創傷多発性菌感染症における黄色ブドウ球菌の抗菌薬感受性に影響を及ぼす正確な空間構造

哉百名


創傷多発性菌感染症における黄色ブドウ球菌の抗菌薬感受性に影響を及ぼす正確な空間構造
Carolyn B. Ibberson https://orcid.org/0000-0002-1696-1952 carolyn.ibberson@ou.edu, Juan P. Barraza https://orcid.org/0000-0001-7057-2598, Avery L. Holmes https://orcid.org/0000-0002-4942-6614, +1, and Marvin Whiteley mwhiteley3@gatech.eduAuthors Info & Affiliations
Edited by Dianne Newman, California Institute of Technology, Pasadena, CA; received July 19, 2022; accepted October 14, 2022
2022年12月15日
119 (51) e2212340119
https://doi.org/10.1073/pnas.2212340119

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感染症における微生物の相互作用は、生物地理学的な背景を欠くことが多く、コミュニティ機能の理解に限界がある。我々は、マウス慢性創傷モデルを用いて、緑膿菌と黄色ブドウ球菌の単独感染および共感染の空間構造をマクロおよびミクロスケールで明らかにした。その結果、慢性創傷では、これらの細菌が高密度に共存し、パッチ状に分布していることを発見した。さらに、正確な空間構造を定量化し、細菌量とは異なり、空間構造は創傷内の位置によって決まり、緑膿菌の分泌する抗菌剤に依存することを明らかにした。重要なことは、空間構造の乱れが黄色ブドウ球菌の抗生物質耐性を変化させることであった。本研究は、多剤耐性菌感染における空間構造の形成に微生物間相互作用が重要であることを明らかにし、抗菌薬効果の重要な決定要因として生物地理学が関与していることを示唆するものである。
要旨
微生物生態学の特徴は、群集のメンバー間の相互作用が群集の機能を形成することである。これには、慢性創傷などのヒト感染症における微生物群集も含まれ、相互作用によってより深刻な疾病が引き起こされる可能性がある。黄色ブドウ球菌は、ヒトの慢性創傷感染症から最もよく分離される菌であり、緑膿菌と協力的および競争的な相互作用があることが示されている。しかし、これらの微生物間の相互作用は、多くの研究にもかかわらず、感染環境を再現していないin vitroのウェルミックス系を用いて特徴づけられているのがほとんどである。本研究では、マウス慢性創傷における黄色ブドウ球菌と緑膿菌の相互作用を、マクロおよびミクロスケールの空間構造が疾患に果たす役割に着目して評価した。その結果、マウス創傷部では、黄色ブドウ球菌と緑膿菌が高い細胞密度で共存していることを発見した。高解像度イメージングにより、これらの微生物は創傷体積の5～25％しか占めないパッチ状の分布を形成していることが明らかになった。この空間構造は、緑膿菌が抗菌物質である2-ヘプチル-4-ヒドロキシキノリンN-オキシドを産生することによって、マクロスケール（mm）およびミクロスケール（μm）の両方で正確に確認され、抗菌物質のピロシアニンは影響しないことがわかった。最後に、この精密な空間構造が、アミノグリコシド系抗生物質に対する黄色ブドウ球菌の耐性を高めるが、バンコマイシンの耐性を高めることはないことを発見した。この結果は、黄色ブドウ球菌と緑膿菌が共存する創傷の生物地理学のメカニズムに迫るものであり、創傷感染における抗菌薬耐性の重要な決定因子として空間構造を示唆するものである。
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多剤耐性ヒト感染症は、人間の健康にとって大きな負担となっている。これらの感染症は、単一微生物による感染症と比較して、抗生物質に対する耐性が高く、臨床転帰が悪くなることが多い(1-7)。多菌感染症に特異的な性質は、しばしば微生物間で起こる相互作用に起因しており、これらの相互作用を特定し、機構的に理解するために多くの研究がなされてきた(8-12)。最近、前臨床感染モデルを用いて、微生物間の相互作用が感染コミュニティのミクロン単位の空間構造に影響を与えることが示され（13-16）、空間構造がコミュニティ機能、ひいては感染転帰を制御する重要な要素であることが示唆された（17）。しかし、多菌種間相互作用に関する我々の理解のほとんどは、in vitroモデルを用いた研究に由来している（13, 14）。そのため、感染動態の重要な要素や宿主因子の役割は見落とされがちである。
緑膿菌と黄色ブドウ球菌は、in vitroおよびin vivoの両方で、微生物間相互作用の研究によく用いられている（11, 13, 18-24）。これらの微生物は、慢性創傷や嚢胞性線維症患者の肺など、いくつかのヒトの多菌感染症で共存している（1-3, 5, 25-29）。ヒトの疾患の転帰に対する共存感染の影響については相反する証拠があり、緑膿菌単独では転帰が悪くなると結論づける研究がある一方（32-34）、緑膿菌-黄色ブドウ球菌の共存感染はより深刻な疾患を引き起こすと結論づける研究もある（35-37）。実験データはマウス感染モデルでより明確であり、共感染は抗生物質耐性の増加と感染転帰の悪化をもたらすことが示されている(8, 10, 20, 28)。このような相乗的な相互作用を制御するメカニズムは生体内ではほとんど不明であるが、ヒトの慢性創傷では緑膿菌と黄色ブドウ球菌が異なる領域を占めているという仮説があり（28）、バイオジェオグラフィーが多菌性創傷感染の転帰に関与している可能性が示唆されている。
本研究では、緑膿菌と黄色ブドウ球菌の単独感染および共感染したマウス慢性創傷の高解像度共焦点画像を100枚以上収集し、その画像を用いて、緑膿菌と黄色ブドウ球菌の感染経路を定量化した。これらの画像を用いて、生体内の緑膿菌および黄色ブドウ球菌の3次元的なマクロおよびミクロンスケールの空間構造を定量化し、既知の緑膿菌細胞外抗菌剤の空間構造に対する役割を定義した。その結果、マウス創傷感染において、黄色ブドウ球菌と緑膿菌は高い細菌密度で共存しているが、その分布は斑状であることを発見した。さらに、緑膿菌が分泌する低分子物質2-heptyl-4-hydroxyquinoline N-oxide（HQNO）に依存したミクロン単位の精密な空間構造を発見し、定量化した。この空間構造は創傷端と中心部で異なることを明らかにした。さらに、このような空間構造は、抗生物質耐性の変化など、臨床的に重要な結果をもたらすことも明らかにした。
結果
黄色ブドウ球菌と緑膿菌は、マウス手術創感染モデルで共存していた。
S. aureusとP. aeruginosaは、ヒトの創傷からよく分離される（3, 29, 38）。しかし、これらの微生物群集の空間構造や微生物間の相互作用が臨床的な感染予後にどのような影響を与えるかについては、ほとんど知られていない。この知見のギャップに対処するため、我々はマウスの手術創前臨床感染モデルを使用した（28）。このモデルでは、剃毛したマウスの背部から厚さ1.5cmの皮膚全面を外科的に切除し、その傷口に半透膜包帯を貼り、包帯の下で傷口に細菌接種物を局所的に投与する。私たちがこのモデルを選んだのにはいくつかの理由がある。このモデルは、3週間までモニターできる自己回復型の感染モデルであること、創傷部を容易に切除でき、微生物学的アッセイと共焦点イメージングを用いて直ちに研究できること、そして我々の研究室の最近の研究から、このモデルがヒト慢性感染症で観察される緑膿菌遺伝子発現シグネチャーを正確に再現していること（39）などがあげられる。
マウス手術創に市中感染型メチシリン耐性USA300黄色ブドウ球菌LAC株と緑膿菌PA14株を共感染させると、4日後にこれらの菌が同等かつ高い菌量（～109コロニー形成単位（CFU）/創）で共存した（Fig. 1A）. 黄色ブドウ球菌の同時感染数は単独感染時と同等であり（Fig. 1A）、同時感染は創傷内の黄色ブドウ球菌の体力に影響を与えないことが示された。しかし、緑膿菌の感染数は単感染時に比べて有意に少なかったが、その差は定量的には2.5倍程度であった。これらの知見は、dsRedまたはGFPをそれぞれ構成的に発現する黄色ブドウ球菌と緑膿菌を感染させた創傷において、共焦点顕微鏡で総バイオマスを評価することで確認した（図1 B、CおよびSI Appendix、図S1）。また、黄色ブドウ球菌LACと緑膿菌ヒト慢性創傷臨床分離株CW2-B1も同様に創傷内で共存しており、共存は緑膿菌PA14に特異的ではないことがわかった（SI Appendix, Fig.S2）。
図1.

S. aureusとP. aeruginosaはマウス手術創モデルで共存している。(A) 感染4日後のマウス慢性創傷における単独感染（開丸）および共感染（閉丸）の細菌量。使用した動物数は以下の通り。B）黄色ブドウ球菌または緑膿菌の単独感染（単感染、開丸）または同時感染（共感染、閉丸）したマウス創傷の共焦点顕微鏡による細菌バイオマスの測定。P値はMann-Whitney検定を用いて決定した。(C) 感染後4日目に黄色ブドウ球菌（赤、最初のパネル）または緑膿菌の単独感染（緑、2番目のパネル）または共感染（3番目のパネル）に感染したマウス創傷の共焦点顕微鏡写真。宿主細胞（青）は、マウント液中のNucBlueで染色した。
共同感染したマウス慢性創傷における緑膿菌の空間分布のマクロスケールでの違い。
最近の研究から、細菌量に加えて、感染の重症度と転帰に重要な寄与をするのは、細菌の空間的配置であることが示されている（15, 16）。この先行研究では、マウスの膿瘍感染やヒトの虫歯におけるミクロン単位の空間構造に焦点が当てられているが、ヒトの創傷における微生物も空間的に組織化されているという逸話的証拠がある（28）。このことを検証するために、まず、創傷を中心核と外縁の2つの領域に分割して、単感染または共感染の創傷における黄色ブドウ球菌と緑膿菌の空間組織を微生物マクロスケール（mmレベルの分解能）で評価した（Fig. 2A）。これは、各創傷の中心から10mmのパンチバイオプシーを採取し、中心核（パンチの内側）と治癒端（パンチの外側）の両方の細菌数を定量化することで達成された。黄色ブドウ球菌の分布は単独感染と共感染で差がなかったが、緑膿菌は共感染時の方がコアに低濃度で認められた（図2B、Mann-Whitney検定、P = 0.028）。さらに、傷口での単培養感染と比較して、共培養時のコアでのP. aeruginosaの割合のばらつきは少なかった。これらのデータは、黄色ブドウ球菌の存在によって緑膿菌が創傷の外縁に再局在化し、この空間構造が高度に保存されていることを示す。
図2.

マウス創傷における黄色ブドウ球菌と緑膿菌の生物学的分布と空間的分布の特徴。(A) マウス創傷の中心領域と周辺領域の図。(B）単独感染（開棒）または共感染（閉棒）創傷の中心部に認められた表面積で正規化した緑膿菌と黄色ブドウ球菌の合計CFUの割合（左縦軸）。各創傷の総細菌CFU（菱形）は右側の縦軸にプロットされている。統計的有意性はMann-Whitney検定で決定した。1条件につき4匹の動物を使用した。(C) 単感染（開放）および共感染（閉鎖）マウス慢性創傷のコアにおける各サイズビンの緑膿菌または黄色ブドウ球菌のオブジェクトの頻度。(D) 単感染（開放）創と共感染（閉鎖）創における総細菌バイオマスに対する浮遊細胞の寄与率。統計的有意性はStudentのt検定で決定した。(E) 黄色ブドウ球菌と緑膿菌に感染したマウス創傷の中心部（丸）または端部（三角）において，緑膿菌と黄色ブドウ球菌の占有率が最も高くなる距離として定義した濃縮距離（Enrichment distance）．(F) 黄色ブドウ球菌と緑膿菌に感染したマウス創傷の中心部（丸）または周辺部（三角）における細菌密度と濃縮距離の関係．R2は非線形ベストフィット線によって決定された。
感染したマウス慢性創傷における空間分布のミクロンスケールでの違い。
次に、高解像度共焦点顕微鏡を用いて、単独感染と共感染の創傷のミクロン単位の空間構造を評価した。まず、創傷の細菌蛍光を広く調査したところ、創傷体積の大部分は細菌によって占有されていないことが明らかになった。その代わりに、どちらの細菌もバイオマスの不均一な分布を示し、さまざまなサイズと存在量のパッチとして表された（SI Appendix, Fig.） 次に、共焦点画像を活用して、バクテリアが浮遊性（個体）細胞として存在するのか、凝集体（バイオフィルム）として存在するのかを判断した。浮遊性細菌と凝集性細菌は、宿主と微生物の相互作用や感染の結果を変える可能性のある、異なる表現型を持つことがよく知られているため、浮遊性細菌と凝集性細菌に注目した(40-41)。単感染および共感染の創傷の中心核と端部の共焦点画像を既報（13）と同様に解析し、プランクトン状（細胞体積<5μm3）および凝集体に存在する緑膿菌と黄色ブドウ球菌の数を定量した（Fig. 2C）。また、凝集体に存在する細胞は、以下の範囲でサイズ別に分類した。5〜10μm3、10〜100μm3、>100μm3。
図2Cは、コインフェクションで観察された黄色ブドウ球菌の物体（浮遊細胞と凝集体の両方を含む）の平均71％が浮遊細胞であり、これは、モノカルチャーで観察されたもの（47％、マン-ホイットニー検定P = 0.014）よりも高いことを示している。このプランクトン性細胞の増加は、最初の2つのサイズ範囲の凝集体の減少に伴って生じた。その結果，5～10μm3および10～100μm3のサイズ範囲の凝集体の相対頻度は，単感染では黄色ブドウ球菌がそれぞれ3％および4％であるのに対し，16％および31％と高かった（Mann-Whitney検定，P = 0.0001 および 0.014）．しかし、共感染の傷口では、より多くの黄色ブドウ球菌の浮遊細胞があったが、これらの細胞は傷口における黄色ブドウ球菌の総生物量のわずか1％程度であり（図2D）、単一感染および共感染の傷口では凝集体が優勢であることが示された。傷口の中心部や縁に存在する黄色ブドウ球菌については、浮遊菌の数や凝集体の大きさに違いは見られなかった。
緑膿菌の浮遊細胞数と凝集塊の数は、創傷の中心部と辺縁部で同程度であった（Fig. 2C）。黄色ブドウ球菌の場合と同様に，単独感染創と共感染創のいずれにおいても，緑膿菌浮遊細胞の数は凝集塊の数よりも多かった．しかし、緑膿菌の浮遊細胞は、黄色ブドウ球菌と比較して微生物バイオマスの大きな割合を占め、単独感染ではバイオマスの8％を占め、共感染では25％に増加した（図2D、Studentのt検定P = 0.04）。これらの結果から、緑膿菌は単独感染および共感染のいずれの傷口でも主に凝集体として存在する一方、浮遊性細胞も存在し、その数は黄色ブドウ球菌の存在下で増加することが明らかとなった。
創傷における緑膿菌と黄色ブドウ球菌の空間構造をさらに明らかにするために、私たちの研究室が最近開発した計算機によるアプローチを用いて、群集のミクロン単位の空間構造を定量化した(13)。この手法は、まず群集の中の1つの種に着目し、比例占有率（PO）を計算する。POは、ミクロン単位の3次元で、さまざまな距離間隔で、他の群集メンバーとの関係で、着目する種のすぐ周りの構成を定量化するものである。ここでは、緑膿菌を対象種とし、各画像についてランダムに選んだ緑膿菌ボクセル1000個に対する黄色ブドウ球菌のPOを計算した。この解析により、距離とPOの正の相関が明らかになり、in vitro嚢胞性線維症前臨床モデルを用いた我々の以前の研究結果（13）と同様に、活発な分離メカニズムが示唆された。このように、分離機構が活発であることを示す証拠が得られたので、次に、黄色ブドウ球菌の濃縮距離を計算した。ここで、濃縮距離とは、緑膿菌（焦点種）からの距離で、黄色ブドウ球菌のPOが最も高くなる距離と定義される。このように，濃縮距離は，緑膿菌に対して黄色ブドウ球菌のバイオマスが過剰に存在する場所を示している。緑膿菌と黄色ブドウ球菌の濃縮距離の中央値は、創傷中心部（20.4 ± 9.5 µm SEM）と創傷端部（24.5 ± 8.1 µm SEM）でほぼ同じであった（Fig. 2E）。次に、局所的な細菌密度と濃縮距離との間に関係があるかどうかを調べ、細菌密度が高い領域では細菌がより近くに集まっているという仮説を検証した。その結果、緑膿菌からの黄色ブドウ球菌の濃縮距離と細菌密度の増加の間に正の相関があることがわかった（Fig. 2F、非線形最適適合線R2 = 0.59）。これは、微生物群集の密度が増加すると群集の空間構造が変化し、高密度群集では緑膿菌と黄色ブドウ球菌がより分離することを示唆するものであった。
HQNOとピオシアニンは，マウス創傷における細菌の体力やマクロスケールでの空間分布に影響を与えない．
緑膿菌と黄色ブドウ球菌の相互作用の多くは敵対的であると考えられており，これらの相互作用は緑膿菌の分泌する分子を介することが示されてきた．抗菌活性を有する2つのP. aeruginosa分泌分子、ピロシアニンとHQNOは、in vitro共培養中のS. aureusの生理・体力に影響を与えることから、特に注目されている（13、42〜46）。これらの抗菌剤がP. aeruginosa-S. aureusの体力と空間構造に影響を与えるかどうかを調べるために、WT S. aureusとピロシアニンやHQNOを生産できない同系のP. aeruginosa変異体を傷口に共感染させた。ピロシアニン変異体Δphz1/2はphzA-Eオペロンを欠失したものであり，既にその特徴が明らかにされている(47)．HQNO変異体、P. aeruginosa ΔpqsLは、pqsLの欠失を含み、したがってHQNO生合成の最終段階が欠損している。この変異体は以前にも特徴づけられ(13)、創傷モデルにおけるΔpqsLとWT P. aeruginosaのトランスクリプトーム解析により、pqsLの欠失は周辺遺伝子に極影響を与えないことが明らかになった（SI Appendix, Table S2）。また、黄色ブドウ球菌とWT緑膿菌PA14または同系統変異体をマウスに共感染させた場合、菌数に差がないことを発見した（図3 A、B）。黄色ブドウ球菌と創傷分離株CW2-B1またはその同系統pqsL変異体の共感染でも同様の結果が得られた（SI Appendix, 図 S2）。また，S. aureusとP. aeruginosaのバイオマス全体に対する浮遊細胞の寄与を比較したところ，WT P. aeruginosa PA14または同系統の変異体を含むコインインフェクションでは差がなかった（Fig. 3C）．これらのデータは，HQNOとピロシアニンが，共感染創傷におけるS. aureusとP. aeruginosaの体力や増殖様式（浮遊性/凝集性）に影響を与えないことを示している．
図3.

HQNOとピロシアニンのマウス創傷における細菌フィットネスと空間分布への役割．(A) 野生型（黒），ΔpqsL（赤），Δphz1/2（青）の単独感染（開丸）および共感染（閉丸）における緑膿菌または黄色ブドウ球菌の傷口あたりのCFU。P値はMann-Whitney検定を用いて決定した。(B）緑膿菌WT（黒）、ΔpqsL（赤）、Δphz1/2（青）変異体の単独（開）または共感染（閉）の傷口の共焦点顕微鏡で測定した総バイオマス量。(C) 黄色ブドウ球菌および緑膿菌WT（黒）、ΔpqsL（赤）、Δphz1/2（青）変異体の単独感染（開）または共感染（閉）における傷口の総細菌量に寄与する浮遊性細胞の割合。(D)緑膿菌の黄色ブドウ球菌からの濃縮距離（単位：ミクロン）。傷の中心部から撮影した画像からの測定値を丸で示し、傷の端から撮影した画像を三角で示す。P値はスチューデントのt検定で決定した。(E）黄色ブドウ球菌と緑膿菌のWT（黒），ΔpqsL（赤），Δphz1/2（青）を共感染させたマウス創傷のコア（丸）またはエッジ（三角）における細菌密度と濃縮距離の関係．
HQNOはピオシアニンではなく創傷におけるS. aureusとP. aeruginosaのミクロンスケールの空間構造を変化させる。
次に，HQNOとピロシアニンが混合生物群集のミクロンスケールの空間構造に対して果たす役割を検証した．そのために、黄色ブドウ球菌と緑膿菌∆pqsLまたは∆phz1/2を共感染させた慢性創傷における緑膿菌からの黄色ブドウ球菌の濃縮距離を算出し、WT緑膿菌との共感染と比較した（図3D、SI Appendix、図S1）。緑膿菌∆pqsLとの共感染は、WT緑膿菌との共感染（22.2 ± 2.3 μm SEM, unpaired Student's t test P = 0.03）と比較して、黄色ブドウ球菌の濃縮距離（12.6 ± 3.1 μm SEM）を著しく減少させることがわかった。緑膿菌∆phz1/2とのコイフェクションでは、濃縮距離の差は見られなかった。これらのデータは，マウス創傷におけるP. aeruginosa-S. aureus微生物群集のミクロンスケールの空間構造は，HQNOによって影響を受けるが，ピオシアニンによって影響を受けないことを示している．
ミクロンスケールの空間構造に対するHQNOの影響は、微生物群集の局所密度に依存しているのだろうか？一つの可能性として，感染部位における微生物パッチの局所的な密度の違いだけで，コインフェクションの際に黄色ブドウ球菌がWT緑膿菌よりも∆pqsLに近づくということが考えられる．このことを検証するために、緑膿菌WT株と∆pqsL株からの黄色ブドウ球菌の濃縮距離を、局所的な細菌密度の関数として比較した。これらのデータから、緑膿菌∆pqsL共感染体は一般にWT P. aeruginosa共感染体よりも密度が低く、WT P. aeruginosa共感染体と異なり、濃縮距離は密度と高い相関がないことがわかった（Fig. 3E）。これらのデータは，創傷部における局所的な細菌密度の一般的な増加のために，黄色ブドウ球菌がP. aeruginosa ∆pqsLに接近することはないことを示している．
HQNOは創傷共同感染時のアミノ配糖体に対するS. aureusの耐性を増強する．
HQNOが共感染の創傷のミクロンスケールの空間構造に影響を与えることは明らかであるが，未解決の問題は，このことが群集の機能的変化をもたらすかどうかである．以前の研究で，緑膿菌が産生するHQNOはin vitroでS. aureusのアミノグリコシドに対する耐性を高めることが示されている（45）；そこで，この表現型に注目した．すなわち，創傷感染症の治療に用いられてきたゲンタマイシン（49, 50）と，慢性肺炎の治療によく用いられ，最近では創傷感染症の予防治療としても注目されているトブラマイシン（51, 52）の2種類のアミノグリコシド系抗生物質について試験を行った．我々はまず，S. aureusがコイン感染創傷において耐性が変化したかどうか，そしてアミノグリコシド耐性においてHQNOが果たす役割について検証した．これは，単独感染創と共感染創を高用量のゲンタマイシン（200 μg/ml, >100X S. aureus MIC）またはトブラマイシン（512 ug/ml, >75X S. aureus MIC）に1時間さらすことによって達成された．aureus耐性は、WT P. aeruginosa PA14の単独感染および同時感染では差がなかったが、P. aeruginosa ΔpqsLの同時感染では耐性が著しく低下した（Fig. 4）。一方、WTまたはΔpqsLとのコインフェクションの間、バンコマイシンに対する黄色ブドウ球菌の耐性に違いは見られなかった（SI Appendix、図S4A）。この黄色ブドウ球菌のアミノグリコシド耐性低下は、緑膿菌CW2-B1株とのコインフェクションの際にも、緑膿菌CW2-B1株WTとのコインフェクションの際と比較して認められた（SI Appendix、図S4B）。これらのデータは，HQNOの産生がコインフェクション中の黄色ブドウ球菌の抗生物質耐性の重要なメディエーターであることを示している．
図4.

無傷および混合創におけるS. aureusのアミノグリコシド耐性。無傷（構造化）または混合（均質化）創傷におけるゲンタマイシン（A）またはトブラマイシン（B）に対するS. aureusの生存率を、同じ創傷の非抗生物質処理部分と比較して示す。単感染は開丸で、WT緑膿菌PA14との共感染は閉丸で、緑膿菌ΔpqsLとの共感染は赤丸で示した。すべてのP値はMann-Whitney検定により決定した。アスタリスクは無傷と混合創の比較でP < 0.01を示す。使用した動物数は以下の通り。パネルA：黄色ブドウ球菌単独感染、n＝4；黄色ブドウ球菌／緑膿菌PA14 WT共感染、n＝4；黄色ブドウ球菌／緑膿菌PA14 ΔpqsL共感染、n＝4。パネルB：黄色ブドウ球菌の単独感染、n＝6；黄色ブドウ球菌／緑膿菌PA14 WTのコインフェクション、n＝6；黄色ブドウ球菌／緑膿菌ΔpqsLのコインフェクション、n＝5。
アミノ配糖体耐性が空間構造に依存するかどうかを調べるため、細菌の凝集体を破壊するが生存率には影響を与えない大型のスチールビーズを用いて、創傷を迅速に均質化し空間構造を除去した。混合（ホモジナイズ）された創傷群では、ゲンタマイシンおよびトブラマイシンに対する殺傷力が、無傷のサンプルと比較して10～1000倍増加した（Fig.4）。最後に、緑膿菌-黄色ブドウ球菌共培養の正確な空間的パターニングもサポートする慢性嚢胞性線維症感染モデルを用いて、in vivoでの所見を確認した（SI Appendix、図S5）（13, 53）。マウス創傷と同様に、トブラマイシンに対する黄色ブドウ球菌の耐性は、ΔpqsLとの共培養中にWT緑膿菌と比較して低下し、共培養物を激しく混合するとさらに低下した（SI Appendix、図S5）。重要なことは、外来性のHQNOを添加すると、よく混合された培養物ではトブラマイシン耐性が増加することであった。これらのデータは，空間構造がS. aureusのアミノ配糖体に対する耐性を高めること，そしてこの効果は，微生物の空間構造を機械的に（均質化），あるいは群集メンバー間の相互作用を（HQNOの不在）変化させることによって解消されることを示している．
考察
多菌種間相互作用は、ヒトの健康や疾病に影響を及ぼす基本的なプロセスであると提唱されている。最近，細菌種間の代謝的相互作用から生じるミクロン単位の空間構造が，多菌感染コミュニティの機能の重要な決定要因であることを示唆する証拠が得られているが，in vivoデータは前臨床試験の一握り以下に限られている（15, 16, 54, 55）。今回、我々は、実験室の多くの条件下では共存しない2つの共存微生物が、マウスの手術創に高密度に安定的に感染し、抗生物質感受性に影響を与えるミクロン単位の正確な空間構造を確立していることを発見した。この空間構造が緑膿菌の抗菌薬であるHQNOによって制御されているという事実は、この低分子が多菌の相互作用を媒介する役割に対する我々の理解をさらに深め、in vitroの結果を、ヒトの慢性感染時の緑膿菌の遺伝子発現を再現することが定量的に示されているマウスモデルへ拡張するものである（39）。さらに、ピオシアニンの産生がこの群集の空間構造に影響を与えないことから、既知の緑膿菌産生抗菌剤のすべてが、観察された正確な空間構造の出現に重要であるとは限らないことが明らかにされた。この感染モデルでは、ピロシアニンが産生されないという説明もあるが、ピロシアニン産生に関与する遺伝子は、検出可能なレベルで産生されるin vitroモデルに比べ、このマウスモデルでは発現が増加するか同等であることから、その可能性は低いと考えている(56)。いずれにせよ，我々のデータは，慢性感染環境におけるP. aeruginosa-S. aureusの群集構造を調節する上でHQNOが重要な役割を担っていることを裏付けている．
この研究の重要な側面は，感染した創傷の高解像度画像を大量に取得したことである．本研究では、各傷口の約1〜3％が高解像度で撮影されたため、複数のスケールで群集の空間構造を評価する機会を得ることができた。傷口内の細菌増殖は、連続する細菌群の大きさが3桁以上異なるため、パッチ状になり（図2C、SI Appendix, Fig.S3）、高密度の局所領域がミクロン単位で空間的に組織化されている（図2F）。これは、このモデルの創傷は当初、創傷の表面全体に分布する浮遊性細菌によってコロニー形成されるため、宿主の局所的な環境条件に起因すると考えられる。したがって、このパッチ状の分布は、ランダムに分布するこれらの浮遊性細胞から出現していると考えられる。緑膿菌と黄色ブドウ球菌の濃縮距離は、細菌密度が高くなるにつれて長くなると考えていたので、意外であった。しかし、我々のデータは、局所的なパッチ内の密度が高いほど競争が激化し、その結果、分離が進むというモデルを支持するものであった。
細胞はプランクトン的にも、傷口で凝集体としても存在するが、細菌バイオマスの大部分は凝集体に存在する。興味深い発見のひとつは、黄色ブドウ球菌の存在によって、緑膿菌のバイオマスがより多く浮遊性細胞に移行することである。単感染ではバイオマスの8%が浮遊性細胞として存在するのに対し、共感染では25%が浮遊性細胞として存在する。この緑膿菌の浮遊性化のメカニズムは不明であるが、黄色ブドウ球菌と緑膿菌の直接的な相互作用の結果である可能性と、コインフェクション時の感染環境の変化の結果である可能性がある。また、in vitroの前臨床CF感染モデルでも観察されなかったことから、そのメカニズムに関わらず、緑膿菌-黄色ブドウ球菌共培養の普遍的な表現型とは言えない(13)。
WTよりも緑膿菌ΔpqsLに近い位置で黄色ブドウ球菌が増殖していることから（図2Eおよび3D），HQNOはおそらく創傷において抗菌的役割を果たし，黄色ブドウ球菌を緑膿菌からより離れた位置にコロニー形成させることが示唆された．全体として，創傷共感染の空間構造は，これらの細菌が8μm以下の濃縮距離を示し，S. aureusがΔpqsLよりもWT P. aeruginosaに接近して増殖した，CF感染前臨床モデルで観察されたものと異なっていた（13）．これらの結果は，HQNOが環境に依存して空間構造に対する効果に差があることを示しており，この分子が常に抗菌機能を果たすとは限らないことを示唆している．
以前のin vitroの実験では，HQNOはS. aureusのtobramycin耐性を高めることが示され（45），我々のデータはP. aeruginosa strain PA14と慢性創傷臨床株CW2-B1を用いた共感染のマウス慢性創傷でこの表現型を確認した（図4およびSI Appendix, 図S4B）．この研究から得られた最も興味深い発見は、ゲンタマイシンおよびトブラマイシン耐性に対する空間構造の影響に関するもので、創傷組織の機械的混合により、WTまたはΔpqsL P. aeruginosaとの共培養にかかわらず、同一の黄色ブドウ球菌耐性が得られるという観察から裏付けられた（Fig. 4）。これらの実験では、迅速に行うことができ、細菌を殺さない機械的混合手順を使用することが重要であった。以前のin vitro実験では、緑膿菌-黄色ブドウ球菌の空間構造が抗生物質耐性における重要な決定要因であるとされていたが（57）、我々の知る限り、同様の実験をin vivoで行ったことはない。
In vivoでの創傷の知見と慢性CF感染の前臨床モデル（SI Appendix, Fig. S5）を用いた知見を確認すると、HQNOを介した空間構造がアミノグリコシド耐性に役割を果たしているという結論がさらに支持された（図4およびSI Appendix, Fig.） これらのデータを総合すると，黄色ブドウ球菌が緑膿菌に対して積極的に「スイートスポット」に位置し，耐性を高める亜致死レベルのHQNOへの曝露を提供するというモデルが支持される．さらに，創傷とCF in vitroモデルには明確な空間的パターンがあることから（図3），上述のように，この有益な空間的位置づけは明らかに環境に依存している（13）．最後に、HQNOによる耐性は、バンコマイシンでは影響が見られなかったように、すべての抗菌薬に適用されるわけではない（SI Appendix、図S4A）。
ヒトの慢性創傷では緑膿菌と黄色ブドウ球菌が空間的に分離することが報告されていることから，今回の結果はヒトの慢性創傷に関連するものであると推測される（28）．以前のトランスクリプトームデータでは，11/13のヒト由来サンプルでpqsLが発現していたことから，HQNOは慢性創傷を含むヒト感染時に産生される可能性が高いことがわかった(39)．ヒト慢性創傷における定量的空間構造データがないため直接比較することは難しいが，これらの研究を総合すると，緑膿菌と黄色ブドウ球菌は創傷感染において空間的に棲み分けていることが示唆される．今後は、本研究で得られた定量的空間構造データをベンチマークとして、in vitroモデルやヒト創傷との比較を、当研究室で最近開発したトランスクリプトームデータを用いたものと同様のフレームワークで行う予定である（39, 58, 59）。
材料と方法
細菌株と増殖条件
本研究で使用した細菌株を SI Appendix, Table S1 に示す。緑膿菌臨床分離株 CW2-B1 は Nottingham University Hospitals の Clinical Microbiology Department により 78 歳の患者の足指の慢性創傷から分離された(60)．dsRedを構成的に発現するS. aureus strain LAC（AH1263）は、S. aureus strain RN4220 + pHC48 (AH3856) のpHC48 (61) をstaphylococcal bacteriophage ϕ11でトランスダクションして作製したものである。GFPを構成的に発現する緑膿菌構築物は、以前に記載したように、ヘルパープラスミドpUXBF13およびpRK2013とのコンジュゲーションを介してPA14、PA14 ∆pqsL、およびPA14 ∆phz1/2にpBK-ミニTn7-gfp2移動して生成した(48)。緑膿菌 CW2-B1 ∆pqsL は、先に述べたようにプラスミド pEXG2pq を用いたコンジュゲーションによる対立遺伝子置換によって構築した (13)。すべての構築物はPCRで確認した。培養は脳心筋梗塞ブロス中で、37℃、225rpm で振盪し、フラスコと培地の体積比を〜7:1 として増殖させた。株緑膿菌 PA14 ∆pqsL の欠失は、周辺遺伝子の発現に影響を与えないことから無極性であることが確認され（SI Appendix, Table S2）、以前に遺伝的に相補されていた(13).
慢性外科創傷モデル。
8〜10週齢の雌性C57BL/6マウス（Charles River）を用いて、既報（9、37、56）と同様に、マウス手術創感染症を実施した。各接種には約5×105CFUを使用し、すべての共感染に対して接種前に黄色ブドウ球菌と緑膿菌を1：1の割合で混合した（各種とも〜2.5×105CFU）。感染後4日目に創傷組織を摘出した。このモデルでは、1つの条件につき少なくとも3つの生物学的複製を使用した。これは、過去のデータおよび予備的データから、統計的に有意な差をもたらすのに十分であると判断されたものである。細菌量については、創傷組織を1mmのスチールビーズと850μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水を含むBeadBugチューブに加え、総量を1mlとした。チューブをビーズで1回、30秒間叩いて組織を均質化し、滅菌PBSで連続希釈してから、マンニトール塩フェノールレッド寒天培地（MSA）および/またはシュードモナス分離培地（PIA）でプレートカウントして菌数を計測した。プレートは、各プレート上のCFUを決定する前に、37℃で一晩インキュベートされた。
マクロスケール空間構造の定量化。
マクロ空間構造化には、創傷切除後に10mm生検パンチを使用して創傷の中心部を外側から分離し、内側と外側それぞれ約0.79cm2と0.98cm2の表面積を持つ2つのピースを残すようにした。各ピースから包帯を取り除き、得られた4ピース（内側組織、内側包帯、外側組織、外側包帯）を計量し、1mmのスチールビーズとPBSを含むBeadBugチューブに総量1 mlとなるように加えた。その後、サンプルを30秒間ビーズビートし、PBSで連続的に希釈し、上記のようにMSAおよびPIAプレートで計数した。
抗生物質耐性。
切除後、傷は滅菌した外科用ハサミで4等分した。各創傷からの1片を3mlのPBS単独に加え、各創傷の2片を12ウェルマイクロタイタープレート（Corning Costar）中の512μg/mlトブラマイシンまたは200μg/mlゲンタマイシンを含む3mlのPBSに加えた。残りの1枚は、PBSと1mmスチールビーズを含むBeadBugチューブに加え、最終濃度512 ug/mlのトブラマイシンまたは200 µg/mlのゲンタマイシンを加える前に30秒間ビーズビートを行った。プレートとチューブは37℃で1時間インキュベートした。プレート内の組織片をビーズバグチューブに移す前に、PBSのみを含む新しいマイクロタイタープレートに移し、30秒間ビーズビートしてホモジナイズした。ホモジナイズした組織を含むチューブを最大速度で4分間スピンして、細胞と組織片をペレット化した。上清を除去して900 µLの新鮮なPBSと交換し、30秒間ボルテックスして再懸濁させた。その後、すべてのチューブをPBSで連続的に希釈し、上記のようにMSAおよびPIA上にプレーティングすることで細菌を計数した。インビトロ実験では、合成CF喀痰培地（SCFM2）共培養を以前に概説したように調製し（13）、300μLの培養量を96ウェルプレートの1mlウェルに入れた。培養物を37℃で4時間静置培養し、このとき100μLのSCFM2または20μMのHQNOを含むSCFM2（培養物中の最終濃度は5μM）をそれぞれの培養物に静かに添加した。培養物は、静置してインキュベートするか、1分間激しくピペッティングして直ちに混合した。30分間のインキュベーションの後、混合した培養物を再び1分間ピペッティングして混合した。その後、トブラマイシン（最終濃度256μg/ml）または滅菌水コントロールを各ウェルに加え、1時間インキュベートしてから、MSAへの希釈プレーティングにより黄色ブドウ球菌を定量化した。プレートは、計数する前に一晩インキュベートされた。
CLSMイメージング。
共焦点顕微鏡を、dsRed発現黄色ブドウ球菌および／またはgfp発現緑膿菌に感染したマウス創傷の画像化に使用した。共焦点画像を撮影するたびに傷口の上で対物レンズを撮影し、その結果、共焦点画像と傷口領域の写真が一致した。その結果、共焦点画像と創傷部位の写真が一致し、その写真を用いて、画像化された創傷部位に応じて、コアとエッジに分類しました。これにより、ミクロンスケールとマクロ（mm）スケールの両方の空間構造を調べることができました。局所的な不均一性には、細菌が全く見えない広大な領域と、細菌集団が非常に密集している領域が含まれていました。この不均一性を捉えるため、共焦点画像のサイズはサンプリングした領域によって異なり、250 μm x 250 μm（0.0625 cm2）の正方形から、最大800 μm x 200 μm（0.16 cm2）の大きな長方形（傷の総面積の1～3％を占める）までであった。各創傷は3カ所以上撮影し、1条件につき少なくとも3つの創傷を撮影し、合計110枚の画像を得た。
感染後4日目に傷口を採取して半分に切り、片方を画像化に、もう片方をCFUによる菌数測定に使用した。各創傷をCoverWell™ Imaging Chamber Gasketに入れ、NucBlueを含むProLong Glass Antifade Mountantを2滴加えて退色を防ぎ、イメージング中のドリフトを最小にした。傷口を4℃で30分間インキュベートし、マウンティングメディウムを固化させた。その後、サンプルは傷の表面が対物レンズに向くように顕微鏡に設置された。すべての画像は、Zeiss LSM 880 CLSM を使用して、3 種類の検出器を備えた Zen image-capture ソフトウェアを利用して取得した。dsRed発現黄色ブドウ球菌の検出は、587 nmを中心とする励起波長と610 nmを中心とする発光波長で行われた。gfp発現細胞の検出は、励起波長488 nm、発光波長509 nmで行った。DAPIの検出は、405 nmで励起し、420 nmから470 nmの発光を検出することにより実施した。すべての画像は、63×油浸対物レンズを使用して取得した。傷口の蛍光シグナルをスキャンし、関心領域でセンタリングした後にイメージングを開始した。タイルで撮影した画像は10％オーバーラップしており、後にZEN blueソフトウェアでスティッチングした。バイオマス解析のために，各菌株のバイオマスは，黄色ブドウ球菌と緑膿菌について，それぞれ赤色または緑色の蛍光を示したボクセルの体積を加算することで算出した．すべての画像解析において、1感染あたり少なくとも2視野、1条件あたり少なくとも3感染を対象とした。細菌密度は、各画像について、その画像内の細菌のバイオマスを画像の総体積で割ることによって算出した。
画像の閾値処理。
共焦点画像はtiffスタックとしてエクスポートされ、各チャンネルはMATLAB（Simulink）を用いて二値化された。画像解析は、強度値の全範囲にまたがるようにヒストグラム伸張ルーチンを使用して開始されました。このルーチンは、カーネル内の高コントラストを識別してそれを維持し、低コントラスト領域を平均化します。その後、大津の方法（62）を用いて、各チャンネルのスタック全体に対して閾値を特定した。最終的な画像は、GFPに対応する緑チャンネルからDsRedに対応する赤チャンネルを減算することによって生成された。
PO。
POは、以前に記載されたように計算された（13、15）。簡単に言えば、0から1までのPO値を0.01単位でビニングし、POについて1000個のランダムサンプリングの母集団の50％の値を計算することによって、各距離における各画像からの値を算出した。条件ごとの各画像からの平均値を最終値として報告した。
エンリッチメントディスタンス。
すべての距離の各サンプルからPOの最高値を収集した。複数の距離が最高値を示した場合、各距離の個体密度を重みとして、その距離の加重平均を算出した。報告された濃縮距離は、条件ごとの平均値であった。
RNA-シークエンス。
緑膿菌 PA14 または同系統の ∆pqsL 変異体を二重感染させた 8～12 週の雌性 C57/BL6 マウス (Charles River) で、上記のようにマウス慢性創傷を生成させた。rRNA は QIAseq FastSelect Kit (Qiagen) を用いて、細菌および HMR 混合プローブを用いて、製造者の説明書に従って枯渇させた。ライブラリーは、ジョージア工科大学のMolecular Evolution Coreで、Illumina NextSeq500 75-bp single-end runにより配列決定した。アダプターを除去し、リードはCutadapt version 2.6 (64)で22塩基対の最小リード閾値を使用してトリミングした。リードは、Bowtie2 version 2.3.5 (65) を用いて、National Center for Biotechnology Information (NCBI) からダウンロードしたP. aeruginosa strain PA14 (accession number GCF_000014625.1) にマップし、FeatureCounts version 2.0.1 で集計を行った。発現量の差はDESeq2 v1.36.0 (66)でβPriorをtrueに設定し、決定した。
データ、材料、ソフトウェアの入手方法
本研究の生シーケンスファイルは、NCBI Sequence Read Archive (SRA) のアクセッション番号 PRJNA858071 で入手でき、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA858071 (67) でアクセスできる。すべての画像解析および定量化のためのスクリプトは、Barrazaらから改変され、https://github.com/jupabago/PaSaChronicWounds で利用可能である。すべての研究データは、論文および/またはSI Appendixに含まれている。
謝辞
この原稿で行った多数の動物実験に協力してくれたWhiteley研究室のメンバーに感謝したい。また、緑膿菌の臨床分離株を提供してくれたSteve DiggleとDiggle Labに感謝する。この研究は、National Institutes of Health (NIH) grant R01GM116547 (to M.W.) および Shurl and Kay Curci Foundation の助成金によって行われた。M.W.はBurroughs Wellcome Investigator in the Pathogenesis of Infectious Diseaseのメンバーである。C.B.I.は、NIH国立アレルギー感染症研究所からの助成金K22AI155927の支援を受けている。
著者貢献C.B.I., J.P.B., M.W.が研究をデザインし、C.B.I., J.P.B., A.L.H., P.C., M.W. が研究を行い、C.B.I. と J.P.B が新しい試薬や分析機器を提供し、C.B.I., J.P.B, M.W. はデータを分析し、 C.B.I., J.P.B, M.W. は記事を執筆しました。
競合利益本研究は、米国国立衛生研究所（NIH）の助成金 R01GM116547（M.W. に）および Shurl and Kay Curci 財団の助成金によるものである。M.W.はBurroughs Wellcome Investigator in the Pathogenesis of Infectious Diseaseのメンバーである。C.B.Iは、NIH国立アレルギー感染症研究所からの助成金K22AI155927の支援を受けている。
参考資料
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展望2022年12月12日号
島嶼保全の海洋的利益を最大化するための島と海洋のつながりの利用
スチュアート・A・サンディン、ペニー・A・ベッカー、[...]ブライアン・J・ズグリチンスキ
研究論文2022年12月13日
前頭前野におけるSELENBP1の過剰発現は統合失調症の陰性症状の背景にある
キム・スジン、キム・ソンウク、[...]キム・ヨンス
研究論文2022年12月12日
デノボタンパク質が半導体量子ドットの合成を触媒する
レア・C・スパングラー、ヤオ・ユエユ、[...]マイケル・H・ヘクト
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感情の身体地図
このように、私たちは、「感情」によって、生存に有利なイベントや楽しい相互作用の際に、行動や生理的状態を調整することができます。このような場合、私たちは怒りや喜びなどの現在の感情状態を意識的に認識していることが多いのですが、そのメカニズムについては、「感情マップ」と呼ばれる体性感覚フィードバックが意識的な感情体験の引き金になることが提案されています。ここでは、ユニークな地形学的自己報告法を用いて、様々な感情に関連する身体感覚のマップを明らかにした。その際、...
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研究論文2017年8月14日
オキシトシンによる規範遵守は、外国人嫌いのアウトグループ拒絶を軽減する
急速なグローバル化の中で、文化の平和的共存のためには、向社会的行動を強制し、外国人嫌いを阻止する力をより深く理解することが必要である。しかし、アウトグループ指向の利他主義を促進するような条件は、これまでには存在しなかった。しかし、外国人嫌いの感情を軽減し、利他主義を促進するための戦略について、神経生物学的な証拠が得られていない。
ニーナ・マーシュ、ダーク・シェーレ、[...]レネ・ハーレマン。
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楽器学習のような高度な聴覚運動学習において、脳の可塑性が時間とともにどのように発達し、関連する個人差がどのように神経アーキテクチャに反映されるかについては、ほとんど理解されていない。聴覚神経系と運動神経系は密接に関連しており、人は楽器の演奏のような、動作と音の対応付けが極めて高度な課題を遂行することが可能である。背側聴性流は、聴覚と運動神経をつなぐ役割を担っていることが知られています。
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