カリブ海で飼育されているサンゴ Acropora cervicornis における白帯病の微生物指標と視覚的健康指標の一致性

2023年6月26日 11:00

Monica D. Schul1、Dagny-Elise Anastasious2、Lindsay J. Spiers3,4、Julie L. Meyer1、Thomas K. Frazer5、Anya L. Brown6,7
2023年6月21日
査読レポートを読む
著者および論文情報

1米国フロリダ州ゲインズビル、フロリダ大学土壌・水・生態系科学科
2中央カリブ海海洋研究所リトルケイマン研究センター、ケイマン諸島、リトルケイマン
3米国フロリダ州ゲインズビル、フロリダ大学水産学部
4フロリダ州魚類野生生物保護委員会魚類野生生物研究所（アメリカ合衆国フロリダ州マラソン市
5南フロリダ大学海洋科学学部（アメリカ合衆国フロリダ州セントピーターズバーグ
6米国フロリダ州ゲインズビル、フロリダ大学自然資源環境学部
7カリフォルニア大学デービス校進化・生態学部ボデガ海洋研究所、カリフォルニア州ボデガベイ、アメリカ合衆国
DOI
10.7717/peerj.15170
公開
2023-06-21
受理
2023-03-13
受理
2021-03-17
学術編集者
クレイグ・ネルソン
専門分野
生態学, 海洋生物学, 微生物学, 分子生物学, 天然資源管理
キーワード
Acropora cervicornis, コア微生物, 病原生物, サンゴ保育所, サンゴ病, 白色バンド病, サンゴ礁
著作権
© 2023 Schul et al.
ライセンス
本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されるオープンアクセス論文であり、適切に帰属表示されることを条件に、いかなる媒体、いかなる目的においても、無制限の使用、配布、複製、翻案を許可する。帰属のためには、原著者、タイトル、出版元（PeerJ）、論文のDOIまたはURLのいずれかを引用しなければならない。
本論文の引用
Schul MD, Anastasious D, Spiers LJ, Meyer JL, Frazer TK, Brown AL. 2023. カリブ海で飼育されているサンゴ Acropora cervicornis における白帯病の微生物指標と視覚的健康指標の一致。PeerJ 11:e15170 https://doi.org/10.7717/peerj.15170
概要

背景
サンゴの病気は、サンゴの個体数を減少させる主な原因の一つです。カリブ海では、白色バンド病（WBD）によりアクロポラサンゴが大幅に減少している。この病気の成因はまだ十分に解明されていませんが、健康な状態から病気になるまでのサンゴの微生物質の特徴を明らかにすることは、病気の進行を理解する上で非常に重要です。サンゴの養殖場では、サンゴを長期的にモニタリングできるため、病気のサンゴと健康なサンゴに関連する微生物の変化をさらに理解することができます。私たちは、CI のリトルケイマンにある海洋養殖場で飼育されている Acropora cervicornis の WBD 発生前と発生中のマイクロバイオームの特徴を明らかにしました。(1)健康なサンゴは長期間（病気の発生前と発生中）にわたって同じマイクロバイオームを示すのか、 (2)病気になったサンゴのコロニーでは、病変した組織と一見健康な組織の両方に病気の兆候があるのか。
方法
2017年（発病前）と2019年（発病中）に健康なサンゴコロニーから微生物粘液組織スラリーを採取した。発病したコロニーは、サンゴ個体群体上の発病界面と、約10 cm離れた健康なサンゴ組織上の2箇所でサンプリングした。16S rRNA 遺伝子の V4 領域の塩基配列を決定し、育苗中の A. cervicornis の細菌群集と古細菌群集の構成を明らかにした。アルファ多様性、ベータ多様性、組成の違いを評価し、健康状態（2019年）および年度間（2017年と2019年）の健康なサンゴ間の微生物群集の違いを明らかにした。
結果
2017年（発病前）と2019年（発病後）の健康なA. cervicornisの微生物群集に有意な差はなかった。さらに、発病していないサンゴのコロニーから採取した健常サンゴと思われるサンプルの微生物群集は、アルファ多様性と群集組成の両方において、同じコロニーの発病部分よりも健常コロニーに類似していた。また、疾患組織の微生物群集は、健常組織や一見健常組織よりもアルファ多様性が有意に高かったが、ベータ多様性の分散には有意な差は見られなかった。この結果から、個体群スケールでは、健全なサンゴ組織や健全と思われるサンゴ組織と、病的なサンゴ組織の微生物群集は異なることが示された。さらに、この結果から、リトルケイマン島のサンゴ礁の微生物群集は長期的に安定していることが示唆された。また、リトルケイマン諸島のサンゴは、2 年間にわたり安定した微生物群集を維持しており、これは微生物群からサンゴの健康状態を評価する上で重要な指標となる。
引用
Schul MD, Anastasious D, Spiers LJ, Meyer JL, Frazer TK, Brown AL. 2023. カリブ海で養殖されているサンゴ Acropora cervicornis において、微生物と目視による白帯病の健康指標が一致した。PeerJ 11:e15170 https://doi.org/10.7717/peerj.15170
論文本文

はじめに
世界的に、サンゴ礁は、サンゴ個体数の減少につながる複数のストレス要因によって、驚くべき速さで消滅している（Pandolfi et al., 2003; Diaz et al., 2016; Pollock et al., 2019）。サンゴの病気は、特にカリブ海でサンゴ礁の減少にますます大きく影響しています（Weil, 2004; Harvell et al., 2007）。特に、白色バンド病（WBD）は、重要な生息域を形成するサンゴ、Acropora palmata と Acropora cervicornis の 80％以上を死滅させました（Aronson & Precht, 2001）。これらの損失により、Acropora の両種は、米国絶滅危惧種法（Endangered Species Act）で絶滅危惧種に指定され（Guertin, 2014）、国際自然保護連合（IUCN）のレッドリスト（Aronson et al.
WBDは1970年代後半に同定され、当初は、コロニーの中央から枝に向かって進行する組織壊死と組織剥落のラインとして記述され、裸の骨格を残し、すぐに芝藻類がコロニーを形成する（Gladfelterら、1977；Gladfelter、1982）。当時から細菌性であることが疑われていたが、現在ではカリブ海全域で発生している病害の情報をもとに、その病因を解明している（Gil-Agudelo, Smith & Weil, 2006; Williams & Miller, 2005）。しかし、WBD Type I & II、急速組織喪失、シャットダウン反応など、少なくとも4つの急性組織喪失症が報告されており、これらはすべて類似した病徴を示すことから、現在の発生状況を説明することは困難である。
WBDは1970年代から存在していたが、潜在的な病原体の特定は困難であった。長い間、Vibrio charchariae/harveyi (WBD Type II, Ritchie & Smith, 1998)、Bacillus sp.、Lactobacillus suebicus (Sweet, Croquer & Bythell, 2014)、Rickettsiales目の細菌(Gignoux-Wolfsohn & Vollmer, 2015)など、いくつかの病原体候補が示唆されてきた。しかし、最近の研究、特に次世代シーケンシング法の出現と普及以降の研究から、他のサンゴの病気と同様に、WBD は単一の病原体が病気の原因であることを示すコッホとヒルの基本定説に従っていない可能性が示唆されています (Sweet & Bulling, 2017); (Vega Thurber et al., 2020)。その代わりに、多くのサンゴの病気と同様に、WBD は多細菌性（Sweet, Croquer & Bythell, 2014）、または繊毛虫との共感染（Verde, Bastidas & Croquer, 2016）である可能性があり、この病気はおそらく病原体、つまり病気を引き起こす微生物の表現型によって最もよく特徴付けられることを示唆しています（Sweet & Bulling, 2017）。感染研究と調査によると、WBD コンソーシアには Rickettsiales 目、Vibrionales 目、Alteromonadales 目、Flavobacteriales 目の細菌分類群が含まれ、これらは場所や環境条件によって異なることが示唆されています (Gignoux-Wolfsohn & Vollmer, 2015; Certner et al., 2017; Rosales et al., 2019)。
WBD やその他のサンゴの病気では、病変の隣に病気の微生物シグニチャーが見られることがある（Pantos & Bythell, 2006; Meyer et al., 2016; Meyer et al., 2019; Gignoux-Wolfsohn, Aronson & Vollmer, 2017）。しかし、健康な組織や病気の組織とは異なる、過渡的な群集として組織の非病気の部分に存在することもある（例えば、太平洋やカリブ海のトビケラ病において；Pollockら、2016；Pantos & Bythell、2006）。さらに、健康なコロニーであっても、病原体（または病原体）が水媒性である場合は特に、大発生時に病原体や早期警告サインを保有している可能性があります（Gignoux-Wolfsohn, Marks & Vollmer, 2012）。新たに報告されたストーニーコーラルの組織喪失病の発生も、このパターンを示している（Rosales et al.）しかし、サンゴのマイクロバイオームをモニターする研究はほとんどなく、病気が迫っていることを示す視覚的な指標もないことが多いため、病気が集団に影響を及ぼす前にサンプリングすることはまれです。そのため、WBD やその他の急性組織喪失症を理解するためには、サンゴのコロニー全体における病気とマイクロバイオームの経時的な変化を明らかにすることが重要です。
サンゴのコロニーの健康状態やコロニーに関連するマイクロバイオームをモニタリングすることは、サンゴの苗床の存在により、ますます現実的になってきています。サンゴの個体数を回復させるために、カリブ海の多くの組織では、コロニーを分断してサンゴを繁殖させ、海洋の養殖場で成長させた後、劣化したサンゴ礁に移植するというコーラルガーデニングアプローチを採用しています（Johnson, Lustic & Bartel, 2011）。野生のサンゴと同様に、養殖場のサンゴも暑さ、富栄養化、悪天候、病気などのストレス要因にさらされています（Johnson, Lustic & Bartel, 2011; Young, Schopmeyer & Lirman, 2012; Rosales et al.）飼育場は、病気を研究する上で理想的な環境を提供し、飼育されたサンゴの歴史的な情報は、野生の個体群における初期の病気発生時に見逃された疫学的な手がかりを特定するのに役立ちます。
私たちは、ケイマン諸島のリトルケイマンにあるサンゴの養殖場で飼育されていた A. cervicornis の個体群に発生した WBD の初期の微生物学的特徴を明らかにしました。この病害は、サンゴの先端に向かって進行する真っ白な骨格の帯として現れ、そこでは組織の剥離が盛んで、白い骨格には藻類が繁殖していた。病気がコロニー内やコロニー間の微生物群集にどのような影響を与えるかを理解するため、発生初期に、健康なサンゴのコロニー（目視で病気の兆候がない）、病気にかかったサンゴの病変部、病気にかかったサンゴの見かけ上健康な組織に関連する細菌群集の違いを明らかにした。サンゴの微生物群集は、健康なサンゴと病気のサンゴで異なることが多いため（Sunagawa et al., 2009; Ushijima et al., 2012; Arotsker et al., 2015; Rosales et al. その結果、(1) 健全なサンプルと比較して細菌の多様性と群集組成に違いがない、(2) 疾患のサンプルと比較して多様性と群集組成に違いがない、(3) 健全なサンゴから症状のある疾患サンゴに移行する際に中間的な群集を示す、のいずれかを示すと予想した。さらに、病気の発生前と発生中の健康なAcropora cervicornisのマイクロバイオームの変動や安定性を把握するために、2019年の健康なサンゴコロニーの微生物群集組成と多様性を、すべてのコロニーが健康だった2017年のサンプルと比較した。
材料と方法
ナーサリー
サンプルは、CI のリトルケイマンにある中央カリブ海海洋研究所（CCMI）の水深 18m のサンゴの苗床で採取した。サンプル採取は、2019 年に Anya Brown（粘液採取）、2018～2020 年に Carrie Manfrino と Thomas Frazer（継続中のサンゴ育苗場許可）がケイマン諸島環境局から承認された許可の下で完了した。ワシントン条約の輸出許可は2019年5月に承認番号2019/KY/001011で承認された。サンゴの苗床には5つの異なるサンゴの遺伝子型があり、苗床では色のついたビーズ（黒、青、緑、赤、黄）で区別されていた。遺伝子型の指定は、2016 年に採取されたオリジナルのドナーコロニーに基づいている（Drury et al., 2017; Maneval et al., 2021）。断片は1.5 m×3 mのPVCフレームに吊り下げ、底質から約1 mの高さに設置した（Maneval et al.）フレームは砂地の溝内に約1 m間隔で設置した。各フレームには、同じ遺伝子型のサンゴのコロニー（約 30 個）を入れた。
サンプル採集-2019
病徴は2019年5月初旬に始まり、7月にピークを迎えた（Brown et al.）発症直後にサンゴの微生物群集をサンプリングしたところ、苗床全体のサンゴの一部だけが病気の兆候を示した。2019 年 5 月 16 日に、健全なサンゴ 10 個体と発病したサンゴ 10 個体のサンプルを、保育所全体の個体群から採取した。滅菌した 20 ml の無針注射器を用いてサンゴの表面（粘液と一部の組織）を採取した。各組織のサンプルは、まず注射器の先端でサンゴの表面を軽く攪拌し、分泌されたサンゴの粘液を採取しました。健康なサンゴの場合、微生物群集は健康な A. cervicornis コロニー全体で類似しているため（Miller et al. 病変のあるコロニーでは、2 種類の組織を別々のシリンジで採取した。1 つは病変の前面に隣接する骨格組織（Disease）、もう 1 つは病変の前面から約 10 cm 離れた見かけ上健康な組織（Healthy）である（図 1B）。サンゴの微生物群集に影響を及ぼす可能性のある環境要因を考慮し、サンゴをグループ（統計ブロック）に分けてサンプリングした。各グループ（n = 10 グループ）には、発病したサンゴのコロニーから採取した 2 つの組織サンプルと、同じ遺伝子型（図 1C など）の見た目に健康なコロニーから採取した 1 つの組織サンプルが含まれます。ここでサンプリングしたフレームを含む、苗床のレイアウトを示す完全な概略図は、Brownら（2022）に掲載されている。2019年のコロニーは、苗床サンゴ集団（黒2、青3、緑1、赤2、黄2）の病気に関連する微生物の変化の一般的な説明を提供するために、5つの遺伝子型にわたってサンプリングした。遺伝子型の違いを調べるためのサンプリングは行わず、大発生が始まったときに発病していたコロニーについて、育苗集団のサンゴの病気の特徴に注目しました。
図 1: CI のリトルケイマンにある Acropora cervicornis の代表的なコロニー。
(A) 健康なサンゴ（濃いオレンジ色の円）の粘液・組織スラリーサンプルは、病気や組織の減少の目視的兆候が見られないサンゴコロニーで無造作に採取された。(B) 2019 年に保育所で飼育された A. cervicornis のサンゴ粘液・組織スラリーの病気（灰色丸）と明らかに健康（薄いオレンジ丸）のサンプリング地点。病気は、生きたサンゴ組織に隣接して、サンゴの骨格が露出している明瞭な白い帯を示している。病変から 10 cm 離れた同じサンゴのコロニーで、明らかに健康なサンプルを選んだ。(C)グループ内のコロニーのサンプリング（1 つのフレームから全処理を行ったサンプル）を図にしたもの。各フレームは1つの遺伝子型のコロニーで構成されている。この研究では、同じフレームからサンプリングされたコロニーは、2019年のすべてのサンプルで同じ遺伝子型であった。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-1
サンプル収集-2017
この病気の2年前に、苗床内のいくつかのコロニーから微生物サンプルが採取された（そして遺伝子型が再現された）（Miller et al.）これらのサンプルは病気発生前に採取されたため、病気発生前後のこの集団の微生物群集を比較するまたとない機会に恵まれた。簡単に説明すると、2017 年 12 月に 3 種類の遺伝子型（緑 3 種、赤 3 種、黄 3 種）の目に見えて健康なサンゴを 9 個採取し、9 個すべてのコロニーを同じフレームで生育させたことを除き（図 1C）、今回の研究と同じ方法で処理した（Miller et al.）これらの健康なサンゴのコロニー（Healthy 2017）から、各コロニーから1つずつ、合計9つのサンプルを無作為に選び、2019年のHealthyコロニーと比較した（n = 9）。
サンプルの処理
サンゴ粘液サンプルの入ったシリンジはすべて、採取後に氷上に置き、CCMI に持ち帰った。粘液は各シリンジの底に沈殿させた後、2 ml の低温バイアル瓶に排出し、エッペンドルフ社製 Minispin 遠心分離機でペレット（約 0.2 µl）になるまで回転させた（最高速度で 5 分間）。余分な海水をデカントした後、1mlのRNAlater（Ambion, Austin, TX）を加え、ベンチで一晩放置した後、-20℃で凍結した。凍結したサンプルはフロリダ大学に移送し、サンプル処理と分析を行った。
研究室の準備
DNA抽出に先立ち、サンプルを10,000 gで5分間遠心分離し、マイクロピペットを用いてRNA水を除去した。DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen、メリーランド州ジャーマンタウン）を用いて、メーカーのプロトコールに従って粘液DNAを抽出した。抽出したDNAは、PCR増幅に先立ち、Denovix DS-11 FX +蛍光光度計（Denovix,Wilmington,DE）でDNA濃度をチェックした。
515Fプライマー(Parada, Needham & Fuhraman, 2016)と806RBプライマー(Apprill et al., 2015)を用いて、Earth microbiomeプロトコル(Gilbert, Jansson & Knight, 2014)に従って16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅した。各26.75 µlのPCR反応液には、12.5 µlのPhusion High-fidelity Master Mix（New England Biolabs, Ipswich, MA）、1.25 µlの5 µMの各プライマー、0.75 µlのジメチルスルホキシド（DMSO）、9 µlのPCRグレードの水、および2 µlのDNA鋳型が含まれていた。PCR増幅は以下の条件で行った： 94 °Cで3分間、94 °Cで45秒間、50 °Cで1分間、72 °Cで90秒間を35サイクル、72 °Cで10分間の最終伸長ステップ。トリプリケートPCR産物をMinElute PCR purification kit (Qiagen)で連結洗浄し、精製PCR産物の濃度をDenovixで定量した。各ライブラリーの合計240 ngをUniversity of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (RRID:SCR_019152)に提出し、Illumina MiSeqでペア150-bpリードでシーケンスした。
バイオインフォマティクスと統計
cutadapt v.1.8.1 (Martin, 2011)を用いて、生のシーケンスリードからプライマーとアダプターを除去した。品質管理、配列のマージ、ASV（amplicon sequence variants）の割り当てには、R 3.6.3（R Core Team）のDADA2パイプライン（バージョン1.16.0、Callahan et al.）リードは、以下のパラメータを使用して、各実行ごとに別々に品質フィルターした：filterAndTrim（fnFs、filtFs、fnRs、truncLen = c(150,150), maxN = 0, maxEE = (c(2,2), truncQ = 2, rm.phix = TRUE, compress = TRUE, multithread = TRUE））。Millerら（2020）の2019年サンプル（n = 30）と選択された2017年サンプル（n = 9）の配列は、完全なノイズ除去ASVを得るためにマージされた。2019年サンプルはBioProject PRJNA679809の下、NCBI SRAデータベースで入手可能であり、2017年サンプルはPRJNA308473で入手可能である（表S1）。ASVは正確な配列を提供し、1塩基対の変異を許容する（Callahan et al.）キメラを除去し、SILVA version 132 small subunit ribosomal RNA database (Yilmaz et al., 2014)を用いて配列変異に分類学を割り当てた。ASV、分類群、メタデータテーブルはphyloseq (McMurdie & Holmes, 2013)にインポートした。真核生物、葉緑体、またはミトコンドリアに分類された配列は、細菌および古細菌のコミュニティをさらに解析する前に削除された。
微生物の多様性の違いを調べるため、データセットに対して希少化曲線（ステップサイズ100）を行い（図S1）、希少化されていないデータについて、phyloseqで飽和したサンプルによる希少化曲線として、シャノン多様性指数と逆シンプソン指数を推定した（図S1）。シャノン多様性は希少な分類群に敏感であるのに対し、逆シンプソン指数は優占的な分類群に影響される（Alberdi & Gilbert, 2019）。
β多様性の違い（すなわちサンプル間のばらつき）を理解するために、ASVの相対存在量を用いてサンプル間のBray Curtis非類似度を計算した。次に、この行列を用いて、各サンプルからグループ（すなわち、処理内のレベル）の重心までの距離を推定することで、ベータ多様性の分散を推定した。この多変量分散の指標は、2019年サンプルについては組織タイプ（健康、疾患、および明らかに健康）、健康コロニーについては年（2017年対2019年）に基づいて、veganのbetadisper関数（Oksanen et al.
各アルファ多様性とベータ多様性の指標について、2019年の組織タイプ（健康、疾患、明らかに健康）と我々のブロック因子（グループ）を比較するために別々の線形モデルを使用した。モデルの残差をプロットし、正規性を視覚的に検定した。モデルが処理について有意（p < 0.05）であった場合、Tukey HSDポストホック検定を行い、処理におけるレベル間の有意差を決定した。2017年と2019年の健常サンプルについては、年をまたいで同じ遺伝子型を考慮するため、固定効果として（ブロック因子としての）遺伝子型と年を比較する線形モデルも用いた。
上述のBray-Curtis距離行列に基づき、ggplot2とggforceパッケージ（Wickham, 2016; Pedersen, 2022）を用いた主座標分析（PCoA）でデータを可視化することで、まず群集組成の違いを調べた。組織タイプに関連する微生物群集が有意に異なるかどうかを調べるため、vegan の adonis 関数（Oksanen et al. サンゴの健康状態（組織タイプ）を 999 の並べ替えで比較し、グループをブロック項（つまり層）として扱った。また、健康状態のみの Bray-Curtis 非類似度行列を PERMANOVA で解析し、年をまたいで比較し、遺伝子型をブロッキング項として含めることで、年をまたいだ健康なサンゴの違いを検証しました。
どの分類群が処理間の違いをもたらしたかを理解するために、細菌の ASV に基づく群集分析（ANCOM）（Mandal et al., 2015）と DESeq2（Love, Huber & Anders, 2014）という 2 つの現存量差分アプローチを用いました。ANCOMを使用して、2つ以上のレベル（2019年の健康状態）を持つ処理を比較した。ANCOMは、Aitchisonの対数比を使用して、分類群を反復的に比較する。テストされた属の総数の90%以上のW統計量は、0.05のアルファレベルで考慮された。DESeq2は小さなサンプルに対してより頑健である可能性があるため（Weiss et al., 2017）、HealthyサンプルとDiseaseサンプル（2019年から）、および年をまたいだHealthyサンプル（2017年と2019年）を比較するDESeq2解析を実行した。DESeq2では、生の配列カウントを使用して、サンプルのサイズ因子、または正規化因子を推定しました。効果量（log2倍比）および分散出力のNegative Binomial一般化線形モデルを使用して、どのASVが有意差をもって豊富に存在するかを計算するためにWald検定を使用しました。健全なサンプルを年度間で比較するため、優勢な ASV（リケッチア目）を除去し、健全なサンゴコロニーに関連する非優勢な ASV を比較しました。
結果
品質フィルタリングと葉緑体、真核生物、ミトコンドリア配列の除去後、サンプルあたりの配列数は1,127～232,727で、平均80,392でした（2017年のサンプルを含む、表S1）。シーケンスリードが800未満の2サンプルはデータ解析に使用されず、これにはHealthy 2019組織タイプ1サンプルとDisease組織タイプ1サンプルが含まれる。フィルタリングステップ後、合計37サンプルを得た： (Healthy 2017 n = 9、Healthy 2019 n = 9、 Apparently Healthy n = 10、Disease n = 9）。健常コロニーと明らかに健常な組織では、リケッチア目のASVの相対存在量が高かった（健常コロニーの平均存在量±se＝2019年56％±6％、2017年75％±6％、明らかに健常な組織＝60％±4％）。比較的、Disease組織ではRickettisalesの存在量が少なかった（平均存在量＝7％±6％；図2）。この目では1つの属が最も多かった： MD3-55（2017年の健常組織では75％、2019年の健常組織では56％、明らかに健常組織では60％、疾患組織では7％）。
図 2：2017 年と 2019 年に採取した A. cervicornis 粘液サンプルの細菌と古細菌の相対的な存在量を目レベルで表したもの。
各バーは異なるサンゴを表す。このプロットには、配列数が800を超えるサンプルと、相対存在量が0.5%を超えるASVのみが含まれている。2019年のサンプルには、「健康」、「健康らしい」、「病気」の組織タイプが含まれている。色はSILVAデータベースによって指定されたOrderを示す。健康な2017年と2019年のサンプルと2019年の明らかに健康なサンプルは、主にリケッチア目（太字）の高い相対的存在量により、細菌組成が類似しているように見える。疾患サンプルは、分類群の組成と存在量において、他のすべてのサンプルとは異なっているように見える。グラフのX軸は、各サンプルのブロッキンググループと遺伝子型の指定（赤、緑、黄、黒、青の色で示す）を示す。2017年のサンプルは、2019年とは異なるコロニー（およびグループ）から採取された。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-2
アルファ多様性
2019年の組織タイプ間（組織タイプ：F2,16＝3.26、p値＝0.06）、グループをブロック因子として含めた場合（フレームとサンゴの遺伝子型を考慮するため；グループ：F9,16＝1.3、p＝0.30）、またはグループを分析から外した場合（組織タイプ：F2,25＝2.933、p値＝0.07、図3A）、シャノン多様性に有意な差は観察されなかった。
図3：A. cervicornisの微生物群集のシャノン多様性と逆シンプソン多様性を、組織の種類と年に基づいて箱ひげ図にしたもの。
各ポイントは1つの組織サンプルを表す。色は組織の種類と年を表す。各ボックスプロットの中央のバーは多様性の中央値を表す。ひげは四分位数間の±1.5まで。(A）A.cervicornisの微生物群集のシャノン多様性は、組織の種類や年によって有意な差はなかった。(B）逆シンプソン指数は、各年の健康組織タイプ間では有意ではなかったが、2019年には組織処理タイプ間で有意差があった。疾患サンプルは2019年において、健常または健常と思われる組織タイプのいずれよりも高い逆シンプソン多様性を示した。Tukey HSD検定に基づく有意差（p < 0.05）を異なる文字で示す。2017年と2019年の健康サンプルは、いずれのアルファ多様性測定においても有意差はなかった。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-3
逆シンプソン指数を計算し、組織タイプ間の優性の違いを検証した。病気にかかっているサンゴは、健康なサンゴに比べて有意に高い逆シンプソン指数を示しました（逆シンプソン：組織タイプ： F2,16 = 7.63, p-value = 0.004; Tukey HSD: p = 0.016); および Apparently Healthy corals (Tukey HSD: p = 0.006) で、これらの組織サンプルは単一のグループに支配されていないことがわかった（図 3）。しかし、健康なサンゴと一見健康そうなサンゴの組織は、互いに差がなかった（Tukey HSD: p = 0.93）。グループ（ブロック効果）には有意差はなかった（逆シンプソン：グループ：F9,16＝1.65、p値＝0.18）。
2017年と2019年の健常組織において、シャノン多様性は年による有意差（シャノン多様性：年：F1,12＝2.79、p値＝0.12、図3A）やブロック因子による有意差（遺伝子型：F4,12＝0.2、p値＝0.94）は見られなかった。また、健康な組織タイプ間の逆シンプソン指数には、年による違いは見られなかった（逆シンプソン年：F1,12 = 1.08、p値 = 0.12、図3A）： F1,12=1.08、p値=0.32、図3B、遺伝子型： F4,12=0.33、p値=0.82）。
ベータ多様性の分散
疾患組織は健常組織よりも変動が大きいと予想されたが、健常組織よりも統計的に高いβ多様性分散を示さなかった（Tissue Type： F2,16=1.45、p値=0.26、グループ： F9,16=0.42、p値=0.91、図4Aおよび5）。また、Healthy サンプルでは、年ごとの分散に有意な差は認められず（F1,12 = 1.25, p = 0.28、図 4B）、Healthy サンゴの遺伝子型間の分散にも有意な差は認められなかった（F4,12 = 2.8, p = 0.07）。
図 4：A. cervicornis サンプルの 2019 年組織型と健全組織におけるベータ多様性の分散。
β多様性（分散）を測定し、2019年の（A）健康、明らかに健康、病気のサンプルと、（B）年をまたいだ健康なサンゴについてプロットした。各ポイントは、処理内の各サンプルのセントロイド値までの距離を表す。各プロットの中央のバーは、各サンプルタイプのセントロイドまでの距離の中央値を表す。各ボックスプロットの上端と下端は、それぞれデータセットの上限と下限を表す。微生物の分散は、（A）2019年の組織処理タイプ間、または（B）健康組織間で、年をまたいでも有意差はなかった。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-4
図5：2017年と2019年の組織タイプのA. cervicornis微生物群集の主座標分析（PCoA）。
各サンプルにおけるASVの相対的存在量に関するブレイカーチス非類似度に基づく主座標分析。各ポイントは個々のサンゴ粘液サンプルを表す。楕円の色は組織タイプと年、点の形は遺伝子型を表す。楕円は ggplot の geom_mark_ellipse() 関数を使用して作成しました。点が近ければ近いほど、より類似したコミュニティを示す。病害サンゴの組織は一般的にまとまっており（左上の楕円）、病害サンゴのサンプルは互いに類似しているが、健全なサンゴや健全と思われるサンゴとは異なっている。健全なサンゴと健全と思われるサンゴは、互いに近い場所に集まっている。PERMANOVA の結果から、2019 年の疾患組織は健康組織と異なることが示唆された。PERMANOVAの結果、年度間では、健康な組織に違いはなく（p値=0.119）、遺伝子型にも違いはない（p値=0.11）。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-5
組成の違い
微生物群集は組織の種類によって異なっていた（PERMANOVA：p値＝0.001、R2＝0.35、図5）。疾患組織サンプルは、健常組織サンプルや明らかに健常な組織サンプルよりも互いに類似していた（図5）。健康な2019年、健康な2017年、明らかに健康な組織サンプルは、互いにほとんど差異を示さなかった（図5）。しかし、PCoA軸1（説明された変動の40％）では、健康なサンゴのマイクロバイオームと関連する分化が観察された。これは、健康状態（Healthy と Apparently Healthy）および遺伝子型との相互作用によるもので、このデータセットでは解決できなかった（図 S2）。
DESeq2の結果、健常組織と疾患組織で発現量の異なる214のASVが示唆された（表S2）。これらの細菌分類群のいくつかは、Vibrio（Vibrionales）、Algicola（Alteromonadales）、Flavobacteriales、Thalassobius（Rhodobacterales）、Leisingera（Rhodobacterales）、およびCytophagalesの未分類属を含む、健康な2019組織型と比較して疾患サンプルで高い存在量を示した（91 ASV、図6、表S2）。その他はDiseaseと比較してHealthy 2019（123 ASV）の組織で濃縮されていた： MD3-55（Rickettsiales）、HIMB11（Rhodobacterales）、Vibrio（Vibrionales）、Francisellaceae（Flancisellales）、Alphaproteobacteriaの未分類属、Litoricola（Oceanospirillaes）、Candidatus Actinomarina（Actinomarinales）。ANCOMの結果も同じパターンを反映しており、健常コロニーで有意に濃縮された分類群は、疾患コロニーと比較して健常コロニーでも濃縮されていることが示された（図S3、表S3）。
図6：2019サンプルについて、DiseaseとHealthyの組織タイプで有意に豊富なASVを選択した。
各ポイントは、DESeq2解析によると、Diseased組織またはHealthy組織（健康なコロニー由来）のいずれかで有意に差次的に豊富であったASVを表す。点の色は異なる組織タイプを表しています。有意に濃縮されたASVは合計214個あった（表S2）。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-6
健康なサンゴの中で、群集は2017年と2019年の間で有意な差はなかった（PERMANOVA：p値＝0.078、R2＝0.123、図5）。これは、健康な組織タイプに共通するリケッチア類の相対存在量が高いためと考えられる。Rickettsialesを解析から除外した場合、DeSeq2は13の異なる存在量のASVを示した（図S4、表S4）。これらの違いは、単にこれらの稀な分類群における確率的な違いによるものかもしれない。
考察
サンゴは病気によって世界的に減少しています。私たちは、CI のリトルケイマンにある海洋サンゴの養殖場で、白色バンド病が発生する前と発生中の A. cervicornis のマイクロバイオームをサンプリングするユニークな機会を得ました。その結果、健全な組織と健全と思われる組織の微生物群集は、病変に関連した組織の群集とは著しく異なっており、病変の組織では、WBD や他のサンゴの病気と一致した微生物群集が観察された。また、発生前と発生中（2 つの時点）では、健全組織と関連する群集の一貫性が示唆された。
組織タイプによるシャノン多様性の違いはほとんど見られませんでしたが、健康な組織タイプに比べて、病気のサンゴでは逆シンプソン指数の値が高いことが分かりました。このことは、組織タイプ間で分類群の数が同程度であることを示唆していますが、分類群の均等性が組織タイプ間の差異を生み出しています。実際、すべての健康な組織タイプ（2017 年の健康な組織、2019 年の健康な組織、2019 年の明らかに健康な組織）では、リケッチア属の相対的な存在量が高かったが、これらの分類群は病気のサンゴではほとんど存在しないか、相対的な存在量が大幅に減少した。
また、いくつかの細菌群は健康な組織と比較して病気の組織で増加しており（図 6）、サンゴの病原生物群の一部である可能性が示唆された。これらの分類群の中には、他のサンゴや無脊椎動物の病気に関与しているものもあり、Vibrionales、 Alteromonadales、Rhodobacterales、Cytophagales（Baker-Austin 他、2018 年、Guibert 他、2020 年、Welsh 他、2017 年）など、病原体形成に寄与する推定病原体コンソーシアムの候補である可能性が高い。Vibrionales 目と Alteromonadales 目は、拮抗性のガンマプロテオバクテリアのグループで、以前、病気になったサンゴで相対的に高い量が発見されたことがある（Rypien, Ward & Azam, 2010; Arotsker et al.）また、Algicola は、石サンゴ組織喪失症（SCTLD）の病変部により多く生息していることが観察されている（Meyer et al.）さらに、フロリダ州環境保護局の報告書では、SCTLD の推定病原体として、今回発見した Leisingera (Rhodobacterales) が特定されている。Leisingera sp. McT4-56 株は単離され、サンゴのプロバイオティクス候補に対する試験に利用されている（Paul et al., 2021; Deutsch et al.）さらに、Montastraea cavernosa のサンゴに病原性 V. coralliilyticus を接種したところ、Vibrionales、 Rhodobacterales、Cytophagales の平均相対存在量も増加しました。Cytophagales と Rhodobacterales の ASV は日和見主義者であることが示唆されました（Welsh et al.）
ビブリオは、疾患組織型において病因となりうる病原体である。Disease サンプルで最も多く見られたビブリオ属の ASV は、V. harveyi と V. parahaemolyticus で（NCBI BLAST の結果に基づく）、両種とも Harveyi クレードに属し、WBD タイプ II を含むいくつかのサンゴの病気（Gil-Agudelo, Smith & Weil, 2006; Luna et al. Algicolaと同様にVibrioも、組織の種類や年によって一貫して見られたが（図S3参照）、疾病組織では健常組織や一見健常組織よりも存在量が有意に高かった。これらの生物は、比較的低存在量であっても、明らかに健全な組織と健全な組織に存在することから、将来的に微生物が不安定になる兆候、および／またはサンゴ全体（目に見える病変がある部分とない部分）が損なわれている可能性（Egan & Gardiner, 2016; Kemp et al.
しかし、ビブリオや病気に関連する分類群が病気の原因ではなく、病気の結果である可能性もあります。これらの病気に関連する分類群は、サンゴのマイクロバイオーム全体に比較的少ない量で存在し（Raina et al., 2009; Rypien, Ward & Azam, 2010; Peixoto et al., 2017）、病気の進行中に栄養分や代謝産物組成の変化により開花するかもしれません（Gignoux-Wolfsohn & Vollmer, 2015; Sweet & Bulling, 2017; Xue et al.） Tenacibaculum（Flavobacteriales）、Thalassobius（Rhodobacterales）、Thalassolituus（Oceanospirillales）、Aestuariibacter（Alteromonadales）、およびArcobacter（Campylobacterales）を含む追加のグループが、本研究では疾患組織でより高い相対的存在量で見つかった。これらの分類群の中には、石サンゴ組織欠損症やイエローバンド病など、サンゴの病気と一貫して関連しているものもあります（図 7）。また、これらの分類群は、病気の一般的な指標となることが示唆され、病気の原因物質としての役割と二次的な役割を理解するために、さらに研究を進める必要があります。
図7：疾患の比較表。
図 7: 病気の比較表サンゴの病気に関する他の 7 つの研究と、私たちの研究で得られた細菌群を比較しました。この表は 4 つの病気の特徴を示しており、私たちの研究と共通する細菌目は、目の名前の横にアスタリスクを付けて示しています。
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DOI: 10.7717/peerj.15170/fig-7
組織タイプ間の最も顕著な違いは、疾患組織におけるMD3-55の減少と、健常組織におけるMD3-55の豊富さである。MD3-55属に関連するASVは、細胞内寄生虫として記載されているCandidatus Aquarickettsia rowheriに酷似または同一である（Klingesら、2019；Klingesら、2020）。ここでも他の場所でも、健康なアクロポラサンゴと病気になったアクロポラサンゴ（および遺伝子型）の両方のサンプルからリケッチア属菌が報告されており、リケッチア属菌が厳密には病原体であるとは考えにくい（Godoy-Vitorino et al.）しかし、リケッチア属を多く含むサンゴの遺伝子型は WBD にかかりやすく（Klinges 他、2020 年）、WBD の発症や進行に寄与する可能性があるという証拠もある（Gignoux-Wolfsohn 他、2020 年）。今回はこの仮説を検証しませんでしたが、以前の研究では、この属の相対量が同様に高い健康なサンゴの間で、 ASV の組成はサンゴの遺伝子型によって異なることが示されています（Miller et al.）また、この微生物属は、存在量に地域差があることも示されている（Baker et al., 2022）。従って、今回の結果と他の研究から、（相互に排他的ではないが）次の 2 つの仮説が考えられる。(1)すべての健康なサンゴで Ca. Aquarickettsia の相対的な存在量が高いため、この分類群体が病気感受性の指標であるとすれば、今回の研究結果は、すべての遺伝子型が病気にかかりやすいことを示唆している。リケッチア属、特に Ca. Aquarickettsia 属の健康なサンゴにおける機能的役割を解明するには、さらなる研究が必要である。アクアリケッチア属は、健康なアクロポラサンゴにおいて機能的な役割を果たしている。
興味深いことに、2017年と2019年のCCMIナーサリーにおいて、明らかに健全な組織と健全な組織の微生物群集が驚くほど類似していることがわかった。リケッチア属のCa. Aquarickettsia 属の Rickettsiales が優勢であったため、Healthy および Apparently Healthy 組織のマイクロバイオームは、サンプリングした 2 年間を通じて概ね安定していた。アクロポラサンゴの宿主は、他のサンゴ属よりも微生物群集をコントロールすることが知られているため、病気で混乱するまではマイクロバイオームの一貫性が期待される（Dunphy et al. これらのサンゴでは、以前に示された遺伝子型による有意な変動は見られませんでした（Miller et al.）これは、遺伝子型間のサンプルサイズが小さかったため、および/または、病気による変動が健康なサンゴの遺伝子型に起因する変動よりも大きかったためと考えられます（すなわち、図 5）。他の研究者が発見したように、遺伝子型と健康なサンゴの微生物相の間に相互作用がある可能性がありますが（図 S2）、ここでは検証していないため、さらなる研究が必要です（Miller et al.）これらの結果から、病気の指標となる微生物の多くは、一時的に病気の病巣に局在し、一般的に、健全なサンゴ群集は長期的に安定していることが分かりました。このような全体的なパターンから、サンゴが病気に罹患しても、病変部から断片化された健全な組織であれば、病気から救われる可能性があることが示唆されました（Miller et al. 今後、健全なコロニーのサンゴ（と微生物）の運命を長期的に追跡することで、発病するコロニーと発病しないコロニーがある理由をより深く理解できるようになるでしょう。
結論
私たちは、サンゴの健康と病気におけるサンゴマイクロバイオームとパソバイオームの複雑さを浮き彫りにしました。ビブリオ属のような推定病原体を含む、疾患サンプルで一貫して濃縮される微生物分類群を示した。他の多くのサンゴの病気と同様に、WBD や他の急性組織損失症候群の原因として単一の推定病原体は特定されていません（Sweet, Croquer & Bythell, 2014; Gignoux-Wolfsohn & Vollmer, 2015）。他の WBD 研究（Lesser et al., 2007; Sweet, Croquer & Bythell, 2014; Gignoux-Wolfsohn & Vollmer, 2015）と一致し、WBD は多細菌性である可能性が示唆された。ケイマン諸島の Acropora cervicornis で、ビブリオや他の病気に関連する分類群が最終的にサンゴ粘液の病原体に寄与し、最終的に病気につながるかどうかを特定するには、感染症調査などのさらなる研究が必要である。
健康な組織の微生物群集は、発病の前後で一貫しており、明らかに健康な組織と違いはなかった。このパターンは、リケッチア属Ca. Aquarickettsia 属の相対的な存在量が高いことで、全ての健常組織で見られ、先行研究（Klinges 他、2020；Aguirre 他、2022；Williams 他、2022）と一致した。この分類群は健全なサンゴと関連しており、A. cervicornis のマイクロバイオームとサンゴの健全性におけるリケッチア属の役割を解明するために、さらに研究を進める必要がある。健全と思われる組織と健全なコロニーに関連する分類群に明確な違いは見られなかったことから、病気のある組織を除去することが、養殖場での病気の軽減につながる可能性があるが、大規模な実施にはさらなる研究が必要である。
カリブ海全域でアカホシサンゴの個体数が大幅に減少していることから、サンゴの苗床の設置や回復プログラムが推進されています（Lirman & Schopmeyer, 2016; Schopmeyer et al.）アクロポラサンゴは成長が早く、海洋生態系にとって重要であるため、カリブ海では多くの回復活動の焦点となっており、保育所や回復現場から多くの研究が始まっています（Miller et al.）サンゴの養殖場は、多くの場合、遺伝子型が分かっているサンゴの個体群を、ライフステージを通じて、時間をかけて追跡・観察できるという点でユニークです。サンゴの微生物マーカーを追跡することは、病気などの環境変動に対するサンゴの反応を理解する上で特に重要です。サンゴの病気を効果的に管理するためのツールはほとんど開発されていません。もし微生物が病気への抵抗性に大きく寄与しているのであれば、これらのサンゴは回復努力に活用され、移植や生存率を向上させる可能性があります（Schopmeyer et al., 2012; Rosales et al.）今回の結果は、サンゴの病気は多細菌性であるとする多くの文献に追加するもので、ケイマン諸島の白帯病に関連するマイクロバイオームについて初めて記述したものです。私たちの研究は、健全な微生物群集と病気の微生物群集に関する基礎的な知識を拡張するものであり、アカロポラサンゴの病気の動態を理解し、サンゴ保全における病気への抵抗力と回復力のための将来の緩和戦略を開発するために利用できる。
補足情報
希薄化曲線
各線は異なるサンプルを示す。私たちのデータでは、各線（サンプル）は飽和を示しており、このデータセットで豊かさを捉えたことを示しています。レアファクション曲線はvegan (Oksanen et al., 2020)でステップ（例：ステップごとに追加されるリード数）を200に等しくして作成した。
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-1
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DADA2とphyloseqを用いたASVの品質フィルタリング
サンプル名と関連するメタデータ（quality filtered reads、サンプルあたりの配列数など）。
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-2
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各処理および各年の各サンプルのグループ別PCoA
各サンプルの各ASVの相対的な存在量からブレイカーティスの非類似度をPCoAで表したもの。各ポイントはサンゴ組織サンプルを表し、形は組織タイプ（サンゴの健康状態）、年とファセットはグループを表す。グループは、同じフレームに同じ遺伝子型のサンゴが含まれることで定義され、各グラフの上部にグループが記されている。楕円と色は遺伝子型に基づく。
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-3
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ANCOMの結果に基づいて有意に異なる属の相対存在量。データはDeSeq解析との整合性を示す。
ANCOM解析によると、疾患発生時に組織タイプによって有意差のあった特定のASVの平均相対存在量±SE（小さいプロットではY軸のスケールが異なることに注意）。点は個々のASVを表し、各小区画は属および科ごとにグループ化されている。点の色は異なる組織タイプを表し、各小プロットの凡例に示された順序で並んでいる。Vibrio、Thalassotalea、Thalassolituus、Catenococcus、Flavobacteriales（分類学的に最も低いレベル）およびAlgicolaは、疾患サンプルにおける相対的存在量が高い。Candidatus Aquarickettsia rohweri（MD3-55）およびいくつかの一般的な海水微生物は、健常検体および健常と思われる検体の両方で相対存在量が高い。ANCOMの全結果は表S3にある。
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-4
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リケッチアを含まない健康な2017年と健康な2019年の組織タイプで有意に存在量の差があったASV
各ポイントは、DESeq2解析に従って、Healthy 2017組織またはHealthy 2019組織のいずれかで有意に差次的に豊富であったASVを表す。リケッチア目（Order Rickettsiales）は、発現量の少ないグループを見るために解析から除外した。点の色は異なる組織タイプを表す。合計13のASVが有意に濃縮された（表S5）。
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-5
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健康2019 VS 疾患2019のDeSeq2解析
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-6
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2019年サンプルの90%カットオフのANCOM結果明らかに健康、健常、疾患の比較
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-7
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リケッチア属を含まないDeSeq2解析健康な2017年と健康な2019年の比較
DOI: 10.7717/peerj.15170/supp-8
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追加情報および宣言
競合利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
著者貢献
Monica D. Schulは実験を行い、データを分析し、図表を作成し、論文の草稿を執筆または査読し、最終原稿を承認した。
Dagny-Elise Anastasiousは実験を行い、論文の草稿を執筆または査読し、最終原稿を承認した。
Lindsay J. Spiersは実験を行い、論文の草稿を執筆または査読し、最終稿を承認した。
Julie L. Meyerは、実験の着想と設計、論文の執筆または草稿の査読、最終稿の承認を行った。
Thomas K. Frazerは、実験の着想と設計、論文の執筆または草稿の査読、最終稿の承認を行った。
アーニャ・L・ブラウン（Anya L. Brown）：実験の着想と設計、実験の実施、データの分析、図表の作成、論文の執筆または査読、最終稿の承認。
フィールド調査の許可
以下の情報は、フィールド研究の承認（すなわち、承認機関および参照番号）に関するものである：
この作業は、2019年にAnya Brown（粘液サンプリング）、2018～2020年にCarrie ManfrinoとThomas Frazer（進行中のサンゴの養育許可）、2019年5月に承認されたワシントン条約輸出許可証について、ケイマン諸島環境局から承認された許可の下で完了した。
データの入手可能性
データの入手可能性については、以下の情報が提供された：
コードは GitHub と Zenodo で入手可能：
https://github.com/anyabrown/SchulDiseaseAcervicornis。
アーニャ・ブラウン (2023). anyabrown/SchulDiseaseAcervicornis: Schul PeerJ 2023 (Version Schul2023). https://doi.org/10.5281/zenodo.7802849。
2019年のサンプルはNCBI BioProjectで入手可能： PRJNA679809。
資金提供
本研究はDart Foundation、Disney Conservation Grant、John J and Katherine C. Ewel Fellowshipから資金を得た。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。
謝辞
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IDDF2021-ABS-0069 潰瘍性大腸炎（UC）における糞便マイクロバイオームの生態学的解析とネットワーク解析
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IDDF2023-ABS-0249 頭頸部癌における口腔咽頭異常症の意義：口腔マイクロバイオームと化学放射線関連合併症
Dheeraj Pandeyほか、Gut誌、2023年
pos0021 結合組織病における腸内細菌叢の変化とリンパ球サブセットおよびサイトカインとの関係
J. Q. Zhangら、Ann Rheum Dis誌、2022年
分娩内抗生物質の乳児消化管マイクロバイオームへの影響：ナラティブレビュー
Laura Diamondら、Archives of Disease in Childhood誌、2022年
マイクロバイオームと小児腸疾患
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