを見出した。TNFα依存性の防御は、NAIP-NLRC4とCASP11の両方を欠損したマウスで最も強く、in vivoで赤痢菌に対抗する細胞死経路の階層的プログラムが明らかにされた。Casp1/11-/-Ripk3-/-およびCasp8/-Ripk3-/-マウスは、パイロプトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの主要な構成要素をすべてではないが一部欠いているが、疾患からほぼ保護され、これらの経路間の冗長性が明らかにされた。しかし、Casp1/11/8-/Ripk3-/-マウスは赤痢に対して過敏であり、プログラム細胞死が赤痢菌感染に対する優勢な宿主防御機構であることを示している。さらに、Interleukin-1 receptor (IL-1R) を介したシグナル伝達やミエロイド制限NAIP-NLRC4は赤痢菌の病原性に影響を与えないことから、IECの細胞死が主に赤痢菌感染からマウスを守ることができることが示唆された。この結果は、細胞内細菌病原体の防御における細胞死の重要性を強調するとともに、免疫経路の階層化により、病原性因子を幅広く進化させた病原体に対する強固な防御を可能にする一例となる。

研究成果
B6 vs 129 Nlrc4-/-マウスの赤痢に対する抵抗性にCASP11が寄与している。
我々は以前、129S1/SvImJ（129）バックグラウンドでNLRC4欠損マウス（129.Nlrc4-/-）を作成し、これらのマウスがC57BL/6J（B6）NLRC4欠損マウス（B6.Nlrc4-/-）よりもShigella flexneri経口チャレンジに感受性が高いことを観察した（Mitchell et al.、2020年）。我々は、系統間の見かけ上の違いは、遺伝子および/または微生物相の違いに起因する可能性があると推論した。これらの可能性を検討するため、B6.Nlrc4-/-マウスと129.Nlrc4-/-マウスを同居させ、2系統間の疾患の重症度を直接比較した（図1、水色対ピンクのシンボル）。B6.Nlrc4-/-マウスは、2日間を通してわずかな体重減少（開始時の体重の5-10％）を示し、3日目までに回復し始めた（図1A）。しかし、129.Nlrc4-/-マウスは、3日目まで体重減少が続いた（開始時の体重の10-15%）（図1A）。3日目の犠牲時に、各マウスの盲腸および結腸からIEC画分を採取し、この画分をゲンタマイシン中で洗浄して細胞外の赤痢菌を排除し、これらの細胞を溶解してIECの細胞内細菌コロニー形成を計数した。129.Nlrc4-/-マウスのIECは、B6.Nlrc4-/-マウスのIECに比べて10倍以上高い細胞内赤痢菌量を保有していた（図1B）。また、129.Nlrc4-/-マウスの腸管組織には、炎症性サイトカインCXCL1およびIL-1βがELISA法により高値で検出された（図1CおよびD）。CXCL1およびIL-1βは、以前、炎症を開始し、腸への自然免疫細胞の動員を促進することによって赤痢時の疾患を駆動することに関与しているNF-κB誘導サイトカインである（Arondelら、1999；Sansonettiら、1999；Sansonettiら、2000；SingerおよびSansonettiら、2004）。ここで、これらのサイトカインは、疾患のバイオマーカーとして機能する。使用したELISAはプロIL-1βと切断型IL-1βを区別できないので、報告されたIL-1βレベルはカスパーゼ-1活性化の強さではなく、NF-κB反応の強さを反映している（報告されたCXCL1レベルのように）。129.Nlrc4-/-マウスはまた、B6.Nlrc4-/-マウスよりも有意に多くの総盲腸収縮を示し（図1E）、感染後2日および3日において、B6.Nlrc4-/-マウスと比較して129.Nlrc4-/-マウスの下痢（マウス糞の湿重量／乾燥重量比により測定）がわずかではあるが有意に増加した（図1F）。2日目および3日目に、潜血（スコア＝1）または巨視的血液（スコア＝2）の存在についてマウス糞を採点し、その合計が0から4までの血液スコアを表す（図1G）。129.Nlrc4-/-マウスの糞便には、少なくともどちらか一方に潜血が認められ、多くは両日とも潜血または巨視的血液が認められた。一方、B6.Nlrc4-/-マウスは便潜血を認めなかった。

図1、補足資料2

CASP11はB6対129 Nlrc4-/-マウスの赤痢に対する抵抗性に寄与している。
(A-G）B6.Nlrc4-/-マウス（ピンク、n=6）、129.Nlrc4-/-マウス（水色、n=6）、およびCasp11で129/129ホモ接合体（濃紺、n=9）またはCasp11でB6/129ヘテロ接合体（マルーン、・・・続きを見る

129系とB6系のNlrc4-/-マウスを同居させると、疾患の重症度が大きく異なることから、微生物叢の違いではなく、遺伝子の違いが系統間の感受性の差を説明している可能性があることが示唆された。マウスの非カノニカルインフラマソームであるカスパーゼ-11とそのヒトのオルソログであるカスパーゼ-4および-5は、細胞質の赤痢菌LPSを感知してパイロプトーシスを開始する（Hagarら、2013；Kayagakiら、2011； Kobayashiら、2013；Shiら、2014）。注目すべきは、129マウスは、カスパーゼ-11が天然に欠損していることである（Kayagaki et al.、2011）。これらの系統間の感受性の違いにカスパーゼ-11が寄与しているかどうかを調べるために、B6.Nlrc4-/-と129.Nlrc4-/-マウスを交配してB6/129.Nlrc4-/-F1ハイブリッドを作成した（図1-図1A）。このF1 B6/129.Nlrc4-/-ハイブリッドに感染させた。Nlrc4-/-ハイブリッドに感染させたところ、赤痢菌チャレンジに比較的抵抗性を示し、その疾患プロファイルは親マウスであるB6.Nlrc4-/-マウスとより一貫して類似していた（図1-図1B-F）。これらの結果は、C57BL/6Jバックグラウンドの優性遺伝子が赤痢菌からの防御を提供している可能性と一致する。次に、これらの雑種を129.Nlrc4-/-親株に戻し、Casp11でホモ接合体129/129またはヘテロ接合体B6/129のラットメイトNlrc4-/-マウスを作成した（図1-図 1A）。これらのNlrc4-/-戻し交雑マウスを親である129.Nlrc4-/-およびB6.Nlrc4-/-株と3週間以上同居させ、赤痢菌を感染させて、B6 Casp11アレルの機能性が疾患の重症度の低下と相関するかどうかを調べるためにCasp11遺伝子座の遺伝子型判定を行った。

実際、Casp11がB6/129のヘテロ接合体Nlrc4-/-マウス（図1、水色の記号）は、Casp11が129/129のNlrc4-/-マウス（図1、濃い青色の記号）よりも赤痢に対する抵抗性が高かった。B6/129 at Casp11ヘテロ接合体マウスは、親マウスであるB6.Nlrc4-/-マウスと同様の体重減少パターンを示し、3日目には回復し始めたが、129/129 at Casp11ホモ接合体マウスの体重減少は親マウスの129/Nlrc4-/-と同じであった（図 1A）。これらの結果と同様に、129/129 at Casp11ホモ接合体マウスは、腸管上皮の細菌コロニー形成も有意に亢進していた（図1B）。Casp11で129/129のマウスでは、Casp11でB6/129のマウスと比較して、炎症性サイトカインCXCL1（図1C）および盲腸の縮小（図1E）が傾向的に増加し、2日目の下痢（図1F）が有意により顕著になることが確認された。これらの差異にもかかわらず、IL-1βレベル（図1D）または糞便血液スコア（図1G）とCasp11遺伝子型との間に強い相関は見られなかった。これは、Casp11が抵抗性に寄与する一方で、129またはB6バックグラウンドには、赤痢に対する感受性に影響を及ぼす追加の遺伝子修飾因子が存在することを示唆している。これらの遺伝的修飾因子はCasp11と比較して相対的に弱いと考えられるため、遺伝学的マッピングは試みなかった。しかし、Helicobacter hepaticus依存性大腸炎に対する感受性の増加と関連する129マウスの遺伝子座であるHiccsの寄与については特に検証した（Boulardら、2012）。そこで、同じNlrc4-/-戻し交配マウスをHiccs遺伝子座で遺伝子型決定し、図1と同じデータを用いて、129またはB6のHiccs対立遺伝子が疾患の違いに関連しているかどうかを調べた（図1-図1A）。Casp11とは対照的に、Hiccsは赤痢感受性の上昇と有意な相関がないことを見出した（図1-図2）。

B6.Nlrc4-/-マウスの赤痢に対する抵抗性にはCASP11の寄与が小さいこと
マウスCaspase-11の役割を均一な遺伝子背景で定義するために、CRISPR-Cas9編集を用いてB6.Nlrc4-/-バックグラウンドでCasp11-/-マウスを作製した（図2-図1）。我々は以前に、Casp1/11-/-マウスが野生型（WT）S. flexneriの経口感染に耐性であることを発見したが、これはおそらく、NLRC4依存性のCaspase-8の活性化がIECの細菌コロニー化を防ぐのに十分であるためである（図2-図2; Mitchellら、2020; Rauchら、2017)。したがって、マウスが機能的なNLRC4を発現する場合、カスパーゼ-11はWT赤痢菌チャレンジからの保護に不要であるが、カスパーゼ-11はNLRC4がない場合のバックアップ経路として依然として重要である可能性がある。そこで、B6.Nlrc4-/-Casp11+/-およびB6.Nlrc4-/-Casp11-/-同腹子にWT赤痢菌を感染させ、感染後2日間の病原性を評価した。

その結果、B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスでは、B6.Nlrc4-/-Casp11+/-と比較して赤痢菌感染感受性がわずかに上昇した（図2）。B6.Nlrc4-/-Casp11+/-マウスはB6.Nlrc4-/-Casp11+/-と比較して体重減少（図2A）、盲腸の縮小（図2B）、下痢（図2C）は認められなかったが、B6.Nlrc4-/-Casp11+-のIECにおける赤痢の負荷は5倍増加した。 Nlrc4-/-Casp11-/- マウス（図2D）では、Caspase-11がNLRC4非存在下でマウス上皮を細菌のコロニー形成から保護することが示された。B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスの腸組織も、B6.Nlrc4-/-Casp11+/-の組織よりも有意に高いレベルのCXCL1を発現した（図2E）。IL-1βレベルは、B6.Nlrc4-/-Casp11+/-と比較してB6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスで上昇したようであるが、この差は有意ではなかった（図2F）。B6.Nlrc4-/-Casp11+/-は糞便中に血液を認めなかったが、B6.Nlrc4-/-Casp11-/-9匹中2匹は潜血を認めた（図2G）。これらの結果は、カスパーゼ11がWT型赤痢菌に対する防御に比較的ささやかな貢献しかしていないことを示唆している。実際、赤痢菌はカスパーゼ11を阻害するOspC3というエフェクターをコードしていることが知られており（下記参照）、カスパーゼ11の役割は小さいと予想される。しかし、129/B6.Nlrc4-/-とB6.Nlrc4-/-Casp11-/-の混合マウスでの結果を総合すると、NLRC4がない場合のバックアップ経路として、カスパーゼ11が生体内の赤痢菌に対する防御に寄与することがわかった（図2-図2）。

図 2 および 2 つの補足資料

CASP11はB6.Nlrc4-/-マウスの赤痢に対する抵抗性にわずかに寄与している。
(A-G）B6.WTマウス（B6.WTとB6.Nlrc4+/-Casp11+/-マウスの共飼い、黒、n=5）およびB6.Nlrc4+/-Casp11+/-（ティール、n=10）とB6.Nlrc4/-Casp11-/-（ラベンダー、n=9）同腹子に25 mg ... もっと見る

赤痢菌エフェクターOspC3が赤痢菌経口感染における病原性に重要であることを発見
S. flexneriタンパク質OspC3は、ヒトCaspase-4とマウスCaspase-11の両方を阻害してパイロプトーシスを抑制するT3SS分泌エフェクターである（Kobayashi et al, 2013; Li et al, 2021; Mou et al, 2018; Oh et al, 2021）。OspC3は、S. flexneriによるマウス腹腔内感染時の病原性（Li et al., 2021; Oh et al., 2021）およびWTマウスにおけるS. sonneiによる腸管コロニー形成（Alphonse et al., 2022）に必要であると示されているが、このエフェクターの役割は、シゲラが腸上皮内に侵入して複製する口腔感染モデルマウスでは検討されていない。実際、WT型赤痢菌に対する防御においてカスパーゼ11の役割を示す我々の結果（前出、図1および図2）は、OspC3によるカスパーゼ11の阻害が上皮細胞では不完全である可能性を示唆するものであった。そこで、赤痢菌感染におけるOspC3の役割を調べるため、B6.Nlrc4-/-マウス（Caspase-11が十分に共存するB6.Nlrc4-/-Casp11+/-マウスの混合）にWT S. flexneriまたはOspC3欠損の変異株（ΔospC3）を経口投与した(図3）。これまでの実験と同様に、WT赤痢菌でチャレンジしたB6.Nlrc4-/-マウスは、WT赤痢菌に感染したWTマウスと比較して、著しい体重減少、腸上皮の細菌コロニー形成の増加、盲腸の縮小、下痢、炎症性サイトカイン（図3A-G）などで特徴づけられる赤痢を発症した。しかし、ΔspC3 S. flexneriでチャレンジしたB6.Nlrc4-/-マウスは、WT感染B6.Nlrc4-/-マウスと比較して、体重減少（図3B）、IECコロニー化の10倍以上の減少（図3C）、盲腸短縮の減少（図3D）およびCXCL1（図3F）の低下を示し、感染に対する感受性が低下した（図3）。これら2群間の下痢（図3E）およびIL-1β（図3G）の有意差は観察されなかった。興味深いことに、ΔospC3感染B6.Nlrc4-/-マウスは、WT赤痢菌に感染したWTマウスと比較して、体重減少（図3B）、IECの細菌コロニー形成（図3C）、盲腸縮小（図3AおよびD）および炎症サイトカイン（図3FおよびG）の傾向的だが有意ではない増加を生じた。また、ΔospC3 S. flexneriを感染させたB6.Nlrc4-/-マウスは糞便血を認めなかったが、WT Shigellaを感染させたB6.Nlrc4-/-マウス11匹のうち6匹は糞便血を認めた（図3H）。これらの結果は、ΔospC3赤痢菌は、我々のB6.Nlrc4-/-マウス赤痢モデルにおいて、著しく減弱していることを示している。

図3

赤痢菌エフェクターOspC3は、赤痢菌経口感染における病原性に重要である。
(A-H) マウスに25 mg硫酸ストレプトマイシン水溶液を経口投与し、1日後に感染させた。B6.WTマウス（野生型[WT]とB6.Nlrc4+/-Casp11+/-の共飼い）に、経口的に107 ... もっと見る

OspC3は、マウスカスパーゼ11を直接不活性化するが（Liら、2021）、インターフェロンシグナル伝達を含む他のシグナル伝達経路を調節することも報告されている（Alphonseら、2022）。OspC3の病原性に対する効果がマウスCaspase-11の阻害に依存するかどうかを調べるために、B6.Nlrc4-/-マウスの両方（共飼いのB6.Nlrc4-/-の混合物である）を感染させた。 Nlrc4-/-Casp11+/- マウスと B6.Nlrc4-/-Casp11+/- マウスの混血）および B6.Nlrc4-/-Casp11-/- マウス（ B6.Nlrc4-/-Casp11+/- のラットメイト）に WT 株または ΔospC3 赤痢菌を感染させたところ、ospC3 赤痢菌の病原性はマウス Caspase-11 の阻害に依存していた。その結果、B6.Nlrc4-/-マウスにおいて、ospC3変異体はWT赤痢菌に比べて減弱していることが再び確認された（図4）。しかし、WTおよびΔospC3赤痢菌はいずれもB6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスにおいて、体重減少、腸管上皮の細菌コロニー形成、盲腸長、下痢、糞便中血液量が同程度で重症化した（図4A-Dおよび図G）。ΔospC3感染B6.Nlrc4-/-マウスは、ΔospC3感染B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスに対して、体重減少、細菌量、盲腸の縮小、IL-1βが著しく少なかった（図4A、B、C、およびF）。これらの結果は、カスパーゼ-11 が生体内における OspC3 の主要な生理学的標的であることを示す。Caspase-11 は OspC3 非存在下で赤痢菌に対する強力な防御機能を発揮するが、ΔospC3 感染 B6.Nlrc4-/- マウスは、WT 感染 WT コントロールマウスと比較して、中程度の感受性を示す表現型を示すことから、これは NLRC4 の喪失を完全に補償するほどではないようだ（図 3、図 4）。我々は、WT感染B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスと比較して、ΔspC3感染B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスにおけるCXCL1の傾向的だが重要ではない減少およびIL-1βの重要な減少を観察し（図4EおよびF）、OspC3もCaspase-11から独立して免疫経路に影響するかもしれないということが示された。ここでも、WT赤痢菌に感染したB6.Nlrc4-/-マウスとB6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスの間で疾患の特徴にわずかな差異しか観察されず（図4）、いずれも有意ではなかったが、これはOspC3がCaspase-11活性を著しく低下させる能力を持つことと一致した。これらの結果は、OspC3がin vivoでCaspase-11を阻害するという先行報告（Kobayashi et al., 2013; Li et al., 2021; Mou et al., 2018; Oh et al., 2021）を確認し、さらにOspC3によるCaspase-11の阻害がShigella virulenceに必要であることを示すものであった。それにもかかわらず、赤痢菌がOspC3を発現しても、B6.Nlrc4-/-マウスではカスパーゼ-11が依然として小さな程度の防御を提供するので、この阻害は不完全であると考えられる（図2および図4）。

図4

B6.Nlrc4-/- マウスにおける OspC3 駆動型病原性は、カスパーゼ-11 に依存する。
(A-G）マウスに25mgの硫酸ストレプトマイシンを水中で経口投与し、1日後に感染させた。B6.WTマウスに、107コロニー形成単位（CFU）の野生型（WT）Shigell...続きを読むを経口投与した。

骨髄系NLRC4もIL-1も赤痢菌の病原性に影響を与えない
一般に受け入れられている赤痢菌の病原性モデルは、赤痢菌がM細胞を介したトランスサイトーシスを介して大腸上皮を通過することを提案している（Schnupf and Sansonetti, 2019; Schroeder and Hilbi, 2008）。トランスサイトーシスの後、赤痢菌は次にマクロファージによって貪食され、さらに2つのステップが続くと考えられている。(1) 感染したマクロファージのインフラマソーム依存的な溶解により細菌を放出し、上皮の侵入を促進する (Schnupf and Sansonetti, 2019; Suzuki et al., 2007; Zychlinsky et al, 1996）、および（2）炎症を促進するサイトカインであるIL-1βの付随する処理および放出（Arondelら、1999；Sansonettiら、1995；Sansonettiら、2000）である。しかしながら、哺乳類の口腔感染におけるこれらの特定のステップの役割については、これまで遺伝的機能喪失実験によって取り上げられたことはない。

骨髄系細胞におけるNLRC4インフラマソーム活性化の役割を評価するために、Nlrc4-/-Rosa26LSL-Nlrc4Lyz2Creマウス（ここでは単にiNlrc4Lyz2Creマウスと呼ぶ）（Rauch et al, 2017）を利用した。これらのマウスは、Nlrc4の生殖細胞ヌル変異を保有しているが、骨髄系細胞（主にマクロファージ、単球、および好中球）において選択的にNLRC4の発現を回復するLyz2Cre誘導性Nlrc4 cDNA導入遺伝子（Rosa26遺伝子座内に統合）をコードしている。WT B6マウスとB6.iNlrc4+Lyz2Cre+およびB6.Nlrc4-/-（iNlrc4-Lyz2Cre+）同腹子を感染させて、遺伝子型間で疾患の経過を比較検討した（図5）。驚くべきことに、iNlrc4+Lyz2Cre+マウスはB6.Nlrc4-/-マウスを表現型としており、体重減少、腸上皮の細菌コロニー形成、盲腸長、下痢に有意差を認めなかった（図5A-E）。B6.Nlrc4-/-マウスでは、炎症性サイトカインCXCL1およびIL-1βのわずかな増加が見られたが（図5FおよびG）、iNlrc4+Lyz2Cre+マウスと比較して糞便血を呈するマウスは少なかった（図5H）。これらの結果は、NLRC4がIECにおいて選択的に発現されるiNlrc4+VilCreCre+マウスを用いた我々の以前の結果との著しい対照を示す（Mitchellら、2020年）。iNlrc4+Lyz2Cre+マウスとは異なり、iNlrc4+VilCreCre+マウスは経口赤痢菌感染から強く保護され、骨髄細胞のNLRC4ではなく上皮細胞のNLRC4が保護することを示唆する。このことから、マクロファージにおけるNLRC4依存性パイロプトーシスは、我々の口腔感染モデルにおける疾患発症や細菌コロニー形成の主要なドライバーではないことが結論付けられた。

図5

骨髄由来細胞におけるNLRC4は赤痢菌の発病に影響を与えない。
(A-H) B6.WT（黒、n=10）マウスをB6.iNlrc4+Lyz2Cre+（青、n=18）およびB6.Nlrc4-/-（iNlrc4-Lyz2Cre+、赤、n=15）同腹子と共飼い、25mg硫酸ストレプトマイシン水で口腔処理、 ... もっと見る

IL-1αとIL-1βは、骨髄系細胞におけるインフラマソーム活性化の下流で産生され、共通のIL-1受容体を介してシグナル伝達する関連サイトカインである。IL-1サイトカインは、マウス鼻腔内赤痢菌チャレンジ（Sansonettiら、2000）およびウサギ結紮腸管ループ感染（Sansonettiら、1995）の文脈で、炎症を促進することに関与していることが示されている。赤痢におけるIL-1の役割をより明確にするために、B6.Nlrc4-/-マウスとB6.Il1r1-/-マウスを交配し、赤痢菌感染に感受性があるがIL-1に反応しないB6.Nlrc4-/-Il1r1-/-二重欠損マウスを作製した。Nlrc4+Il1r1+ マウス（B6.WTとNlrc4+/-Il1r1+/-マウスの共飼育）、Nlrc4+/-Il1r1+/-、Nlrc4+/-Il1r1+/-、Nlrc4-/-同腹子に感染させて再び病勢を評価した（図6）。驚くべきことに、Nlrc4-/-IL1r1-/-マウスは、Nlrc4-/-IL1r1+/-マウスとほぼ同じ表現形式であった。Nlrc4-/-IL1r1-/-は、Nlrc4-/-IL1r1+/-マウスよりも体重減少に弱いようであったが、この差は統計的に有意なものではなかった。さらに、Nlrc4-/-IL1r1-/-とNlrc4-/-IL1r1+/-マウスの間で、腸管上皮のコロニー形成、正規化盲腸長、炎症性サイトカインに違いは見られなかった（図6A-E）。多くの細菌感染症において、IL-1シグナルは、感染部位への好中球の動員を開始する。しかし、感染後1日目のNlrc4-/-IL1r1-/-マウスとNlrc4-/-IL1r1+/-マウスの糞便中の好中球マーカーMPOの量に有意差はなかった。は、感染後2日目にNlrc4-/-Il1r1-/-マウスの糞便MPOがNlrc4-/-Il1r1+/-マウスに対してわずかではあるが有意に減少したことから、IL-1は赤痢感染時の好中球性炎症の持続に必須である可能性が示された（図6F）。また、Nlrc4+/-IL1r1-/-マウスは、Nlrc4+/-IL1r1+/-マウスの表現型を大きく変え、感染に対して抵抗性を示すことがわかった。これらの結果から、感受性マウスで一貫して見られたIL-1βの増加にもかかわらず、IL-1シグナルは好中球の採用に影響を与えるかもしれないが、経口赤痢菌感染時の病因または防御の主要なドライバーではないことが示された。したがって、NLRC4依存性の赤痢に対する抵抗性は、IECにおけるパイロプトーシスと排出の開始によるものであり、骨髄細胞のパイロプトーシスやIL-1シグナルによるものではないようである。IL-18はIL-1βとは異なり、IECで高発現していることから、別のインフラマソーム依存性サイトカインの役割の可能性も残されている。

図6

IL-1シグナルは赤痢菌の病原性に影響を与えない。
(A-F）Nlrc4+-IL1r1+マウス（B6.WTとNlrc4+/-IL1r1+/-の同居、黒、n=7）、Nlrc4+/-IL1r1-/-（青、n=7）、Nlrc4-/-IL1r1+/-（ティール、n=7）、Nlrc4+/-IL1r1/-（マルーン、n=7）同腹子に... もっと見る

TNFαは赤痢菌に対する抵抗性に寄与する
NLRC4とCASP11がマウス上皮を赤痢菌のコロニー形成から守っていることから、このニッチでは赤痢菌の侵入と拡散に対抗するために、さらなる細胞死のメカニズムが機能しているかもしれないと考えた。腸におけるもう一つの細胞死イニシエーターはTNFαであり、サルモネラ菌によるIECの死と遊離を促進することが示されている（Fattingerら、2021年）。TNFαは、特にNF-κBシグナル伝達が変化または遮断された場合に、TNFRIの関与を通じてCaspase-8依存性アポトーシスを開始する（Leppkesら、2014；Liuら、2004；Piguetら、1998；Ruderら、2019）。赤痢菌は、NF-κBシグナル伝達を阻害することが報告されているいくつかのエフェクターをコードしており（Ashida et al., 2010; Ashida et al., 2013; de Jong et al., 2016; Kim et al., 2005; Newton et al., 2010; Sanada et al., 2012; Wang et al., 2013）、したがって、TNFαは感染IECの死を誘発することにより赤痢菌を制限するかもしれないという仮説が考えられた。

赤痢菌感染時のTNFαのin vivoでの役割を評価するために、まず、TNFαを中和する抗体、またはアイソタイプコントロール抗体を投与したB6.Nlrc4-/-マウスに感染させた（図7）。TNFα中和抗体を投与したB6.Nlrc4-/-マウスは、コントロール抗体を投与したB6.Nlrc4-/-マウスよりもわずかに赤痢に対する感受性が高く、体重減少、IECにおける細菌量、IL-1βレベル、および糞便中の血液量はトレンドはあるが重要ではない増加を示し（図7A、B、D、E）、CXCL1が有意に増加した（図7C）。B6.Nlrc4-/-マウスは、機能的なカスパーゼ-11インフラマソームを発現し、我々が観察したNLRC4とカスパーゼ-11の間の重複を考えると（図1〜4、Mitchellら、2020）、赤痢感染中のTNFαの保護的役割は、これらの細胞死経路が両方ともない場合に最も明らかになるのかもしれないという仮定を立てた。これを検証するために、B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスで実験を繰り返したところ、実際に、この遺伝子背景でのTNFαの中和は赤痢菌感染に対する感受性を有意に増加させることが判明した。TNFαに対する抗体を投与したマウスでは、体重減少が約5％増加し、腸管上皮の細菌コロニー形成が10倍増加し、大腸収縮、下痢、炎症性サイトカインが有意に増加した（図7F-HおよびJ-N）。また、TNFα中和抗体で処理したマウスでは、潜血や巨赤芽球の増加が傾向的に見られたが、有意ではなかった。B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスではTNFαレベルが有意に上昇し、このサイトカインの発現が感受性マウスで誘導されることが示された（図7N）。抗TNFα抗体は、ELISAによって検出されるその能力を妨げることなく、このサイトカインによるシグナル伝達を中和するので、ELISAによって測定されるTNFαのレベルを減少させなかった。

図7 1の補足

NLRC4とCASP11を欠損したマウスでは、TNFαが赤痢菌に対する抵抗性に寄与している。
野生型（WT）（B6.WT、黒、（A-E）はn=13、および両共飼いのB6.WTおよびB6.Nlrc4+/-Casp11+/-、黒、（F-O）はn=9）、B6.Nlrc4-/-、およびB6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスに25 mgを経口投与して ... 詳しく見る

重要なことは、カスパーゼ-11が天然に欠損している129.Nlrc4-/-マウスで行った同様の実験でも、TNFαの強い保護的役割を観察できたことであり（図7-図1）、TNFα依存性の保護がNLRC4とカスパーゼ-11の両方と冗長であることが確認されたことであった。これらの結果は、階層的な細胞死経路が腸管上皮を赤痢菌感染から守っていることを示唆している。NLRC4 はマウスを赤痢から守るのに必要かつ十分な経路であると思われるが、NLRC4 がない場合、Caspase-11（赤痢菌エフェクター OspC3 が存在しても）および TNFα の両方が適度な二次防御を提供できる（図 1、2、7A-E）。これらの二重のカスパーゼ-11 と TNFα のバックアップ経路は、赤痢菌感染時に重複して代償機能を発揮するようです。なぜなら、NLRC4 欠損マウスでは、両方の経路を除去するだけで赤痢菌感染に対する感受性が著しく上昇するためです。しかし、赤痢菌が OspC3 を欠損した場合、カスパーゼ 11 は NLRC4 の欠損をかなり補うことができるが完全ではないため（図 3 および図 4）、TNFαは NLRC4 の欠損を補うことができないようだ（図 7A-E）、防御階層においてはカスパーゼ 11 が TNFαよりも上位にあるようである。

複数の細胞死経路の喪失は、マウスを赤痢菌に過敏に反応させる
赤痢菌感染時のカスパーゼ8の役割を調べるため、カスパーゼ-1および-11（B6.Casp1/11-/Casp8+/-Ripk3-/）、カスパーゼ-8（B6.Casp1/11+/-Casp8/-Ripk3-/）、カスパーゼ-1、-11、-8 （B6.Casp1/11/8-/-Ripk3-/-）いずれかの欠損マウスを作成し、感染時のカスパーゼ-8の挙動について検討した。カスパーゼ-8の欠損はRipk3欠損胚の致死をもたらすので、3つの遺伝子型はすべてRipk3を欠損している。Casp1/11-/-Casp8+/-Ripk3-/-マウスは、NLRC4とTNFαの両方の下流でCaspase-8の機能を保持しており（図2-図2）、Casp1/11-/-マウスに関する我々の以前の実験に基づいて（Mitchellら、2020）、これらのマウスが感染に対して抵抗性を有すると予想された。同様に、Casp1/11+/Casp8-/-Ripk3-/-マウスは、カスパーゼ-1をNLRC4に勧誘する能力およびカスパーゼ-11を介して細胞死を開始する能力を保持しており（図2-図2）、したがってまた感染に対して抵抗性であると考えられる。一方、Casp1/11/8-/Ripk3-/-マウスは、NLRC4（Caspase-1またはCaspase-8経由）、Caspase-11、TNFαによる細胞死経路を欠き（図2-図2）、上記の結果よりこれらのマウスは非常に感染しやすい可能性が示唆された。

そこで、WTマウスとCasp1/11-/Casp8+/-Ripk3-/-、Casp1/11+/-Casp8/-Ripk3-/-、Casp1/11/8-/-Ripk3-/-を同居させ、4つの遺伝子型の疾患表現型を評価した（図8）。その結果、Casp1/11+/-Casp8-/-Ripk3-/-マウスはWT B6マウスとほぼ同じ表現型を示し、体重減少、下痢、セカールまたはコロニーの収縮が少なく、糞便中の血液もなく、感染に対して抵抗性があった（図8A、B、D、E、F、I）。さらに、Casp1/11+/-Casp8-/-Ripk3-/-マウスでは、腸管上皮の細菌量（図8C）および炎症性サイトカイン（図8GおよびH）の有意な増加は検出されなかった。これらの結果は、機能的なNLRC4-CASP1およびCASP11インフラマソームの存在下では、Caspase-8およびRIPK3が赤痢菌に対する抵抗性に必要でないことを示唆している。興味深いことに、Casp1/11-/Casp8+/-Ripk3-/-マウスは、病気に対して完全には抵抗性ではなく、緩やかではあるが有意な体重減少（WTに対して〜5％）および盲腸および大腸の収縮の有意な増加が見られた（図8B、EおよびF）。これらのマウスはまた、下痢、炎症性サイトカインCXCL1およびIL-1β、および糞便血液の傾向的ではあるが有意でない増加を示した（図8D、G、H、I）。この結果は、カスパーゼ-8が、マウスを赤痢菌感染に対して完全に抵抗性にするのに十分ではないことを示しており、おそらく、ヒト細胞株においてカスパーゼ-8活性を抑制する赤痢菌エフェクターOspC1によって拮抗されるためである（Ashida et al.、2020年）。

図8

複数の細胞死経路の消失により、マウスは赤痢菌に過敏に反応するようになる。
(A-I) B6.WTマウス（黒、n=8）とB6.Casp8-/-Ripk3-/-（B6.Casp1/11+/Casp8-/-Ripk3-/-、マルーン、n=10）、B6.Casp1/11-/Ripk3-/-（B6.Casp1/11+/-Ripk3、ティール、n=11）およびB6.Casp1/1-... もっと見る

最も顕著な観察は、Casp1/11-/-Ripk3-/-マウスが赤痢菌感染に非常に感受性が高く、重度の体重減少（開始時の体重の約15％）、下痢、盲腸および大腸の縮小を示したことである（図8A、B、D-F）。これらのマウスはまた、腸管上皮の細菌コロニー化の大規模な（500倍以上）増加（図8C）および炎症性サイトカインのレベルの上昇（図8GおよびH）を示した。すべてのCasp1/11-/Ripk3-/-マウスは糞便中に血液を呈し（図8I）、10匹中1匹も感染後2日以内に赤痢で死亡した。Casp1/11/8-/-Ripk3-/-マウスの陰門と大腸は非常に炎症がひどく、組織は肥厚して白くなり、上皮の一部が内腔に脱落したように見えたが、そこには糞便が全くなく、代わりに好中球性の膿で満たされていた（図8A）。B6.Nlrc4-/-マウスの最も顕著な炎症は通常盲腸で見られるが（Mitchell et al., 2020）、我々はCasp1/11-/Ripk3-/-マウスの結腸も同様に高い炎症を起こしていることに注目し（図8AおよびF）、Caspase-8の保護的役割がこの器官に最も重要かもしれないということを示唆した。Casp1/11-/-Casp8+/-Ripk3-/- と Casp1/11/8-/-Ripk3-/- の間の感受性の著しい差は、OspC1 による Caspase-8 の阻害があったとしても、それは控えめであることを示唆するものであった。実際、このエフェクターの活性は、ヒトの細胞に特異的である可能性がある。

以上の結果から、冗長な細胞死経路が赤痢菌経口感染時のマウスを疾患から守っていることが示唆された。この反応に不可欠な3つのカスパーゼを遺伝的に除去すると、重篤な赤痢が引き起こされる。しかし、この反応に不可欠な1つまたは2つのカスパーゼを除去しても、他の経路から大きな補償が得られるため、重篤な疾患には至らない。我々は、細胞死経路の階層的重要性、すなわち、NLRC4>CASP11>TNFα-CASP8を観察した（図2-図2）。この階層性は、ある経路が上皮内に侵入した赤痢菌を感知し、細胞死反応を開始する順番によって確立されているのではないかと推測される。

考察
我々は以前、マウスの赤痢に対する抵抗性を付与するのに十分なNAIP-NLRC4インフラマソームのIEC発現を示した（Mitchell et al.、2020）。赤痢菌によるNAIP-NLRC4の活性化は、パイロプトーシスと感染IECの排出を促進する。IECからNAIP-NLRC4を遺伝的に除去すると、赤痢菌が腸管上皮に定着し、腸の炎症と疾病を促進する事象が発生する。しかし、マウスIECはプログラム細胞死のイニシエーターをさらに配備しており（Patankar and Becker, 2020）、これらの細胞死経路も赤痢菌に対抗しうるかどうかは未解決のままであった。

我々は、CASP11の機能を欠く129.Nlrc4-/-マウスの自然変異を利用し（Kayagaki et al, 2011）、CASP11が129.Nlrc4-/-とB6.Nlrc4-/-マウス間の感受性差を一部制御することを示した（図1、図1-図1）。Casp11遺伝子座が129/129またはB6/129のF1 129/B6.Nlrc4-/-×129.Nlrc4-/- 逆交雑マウスでは、病気の重症度と腸管上皮のコロニー化の増加は、Casp11129遺伝子座ホモ接合ヌルに関連していた。また、H. hepaticus誘発性大腸炎に対する感受性の上昇をもたらす129マウスに存在する遺伝子座、Hiccsの役割についても検討した（Boulard et al.、2012）。129 Hiccs遺伝子座は、ヒト細胞において赤痢菌由来のADP-ヘプトースを感知することが示されているNF-κBの活性化因子であるαキナーゼ1（ALPK1）をコードするAlpk1遺伝子の多型を含む（Zhou et al.、2018年）。しかし、129マウスとB6マウスのHiccsの自然変異が、2つの系統間の感受性の違いに寄与しているという証拠は見出せなかった（図1-図解2）。

我々は、ΔospC3赤痢菌がB6.Nlrc4-/-マウスでは著しく減弱するが、B6.Nlrc4-/-Casp11-/-では減弱しないことを観察し、「遺伝子の2乗」解析（Persson and Vance, 2007）によって、赤痢菌エフェクターOspC3がマウス口腔感染時のCASP11を阻害することを示している（図3と4）。ΔospC3感染B6.Nlrc4-/-マウスにおける腸管上皮のコロニー形成が、ΔospC3感染B6.Nlrc4-/-Casp11-/-マウスと比較して著しく減少したことから、CASP11依存性の防御は上皮内在性であることが示唆される。赤痢菌はまた、ヒト（マウスではない）GSDMDを分解してパイロプトーシスを阻止するエフェクターIpaH7.8を展開し、防御におけるこの軸の重要性をさらに強調している（Luchettiら、2021年）。CASP11依存性の防御は、ΔospC3感染B6.Nlrc4-/-マウスを疾患症状に対して完全に耐性にするのに十分ではなく、おそらくCASP11発現を誘導するのに必要なプライミングがその防御応答を遅らせる可能性があるからである（Oh et al.、2021）ことに留意されたい。

腸における重要な細胞死イニシエーターとしての役割（Patankar and Becker, 2020; Piguet et al., 1998; Ruder et al., 2019）にもかかわらず、TNFαが腸上皮に定着する病原体に対する防御において主要な役割を果たすことはまだ示されていない。実際、その役割は通常、宿主に有害であると報告されている。例えば、TNFαはクローン病の間の病理学の主要なドライバーである（van Dullemenら、1995）。サルモネラ菌感染との関連では、TNFαは、感染後72時間におけるIECの広範な病的死および遊離を駆動するようである（Fattingerら、2021）。ここでは、TNFαが赤痢菌経口感染時に保護的であることを示し、なぜこのサイトカインが腸内で産生されるのかの根拠を示す。B6.Nlrc4-/-Casp11-/-および129.Nlrc4-/-マウスの両方で、TNFα中和により、感染の重症度が著しく上昇し、腸上皮の細菌コロニー化が10倍増加した（図7、図7-図1）。

TNFα依存的な防御は、TNFRIを発現する感染IECやバイスタンダーIECからのNF-κB依存的な炎症反応、あるいはTNFRI-CASP8による感染細胞のアポトーシスによって起こるのかもしれない。NLRC4の非存在下でのCaspase-11とTNFαの両方の冗長で重複する機能を考慮すると、TNFαは、NF-κBシグナルが遮断された感染細胞のIECアポトーシスを開始することによって上皮防御を促進するという仮説を支持している（芦田ら、2010；芦田ら、2013；de Jongら、2016；キムら、2005；ニュートンら、2010；真田ら、2012；Wangら、2013）。NF-κB依存性サイトカインIL-1βおよびCXCL1は、TNFα中和後に増加し、保護がTNFα依存性のNF-κBの活性化によって駆動されていない可能性をほのめかしている。しかし、この解釈は、細菌量も増加し、別のメカニズムでNF-κB依存性サイトカインの増加を引き起こすかもしれないという事実によって複雑になっている。次の重要なステップは、TNFα依存的な防御と、マウス腸管またはIECオルガノイド培養における感染IECの排出を関連づけることである。これらの実験においてCaspase-8を共染色することは、TNFαが外因性アポトーシスを介して赤痢菌の排除を促進するという我々の仮説をさらに支持することになろう。マウスNF-κBシグナルを遮断し、in vivoで感染細胞のアポトーシスを促進する赤痢菌エフェクター（Ashida et al., 2010; Ashida et al., 2013; de Jong et al., 2016; Kim et al., 2005; Newton et al., 2010; Sanada et al., 2012; Wang et al., 2013）の特定は、継続的に調査されているテーマである。実際、ヒト上皮細胞において赤痢菌がCASP8依存性のアポトーシスを抑制するという既存の報告は、この細胞死経路が防御に関与することをさらに示唆している（Ashidaら、2020；Fahertyら、2010）。

我々は、パイロプトーシス、外因性アポトーシス、ネクロプトーシスの実行経路を持たないCasp1/11/8-/Ripk3-/-マウスは、B6 WTマウスに比べて腸管上皮のコロニー形成が500倍増加し、重度の赤痢を起こすことを見出した（図8）。両マウスを直接比較したわけではないが、Casp1/11/8-/Ripk3-/-マウス（図8）はNlrc4-/Casp11-/-マウス（図2、4、7）よりも重症化し、上皮のコロニー形成も進行した。Casp1/11/8-/-Ripk3-/-マウスは、TNFRI-CASP8依存性のアポトーシスがなく、またおそらくRIPK3依存性のネクロプトーシスがないため、さらに発症しやすいと推察された。ヒトの細胞では、アポトーシスとネクロプトーシスの両方が赤痢菌エフェクターOspC1とOspD3によってそれぞれ阻害されるようであるが（Ashidaら、2020）、Caspase-1、Caspase-11およびRIPK3がない場合のCaspase-8の重要な保護的役割は、この細胞死開始因子がマウスではOspC1によって強く阻害されないということを示している。堅牢なCASP8依存性活性は、本質的にネクロプトーシスを防ぐかもしれない（Jorgensenら、2017；Wenら、2017）ため、マウスRIPK1およびRIPK3を標的とする能力にかかわらず、マウス赤痢感染の文脈でOspD3を重要でないものにすることが可能である。しかし、Casp1/11-/Casp8+/-Ripk3-/-は感染にやや感受性であるのに対し、Casp1/11+/-Casp8-/-Ripk3-/-マウスは完全に抵抗性であることが観察された。この差は、上記のように、OspC1による控えめで不完全なCASP8遮断の結果であるか、またはNLRC4-CASP8依存性細胞死がNLRC4-CASP1依存性細胞死と比較して遅延するからかもしれない（Leeら、2018；Rauchら、2017）。さらに、CASP8は多面的な酵素であり、TNFαまたはNLRC4依存性細胞死とは独立した機構を介して赤痢菌に対する防御に寄与する可能性があることに留意する（Gitlinら、2020; Philipら、2016; Schwarzerら、2020; Stolzerら、2022; Wengら、2014; Woznickiら、2021)。

マクロファージのパイロプトーシスとIL-1シグナルが赤痢菌の病原性を駆動するという通説（Schnupf and Sansonetti, 2019; Schroeder and Hilbi, 2008）にもかかわらず、赤痢菌感染中にどちらにも大きな保護または病原性の役割は見いだせない（図5および図6）。これらのデータは、上皮特異的な細胞死と排出が、マウスを赤痢菌から保護する重要なメカニズムである可能性を示唆している。IL-18欠損マウスで感染させることで、防御におけるインフラマソーム依存性サイトカインの役割がさらに明らかになると考えられる。CASP11とTNFαの防御効果が上皮内在性であるかどうかを遺伝学的に確認するためには、骨髄キメラマウスや組織特異的ノックアウトマウスでの追加研究が必要である。我々は、腸管上皮における細胞死がCASP11とTNFαの両方の下流の保護機構であると推論しているが、これらの細胞死のモードの違いをin vivoで直接観察し定量化するためには、さらなる実験が必要である。

以上のことから、我々の実験は、マウスの経口赤痢菌感染に対する防御に不可欠な、層状の細胞死経路の階層（NLRC4>CASP11>TNFα-CASP8）の存在を示唆するものであった。本研究は、細胞内病原体に対抗する戦略として免疫の冗長性の重要性と、赤痢菌がこれらの経路を克服してヒトに病気をもたらすために必要な重要な進化的ステップの両方を強調している。私たちの実験では、IECの細菌量と病原性の間に相関関係が認められ、赤痢菌が腸管上皮にどの程度コロニー形成できるかが感染時の重症度を決定していることが示された。しかし、生体内で炎症を起こし、病原性を高めるIEC内のセンサーはまだ明らかにされておらず、急性赤痢菌感染時の病的炎症を抑制する理想的な薬理学的標的を提示する可能性がある。

材料と方法
主要リソース表
試薬の種類（種）またはリソース指定元または参照先識別子追加情報
株、系統背景（Mus musculus, C57BL/6J） WT Jax and Vance Lab コロニー、Jax stock No.000664
系統、系統背景 (Mus musculus, C57BL/6J) Nlrc4-/- Vance Lab colony Tenthorey et al., 2020 129.に交配した。Nlrc4-/- マウス（マッピング研究用
系統、系統背景 (Mus musculus, C57BL/6J) Casp11-/- Vance Lab colony, 本論文。
系統、系統背景 (Musculus, C57BL/6J) Il1r1-/- Jax and Vance Lab colony, Jax stock No. 003245
系統、系統背景（Musculus, C57BL/6J） Casp1/11/8-/-
Ripk3-/- Vance Lab コロニー Rauch et al., 2017
系統、系統背景（Mus musculus, C57BL/6J and C57BL/6N mixed） Rosa26LSL-Nlrc4 (formerly called iNlrc4) Vance Lab colony Rauch et al., 2017 Rosa26遺伝子座にCre誘導性Nlrc4遺伝子をエンコードしたものである。
系統、系統背景（Mus musculus, C57BL/6J） Lyz2Cre Jax, Vance Lab Colony, Jax stock No.004781
系統、系統背景（Mus musculus, 129S1/SvImJ） WT JaxおよびVance Labコロニー、JaxストックNo.002448
Strain, strain background (Mus musculus, 129S1/SvImJ) Nlrc4-/- Vance Lab colony Mitchell et al., 2020 B6と掛け合わせた。Nlrc4-/- マウス（マッピング研究用
系統、系統背景 (Shigella flexneri serovar 2a) WT 2457T Lesser Lab ストレプトマイシン耐性
株、株背景 (Shigella flexneri serovar 2a) ΔospC3 2457T Lesser Lab Mou et al., 2018 Streptomycin resistant
抗体 Rat anti-mIL-1β capture and goat anti-mIL-1β polyclonal detection antibodies R&D DY401 ELISA用（各100 µL/wellで使用）。
抗体ラット抗 mCXCL1 捕捉抗体およびラット抗 mCXCL1 検出抗体 R&D DY453 ELISA 用（各 100 μL/well で使用）。
抗体ヤギ抗 mMPO 捕捉抗体およびヤギ抗 mMPO 検出抗体 R&D DY3667 ELISA用 (各々100μL/well使用)
抗体モノクローナル抗 TNFα捕捉抗体および検出抗体 Thermo Fisher BMS607HS ELISA 用。捕捉抗体は購入したプレートにプレコート、検出抗体は 1 ウエルあたり 50μL で使用。
抗体ハムスター抗 TNFαモノクローナル中和抗体 Bio X cell TN3-19.12 In vivo 処理、200μg/日
抗体ポリクローナルアルメニアハムスター IgG アイソタイプコントロール Bio X cell BE0091 In vivo 処理、200μg/日
抗体ラット抗 mCasp11 モノクローナル抗体 Novus 17D9 1:500
動物実験手順
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すべてのマウスは、感染の1-8週間前まで特定の病原体を含まないコロニーで飼育し、12時間の明暗サイクル（午前7時から午後7時）で維持し、標準的なチャウ食（ハーラン照射実験動物食）を自由食で与えた。感染実験に用いた動物は、同腹の者であるか、それが不可能な場合は、通常、離乳時に同居させた。離乳時に同居させなかった場合は、感染前に少なくとも3週間同居させた。同居は、全実験群間でケージの重なりが最大になるように戦略的に行われた。異なる実験処理（異なる赤痢菌遺伝子型または抗体処理間での疾患の比較）は、表現型が異なるリターマイクロバイオームの違いの結果でないことを確実にするために、可能であれば、同じリターのマウス遺伝子型内で層別化した。マウスは、感染の少なくとも1週間前にSPFコロニーからABSL2施設に移された。すべてのマウス感染は、カリフォルニア大学バークレー校動物愛護使用委員会の規制基準に準拠し、同委員会の承認を受けた。B6.Nlrc4-/-（C57BL/6Jバックグラウンド）および129.Nlrc4-/-（129S1/SvImJバックグラウンド）マウスは、以前に記載したように生成した（Mitchellら、2020; Tenthoreyら、2020）。F1 129/B6.Nlrc4-/-は、親129.Nlrc4-/-とB6.Nlrc4-/-マウスの交配により作製した。F1 129/B6.Nlrc4-/- マウスを親129.Nlrc4-/-マウスと交配し、各遺伝子座でB6/129または129/129となる戻し交雑マウスを作製した。129およびB6 Casp11対立遺伝子は、プライマーB6.129_Casp11_F 5' GTTATCTATCAGTAGGAAGTGG 3' および B6.129_Casp11_R 5' AAACTAATACTTCTTATGAGC 3' を用いたPCRと配列決定により区別した。129マウスはエクソン7のスプライシングアクター接合部を網羅する5 bp欠失が区別できる（Kayagakiら、2011年）。Hiccs遺伝子座は、B6と129の対立遺伝子間の多型を区別するために、プライマーD3Mit348_F 5' CATCATGCATACTTTTCCTCA 3', D3Mit348_R 5' GCCAAATCATTCACAGCAGA 3', D3Mit319_F 5' TCTCCCTCACTTTCCTTCC 3' and D3Mit319_R 5' AACAGCCAGTCCAGCAAATC 3' を用いてPCRにより遺伝子型決定が行われた。B6.Nlrc4-/-Casp11-/-動物は、既存のB6.Nlrc4-/-マウスのCRISPR-Cas9変異導入によりCasp11をターゲティングして作製した。CRISPR/Cas9ターゲティングは、受精接合体へのCas9タンパク質およびsgRNAのエレクトロポレーションによって、本質的に以前に記載されたように行った（Chenら、2016）。創始者マウスは、プライマーを用いたPCRおよび配列決定によって遺伝子型を決定した。Casp4_F 5' GTCTTTAGCCCTTGAGAAGGAC 3'およびCasp4_R 5' CACCCCTTCACTTGAGTTTCTCC 3'を用いて、PCRおよび配列決定により遺伝子型を決定した。変異を持つ創始者をB6.Nlrc4-/-マウスと1世代交配し、修正ハプロタイプを分離した。ホモ接合体系統は、一致したハプロタイプを持つヘテロ接合体を交配することにより作製した。Rosa26遺伝子座に統合されたloxP-STOP-loxP-Nlrc4トランスジーンを保有するマウス（Rosa26LSL-Nlrc4マウス）（Rauchら、2017）は、以前に記載されたものである。Rosa26LSL-Nlrc4マウスをB6.Nlrc4-/-系統に交配し、さらにB6.Nlrc4-/-バックグラウンドでLyz2Cre（Jax系統004781）トランスジェニック系統に交配して、ここでiNlrc4+Lyz2Cre+マウスと呼ぶNlrc4-/-Rosa26LSL-Nlrc4/Lyz2Cre マウスを作出した。Nlrc4-/-Il1r1-/-マウスは、B6.Nlrc4-/-マウスとB6.Il1r1-/-マウス（Jax株003245）を交配することによって作製した。B6.Casp8-/-Ripk3-/-、B6.Casp1/11-/-Ripk3-/-、およびB6.Casp1/11/8-/-Ripk3-/-マウスは、以前に記載したように生成した（Rauch et al.、2017）。

赤痢菌株
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S. flexneri serovar 2a 2457T株、WTまたはΔospC3（Mou et al.、2018）を用いてマウス感染を実施した。0.01% Congo red（CR）を含むトリプティックソイブロス（TSB）プレートに培養菌をプレーティングし、硫酸ストレプトマイシンの濃度を増加させることにより、WTおよびΔospC3の天然ストレプトマイシン耐性株を作製した。ストレプトマイシン耐性株は、抗生物質を含まないTSBブロスで親株と区別なく増殖することが確認され、ストレプトマイシン依存性がないことが示された。

In vivoでの赤痢菌感染と治療法
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ストレプトマイシン耐性S. flexneriを、0.01%CRを含み、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシンを添加したトリプティック大豆寒天培地プレート上で37℃にて増殖させた。感染では，CR陽性コロニー1個を5 mL TSBに接種し，37℃で一晩振とう培養した．飽和した培養液を5 mLのTSBで1:100に希釈し，37℃で2〜3時間振盪培養した。分光光度計でおおよその感染量を測定した（OD600 of 1=108 CFU/mL）。細菌は5000×gでペレット化し，PBSで2回洗浄後，PBSに懸濁して経口投与した。実際の感染量は，初期接種量の一部を連続希釈し，0.01%CRおよび100 μg/mLストレプトマイシンを含むTSBプレート上にプレーティングすることにより決定した。マウス感染は6週齢から22週齢のマウスで行った。はじめに，4〜6時間餌と水を奪われたマウスに，水に溶かした250 mg/mL硫酸ストレプトマイシン（25 mg/マウス）100 μLを経口投与し，新鮮な寝具を敷いたケージに入れた．1日後、再び4〜6時間餌と水を奪われたマウスに、PBSに懸濁した対数相のストレプトマイシン耐性S. flexneriを100μL（107CFU/マウス）の用量で経口投与した。感染1日前から安楽死・収穫の日まで、マウスの体重と糞便ペレットを毎日記録または採取し、疾患の重症度と炎症のバイオマーカーを評価した。糞便のコロニー形成（CFU/g of feces）およびチャレンジの成功は、感染後1日目に採取した糞便をホモジナイズし、プレーティングすることにより決定した（下記参照）。マウスの糞便が赤痢菌にコロニー形成されていない稀なケースでは、マウスは解析から除外された。各マウス感染実験では、各実験群に少なくとも3匹のマウスが含まれるようにした。すべてのマウス感染実験は、少なくとも1回繰り返した（図1、図1-図1、図1-図2を除く）。マウスを同居させる場合は盲検化と無作為化を行い、ARRIVEガイドラインが適用される場合はそれを適用した。各マウスは、データ収集後に処理群または遺伝子型にのみ関連付けられる固有の番号のイヤータグ識別子を有していた。in vivo抗体処理では、抗TNFα抗体（Bio X Cell、クローンTN3-19.12）およびポリクローナルアルメニアハムスターIgGアイソタイプコントロール抗体（Bio X Cell）を、感染の1日前から毎日腹腔内注射で200μg投与した。

糞便中CFU、糞便中MPO ELISA、湿乾比、糞便中血中濃度
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糞便ペレットを2mLチューブに採取し、プロテアーゼ阻害剤を含むPBS中の2％FBS 1mLに懸濁し、ポリトロンホモジナイザーを用いて18,000rpmでホモジナイズした。CFU測定のため、PBSで連続希釈し、0.01%CRおよび100 mg/mL 硫酸ストレプトマイシンを含むTSBプレートにプレーティングした。MPO ELISAでは、糞便ホモジネートを2000×gで紡糸し、上清を吸収性イムノアッセイ96ウェルプレートに2重プレートでプレートした。リコンビナントマウス MPO 標準抗体，MPO 捕捉抗体，MPO サンドイッチ抗体は，R&D Systems 社より購入した．糞便の乾燥前と乾燥後の重量を測定し、湿潤/乾燥比を求めた。新鮮なペレット中の糞便血液の有無は、顕微鏡観察、または湿った糞便サンプルをHemoccult血液検査キット（Beckman Coulter）の検出タブに適用することにより判定した。

腸内CFUの測定
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マウスの黄菅および大腸のIEC画分から細胞内赤痢菌CFUを計数するため、マウスを犠牲にして臓器を取り出し、縦に切断してPBSで洗浄し内腔内容物を除去した。組織は14 mLの培養チューブに入れ、5% FBS、2 mM L-グルタミン、25 mM HEPES、400 μg/mL of gentamicin を含むRPMIで1-2時間インキュベートし、短時間ボルテックスした。組織をPBSで5回洗浄し、1cmに切り、15mLの剥離液（HBSS, 10mM HEPES, 1mM DTT, 2.6mM EDTA）に入れ、穏やかに撹拌しながら37℃で25分インキュベートした。上清を100 µmフィルターに通し、残りの組織片を10 mLのPBSを入れた50 mLコニカルで激しく振盪し、再び100 µmフィルターに通した。この濃縮上皮細胞画分を50μg/mLゲンタマイシン中で30-40分間氷上インキュベートし、300×g、4℃で8分間スピンし、上清を吸引し、PBSに再懸濁し、300×g、4℃で5分間スピンして、2回洗浄した。1回目の洗浄後、細胞数を測定するために細胞の一部を取り置いた。2回目の洗浄後、ペレットを1 mLの1% Triton X-100に再懸濁し、溶解させた。この溶液から連続希釈液を作り、0.01%CRと100μg/mLストレプトマイシンを含むTSB寒天プレートにプレーティングし、37℃での一晩培養後にCR+陽性コロニーを計数した。

組織免疫測定法
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IEC画分を単離した後（上記）、残りの組織を、2％FBSとプロテアーゼ阻害剤を含むPBS1mLを含む14mL培養管に移した。臓器はポリトロンホモジナイザーを用いて20,000rpmでホモジナイズし、2000×gで遠心分離し、上清を吸収性免疫測定96wellプレートにプレーティングした。リコンビナントマウスCXCL1およびIL-1βスタンダード、キャプチャー抗体、サンドイッチ抗体はR&Dから購入した。TNFαレベルは、Thermo Fisherからの高感度ELISAを使用して検出した（注文番号：BMS607HS）。

イムノブロットおよび抗体
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Casp11+/-およびCasp11-/-マウス骨髄由来マクロファージからライセートを調製し、16,100×g、4℃で10分間スピニングすることにより清澄化した。ライセートはSDSローディングバッファーで変性させた。サンプルはNuPAGE Bis-Tris 4-12% gradient gels (Thermo Fisher) で製造者のプロトコルにしたがって分離した。タンパク質をImmobilon-FL PVDF膜に375 mAで90分間転写し、Odysseyブロッキングバッファー（Li-Cor）でブロッキングした。タンパク質は、抗カスパーゼ11一次抗体（コーン17D9）およびAlex Fluor-680結合二次抗体（Invitrogen）を用いてLi-Cor Odyssey Blot Imager上で検出された。

統計解析
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統計的有意性は、Prism（GraphPad）ソフトウェアを用いて、2群間を比較する場合は対にしない両側Mann-Whitney検定、複数群を比較する場合はTukeyの多重比較検定付きの一元または二元ANOVA検定、カテゴリーデータ（fecal blood score）を比較する場合はFisherの正確検定で決定した。いくつかのANOVA計算では、正規でないデータはまず正規性を得るために対数変換された（図の凡例参照）。Fisherの正確検定では、血液の有無（スコア＝1または2）または非存在（スコア＝0）によりデータを2群に層別化した。各フィッシャーの正確検定は、図に示した実験群間で独立して実施した。

材料入手に関する声明
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赤痢菌の株やマウスの系統など、使用したすべての材料は、リクエストに応じて入手可能です。対応する著者Russell E Vanceまでご連絡ください。

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データの利用可能性
この研究で生成または分析されたすべてのデータは、原稿に含まれているか、Dryad (https://doi.org/10.6078/D1S13W) に寄託されている。

以下のデータセットが作成された。
Vance RERoncaioli J (2023) Dryad Digital Repository Data from: A hierarchy of cell death pathways confers layered resistance to shigellosis in mice. (https://doi.org/10.6078/D1S13W)
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決定書
アルトゥーロ・カサデバル
シニア・レビュイング・エディター、ジョンズ・ホプキンス大学ブルームバーグ公衆衛生大学院、米国
エドワード・ミャオ
査読者; デューク大学、米国
i）読者のためにプレプリントと一緒に掲載される公開レビュー、ii）著者へのフィードバック（修正依頼を含む）です。また、編集者が論文のどこが興味深かったか、あるいは重要であったかを説明するアクセプトサマリーも含まれます。

査読後の判定レター

論文「A hierarchy of cell death pathways confers layered resistance to shigellosis in mice」を eLife にご投稿いただき、ありがとうございました。あなたの論文は3名の査読者によって査読され、査読編集者とシニアエディターのArturo Casadevallによって評価が監督されました。あなたの投稿論文の審査に携わった以下の人物は、身元を明らかにすることに同意しています。Edward A Miao (Reviewer #3)。

査読者は、互いの査読について議論し、査読編集者は、あなたが修正投稿を準備するために、これを起草しました。

必須修正事項

統計解析の厳密性に関する懸念に対処してください。
査読者3名全員から、実験内容や文章について何度も説明を求められたので、それに対応してください。

査読者2名（著者への提言）

Nlrc4-/-Casp11-/-, Casp1/11/8-/- Ripk3-/- マウスでは、Nlrc4-/- マウスと比較して、さらに上皮細胞死が欠損しているのか。免疫組織化学や免疫蛍光顕微鏡による切断型カスパーゼ3の測定など、生体内での上皮細胞死の実験的定量化は、この論文をより強固なものにしてくれるでしょう。しかし、この査読者は、これが生体内で取り組むことが潜在的に困難であることを認識しているが、そのようなアッセイは発表された研究で実施されている（すなわちPMID 31606566）。あるいは、著者らは、彼らの以前の研究（Mitchell and Roncaioli et al. 2020,, Rauch et al., 2017）と同様に、培養上皮細胞における細胞死および押出しに対する影響を示すことができる。
TNF⍺を介した抗シゲラ防御のメカニズムは、「TNF⍺依存性のNF-κBの活性化によって駆動されているとは考えられない」という議論での主張は、カスパーゼ8が様々な環境下でNF-κB活性化とサイトカイン産出を駆動できるため過大評価されているかもしれないと著者は述べている。さらに、カスパーゼ-8欠損マウスや抗TNF⍺で治療したマウスでは細菌量が増加しており、サイトカイン産生の増加の解釈を混乱させる。実験的には、細菌負荷がグループ間で等しいタイムポイントまたは組織で、フローサイトメトリーにより細胞内在性サイトカイン産生を測定することで対処できるだろう。あるいは、TNF_237Aシグナル下流のNF-κB活性化が細菌制御に寄与している可能性を含む代替解釈を認めて、著者は考察の文章を修正することも可能である。

以下の提言は、論文を強化するものであるが、研究の結論を支持するために不可欠なものではない。これらの点を実験的に解決するか、本文を適切に修正するかは、著者の裁量に委ねられるべきである。

図2において、Nlrc4欠損マウスではカスパーゼ11インフラマソームが「病気を防ぐ」という主張は、図の説明文にあるように、言い過ぎか、少なくともデータからするとニュアンスが足りないように思われる。特に、体重には差がなく、腸内に血液があったマウスはわずか2/9であり、これらのデータからしっかりとした統計的結論を出すことはできない。OspC3 が Casp-11 の活性化を効率的に阻害し、Casp-11 の抗菌作用を隠している可能性が高いというものだ。これに基づいて、本文中の図 2 の説明は、この可能性のある解釈を考慮して修正した方がよいかもしれません。
1. Casp1/11/8-/- Ripk3-/- マウスは、その後の時点でどうなるのでしょうか？129.Nlrc4-/-マウス（Mitchell and Roncaioli et al. 2020）で以前に示されたように、最終的に体重や下痢が回復するのか、それとも感染に負けるのか？もし著者らがこのデータを既に持っていれば、これらのマウスの感受性上昇の本質をさらに明確にすることができるだろう。しかし、この実験は論文の主張にとって不可欠なものではない。
3.統計的な推奨事項

a. 図5：すべてのパネルにおいて、WT群とiNlrc4Lyz2Cre群を比較した統計量を提示してください。

b. b. 2群以上を含む統計解析では、多重比較を補正する検定を使用してください（特に図4と図8）。

c. 潜血の解析では、フィッシャーの正確検定など、カテゴリーデータを解析できる統計検定を使用することを検討してもよい。

査読者3（著者への推奨事項）。

T3SS がアクチン系の運動を媒介すると紹介されていますが、これは主に IcsA 依存性であり、T3SS のエフェクターではないと思います。

図1の凡例に、この実験は1つの実験の代表であることを明記すべきです。私たち読者は、省略によってこれを推論してはいけません。

129S1/SvImJ "の完全株名をメソッドセクションに追加してください。

CXCL1 は、この論文で調査する特定のメディエーターとしてではなく、疾患のマーカーとして測定されていることを明記されたい。図1dは、組織ホモジネートからのIL-1βのELISAを示す。このシグナルは、プロIL-1βまたは成熟IL-1βのいずれかから生じうる。もしELISAが両方の形態を検出する能力を有するならば、これはカスパーゼ-1活性化よりもむしろNF-κB応答のためのマーカーであるかもしれない。著者らは、どちらとも言えない。この点については、現在議論されていないので、単に本文中でコメントする必要がある。

Figure 1 paragraph 2: "mixed homozygous 129/129 or heterozygous B6/129 at all loci"（すべての遺伝子座で129/129またはB6/129の混合型）。これは正しくないので、修正をお願いします。

このデータの本文中での議論や、図の説明文（図1、図1--補足図2）での提示の仕方は間違っています。私の理解では、これら2つの図のデータは同じデータですが、Casp11とHiccsの遺伝子型に基づいてグループが分かれています。凡例に同じデータであることを明確に記載する必要がある。実際、補足ラベルの詳細をすべて削除し、単に図1を参照するようにしてもよいでしょう。そうすれば、同じ実験データであることがより明確になる。また、本文の文章をより明確にし、遷移文にすることで、より容易になります。

図1は、「129/129 at Casp11」と「B6/129 at Casp11」のグループもNlrc4が欠損していることがより明確になるように、ラベルを変更すべきです。Nlrc4-/-と下に書いて、全グループに線を引くとか？また、パネル1Gのラベルの整合性を確認する。

図1c-1d-1eの解釈は正しくない。著者らは、遺伝子型N2クロスCasp11(129/129)マウスは炎症性サイトカインの「適度な増加」と盲腸の縮小があると説明しているが、CXCL1のp値は0.09であり、傾向としてはあるが統計的には有意ではない、IL-1b値は目によって差がない、盲腸長はおそらく傾向である、としてよいだろう。

図2Eは統計的に有意な差だが、図2Fは傾向的としか言えないので、本文で正しく記載する必要がある。

図3Bと3Dは、論じる際に文中で対になっていますが、3Bは有意で、3Dは傾向的なものです。

図3Fと図3Gは、「レベルが低下した」として再び文中で対になっているが、3Fは有意であり、3Gは傾向も異なっている。

図7A～Eは「緩やかな増加」とされていますが、これらのほとんどは統計的に有意ではありません。実験の検出力が2倍、3倍になれば、そこに本当の違いが出てくるかもしれないが、これはおそらく努力に値するものではないだろう。比較すると、図6Aは、IL-1Rが体重に有害な効果を持つように見える傾向の違いを有するが、これは有意差なしと解釈される。これも十分な検出力があれば有意かもしれないが、やはりそれを追求する価値はないだろう。

図5Fと図5Gの解釈は、著者がより明確で正確であり、このスタイルは以前の図にも適用されるべきです。他の不正確な解釈を見逃しているかもしれないので、それぞれの解釈が正しいかどうか、注意深く読んでください。

メソッドに統計解析の項目を追加してください。

統計解析について、図1Aで、129の親玉はN2 Casp11(129/129)と同じ、B6の親玉はN2 Casp11（B6/129）と同じという解釈をしています。しかし、4群を比較するため、統計解析にはMann-Whitneyを用いることができない。もし、3日目だけを分析するのであれば、一元配置のANOVAを使用する必要があります。もし、この分析に時間が加えられたら、これは実験に加えられたもう一つの変数であり、二元配置分散分析が必要です。

Figure 3, 4, 6, 7Nの説明には、すべてのデータ解析にMann-Whitney検定が用いられたとありますが、統計は2つ以上のグループでの比較を示しています。この場合、一元配置分散分析（またはクラスカル・ワリス）が正しい分析です。

supplement figure 1のF1マウスの実験については統計解析が行われていませんが、本文中ではこれらの実験から結論を導いているので、統計解析を行う必要があります。

多くの図がlittermatesを使用している。親がどのような遺伝子型であったかを結果本文に記載する必要がある。また、図中のパネルにある各遺伝子の完全な遺伝子型を記載する必要がある。ヘテロ接合体の充足は仮定できないので、各マウスについてヘテロ接合体の状態を明記する必要がある。もし、ヘテロ接合体のマウスをすべて捨て、het x hetの交配からマウスが生まれたのであれば、読者がそのような懸念を抱かないよう、明確に記載する必要がある。例えば、図2において、WTマウスは実際にNlrc4+/-とCasp11+/-であり、Nlrc4-/-マウスは実際にNlrc4-/- Casp11+/-マウスであるか。例えば、Casp8-/-Ripk3-/-マウスは、Casp1/11+/-でもあると思われます。完全な遺伝子型を記載する必要がある。また、凡例ではWTマウスも同腹のような記載になっている。これらはヘテロ接合体マウスなのか、それとも非同居のWT対照比較群なのか？これは記載すべきです。

図8の「loss of multiple cell death...」の項では、冒頭で既にOspC3が不完全な阻害剤であるという概念を紹介し、OspC1やOspD3についても紹介されています。したがって、このセクションを読み始めるにあたって私が期待したのは、これらも不完全阻害剤であるかもしれないということでしたが、これには触れられていませんでした。また、これらのエフェクターを直接命名し、議論することは有益でしょう。私は、これらの突然変異体を調べた将来の研究で、さらなる「遺伝学の二乗」の表現型を期待します。つまり、ospC1変異体を調べた場合、カスパーゼ-8についてより強い表現型が観察されるかもしれません。本文の改訂は、読者にとって有益であろう。

糞便血液のグラフは各マウスに点をつけているが、ほとんどのグラフではこれらの点が合体しているため、見えない。著者らは血便のあるマウスとないマウスの数を表示することで補っている。別のグラフを使えば、より正確にデータを伝えることができるかもしれない。菱形にすれば見えるかもしれない。例えば、Y軸をマウスの割合とし、各遺伝子型を糞便血症のスコアで「積み上げ棒」にするとか。あるいは、図の中に表を挿入するとか？

Figure Supplement 2のモデルですが、RIPK3、OspC1、OspD3を図に追加してもそれほど手間はかからないと思います、いずれも原稿に関連するものです。また、CASP11モジュールを左側に配置し直せば、CASP8をNLRC4の下から取り除き、代わりにNLRC4からCASP8までの線をTNF受容体の下に引くことができます（したがって、CASP8が2回図に載るのを避けることができます）。

Casp8-/- Ripk3-/-マウスの使用に関する文章を修正することを提案します。現在、このマウスはカスパーゼ8のみを調査し、RIPK3は役割を果たさないとされているようです。しかし、RIPK3の役割は、赤痢菌がカスパーゼ8を阻害したときに初めて明らかになるのかもしれません。しかし、RIPK3の役割は、赤痢菌がカスパーゼ8を阻害したときに初めて明らかになるもので、OspC1で阻害していることから、OspD3の存在も説明できる。したがって、最も可能性が高いのは、両方が役割を果たしているが、カスパーゼ8で十分であるため、単一のノックアウトではRIPK3の役割が明らかにならないことである。

https://doi.org/10.7554/eLife.83639.sa1
著者からの回答
本質的な修正。

統計解析の厳密性に関する懸念に対処してください。
査読者 3 名全員から、実験の詳細と本文に関する明確化の要望が複数あったため、それに対応すること。

このたびは建設的で詳細なコメントをいただき、ありがとうございました。また、3名の査読者からいただいた批評を受け、統計と実験の詳細について多くの変更を加えました。これらの変更は以下の通りであり、原稿を大幅に改善することができたと考える。

査読者2名（著者への提言）

Nlrc4-/-Casp11-/-, Casp1/11/8-/- Ripk3-/- マウスでは、Nlrc4-/- マウスと比較して、さらに上皮細胞死が欠損しているのか。免疫組織化学や免疫蛍光顕微鏡による切断型カスパーゼ3の測定など、生体内での上皮細胞死の実験的定量化は、この論文をより強固なものにしてくれるでしょう。しかし、この査読者は、これが生体内で取り組むことが潜在的に困難であることを認識しているが、そのようなアッセイは発表された研究で実施されている（すなわちPMID 31606566）。あるいは、著者らは、彼らの以前の研究（Mitchell and Roncaioli et al. 2020,, Rauch et al., 2017）と同様に、培養上皮細胞における細胞死および押出しに対する影響を示すことができる。

細胞死を実験的に定量化すれば、論文の結論が強化されるという査読者の意見に同意します。赤痢菌感染に伴う腸管上皮の細胞死を直接的に同定／定量化することは、実験的に困難であることに留意している。我々の以前の研究で使用したex vivoオルガノイド上皮細胞系は、NLRC4が同調した赤痢菌単層感染に強く反応するためと思われるが、NLRC4活性のあるオルガノイド単層とNLRC4欠損のオルガノイド単層の間で細胞死に明確で明白な差があったことから、部分的には有効であったと考えられる。しかし、CASP11とTNFの効果はNLRC4の効果よりも微妙であり、（オルガノイドには存在しない）造血細胞に由来するサイトカイン反応に依存している可能性がある。

Rauchら（2017）では、FlaToxの投与により、同期した迅速かつ強力な細胞死反応が可能になるため、細胞死は容易に検出可能であった。しかし、赤痢菌感染の文脈では、細胞死は上皮における細菌の複製および播種を制限する上で重要と思われるが、細胞死事象は同期しておらず、発生頻度も低く、したがって視覚的に捉えることがより困難である。さらに、アポトーシス、パイロプトシス、ネクロプトシスマーカーやイニシエーターに対する免疫蛍光法はin vivoで行うことが困難であるため、ある細胞死経路を開始する経路やセンサーを特定することは困難である。しかし、今後の研究により、生体内での細胞死を直接定量化できるようにしたい。

TNF⍺を介した抗赤痢菌防御機構が「TNF⍺依存性のNF-κBの活性化によって駆動されているとは考えられない」という考察での主張は、カスパーゼ8が様々な環境下でNF-κB活性化とサイトカイン生成を駆動できるため、誇張されているかもしれないと著者は述べている。さらに、カスパーゼ-8欠損マウスや抗TNF⍺で治療したマウスでは細菌負担が増加しており、サイトカイン産生の増加の解釈を混乱させる。実験的には、細菌負荷がグループ間で等しいタイムポイントまたは組織で、フローサイトメトリーにより細胞内在性サイトカイン産生を測定することで対処できるだろう。あるいは、TNF_237Aシグナル下流のNF-κB活性化が細菌制御に寄与している可能性を含む代替解釈を認めて、考察の文章を修正することも可能である。

我々は、保護におけるTNF⍺の役割に関する我々の主張が、本文のあるセクションで誇張されているという査読者の意見に同意する。我々は、NFkBシグナルを通じて保護が行われる可能性を含むように考察のセクションを修正し、保護がアポトーシスを介して行われると仮定する理由についての我々の思考過程をさらに説明した。また、抗TNF⍺療法を行ったマウスでは細菌量が増加しており、サイトカイン産生の増加の解釈を混乱させるという注意点も認識している。

以下の提言は、この論文を強化するものであるが、この研究の結論を支持するために重要なものではない。これらの点を実験的に解決するか、本文を適切に修正するかは、著者の判断に委ねられるべきである。

図2において、Nlrc4欠損マウスではカスパーゼ11インフラマソームが「病気を防ぐ」という主張は、図の説明文にあるように、言い過ぎではないか、少なくともデータからするとニュアンスが足りないように思われます。特に、体重には差がなく、腸内に血液があったマウスはわずか2/9であり、これらのデータからしっかりとした統計的結論を出すことはできない。OspC3 が Casp-11 の活性化を効率的に阻害し、Casp-11 の抗菌作用を隠している可能性が高いというものだ。これに基づいて、本文中の図 2 の説明は、この可能性のある解釈を考慮して修正した方がよいかもしれません。

OspC3 存在下での CASP11 の保護作用が控えめであることを反映し、このセクションと図のタイトルを修正した。IECにおける細菌負荷（図2B）およびCXCL1の有意な増加は、この表現型が完全に浸透していないとしても、CASP11が保護において依然として小さな役割を果たすことを示すことに留意されたい。

1. Casp1/11/8-/-Ripk3-/-マウスは、後の時点でどうなるのだろうか？129.Nlrc4-/-マウスで以前示されたように（Mitchell and Roncaioli et al. 2020）、最終的に体重や下痢が回復するのか、それとも感染に屈するのか？もし著者らがこのデータを既に持っていれば、これらのマウスの感受性上昇の本質をさらに明確にすることができるだろう。しかし、この実験は論文の主張にとって不可欠なものではない。

Casp1/11/8-/- Ripk3-/-と129.Nlrc4-/-の両マウスで感染後2日から6日の間に死亡が観察されることがあるが、これらの実験の目的は感染に対する生存率ではないので直接数値化したことはない。これらの遺伝子型内での生存率は、感染ごとに異なる傾向があることがわかり、マイクロバイオーム（または他の要因）が致死的な感染に対する感受性に影響を与える可能性があることが示唆された。今後の研究において、生存率曲線のデータを収集する予定である。

統計的な推奨事項

a. 図5：全てのパネルにおいて、WT群とiNlrc4Lyz2Cre群を比較した統計量を提示してください。

我々は、Tukeyの多重比較検定を用いたone way ANOVAでこれらのデータを解析し、有意性を確認した。

b. b. 2群以上を含む統計解析では、多重比較を補正する検定を使用してください（特にFigure 4と8において）。

特定の実験で2群以上を解析する場合、Tukeyの多重比較を伴う1元配置および2元配置のANOVA検定を含めるように原稿を更新した。

c. c. 潜血分析において，Fisherの正確検定など，カテゴリーデータを分析できる統計的検定を用いることを検討してもよいのではないか．

我々は、Fisherの正確検定を使用して潜血スコアを解析した（Figure 1とFigure 1 -figure supplement 2は例外で、一元配置分散分析を使って我々の追加した血液スコア間の有意性を解析している）。フィッシャーの正確分析では、血液の有無（スコア＝1または2）または有無（スコア＝0）によってデータを2群に層別化しました。

査読者3(著者への提言)

序文で、T3SS がアクチンに基づく運動性を媒介するとありますが、これは主に IcsA 依存性であり、T3SS のエフェクターではないと思います。

この修正に伴い、序文を修正しました。

図1の凡例で、著者は、この実験が1つの実験の代表であることを述べるべきです。読者の皆様は、省略されることによって、このことを推論してはなりません。

凡例に修正を加えました。

129S1/SvImJ "の完全株名を方法欄に追加してください。

この修正に伴い、メソッドのセクションを修正しました。

CXCL1 は、この論文で調査する特定のメディエーターとしてではなく、疾患のマーカーとして測定されていることを明記する必要があります。図 1d は、組織ホモジネートからの IL-1β の ELISA を示している。このシグナルは、プロIL-1βまたは成熟IL-1βのいずれかから生じうるものである。もしELISAが両方の形態を検出する能力を有するならば、これはカスパーゼ-1活性化よりもむしろNF-κB応答のためのマーカーであるかもしれない。著者らは、どちらとも言えない。この点については、現在議論されていないので、単に本文中でコメントする必要がある。

我々は、IL-1b と CXCL1 の両方を疾患のバイオマーカーとして使用しており、調査すべき特定のメディエーターとして使用していないことを反映するために、結果のセクションの文章を変更しました。また、この ELISA は、未処理の IL1b と処理済みの IL1b を区別しないことを明記しました。

Figure 1 paragraph 2: "mixed homozygous 129/129 or heterozygous B6/129 at all loci". これは正しくないので、修正をお願いします。

本文中で修正しました。

このデータの本文中での議論や、図の凡例（図1、図1--補足図2）での提示の仕方は正しくありません。私の理解では、この2つの図のデータは同じデータですが、Casp11とHiccsの遺伝子型に基づいてグループが分かれています。凡例に同じデータであることを明確に記載する必要がある。実際、補足ラベルの詳細をすべて削除し、単に図1を参照するようにしてもよいでしょう。そうすれば、同じ実験データであることがさらに明確になります。また、本文の文章をより明確にし、遷移文にすることで、より容易になります。

はい、図1と図1-図2のデータは同じものです。このことを明確にするために、本文と図の説明の両方で、実験とデータの表示について、より正確な記述を行いました。

図1は、「129/129 at Casp11」と「B6/129 at Casp11」のグループもNlrc4欠損であることをより明確にするために、ラベルを変更する必要がある。Nlrc4-/-と下に書いて、全グループに線を引くとか？また、パネル1Gのラベルの整合性を確認して下さい。

図1、図1-図2ともに図の説明を更新し、これらのグループのマウスはNLRC4も欠損していることを示しました。パネル1Gのラベルを更新しました。

図1c-1d-1eの解釈は正しくない。著者らは、遺伝子型N2クロスCasp11(129/129)マウスが炎症性サイトカインの「適度な増加」と盲腸の縮小を有すると説明しているが、CXCL1のp値は0.09であり、傾向的だが統計的に有意ではないと表現できる、IL-1bレベルは目によって差がない、盲腸長はおそらく傾向的になっていると思われる。

査読者のコメントを反映し、解釈を変更しました。

図2Eは統計的に有意な差ですが、図2Fはtrendingのみですので、本文中に正しく記載する必要があります。

査読者のコメントを反映し、解釈を変更しました。

図3Bと図3Dは、議論する際に文中で対になっていますが、3Bは有意で、3Dはトレンドになっています。

査読者のコメントを反映し、解釈を変更しました。また、統計的検定を更新した結果、図3Dのデータは有意であることを明記しました。

図3Fと図3Gは、文中で再び「レベルが下がった」として対になっているが、3Fは有意であり、3Gは異なる傾向にもなっていない。

査読者のコメントを反映し、解釈を変更した。

図7A～Eは、「緩やかな増加」と表現していますが、これらのほとんどは統計的に有意ではありません。実験の検出力が2倍、3倍になれば、そこに本当の違いが出てくるかもしれませんが、これはおそらく努力に値するものではありません。比較すると、図6Aは、IL-1Rが体重に有害な効果を持つように見える傾向の違いを有するが、これは有意差なしと解釈される。これも十分な検出力があれば有意かもしれないが、やはりそれを追求する価値はないだろう。

図5Fと図5Gの解釈は、著者がより明確で正確であり、このスタイルは以前の図にも適用されるべきです。他の不正確な解釈を見逃しているかもしれないので、それぞれの解釈が正しいかどうかよく読んでほしい。

各図の結果セクションの解釈と文言を修正し、より正確かつ的確になるようにしました。

メソッドに統計解析のセクションを追加してください。

メソッドに統計解析の項目を追加しました。

統計解析について、図1Aで、129の親玉はN2 Casp11(129/129)と同じ、B6の親玉はN2 Casp11（B6/129）と同じという解釈をしています。しかし、4群を比較するため、統計解析にはMann-Whitneyを用いることができない。もし、3日目だけを分析するのであれば、一元配置のANOVAを使用する必要があります。もし、この分析に時間が加われば、これは実験に加えられたもう一つの変数であり、二元配置分散分析が必要になります。

我々は、一元配置分散分析とTukeyの多重比較検定を用いて、（3日目の）データを再分析した。

図3、4、6、7Nの凡例では、すべてのデータ解析にMann-Whitney検定を用いたとあるが、統計は2群以上にわたる比較を示している。この場合、一元配置分散分析（またはクラスカル・ワリス）が正しい分析です。

これらの図のデータは、一元配置分散分析、二元配置分散分析、Tukeyの多重比較検定を用いて再分析しています。正規分布のないデータには対数変換を行った（図の凡例に示す）。

supplement figure 1のF1マウス実験については統計解析を行っていませんが、本文中ではこれらの実験から結論を導いていますので、統計解析を行う必要があります。

そこで、この図のために作成したデータについて、統計解析を行いました。

多くの図では同胞を使用しています。親がどのような遺伝子型であったかを結果本文に記載する必要があります。また、図中のパネルにある各遺伝子の完全な遺伝子型を記載する必要がある。ヘテロ接合体の充足は仮定できないので、各マウスについてヘテロ接合体の状態を記載する必要がある。もし、ヘテロ接合体のマウスをすべて捨て、het x hetの交配からマウスが生まれたのであれば、読者がそのような懸念を抱かないよう、明確に記載する必要がある。例えば、図2において、WTマウスは実際にNlrc4+/-とCasp11+/-であり、Nlrc4-/-マウスは実際にNlrc4-/- Casp11+/-マウスであるか。例えば、Casp8-/-Ripk3-/-マウスは、Casp1/11+/-でもあると思われます。完全な遺伝子型を記載する必要がある。また、凡例ではWTマウスも同腹のような記載になっている。これらはヘテロ接合体マウスなのか、それとも非同居のWT対照比較群なのか？これを明記する必要があります。

各試験で使用したマウスの遺伝子型と、マウスが同腹子か同居ケージ子かをより正確に表現するために、本文、図、図の説明の両方を修正しました。

エフェクターOspC1およびOspD3の潜在的な役割を考慮し、結果のセクションと考察のセクションの両方を修正した。しかし、OspC1とOspD3は、ヒトではアポトーシスとネクロプトーシスを抑制するように見えるが、マウスではこれらのエフェクターはあまり効果がないと仮定している。我々のデータは、CASP8が赤痢菌感染時に実際に活性化し、防御に強い役割を担っていることを示している。このことは、この酵素がOspC1によって強く阻害されないことを示すと考えられる。さらに、CASP8経路が活性化すれば、ネクロプトーシスを本質的に阻害することになり、マウスではOspD3が「時代遅れ」になることが予想される。

糞便中の血液のグラフでは、各マウスに点が付けられているが、ほとんどのグラフではこれらの点が合体しているため、視認できない。著者らは、血液があるマウスとないマウスの数を表示することで補っている。別のグラフを使えば、より正確にデータを伝えることができるかもしれない。菱形にすれば見えるかもしれない。例えば、Y軸をマウスの割合とし、各遺伝子型を糞便血症のスコアで「積み上げ棒」にするとか。あるいは、図の中に表を挿入するのもいいかもしれない。

糞便血液検査の結果をパーセンテージや割合で棒グラフにすることも考えましたが、実験グループを色で分け、なおかつ3つの血液検査の結果を視覚的に効果的に区別できる図を作ることができませんでした。また、血液が検出されなかったマウス群の棒グラフは、誤解を招く可能性があることがわかりました。査読者3名のアドバイスにより、各マウスを表すのに円の代わりに菱形を使用しました。円形よりも菱形の方が、よりはっきりと分離して見えますが、この新しい視覚的表現は完璧ではありません。また、各グループのマウス数を表示することで、よりわかりやすい表現になりました。

Figure Supplement 2 のモデルですが、RIPK3、OspC1、OspD3 を図に追加してもそれほど手間はかからないと思います、いずれも原稿に関連するものです。また、CASP11モジュールを左に配置し直せば、CASP8をNLRC4の下から取り除き、代わりにNLRC4からTNF受容体の下にあるCASP8まで線を引くことができます（したがって、CASP8が2回図に乗ることは避けられます）。

このデータから、CASP8はOspC1によって強く阻害されないことが示唆され、したがって、ネクロプトーシスはマウスにおける防御の中心ではないことが予測される。少なくとも、マウスではネクロプトーシス、OspC1、OspD3が重要であることを示す証拠はない。従って、RIPK3、OspC1、OspD3を図から省き、最初の図を残すことにしました。

Casp8-/- Ripk3-/-マウスの使用に関する文章を修正することを提案します。現在、これらのマウスはカスパーゼ8のみを調査し、RIPK3は役割を果たさないとされているようです。しかし、RIPK3の役割は、赤痢菌がカスパーゼ8を阻害したときに初めて明らかになるのかもしれません。しかし、RIPK3の役割は、赤痢菌がカスパーゼ8を阻害したときに初めて明らかになるもので、OspC1で阻害していることから、OspD3の存在も説明できる。したがって、最も可能性が高いのは、両方が役割を果たしているが、カスパーゼ8で十分であるため、単一のノックアウトではRIPK3の役割が明らかにならないことである。

RIPK3、OspC1、OspC3の潜在的な役割（上記参照）、およびマウス感染時のそれぞれの役割に関する我々の予測について、より詳細なコメントを含めるために、「結果および考察」のセクションを改訂した。

https://doi.org/10.7554/eLife.83639.sa2
論文・著者情報
著者詳細
Justin L Roncaioli
免疫学・分子医学部門、分子・細胞生物学部門、University of California, Berkeley, Berkeley, United States
貢献概念化、データキュレーション、形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆 - 原案、執筆 - 査読と編集
競合する利益競合する利益の宣言はありません。
ジャネット・ピース・バビリェ
免疫学・分子医学部門、分子・細胞生物学部門、カリフォルニア大学バークレー校、バークレー、アメリカ合衆国
貢献度調査
競合する利益競合する利益の宣言はない
ロベルト・A・チャベス
免疫学・分子医学部門、分子細胞生物学部門、University of California, Berkeley, Berkeley, United States
貢献度調査
競合する利益競合する利益の宣言はない
Fitty L Liu
カリフォルニア大学バークレー校、分子細胞生物学部、免疫学・分子医学部門、米国
貢献度調査
競合する利益競合する利益の宣言はない
Elizabeth A Turcotte
免疫学・分子医学部門、分子細胞生物学部門、University of California, Berkeley, Berkeley, United States
貢献度調査
競合する利益競合する利益の宣言はない
アンガス・Y・リー
癌研究所、カリフォルニア大学バークレー校、バークレー、アメリカ合衆国
貢献度リソース
競合する利益競合する利益は宣言していない
Cammie F Lesser
ハーバード大学医学部微生物学教室（米国、ボストン
ハーバード大学・マサチューセッツ工科大学ブロード研究所（米国・ケンブリッジ
マサチューセッツ総合病院医学部感染症科、米国、ボストン
貢献度資源、監督、資金獲得、方法論、執筆 - 査読と編集
競合する利益競合する利益の宣言はありません。
ラッセル・E・バンス
カリフォルニア大学バークレー校分子細胞生物学教室免疫学・分子医学部門、米国
米国カリフォルニア大学バークレー校がん研究所
免疫治療学およびワクチン研究イニシアティブ、カリフォルニア大学バークレー校、バークレー、アメリカ合衆国
ハワード・ヒューズ医学研究所、カリフォルニア大学バークレー校、バークレー、アメリカ合衆国
貢献概念化、資源、監督、資金獲得、執筆 - 原案、執筆 - 査読・編集
通信： rvance@berkeley.edu
競合利益 eLife 誌の編集に携わる。
ORCIDアイコン 0000-0002-6686-3912
資金提供
ハワード・ヒューズ医学研究所
ラッセル・E・バンス
米国国立衛生研究所(AI075039)
ラッセル・E・バンス
米国国立衛生研究所(AI063302)
ラッセル・E・バンス
米国国立衛生研究所（AI155634）
Russell E Vance
研究助成機関は、研究デザイン、データの収集と解釈、または論文を出版するための投稿の決定に関与していない。

謝辞
P Mitchell、I Rauch、S Fattinger、K Eislmayrには、議論と助言をいただいた。また、Vance and Barton Labsのメンバーには、議論に参加いただき、感謝する。資金提供 REVはHHMI Investigatorであり，HHMI EPI支援を受けており，NIHグラントAI075039，AI155634およびAI063302の支援を受けている．JLRはIrving H Wiesenfeld CEND Fellow、EATはNSF GRFP DGE 1752814、CFLはBrit d'Arbeloff MGH Research Scholarで、NIH AI064285およびNIH AI128743の支援を受けている。

倫理
本研究は、National Institutes of HealthのGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsの勧告に厳密に従って実施された。すべての動物は、カリフォルニア大学バークレー校の承認された機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC）プロトコル（AUP-2014-09-6665-1）に従って取り扱われた。

シニアエディターおよびレビュアー
アルトゥーロ・カサデヴァル（ジョンズ・ホプキンス大学ブルームバーグ公衆衛生大学院、アメリカ合衆国
査読者
エドワード・A・ミャオデューク大学（米国
掲載履歴
プレプリントを掲載しました。2022年9月21日（プレプリントを見る）
受理：2022年9月27日 2022年9月27日
受理：2022年9月27日 2023年1月15日
Accepted Manuscript 公開。2023年1月16日(第1版)
バージョンオブレコード発行 2023年1月25日(第2版)
著作権
© 2023, Roncaioli et al.

この記事は、原著者と出典を明記することを条件に、無制限の使用と再配布を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されています。

メトリックス

カテゴリーとタグ
Research Advance免疫・炎症微生物学・感染症病原体赤痢菌
研究対象生物
マウス
読み物
免疫・炎症微生物と感染症
NAIP-NLRC4欠損マウスは赤痢に罹患しやすい
パトリック S ミッチェル, ジャスティン L ロンカイオリ ... ラッセル・E・バンス
研究論文 2020年10月29日更新
計算・システムバイオロジー免疫・炎症
適応免疫受容体レパートリープロファイリングにおける定量的バイアス補正のためのナチュラルキャリブレーターとしての非機能性クロノタイプの使用
Anastasia O Smirnova, Anna M Miroshnichenkova ... Alexander Komkov
ツール・リソース 2023年1月24日
免疫・炎症
若年性特発性関節炎における優勢（制御）T細胞クローンのコンパートメント化と存続が示す抗原の偏り
Gerdien Mijnheer, Nila Hendrika Servaas ... フェムケ・ファン・ヴァイク
研究論文 2023年1月23日
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