慢性抗生物質抵抗性袋体炎における複数回の糞便微生物叢移植による必須機能の移植-メタトランスクリプトミクスを用いたケーススタディ

2023年12月12日 18:33

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公開日：2023年12月01日
慢性抗生物質抵抗性袋体炎における複数回の糞便微生物叢移植による必須機能の移植-メタトランスクリプトミクスを用いたケーススタディ

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01713-9

Zhi-Luo Deng, Dietmar H. Pieper, ...Irene Wagner-Döbler 著者一覧を見る
マイクロバイオーム第11巻、論文番号：269（2023）この論文を引用する

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指標詳細

要旨
背景
潰瘍性大腸炎（UC）に対する肛門全摘術後の標準治療として、回腸パウチ-肛門吻合術（IPAA）が行われている。患者の約50％が特発性炎症状態である袋部炎を経験する。抗生物質が袋炎の治療の基幹であるが、抗生物質耐性の袋炎が5〜10％の患者に発症する。糞便微生物叢移植（FMT）はUCの有効な治療法であることが示されているが、FMTによる抗生物質耐性袋炎に対する結果は一貫していない。

方法
FMT中にどの代謝活性がレシピエントに移行し、寛解を助けたかを明らかにするために、3人の患者とそのドナーの腸管メタトランスクリプトームの縦断的症例研究を行った。患者は2～3回のFMTにより治療され、便サンプルは最長140日間分析された。

結果
健康なドナーと比較して、袋炎患者ではアミノ酸、補酵素、ビタミンB群の生合成に関与する遺伝子の発現低下が観察された。UC患者の独立したメタトランスクリプトームデータセットでも同様の結果が示された。酪酸の生合成、胆汁酸の代謝、トリプトファンを含む他の機能も、袋炎では発現がかなり低かった。FMT後、これらの活性は一過性に上昇し、メタトランスクリプトーム全体のプロフィールは、その後の数週間の間に顕著な変動はあったものの、それぞれのドナーのものと密接に反映された。臨床マーカーである糞便カルプロテクチンのレベルは、メタトランスクリプトームのデータと一致していた。Faecalibacterium prausnitziiは、アセチルCoA経路を介して酪酸合成に寄与する最も活性の高い菌種であった。寛解はすべての患者で最後のFMTの後に起こり、そのうち2人の患者ではドナーとは異なる微生物叢活性プロファイルによって特徴付けられた。

結論
我々の研究は、各FMT後にドナー微生物叢、特に酪酸生合成の活性が明らかに、しかし短期間で移植されたことを示している。このデータは、FMTが患者微生物叢の活性を健康な状態へとシフトさせる引き金となり、重要な閾値に達するには繰り返す必要があることを示唆している。ケーススタディとして、これらの知見は慎重な解釈が必要であり、一般化された応用のためには、より大規模なコホートでの検証が必要である。長期的には、十分に特性化された菌株で構成される分類学的多様性の高いプロバイオティクスがFMTに取って代わる可能性があり、ドナーの高額なスクリーニングや不要な遺伝物質の移植のリスクを回避することができる。

ビデオ要約

背景
糞便微生物叢移植（FMT）は、健康なドナーの糞便微生物叢を重症のレシピエントに移植する新しい治療法である[1]。クロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile：CDI）による再発性感染症に高い効果がある [2, 3]。FMTの他の多くの適応症も試験されており、現在の文献のメタアナリシスでは、FMTは潰瘍性大腸炎（UC）にも有効であると報告されている［4］。

UCは、炎症性腸疾患（IBD）の2つの主要なタイプのうちの1つであり、世界的な有病率が上昇している世界的な疾患である [5] 。UCは、患者に多大な影響を与える生涯の病気である。UCの病因に関する現在の概念では、腸内細菌叢と免疫の調節異常、遺伝的体質、環境因子、生活習慣因子を含む因子の複雑な相互作用が強調されており、慢性腸炎を引き起こしている [6] 。過去数十年間で、UCの治療法は大きく進歩した。しかし、UC患者のかなりの割合が外科的介入を必要としている。回腸パウチ-肛門吻合術（IPAA）を伴う修復的直腸切除術は、内科的治療に抵抗性のUCや悪性化を伴うUCに対して選択される外科的治療法である。IPAA患者では、回腸貯留部の粘膜炎症である袋炎が最も一般的な長期合併症であり、10年間の累積発生率は24～59％である [7] 。急性袋炎の症状は、便の回数の増加、倦怠感、腹部けいれん、直腸出血、時に発熱を特徴とする。

袋炎に対する抗生物質治療（ABT）は初期には成功するが、しばしば炎症がABTに抵抗性を示すようになり、FMTが重要な最終選択肢となる。慢性で抗生物質耐性の再発性袋炎患者におけるFMTの結果に関する報告はまれである。現在のところ、症例報告や症例数が非常に少ない研究がほとんどであり、その結果もさまざまである [8,9,10,11,12,13,14,15] 。慢性再発性袋炎に対するFMTの有効性に関する前向き多施設共同二重盲検ランダム化比較試験が現在進行中である [16, 17]。

IBD患者の便微生物叢は、現在までに最も広く研究されている微生物群集である。ヒトマイクロバイオームプロジェクトの一環として、いくつかの臨床コホートから得られたマルチオミクスデータセットが、これらの疾患のシステムレベルの理解を深める目的で、ディスバイオージスのメカニズムと初期マーカーについて解析された [18,19,20] 。この非常に複雑な研究は、以下にいくつかの知見のみを要約するが、ここで報告する症例研究の重要なベースラインを提供するものである。IBDにおける主な知見は、分類学的および機能的多様性の喪失、通性嫌気性菌（例えば大腸菌）の増加、短鎖脂肪酸（SCFA）の偏性嫌気性産生菌、特に酪酸産生菌であるFaecalibacterium prausnitziiとRoseburia hominisの減少である。

このような大規模なコホート研究は、一般化された結論を得るための貴重な基盤ではあるが、微生物叢の組成や活性における甚大な個人差を説明することはできない。さらに、ほとんどの研究は、微生物群集の分類学的フィンガープリントは得られるが、機能的情報はほとんど得られない16S rRNA遺伝子配列決定や、微生物叢の遺伝的可能性を示すが実際の活性を示さないメタゲノム解析に依存している。

我々の以前の研究[14]では、慢性抗生物質不応性袋炎を患っていた5人の患者にFMTを適用した。5例中4例では、2～3回のFMTで寛解がみられた。16S rRNA遺伝子のアンプリコンを解析したところ、その後のFMT間でドナーの微生物叢の生着に差があることが以前に示されていた[14]。ここでは、ドナーと臨床的寛解を経験し、FMT中の臨床データが完全に記録されていた3人の患者のメタトランスクリプトームを解析した。これらの3症例は、我々の知る限り、メタトランスクリプトーム解析を用いてFMT前後の腸内細菌叢活性の変化を追跡し、どの活性変化が寛解に寄与したかを明らかにした初めての研究である。

我々はまず、各患者の活動的な群集の分類学的および機能的組成を分析し、最大3回のFMTと140日間の追跡を行った。そして、FMT中に患者に提供された機能を、健康と袋体炎を比較することによって決定し、それらのシフトを促進する微生物を同定した。

次に、腸の代謝産物である酪酸、二次胆汁酸、ビタミンB12（コバラミン）、ビタミンB6（ピリドキシン）、トリプトファン由来の代謝産物の経路に注目した。これらの代謝産物は、腸の健康に重要な役割を果たし、腸の炎症を緩和することが示されている[21]。これらの重要性に基づき、我々は健康と疾患におけるこれらの代謝物の経路に注目し、発現が異なる遺伝子とこれらの機能に対する細菌分類群の寄与を解析した。その後、患者における2～3回のFMTの間、これらの発現を追跡した。

これらの解析から、F. prausnitziiが重要な役割を果たしていることがわかった。これは酪酸の生合成に最も活発に寄与する。そこで我々は、健康時と疾患時、また治療過程全体におけるF. prausnitziiの活性を詳細に追跡した。

我々の解析によれば、レシピエントにおけるドナー微生物叢の生着は明らかに起こったが、安定したものではなかった。FMT後、一時的に低下した遺伝子は回復した。最終的な寛解には数回のFMTが必要であり、3例中2例では治療前のドナーや患者とは異なる活発な微生物群集が特徴的であったが、3例目では患者はドナーの微生物群集に類似した微生物群集を獲得していた。

研究結果
研究デザインと臨床データ
慢性抗生物質耐性袋炎に罹患した3名の患者を、便サンプルを採取することにより、2～3回のFMTまで追跡した。この研究のために選ばれた3人の患者は、私たちが以前に発表した臨床研究[14]に参加した患者であり、その臨床データは表S1シート1に示されている。これらの患者を特に研究対象として選んだのは、便中カルプロテクチン（FC）レベルと袋炎疾患活動性指数（PDAI）スコアの両方を包括的に記録している唯一の患者だったからである。すべての患者から、治療前に2検体を採取し、病的状態を表した。すべての患者は最初のFMTの前にABTを受けた。メタトランスクリプトームについては、最初のFMTから140日後（CG）、99日後（DW）、55日後（JM）の患者を追跡した（Table S1シート1-2）。FC値は最後のFMTから4-6ヵ月後まで追跡した（Table S1 sheets 1-2）．ABTとFMTの手順の詳細は[14]を参照されたい。FMT前には、すべての患者が400μg/gを超える有意なFC値の上昇を示した（表S1シート1）。FMT後、これらの値は顕著に低下した。PDAIスコアに反映されるように、最後のFMT後、3～4ヶ月間抗生物質を使用しない寛解が3人の患者で観察された。

シーケンスデータとメタトランスクリプトーム解析
49検体の便のメタトランスクリプトームを決定した。2つの異なるドナーからの7検体と3つの異なる患者からの42検体を解析した。完全なサンプルリストは表S1シート2にある。シークエンシングの結果、合計4,266,728,608（～43億）リードが得られた。このうち50%はリボソームRNAであった。ヒトのリードは1.89%であった。したがって、解析に利用可能な推定mRNAリードの量は〜20億リード、サンプルあたり平均41,849,255 ± 23,966,569（4,180万）リードであった。このうち43.8%は、古細菌、細菌、真菌、ヒト、プラスミド、ウィルスのNCBI RefSeqゲノムを含むKraken標準データベースを用いて、Kraken [22]によって分類を割り当てることができた。メタトランスクリプトームの活性と分類学を包括的に解析するために、9,879,896個の参照遺伝子からなるヒト腸内マイクロバイオームデータベース（IGC）の参照遺伝子の統合カタログ[23]をマッピングに使用した。このデータベースを用いると、BWA-MEMを用いて、クリーニングされたメタトランスクリプトームリードの86.71%をマッピングすることができた[24]。このマッピング率は、IGCデータベースにさらに非冗長遺伝子を追加することで87.91%まで向上した（詳細は「方法」、図S1A、表S1シート3を参照）。近年のNCBI RefSeqデータベースの拡張を考慮し、またIGCの分類学的情報には種レベルが含まれていないため、遠心分離機[25]を用いて分類学的割り当てを更新した（詳細は「方法」を参照）。その結果、70.35%のリードが門レベルに、65.45%が属レベルに分類された。図S1Bに、下流の機能的濃縮解析と活性移植解析を示す。

微生物群集の分類学的組成と遺伝子発現
マップされたリードは、放線菌門、子嚢菌門、バクテロイデーテス門、ファーミキューテス門、およびプロテオバクテリア門の5つの主要な門によって寄与された（表S1シート4）。図1（ヒートマップと右の棒グラフ）は、遺伝子にマッピングされた全リードをもとに、全サンプリングタイムポイントにおける転写産物の属レベルでの分類学的構成を示したものである。Bacteroidesが最も活性が高く、次いでRuminococcus、Streptococcus、Bifidobacterium、Blautia、Prevotella、Escherichia、Faecalibacteriumであった（図1、図S2、表S1シート5）。バクテロイデス属は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスに基づく我々の以前の研究でも最も豊富な属であり（図S3）、プレボテラ属、連鎖球菌属、フェカリバクテリウム属、エシェリヒア属／シゲラ属がそれに続いた。16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスのデータによると、Streptococcus属とEscherichia/Shigella属はFMT前の患者には豊富であったが、ドナーのいずれにも存在しなかった。Faecalibacteriumは両ドナーで豊富であったが、FMT前の患者DWとJMでは非常に少なかった。

図1
図1
属レベルでの発現遺伝子に基づくFMT中の腸内細菌群集の分類学的構成のヒートマップ。メタトランスクリプトームリードは、機能的および分類学的情報を付与するために、改良されたIGC（Integrated Gene Catalogue）データベースにマッピングされ（「方法」参照）、その後、属に従ってグループ化された。存在量はサンプルあたりのマップされたリードの総数で正規化した。全サンプルの平均相対発現量が0.1%以上の属のみを示し、分類学的に割り当てられたリードの98%以上を占める。右側のバーは、全サンプルにわたるこの属の全遺伝子の相対発現の平均、左側のバーは、全サンプルにわたるこの属の発現遺伝子数。2列のアノテーションバーは、患者グループ（CG、DW、JM）と疾患ステータスを示す。before/afterABT "は抗生物質治療の前または後を示す。詳細は "Methods "を参照。

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合計で815,055のユニークな遺伝子が、全サンプルの平均リードカウント＞1で発現していた。これらはマップされたリードの99%以上を占める。ユニークな発現遺伝子のうち、65,991個がBacteroides、39,132個がFaecalibacterium、39,035個がStreptococcus、31,857個がBlautia、そしてRuminococcus、Clostridium（sensu stricto）、Bifidobacteriumがそれに続いた（図1、左棒グラフ）。属ごとにクラスター化した全リードの累積順位存在量曲線は、20属以下で飽和に達したことを示している（図S4）。分類学的に割り当てられた遺伝子にマッピングされた全リードの80%カバレッジは、ドナーのコミュニティでは9.14±1.07属で達成されたが、治療前の患者では6.00±1.10属で達成された。ABTおよびFMT後の患者では、このカバー率は4.88±2.06属であった。この結果は、ドナーのメタトランスクリプトームの分類学的多様性が高いことを示唆している（図S4）。

治療前、患者はFCレベルの上昇（CGで849μg/g、DWで479μg/g、JMで566μg/g）を示した（図2A、表S1シート1）。最初のドナーDKSを用いた最初のFMTでは、患者DWを除くすべての患者のFC値が大幅に低下した。しかし、CG（FC = 219μg/g）では高い値を維持した。患者DWでは、FMT1後のFC値の減少はわずか21％であった（479μg/gから377μg/gへの減少）。同じドナーを用いたDWの2回目のFMTでは、FCレベルは約200μg/gまで低下した。その後、異なるドナー（DSS）を用いたCGのFMT2とDWのFMT3で、FCレベルは正常範囲（CGは150μg/g、DWは15μg/g）になった。患者JMについては、FMT1がすでに成功し、FCレベルが低くなった（FC＝47μg/g）。活性型群集の分類学的組成（図1、図S2）と遺伝子発現プロファイル（図2B）は、患者特有のパターンを示した。患者の初期群集はそれぞれ異なり、治療に対する反応も明瞭であった（図1、図2B、図S2）。活動的な属は、袋炎患者ではFMT前にPrevotella属、Ruminococcus属、Bifidobacterium属であったが、ドナーではBacteroides属、Faecalibacterium属、Ruminococcus属、Prevotella属であった。FMT後、Bacteroides、Faecalibacterium、Prevotellaで有意な生着が観察された。

図2
図2
FMT治療のタイムラインとPCoAの可視化。A FCレベルによる治療過程のタイムライン。B 各サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づくPCoA。Aでは、サンプリング時点を以下のように示す： < ABTは抗生物質治療のタイムポイント。FMT1/2/3は対応するFMTの時点を示し、括弧内のDKSまたはDSSはこのFMTに使用されたドナーを示す。バーの高さはFCレベルを示す。Bの各ドットはサンプルを表し、ドット内の数字は最新のFMTからの日数を示す。マイナスの数字は、最初のFMTの前にサンプルを採取したことを示す。軌跡線は、異なるFMT治療にわたるタイムポイントを示している。各FMTの開始はイタリック体で示す。各FMTで使用されたドナーサンプルはマークされ、緑色で着色され、治療前のサンプルは赤色、ABT後のFMT前はオレンジ色、FMT後は青色で示されている。距離メトリックを計算し、データを可視化するために、マップされたリード全体の92%を占める上位20万個の発現遺伝子のみが考慮された。

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遺伝子発現プロファイルに基づく主座標分析（PCoA）は、FMT前とFMT中の群集の時間的ダイナミクスを示した。患者CGの腸管メタトランスクリプトームは、当初、FMT前のドナーDKSのメタトランスクリプトームに近かった（図2B）。DKSが提供したFMT1後は、FCレベルの大幅な低下を伴って、このドナーとさらに類似していた。しかし、FCレベルの低下は200μg/g以上のままであったため、別のドナー（DSS）による2回目のFMTが行われた。このFMT2では、FCレベルに応じてこの患者の炎症がさらに軽減され、患者のメタトランスクリプトームは、ドナーの黄砂のそれと類似するようになった。FMT2から92日後のサンプルは、ドナーサンプルとも治療前の患者サンプルとも異なる活性パターンを示した。患者DWは非常に多様な微生物叢を示した（図2B）。1回目と2回目のFMTは、病的状態（ABT前）の周辺だけでなく、ドナー群集の方向にも、またドナー群集から離れる方向にも大きな変動を引き起こした。特に、FMT1ではFCレベルの有意な減少を引き起こすことができず、FMT1後15日目には200μg/gをはるかに上回るレベルを維持していた。さらに、FMT1後14日目から21日目の間に、活性プロファイルはドナー群から顕著に乖離した。同じドナーを用いた2回目のFMTの後も、活性プロファイルはドナーのものから乖離していた。対照的に、異なるドナー（DSS）を使用した3回目のFMT後は、プロファイルはより安定し、ドナーに近づいた。3回目のFMTの1ヵ月後、FCは非常に低いレベルまで低下し、FMT3の4ヵ月後も低いままであった。この患者のデータは、FMTのドナーの選択が生着率に大きな影響を与えた可能性を示している。

驚くべきことに、患者JMの場合、最初のFMTでコミュニティが変化し、ドナーのコミュニティと同じになり、その状態が1ヶ月間維持され、FC測定値がすでに非常に低いレベルになった（図2）。患者がドナーの微生物叢によく反応したため、2回目のFMTにも同じドナー（DKS）を使用した。2回目のFMT後、群集は20日間はドナーの状態に近かったが、やがて全く異なる状態に変化した。2回目のFMTから27日後の最終メタトランスクリプトームサンプルは、それまでのすべてのコミュニティ状態とは異なり、ABT後のコミュニティに最も近い状態であった。しかし、FC値は2回目のFMTから4.5ヵ月後と6.5ヵ月後も非常に低いままであり（それぞれFC＝56と32）、これは正常な状態を表している。患者JMは最も若いレシピエントであり、そのパウチは16ヶ月しか経っていなかった。興味深いことに、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）の転写産物は、FMT2前の患者JMのサンプルとドナーDKSのサンプルJM_FMT1/2に非常に多く認められた（表S1シート6、図S5）。このウイルス転写物は、患者DWに使用されたこのドナーからの別のサンプルDW_FMT1でも検出されたが、このFMTの後、サイトメガロウイルスは検出されなかった。

全コミュニティのクラスタリング解析（図3）によると、FMT後、レシピエントのコミュニティはドナーと一緒に2つのグループに明確にクラスタリングされた（図3、図S6）。患者CGのFMT2および患者DWのFMT3に使用されたドナーDSSは、DWのFMT1の7日後を1つの例外として、FMT後にこれらの患者のサンプルと一緒にクラスター化した。同様に、他のすべてのFMTに使用されたドナーのDKSは、FMT後に患者のサンプルと一緒にクラスター化した。クラスター内のすべてのコミュニティは、互いに55％の遺伝子発現プロファイルの類似性を共有していた。治療前とABT後のコミュニティでは、より小さなクラスタが観察された。

図3
図3
遺伝子発現に基づく試料のクラスタリング。サンプルの距離の算出にはBray-Curtis非類似度を用いた。赤い点線は、類似度（100％-非類似度）のカットオフ値55％を示している。このカットオフにより、FMT後のレシピエントサンプルは、対応するドナーが表す2つのクラスターに明確にグループ分けされた。下のヒートマップは、各サンプルのペア間の類似性を示し、これらの2つのクラスターを明らかに示している。この可視化には、図2Bのように上位200,000の表現が使用された。

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健康時と袋小路炎時の活動変化
コミュニティーの活性シフトとそれを促進した微生物メンバーを発見するために、ドナーのメタトランスクリプトーム（ドナーDKSから5サンプル、ドナーDSSから2サンプル）と治療前の患者のメタトランスクリプトーム（患者ごとに2サンプル）を比較した。ALDEX2を用いて、815,055個の遺伝子のうち6832個が、健康な状態と袋体炎の間で差次的に発現（DE）していることを同定した（表S1シート7）。これらのDE遺伝子の98％以上は、エフェクトサイズの中央値が1.5以上であり、解析の統計的検出力を保証していた。これらの遺伝子のほぼ全てが健康な状態で発現が上昇し、一方、袋炎で発現が上昇したのは46遺伝子だけであった。これらのDE遺伝子のうち、658遺伝子がBacteroides由来、407遺伝子がBifidobacterium由来、394遺伝子がAlistipes由来、338遺伝子がBlautia由来、311遺伝子がFaecalibacterium由来であった。種レベルでは、330遺伝子がBifidobacterium adolescentisで、90遺伝子がRoseburia intestinalisで、90遺伝子がEggerthella lentaで、66遺伝子がFaecalibacterium prausnitziiで差次的に発現していた（表S1シート7）。

ClusterProfiler[26]を用いた6,832個のDE遺伝子の遺伝子セット濃縮解析により、健康時と袋炎時で有意に制御が異なる65のKEGGパスウェイと24のKEGGモジュールが同定された（表S1シート8、図S7A）。最も有意に濃縮されたKEGGパスウェイは、アミノ酸生合成、補因子生合成、鞭毛アセンブリ、リボソーム、炭素代謝、ビタミンB複合体生合成／代謝（ビオチン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、チアミン）、セレン化合物代謝、硫黄代謝、および細菌の走化性であった（図S7、表S1シート8）。健康状態において最も有意に濃縮されたKEGGモジュールは、アミノ酸、脂肪酸、ヘム、およびビタミンB12（コバラミン）の生合成であった（図S8A、表S1シート8）。このデータから、治療前の患者の腸内細菌叢は、必須栄養素を自ら生産することができなかったことが示唆される。パスウェイとモジュールを属特異的な活性に分解することで、これらの活性変化を引き起こしている属を同定した。図4は、65のKEGGパスウェイのうち、アミノ酸の生合成、補酵素の生合成、クオラムセンシング、メタン代謝、パントテン酸生合成、チアミン代謝、ニコチン酸代謝、葉酸生合成、モノバクタム生合成、ビオチン代謝を含む10のパスウェイに寄与した属を示している。寄与した属は、パラバクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブラウティア属、アリスティペス属、フェカリバクテリウム属、エッゲルトヘラ属、バクテロイデス属、ローズブリア属、コリンセラ属、ユウバクテリウム属であった。Eggerthellaを除いて、これらはすべて患者とドナーの便微生物叢で最も活性の高い25属の中に含まれていた（図1）。これらの属はそれぞれいくつかのKEGGパスウェイに貢献していたが、その程度は異なっていた。例えば、パラバクテロイデス属はアミノ酸生合成活性の変化を最も強く促進したが、今回分析した他の経路の差次的制御の主要な担い手でもあった。一方、コリンセラは、クオラムセンシング関連遺伝子には大きな役割を果たしたが、他の全ての経路には小さな役割を果たした。機能モジュールの観点から見ると、それらの差次的発現は通常複数の属によって駆動されていた。例えば、ビタミン関連経路は少なくとも3つの属、例えば葉酸生合成ではビフィドバクテリウム属、パラバクテロイデス属、コリンセラ属によって発現が異なっていた。

図4
図4
子宮頸管炎の活動性変化を促進する微生物。医療介入前の袋炎患者と比較して健常人ドナーで有意に濃縮されたKEGGパスウェイと、これらのパスウェイに寄与する微生物分類群を示すサルコスプロット。左側の円弧は属レベルでグループ化された微生物分類群を示し、右側の円弧はパスウェイを示す。両者間のリンクの幅は、あるパスウェイについて各分類群から差次的に発現したKEGGオルソログ（KO）遺伝子の数を示し、リンクの色は微生物属の色と一致している。経路円弧の下のヒストグラムは、健常時と袋炎時のKO遺伝子発現の中央値のlog2FCを示している。各経路について、差次的に制御された遺伝子のみが示されている。「不明」は、微生物属に割り当てることができなかった差次的に発現した遺伝子を指す。

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サンプル数が比較的少なかったため、HMP2（https://www.ibdmdb.org/）から得られたより大規模な独立したデータセット[18]を解析し、我々の知見を統合した。腹膜炎のメタトランスクリプトームデータセットは公表されていない。このHMP2データセットには、UC患者（n = 53）とUCでない個人（n = 53）のメタトランスクリプトームが含まれている。UC患者と袋炎患者のマイクロバイオームは、IPAA後の解剖学的構造の変化によって異なるかもしれないが、袋炎の基礎的な病理学的構造はUCに根ざしている[27, 28]。したがって、両者のマイクロバイオームは異なるものの、健常な状態よりも類似点が多いはずである。合計で、5128遺伝子が非UCとUCの間で差次的に発現し、そのうち4495遺伝子が非UCで発現上昇し、633遺伝子のみが発現低下した。アップレギュレートされた遺伝子の大部分（3240個）をアリスティペス属が占め、バクテロイデス属（110個）、フェカリバクテリウム属（29個）、ルミノコッカス属（27個）、バルネシエラ属（26個）、クロストリジウム属（24個）がそれに続いた。補酵素の生合成、アミノ酸の生合成、リボソーム、脂肪酸の生合成、トリプトファンの生合成、各種ビタミンB複合体（葉酸、ビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン）の生合成、および代謝を含むKEGGパスウェイおよびモジュールは、非UCでアップレギュレートされた（表S1シート9、図S7B、図S8B）。アリスティペス、バクテロイデス、およびルミノコッカスが、群集におけるこれらの経路のアップレギュレーションに主に寄与していた。非UCコミュニティとUCコミュニティの間の活性変化は、我々が袋炎データセットで発見した変化と非常に類似していた。実際、エンリッチされたKEGGパスウェイの81％とエンリッチされたKEGGモジュールの54％は、袋炎とUCのメタトランスクリプトーム解析の間で共有されていた（図S7と8）。興味深いことに、これらの活性の変化を引き起こしている微生物の構成員は非常に異なっていた。この解析により、我々の結果の妥当性が確認され、より詳細な解析が可能になった。

酪酸の合成、ビタミンB群、胆汁酸の代謝、トリプトファンにおける遺伝子発現の変化
KEGGパスウェイとモジュールはかなり広いカテゴリーなので、腸内細菌叢の健康に重要であることが知られている機能を手作業で分析した。これらには、酪酸の生合成、ビタミンB12（コバラミン）、ビタミンB6（ピリドキシン）、胆汁酸の代謝、トリプトファンの経路が含まれる。このうち、B12生合成は、前述のKEGGモジュール濃縮解析ですでに有意に発現が上昇した機能として同定されていた。

メタトランススクリプトーム全体で1799の発現酪酸生合成遺伝子が同定され、28のオルソログ酪酸生合成遺伝子に属し、4つの異なるパスウェイに割り当てられた（図S9）。これらの発現した酪酸生合成遺伝子のうち、34個が健常時と袋炎時で発現に差があり、9個のオルソログ遺伝子に属していた（図S10、表S1シート10）。特筆すべきは、これらの遺伝子の全てが袋炎で発現低下しており、その平均発現倍率は100倍以上であったことである。これらのDE酪酸生合成遺伝子は、Blautia、Eubacterium、FaecalibacteriumおよびRoseburia由来であった（図S10、表S1シート10）。Fisherの正確検定を用いると、酪酸生合成遺伝子はすべての差次発現遺伝子の中で強く濃縮されていた（p = 2.123e-05, 濃縮比 2.285 (95% CI: 1.576, 3.209)）。

胆汁酸代謝は638遺伝子が発現していた。その中で、10個の遺伝子が健康な状態と袋小路炎の間で差次的に制御されていた（図S11、表S1シート11）。これらの遺伝子は治療前の患者において、平均150倍以上の変化で発現が低下していた。興味深いことに、cbhとbaiNのオルソログのみが構成されていた。二次胆汁酸（baiA-I）の形成に関与するどの遺伝子にも調節の差は見られなかった。cbh遺伝子は主にAlistipesとCollinsellaに由来し、baiNはBlautiaとFaecalibacteriumに由来した。

ビタミンB12の生合成に関しては、4874の発現遺伝子が同定された。そのうち40の遺伝子は健康時と袋炎時で発現が異なり、そのすべてが健康時に発現が上昇し、平均発現倍率は約200倍であった（図S12、表S1シート12）。ビタミンB12生合成に最も多くの転写産物をもたらした属は、アリスティペス属、アネロブチリカム属、ビフィドバクテリウム属、ブラウチア属、パラバクテロイデス属であった。

ビタミンB6生合成に関しては、メタトランススクリプトーム全体で1249個の発現遺伝子を同定し、そのうち11個の遺伝子が健康時と袋炎時で差次的に制御されており、その全てが健康時に平均200倍以上の変化で発現上昇していた（図S13、表S1シート13）。これらの差次的に制御された遺伝子は主にAlistipes、Bifidobacterium、Blautia由来であった。

トリプトファン代謝は、データセット中の1168の発現遺伝子で表され、そのうち16遺伝子が差次的に発現していた。しかし、トリプトファンからインドールを生産することが報告されているアリスティペスのトリプトファナーゼだけが、トリプトファン代謝に重要であると推測できる（図S14、表S1シート14）[29]。

FMT中の必須機能の移植
次に、ドナーと袋炎（上記参照）の間のこれらの6832のDE遺伝子が、完全なFMT治療にわたって患者においてどのように発現されるかを調べた。図S15のヒートマップは、全サンプルにおけるこれらの遺伝子の発現を属別にクラスター化したもので、上部の棒グラフは全属における相対発現を要約したものである。すべての患者において、FMT後のDE遺伝子の短期間の生着と、FMTの4週間後の消失がはっきりと確認できる（図S15の上部のバープロット）。例外は、患者DWの2回目のFMTで、ドナー微生物叢の活性が患者に実質的に生着しなかった。この患者に対して、別のドナーを用いた3回目のFMTを行ったところ、DE遺伝子に代表される活性が短期間のうちに明らかに移植された。

次に、FMT中の患者からのサンプルにおける、酪酸の合成（図S10）、胆汁酸の代謝（図S12）、ビタミンB12の合成（図S12）およびB6の合成（図S13）、トリプトファンの代謝（図S14）（上記参照）を含む特定の機能におけるDE遺伝子の発現を解析した。これらの遺伝子の発現レベルは、FMTによって一時的に回復したが、後の時点で再び消失した。特に、すべての酪酸生合成遺伝子の全体的な発現レベルも明らかな生着が見られた（図5）。酪酸生合成遺伝子を発現している最も重要な属はFaecalibacterium属で、次いでClostridium属、Eubacterium属、Ruminococcus属であった（図5、右側棒グラフ）。各FMT後（患者DWのFMT2を除く）、これらの酪酸生合成遺伝子の発現は増加し、FMT後1ヵ月頃には低発現レベルに戻った（Fig.）注目すべきは、DWに対する最初のFMTでは、これらの遺伝子の発現は一過性の上昇にとどまったことである（図2A）。FMT2では、酪酸合成遺伝子の発現が増加したが、メタトランスクリプトーム全体のプロフィールは依然としてドナーから乖離しており、FCレベルは高い値を維持した。対照的に、異なるドナーを用いた3回目のFMTでは、酪酸合成遺伝子の発現が1ヶ月間効果的に上昇し、FC濃度の有意な低下を伴った。トリプトファン代謝に関与する全遺伝子の全体的な発現レベルは酪酸生合成遺伝子と同様のパターンを示したが、患者JMの最後のサンプルではトリプトファン代謝遺伝子の発現レベルが高かった（図S16）。これらの遺伝子の中で、トリプトファナーゼをコードするDE遺伝子（tnaA）のみがトリプトファン代謝に重要であり、2回目のFMT後のCG（CG_2_1）と3回目のFMT後のDW（DW_3_7）に生着した（図S14、表S1シート14）。トリプトファンの代謝変化に寄与する属のトップはアリスティペス属であった。しかし、胆汁酸の代謝やビタミンB12とB6の生合成に関与する遺伝子の全体的な発現は、FMT中にそのようなパターンを示さなかった。

図5
図5
異なる分類群におけるFMT中の酪酸合成遺伝子の発現。ヒートマップの各セルは、与えられたサンプルについて、特定の属内の酪酸合成遺伝子のZスコア変換相対発現を表示する。上部の棒グラフは、各サンプルのすべての酪酸合成遺伝子の相対発現の合計を示す。右のバーは、全サンプルにわたるこの属の酪酸生合成遺伝子の発現総数を示す。属は寄与遺伝子の数に基づいて、多いものから少ないものへとソートされている。カラムアノテーションバー上部の青い三角形は、各FMT後の最初の時点を示す。列注釈バーは図1と同じ。

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FMT中のFaecalibacterium prausnitziiの活性
F. prausnitziiは健常時と袋炎時の酪酸生合成活性の変化に寄与する最も活性の高い微生物であることが示され、健康な腸にとって重要であることが報告されているため、その活性をより詳細に解析した。上に示したように、F. prausnitzii由来の転写産物の全体的な存在量は、ドナーの方が袋炎よりも高く、特にドナーのDKSで高かった（図S2）。次に、F. prausnitziiに属するすべてのリードを抽出し、2154個のeggNOG遺伝子と20個のClusters of Orthologous Groups（COG）カテゴリーにグループ化した。EggNOGは階層的、機能的、系統的にアノテーションされたオルソロジーリソースであり[30]、IGC参照遺伝子データベースにはCOGカテゴリーだけでなくEggNOGアノテーションも含まれている。COGカテゴリー構成はサンプル間で明確なパターンを示さなかった（図S17）。次に、リードカウントの中心対数比（CLR）変換の中央値で表されるF. prausnitziiのeggNOG遺伝子の発現を解析した（図6A）。トランスクリプトームシーケンスデータは構成的であり、シーケンス深度はサンプルによって異なるため、遺伝子のリードカウントを単純に細胞数で正規化して、真のmRNA/細胞値を反映させることはできなかった[31]。そのため、トランスクリプトームデータの構成的特性を考慮したライブラリサイズの正規化手法が必要となる。CLR変換は形式的には効果的なライブラリーサイズ正規化と同様であり、存在量と発現量の比較に意味のある値を提供する[32, 33]。ドナーおよび袋炎における所与の遺伝子のCLR値の中央値を用いて、その遺伝子の発現の倍数変化を決定した。その結果、F. prausnitziiはドナーと袋炎で異なる活性を示した。ドナーで最も強く発現が上昇した遺伝子はトランスポーターと膜タンパク質であり、最も発現が低下した遺伝子はヌクレオチド代謝、アミノ酸代謝、莢膜多糖生合成、毒素-抗毒素系、制限修飾系に関与する遺伝子であった。酪酸生合成に関与するeggNOG遺伝子は全部で8つあり、いずれもドナーのCLR中央値で7倍から27倍の高発現であった（表S1シート15）。個々の遺伝子をパスウェイにマッピングすると、酪酸生合成は主にアセチル-CoA経路が寄与していることが示唆された。F. prausnitziiではアセチル-CoA経路に関与する全ての遺伝子が発現しており、ドナーでは袋炎に比べて発現が上昇していた（図6B）。Thl遺伝子とBut遺伝子はドナーのDSSでドナーのDKSに比べてはるかに発現が高く、Cro遺伝子はDKSではるかに活性が高かった。FMTの1～7日後、患者のマイクロバイオームではアセチルCoA経路遺伝子の相対発現量が急激に増加した（図6B）。その結果、F. prausnitziiの転写産物総量が少ない場合、酪酸生合成遺伝子の発現量は他のすべての遺伝子に比べてかなり低い傾向にあることが観察された。これはF. prausnitziiが増殖するために酪酸を生産する必要があるためかもしれない。HMP2 UCとnon-UCのデータセットでは、F. prausnitziiは我々のFMTドナーサンプルほど活発ではなく、non-UCとUCの間で酪酸生合成遺伝子の発現に実質的な差は観察されなかった。

図6
図6
FMTにおけるFaecalibacterium prausnitziiの活性変化。A 健康時と疾患時のF. prausnitziiの遺伝子発現プロファイル（eggNOG遺伝子）。B Faecalibacterium prausnitziiの酪酸生合成アセチルCoA経路の遺伝子発現変化。Aでは、F. prausnitziiに割り当てられたすべての発現遺伝子をオルソログアノテーションに従ってeggNOG遺伝子にグループ化した。リングは（外側から内側に向かって）以下を示す： #2すべてのeggNOG遺伝子、#3酪酸合成遺伝子（緑矢印）、トリプトファン代謝に関与する遺伝子（赤矢印）、二次胆汁酸代謝に関与する他の遺伝子、ビタミンB1（チアミン）、B3（ニコチン酸）、B5（パントテン酸）、B6（ピリドキシン）、B7（ビオチン）、B9（葉酸）、B12（コバラミン）生合成は、異なる色のバーで示されている；健康（ドナー）と袋炎（治療前の患者）の間の遺伝子発現の#4 log2倍変化、袋炎（治療前の患者）の遺伝子の#5発現レベル、健康（ドナー）の遺伝子の#6発現レベル。Bについては、FMT前、1週間後、および各FMT後の最後の時点の患者のサンプルのみを対象とした。パスウェイの遺伝子名で着色したボックスは、ドナーと袋体炎の間のlog2FCを示している。赤色は、袋体炎と比較してドナーで最も強い発現上昇を示している。棒グラフは治療過程における各遺伝子の発現レベルを示す。バーの高さと色は、その遺伝子の相対発現レベル（その遺伝子からのリード数をF. prausnitziiからの全リード数で正規化したもの）を示す。棒グラフ上部の青い矢印は、各FMT後の最初のタイムポイントを示す。

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方法
サンプル採取
便サンプルは、抗生物質耐性袋炎に罹患した患者に対するFMTの臨床研究中に得られた[14]。我々は、臨床的寛解を経験し、完全な記録を有する3名の患者から、治療全過程におけるメタトランスクリプトームを追跡した。これらの患者CG、DW、JMの臨床データとFMT治療結果は、最初に[14]で報告された。患者DWが3回のFMTを受けたのに対し、CGとJMはともに2回のFMTを受けたことが重要である。2016年の発表では、患者JMが受けた2回のFMTのうち、最初のFMTについてのみ記述されている。さらに、2016年の表に示されたデータとは対照的に、患者CGは3回のFMTではなく2回のFMTを受けている。患者サンプルは以下のようなフォーマットで命名された： < 患者ID > _ < No. ドナーサンプルは以下のように命名された： < レシピエント患者ID > _FMT < no. FC値は、治療前と各FMT後、および治療の長期的効果を確認するために最後のFMTから4～6ヵ月後に測定された。カルプロテクチン値が200μg/gを超えると、患者の炎症状態を示す。したがって、患者の状態の改善は、FC値が200μg/gをはるかに超えていたのが、この閾値以下に大幅に低下することで定義される。最後のFMT後の最終的な寛解は、PDAIスコアが7を下回ることで特徴付けられた（表S1シート1）。

RNA抽出と配列決定
RNAは、PowerMicrobiome RNA Isolation Kit（MoBio社製）を用いて、[34]に従って抽出した。その後、Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Epidemiology)(Illumina、米国)を使用し、製造元の指示に従ってエタノール沈殿でrRNAを枯渇させた。ペアエンドmRNAイルミナシーケンスライブラリーは、ScriptSeqキット（イルミナ）により作成した。HiSeq 2500シーケンサープラットフォームを使用して、鎖特異的2 × 110 bpペアエンドシーケンスリードを作成した。

シーケンスリードの品質管理と前処理
生シーケンスデータからプライマーとシーケンシングアダプターをトリミングし、続いてFastq-Mcf（https://github.com/ExpressionAnalysis/ea-utils）[35]を用いて、リードの5′および3′末端からスコア<20の低品質塩基をクリッピングした。rRNAリードはSortMeRNA v2.0[36]を用い、デフォルトのパラメータ設定で除去した。ヒトのリードは、Krakenを用いてヒトリファレンスに対してリードを割り当てて除去した。

リファレンスデータベースの構築
IGCデータベースはヒト腸内細菌叢の包括的な遺伝子カタログを提供している[23]。この非冗長遺伝子セットは機能的および分類学的にアノテーションされており、ヒト腸内細菌叢の分類学的および機能的多様性を高解像度で概観できる。さらに、このデータベースにより、ヒト腸内メタトランススクリプトームデータの分類学的および機能的プロファイリングを行うことができる。IGCを参照データベースとして使用した場合、BWA-MEMで推定される微生物mRNAリードの86.71%をマッピングすることができた[24]。さらにマッピング率を向上させるために、IGC59Gという参照遺伝子カタログを構築した。IGC59G構築のパイプラインを図S1Aに示す。IGCにマッピングする前に、品質管理されたリードをKrakenを用いて、NCBI RefSeqデータベースの全細菌、古細菌、ウイルス、プラスミド、真菌、ヒトゲノムを含むKraken-BVAHPFと呼ぶデータベースに分類学的に割り当てた。Krakenを用いることで、品質管理されたリードの43.82%のみが分類され、そのうち3.78%はヒト宿主由来のものであったため、除去された。興味深いことに、IGCデータベースにマップされなかったリードのうち、54.33%はKraken-BVAHPFを用いてKrakenで分類できた。そこで、IGCデータベースとKrakenデータベースに基づいて、より包括的なデータベースを構築した。そのために、Krakenデータベースにおいて、どのサンプルにおいてもIGC unmapped readsが10万以上割り当てられている種の代表的なゲノムを抽出した。全部で59ゲノムあった。Roary[37]とCD-hit[38]を用いて、これら59ゲノムのコード配列（CDS）を同一性0.95、カバレッジ0.9でクラスタリングした。得られた非冗長遺伝子をBLASTNを用いてICG遺伝子とマッピングし、59ゲノムから冗長遺伝子を除外した。同一性が95%以上、カバレッジが90%以上の遺伝子を除外した。最終的に、これら59ゲノムから60,658の未マッピング遺伝子をICGデータベースに追加し、最終的な遺伝子カタログIGC59Gを構成した。この改良されたデータベースとショートリードアライナーBWA-MEMを使用することで、非ヒトリードの87.91%を割り当てることができた。特にCG_2_92, DW_1_-1, DW_1_27では10%以上のアライメント率向上が見られた。

参照遺伝子の分類と機能アノテーション
IGCデータベースのアノテーションが数年前に行われて以来、NCBI RefSeqデータベースは拡大を続けている。また、IGCのオリジナルの分類情報には生物種レベルが含まれていない。そこで、IGC59Gデータベースについて、遠心分離機[25]を用いて分類を行った。ヒト、細菌、古細菌、ウイルス、真菌のゲノムを2020年3月18日にNCBI RefSeqからダウンロードし、各参照遺伝子配列について不足している分類学的情報の更新と種の割り当てに使用した。Centrifugeは、短いリードと長い配列の両方について、高い精度で分類学的情報を割り当てるために使用できる。スコア > = 200およびhitLength/queryLength > = 0.2のヒットが考慮された。酪酸生合成遺伝子の発現を調べるため、DIAMOND[39]を用いて参照遺伝子のアノテーションを行った（パラメータ：-id 60 -e 1e-9 -query-cover 70）。酪酸生合成遺伝子の配列とアノテーション情報は、ヒトマイクロバイオーム由来の149生物種から2766個の酪酸生合成遺伝子を収集した先行研究[40]からダウンロードした。これらの遺伝子は28のオルソログ遺伝子と4つのパスウェイに属している。IGC59Gの追加遺伝子に対するeggNOG, KEGGアノテーションは、酪酸生合成遺伝子アノテーションに用いたのと同じ基準で、eggNOG, KEGGタンパク質データベースに基づいてDIAMONDを用いて行った。

遺伝子発現プロファイルを計算するために、非ヒトリードを参照遺伝子データベースに対してマッピングした。メタトランスクリプトームの分類学的構成は、参照データベースの各遺伝子の分類学的情報に基づいて決定した（図S1B）。PRIMER-ANOVA +を用いて、優性度、多様性、Bray-Curtis類似度、PCoAの解析を行った[41]（図S1B）。サンプルDW_2_1、JM_1_14、JM_2_20は、マップされたリード数が1,000万以下であったため、PCoAから除外した。Bray-Curtis類似度が55%以上のコミュニティを類似とみなした。

発現差の計算とKEGGパスウェイ解析
ドナーと袋体炎の間で差次的に発現している遺伝子を同定するために、リードカウントに基づいてALDEX2を用いて差次的発現（DE）解析を行った。ALDEX2[42]は、トランスクリプトームおよびメタトランスクリプトームデータを含むハイスループットシーケンスデータ用のANOVAライクなツールである。ALDEX2は、条件間で差次的に発現する遺伝子を同定するために、CLR変換したリードカウントに対して統計的検定を行う。平均リードカウントが1以上の遺伝子のみが考慮された。ALDEX2で計算された結果の頑健性を確認するために、RパッケージのedgeR [43]をDE解析に追加使用した。ALDEX2もedgeRも、比較的控えめなサンプルサイズのデータセットを含む解析に適している。興味深いことに、edgeRはALDEX2の10倍以上のDE遺伝子を検出し、ALDEX2で予測されたDE遺伝子の約90%はedgeRでも同定された。したがって、下流の解析では、より厳密であることが明らかなALDEX2の結果を使用した。FMTデータセットでは、FDR < = 0.05（偽発見率：Benjamini-HochbergによるWilcoxon検定のp値補正）の遺伝子を有意に発現が異なるとみなした。HMP2データセットはサンプルサイズがはるかに大きいので、より厳密なFDRカットオフ0.01を用いた。KEGGパスウェイの濃縮解析には、RパッケージClusterProfilerを使用した。FDR < = 0.05のパスウェイまたはモジュールのみを有意に濃縮されたものとみなした。ドナーおよび袋炎におけるF. prausnitziiのeggNOG遺伝子発現を解析するために（図6A）、リードカウントに対して以下のようにCLR変換を行った：

ここで
は遺伝子
そして
は全遺伝子の幾何平均である。

考察
健康なヒトの腸内細菌叢は長期的には安定しており、環境条件（例えば、食物、生活様式、医療介入）の変化に対して迅速に、しかし通常は一過性に反応する [44] 。病原性の条件下では、分類群の相対的な存在量が特徴的に変化する [46] 。したがって、腸内細菌叢を健康に保つことは、肥満、慢性炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸がん、神経疾患など、様々な疾患や機能不全を予防したり、治癒させたりする可能性がある [47, 48]。したがって、食事介入、プロバイオティクス、あるいはFMTによって腸内細菌叢の組成を変化させることは、大きな関心を集めている。FMTの場合、高度に多様で複雑な微生物叢が、介入時にはdysbioticな腸内微生物群を持っている宿主に移植されるが、それにもかかわらず、安定した回復力のある状態に発達している可能性がある [44, 49]。

ここで我々は、メタトランスクリプトーム解析を用いて、FMT前およびFMT中の健常ドナーと袋体炎患者の便微生物叢の時間分解縦断的症例研究を初めて行った。この臨床適応に関しては、大規模なコホート研究はまだ行われておらず、現在進行中の臨床試験はほんの一握りである。我々の研究では、まずFMT前患者と健常ドナーのメタトランスクリプトームを比較した。次に、FMT後の活性変化について、治療に対する反応がそれぞれ異なるため、患者一人一人に焦点をあてて検討した。このアプローチは、FMTに対する患者固有の反応を正確に捉え、一方で、すべての患者に共通するパターンと傾向を特徴付けた。メタゲノム研究とは対照的に、我々は微生物の遺伝的可能性ではなく、実際の活性を観察した。メタトランスクリプトームは、ゲノムの潜在能力と実際の活性とのギャップを埋めるだけでなく、重要な遺伝子や機能、そしてその根底にある微生物の役割に焦点を当てることを可能にする。例えば、大腸がんでは、コリバクチン産生大腸菌、腸内毒素原性バクテロイデス・フラジリス、フソバクテリウム・ヌクレアタムの腫瘍促進作用は、その種の一部の株にしか見られない一握りの特定の遺伝子に突き止めることができる[50]。

我々のデータは、FMT直後の患者において、ドナー微生物の活性が顕著に移植されたことを示している。PCoAと遺伝子発現プロファイルに基づくクラスタリングから、FMT直後の患者の微生物叢活性は、それぞれのドナーのそれと区別がつかないことが示された（FMT2後のDWを除く）。さらに、治療前にドナーでは高発現だが袋炎患者では低発現であることが示された経路や機能モジュール（例えば、酪酸、アミノ酸、補酵素、ビタミンB複合体の合成）は、FMT後1～2週間で高発現した。我々は、FCレベルとFMT後の活性生着との間に顕著な関連を見出した。特に、FCレベルが高くなるのは、レシピエントの活性プロファイルがドナーから乖離したときに起こる傾向がある。

我々は、健康時と袋炎時の違いを決定づけた属、すなわちパラバクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブラウチア属、アリスティペス属、フェーカリバクテリウム属、エッゲルトヘラ属、バクテロイデス属、ロゼブリア属、コリンセラ属、ユウバクテリウム属を同定した。これらの属は、Eggerthellaを除き、メタトランスクリプトームで最も活性の高い25属に含まれていた。Eggerthella lentaは、特異的なオペロンを発現することで、腸内で心疾患治療薬ジゴキシゲニンを不活性化できることが示されている[51]。また、腸内でリグニンや植物由来の代謝産物の代謝に重要な役割を果たしている [52]。一方、E. lentaは新興の病原体であり、血流感染症を引き起こす可能性があり [53, 54]、関節リウマチとの関連も指摘されている [55]。Eggerthella属は、健康な状態と袋炎との間の活性変化の重要な原動力であったため、定義された組成のプロバイオティクスにおいて有用な成分である可能性がある。しかし、種の選択と種内の菌株の選択が最も重要である [56]。

我々のデータは、FMT後に直接ドナーの微生物叢が特異的に生着していることを示しているため、DKSがDSSと比較して優れたドナーなのか、あるいはその逆なのかを検討した。潰瘍性大腸炎患者に対するFMTに関する研究では、寛解に至った9人の患者のうち7人が同じドナーからFMTを受けており[57]、そのためスーパードナーであると推測された[58]。われわれのデータでは、2人の患者がドナーDKSからのFMTにあまり反応しなかったが、ドナーDSSからのFMT後にFC値が劇的に低下した。DKSのもう一つの潜在的な問題は、そのコミュニティーにHCMVの配列が含まれていたことである。HCMVは2回目のFMT前の患者JMでも活性があった。HCMVは二本鎖DNAウイルスであり、ほとんどの成人は一生のうちにHCMVに感染したことがある[59]。初感染後はほとんど遺伝子が転写されないまま生涯にわたって体内のリンパ球に潜伏し、宿主の免疫が抑制されると反応性を示すようになる。ドナーDKSと患者JMのHCMV陽性検体では、すべてのHCMV遺伝子が活性であった（表S1シート6）。

F. prausnitziiはルミノコックス科の偏性嫌気性菌で、健康な大腸微生物叢全体の約5％を占め[60]、その範囲は新生児で0.96％、成人で7.6％である[61]。潰瘍性大腸炎 [62] やクローン病 [63] では、F. prausnitziiの減少が認められている。F. prausnitziiは炎症反応を抑制することができ [64]、腸粘膜の完全性をサポートする短鎖脂肪酸である酪酸を産生する [65] 。したがって、食事改善、プロバイオティクス、糞便微生物叢移植（FMT）などによる介入を行う有力な候補である [66, 67]。F. prausnitziiは、総転写産物量の点で、袋炎患者と比較して健常ドナーの方がはるかに活性が高く、ドナーのDKSでは特に活性が高かった。さらに、F. prausnitziiは健康時と袋炎時で異なる活性を示した。主にアセチルCoA経路を介した酪酸合成に関与する8つのeggNOG遺伝子の発現レベルは、袋炎では低く、各FMT直後には上昇していた。FCレベルに代表される臨床転帰は、酪酸合成活性の生着と相関しているようである。F. prausnitziiは偏性嫌気性菌であるため、酸素の存在下では増殖できない [68]。腸内の酸素濃度が大きく変化すると、偏性嫌気性菌の生存や発酵能に大きな影響を及ぼす [69] 。腸内の酸素濃度の上昇は、炎症性腸疾患に典型的なディスバイオシスを引き起こすことが示唆されている [70, 71]。

健康状態では、これまで二次胆汁酸の形成に関与すると考えられていたbaiNやcbhなどの遺伝子が、ブラウチア、フェカリバクテリウム、アリスティペス、コリンセラで発現上昇していた。実際、二次胆汁酸の形成に関与する酵素が同定されたのはごく最近のことであり[72]、これまでの仮定とは異なり、Lachnoclostridium scindensで3-デヒドロ胆汁酸Δ(4,6)-レダクターゼ[73]をコードするものとして同定されたbaiNは、明らかに二次胆汁酸の形成には関与していない。従って、様々な細菌がbaiNに類似した遺伝子をコードしていることが観察されており、baiA-I遺伝子の存在はbaiNの機能が異なることを示している。炎症性腸疾患における胆汁酸プロファイルの以前の解析では、健常人と比較して共役胆汁酸のレベルが有意に増加していることが観察されており、これは疾患における脱共役活性の低下を示している [74] 。

寛解にはFMTを繰り返す必要があった。臨床エンドポイントでは、ドナー共同体の生着率は3人の患者で異なっていた。患者DWでは、最後のサンプリング時点におけるコミュニティ活性プロファイルは健常ドナーのそれと同様であった。他の2人の患者は、共に安定した寛解状態にあると報告されているが[14]、最終的なコミュニティは治療前の状態ともドナーコミュニティとも異なっていた。CDIの治療としてのFMTカプセルの長期生着に関する解析でも同様の所見が報告されており、そこでは18人の患者全員が安定した寛解状態にあったが、ドナー微生物叢の生着は61％でしか観察されなかった[75]。患者の便微生物叢がまだ安定していなかった可能性がある[76]。健康な状態に戻った患者からのサンプルがなかったため、便群集の活動が元の個々の状態に向かって進化しているかどうかを判断することはできなかった。寛解によって患者の食習慣が回復し、腸内細菌叢が変化する可能性もある [77]。

長期的には、ドナーのスクリーニングに費用がかかることや、不要な遺伝形質が移行するリスクを避けるために、FMTではなく、十分に特性化された菌株からなるプロバイオティクスを使用すべきである。本研究で得られた知見は、プロバイオティクスの設計に役立つものである。健康な便微生物叢は高い多様性を特徴としており、その回復力は、必須機能の合成が単一の種に委ねられているのではなく、したがって危険にさらされているのでもなく、異なる適応と生態学的ニッチを持つ種のコンソーシアムによって提供されているという事実に負っている（保険理論）[3, 18, 44, 49]。従って、健康な場合と比較して、袋炎におけるKEGGパスウェイの活性変化に対する豊富な微生物分類群の寄与を分析したところ、調査した各活性変化に複数の属が寄与していることがわかった。実験室条件下で目的の形質を最も強く発現している単一の種を探すという従来の方法では、このような複雑性は説明できない。高性能の単一菌株ではなく、シャノン多様性の大きい多種類のプロバイオティクスを提供することで、生着する可能性が高まるかもしれない。

サンプル数が少なかったため、袋炎および関連疾患における活性変化に関する追加的証拠を探した。この目的のため、HMP2プロジェクトで得られたUC患者（n = 53）と健常対照者（n = 53）のディスバイオティック・マイクロバイオーム活性プロファイルを比較した。IPAA手術後の袋炎患者は、UC患者や健常人と比べて解剖学的構造が変化している。しかし、袋炎の基本的な病態はUCに根ざしており、しばしば袋回腸粘膜内の「UCの再発」と考えられている [27] 。いくつかの違いはあるものの、袋炎とUCは、その臨床的および病理学的特徴においてかなりの重複を示す [28] 。この密接な病理学的関連性から、袋炎患者とUC患者の便中マイクロバイオームは、それぞれ異なるものの、健常人のそれよりも多くの類似点を共有しているはずであることが示唆される。興味深いことに、袋炎患者で観察されたのと同様の活性変化が、UC患者のHMP2データセットでも見られたが、これらの変化に寄与した主な分類群は異なっていた。微生物群集の分類学的組成、機能的潜在能力、実際の機能的活性の間に複雑な関係があることを強調する研究が増えている。異なる被験者から採取した口腔内と便の微生物叢を分析した結果、メタ転写プロファイルは著しく個人特異的であり、その変動性はDNAレベルの機能プロファイルと微生物組成の中間に位置することが浮き彫りになった [78]。その後、IBD患者の腸内細菌叢を調査した研究では、機能的可能性とメタトランスクリプトーム発現の間に一般的な一致が見られるが、特定の分類群ではDNAとRNAの存在量に弱い相関が見られることが明らかになった [18] 。ヒトの糞便微生物叢に関する別の研究では、メタトランスクリプトームにおける発現量に基づいて、経路を「コア」と「可変」のサブセットに分類し、「コア」の経路はしばしば異なる微生物によって転写されることが明らかになった [79]。膣内細菌叢に関する我々の以前の調査では、分類学的なばらつきがあるにもかかわらず、細菌性膣炎では被験者間で全体的な活性プロファイルが驚くほど一致していることが示唆された [80]。我々は、同じような環境と宿主の条件下では、たとえ分類学的構造が異なっていても、コミュニティは「中核的」機能に対して同じような発現パターンを示すことができるという仮説を立てた。この現象は、ほとんどの微生物種の遺伝的潜在能力に内在する冗長性に起因すると考えられる。Schirmerと共同研究者らはまた、腸内環境における病気に関連した変化が、時には機能的可能性を変えることなく、異なる生物種や経路にまたがる微生物の発現に影響を与える可能性があることを明らかにした [18]。同様に、マウスの研究では、宿主の遺伝子シフトが、分類学的に大きな変化を伴わずに、腸内微生物の遺伝子発現を変化させることが観察された [81]。これは、微生物の遺伝子発現は宿主の状態変化に迅速に適応する傾向があり、しばしば機能的潜在能力や分類学的構造の変化に先行するためと考えられる。したがって、メタトランスクリプトームは、メタゲノム解析では見落とされる可能性のあるシグナルを捉え、疾患に関連した微生物のシフトについて、迅速かつ全体的な洞察を提供する。

我々の研究では、プラセボFMTを受けた対照患者からメタトランスクリプトームを得ることは現実的ではなかった。しかし、2つの異なるドナーの便から調製した便で治療を受けた患者DWについては、メタトランスクリプトームの生着率と臨床転帰との間に相関が認められた。最初のFMT治療（ドナーDKS）は、FC値が有意に低下しなかったこと（FMT1後のFC>200、図2A）から明らかなように、有効ではなかった。この効果の欠如は、PCoAにおける活性組成の分岐（図2Bと3）と酪酸生合成遺伝子の発現欠如（図5）を示したメタトランスクリプトームデータによって裏付けられた。その後、同じドナーを用いたFMT治療でも、患者の活性プロファイルをドナーに合わせることはできなかった。その後、患者は別のドナー（DSS）による治療を受けたが、その結果、FMT3後4週間のFCレベルは非常に低かった（図2A）。FMT3後30日目の活性プロファイルはドナーのものと似ており（図2Bと3）、酪酸生合成遺伝子の発現は比較的高かった（図5）。便微生物叢の株分解メタゲノム解析に基づいてCDI患者におけるFMT治療の有効性を検討した最近の研究では、FMTの成功例はFMTの失敗例に比べてドナー株の生着率が有意に高いことが強調されている[82]。この所見を補完するように、患者DWに関する我々のデータでも、FMT中の活性生着のパターンが同様であることが明らかになった。これらの観察結果は、メタトランススクリプトームレベルでのドナー生着がFMTの成功に重要である可能性を示唆している。しかし、同じ初期ドナーがJM患者にも有効であった。また、患者DWのFMT成功の原因は、ドナーの変更以外の要因を排除することはできない。

2019年現在、FMTの有効性を検討した臨床研究は3件のみである[83]。2件が顕著な改善なし、または症状の軽度の緩和のみを報告しているのに対し、Stallmachら[14]は、異なるドナーを用いて内視鏡的FMTを繰り返した結果、80％の患者（4/5）が3ヵ月以上の寛解を経験したことを観察している。ドナーの選択、FMTの方法、FMTの頻度などが、こうした違いの理由として議論されている [12, 84]。その後に行われた最初の無作為化概念実証試験では、初回の内視鏡的FMTに続いて、同じドナーからの便カプセルを2週間毎日投与したが、抗生物質を含まない臨床的寛解を達成したのは6人中1人だけであった [11] 。2021年に行われた2回目の無作為化二重盲検試験では、プラセボFMTと治療FMTで同様の結果が得られた [17] 。今日、9つの研究を考慮しても、まだ明確な結論は出ていないが［85］、抗生物質耐性袋炎の治療法としてFMTを否定するのは時期尚早である。FMTはrCDIに対しても有効であることが証明されている［86］。しかし、袋炎やUCの病因はもっと複雑で、宿主の遺伝、環境因子、患者の健康なマイクロバイオーム、そして袋炎の場合は手術が関係している。また、機能的な情報が限られている16S rRNAマーカー遺伝子に依存しているため、マイクロバイオームにおけるディスバイオーシスはよく理解されていない [88] 。重要な課題は、袋炎にとって "理想的な "ドナーを特定すること、あるいは特定の患者における袋炎にとって理想的なドナーを特定し、この治療を個別化医療の選択肢とすることであろう。上記で報告された無作為化臨床研究では、複雑さを軽減するために、当然のことながら単一のドナーが用いられている。我々の研究は、FMTにおける異なるドナーの生着率をメタトランススクリプトームレベルで検討した最初の研究であり、ドナー選択の重要性を強調している。

本研究で得られた知見は、厳密な統計学的アプローチを用いて得られたものであるが、結論は、症例研究という性質上、すなわちサンプル数が少なく、考慮できなかった多くの潜在的交絡因子のために、慎重に解釈されるべきである。しかしながら、この研究は、将来、より大規模なコホート研究を実施し、袋体炎のFMTの臨床的成功に寄与する主要な微生物因子と関連する活動をより包括的に理解するための基礎を築くものである。

結論
我々の研究では、FMTのたびに、短期間ではあるがドナー腸内細菌叢の活性が明らかに移植されることが示された。アミノ酸、補酵素、ビタミンB群、酪酸の生合成のような重要な機能に対する活性の変化は、いくつかの分類群によってもたらされたが、そのうちのいくつかはすでにプロバイオティクスの可能性が示されている。F. prausnitziiからの酪酸生合成活性の生着は、患者の炎症状態とよく相関していた。この結果は、FMTを繰り返すことにより、袋炎の微生物叢が健康な状態へとシフトすることを示唆している。将来的には、ドナーのスクリーニングに費用がかかることや、不要な遺伝物質が移行するリスクを回避するために、FMTではなく、十分に特性化された多数の菌株からなる分類学的多様性の高いプロバイオティクスを使用すべきである。

データと材料の入手可能性
全てのシーケンスデータは、European Nucleotide Archive (ENA)のアクセッション番号PRJEB48996から入手可能。

略号
FMT：
糞便微生物叢移植

CDI：
クロストリジオイデス・ディフィシル感染症

IBD：炎症性腸疾患
炎症性腸疾患

UC：潰瘍性大腸炎
潰瘍性大腸炎

IPAA
回腸囊肛門吻合術

ABT
抗生物質治療

PCoA
主座標分析

DE：
分化発現/発現

CLR：
中心対数比

IGC：
統合遺伝子カタログ

HCMV：
ヒトサイトメガロウイルス

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参考文献のダウンロード

謝辞
本研究のためにサンプルを提供してくれたボランティア、および優れた技術支援をしてくれたBettina Elxnatに感謝する。Frank Pessler（TWINCORE Center for Experimental and Clinical Infection Research、ドイツ、ハノーバー）には、このプロジェクトに取り組むよう勧めていただき、また多くの刺激的な議論を交わしていただいたことに感謝したい。HZIのシークエンシング施設には、彼らのたゆまぬサポートに感謝している。また、Michael JarekとJürgen Tomaschには、この研究の多くの側面について専門的な助言をいただいた。

資金提供
Projekt DEALによるオープンアクセス資金援助。この研究は、革新的医薬品イニシアティブ共同事業（Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking）の助成金契約番号[115523]、COMBACTE (www.combacte.com)によって支援された。その財源は、欧州連合（EU）の第7次枠組み計画（FP7/2007-2013）からの資金拠出とEFPIA企業の現物拠出である。また、Deutsche Forschungsgemeinschaftの共同研究センターRoseobacter（TRR 51）からも資金提供を受けた。

著者情報
著者および所属
ドイツ、ブルンスウィック、ヘルムホルツ感染研究センター、感染研究のための計算生物学グループ

鄧志洛

ドイツ、ブルンスウィック、ヘルムホルツ感染研究センター、微生物相互作用・プロセスグループ

ディートマー・H・ピーパー

イエナ大学病院IV内科（消化器・肝臓・感染症）、ドイツ・イエナ

アンドレアス・シュタルマッハ＆アルント・シュトイベ

ハノーバー医科大学医療微生物学・病院疫学研究所（ドイツ・ハノーバー

マリウス・ヴィタル

微生物コミュニケーショングループ、ヘルムホルツ感染研究センター、ブルンスウィック、ドイツ

ミヒャエル・レック

ドイツ、ケルン、テュフラインランド

ミヒャエル・レック

ブラウンシュヴァイク工科大学微生物学研究所（ドイツ・ブランズウィック

イレーネ・ワグナー・デブラー

貢献
Z-LDが解析を行い、原稿の第1稿を執筆した。DHPは16S rRNA遺伝子のアンプリコンシーケンスデータを提供した。ASとASはFMTを実施し、便サンプルと臨床データを提供した。MVは検体と臨床情報を収集・管理した。MRはRNAの抽出と塩基配列を決定した。IW-Dは本研究を計画・監督した。すべての著者が最終原稿に貢献し、承認した。

責任著者
Zhi-Luo Dengまで。

倫理申告
倫理承認および参加同意
該当なし。

発表の同意
該当なし

競合利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。

その他の情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保つ。

補足情報
追加ファイル1：図S1.
リファレンスデータベースの構築とメタトランスクリプトームデータ解析のワークフロー。(A)IGCに基づく遺伝子データベースの構築と機能および分類の割り当て。Kraken BVAHPFは細菌、ウイルス、古細菌、ヒト、プラスミド、真菌のNCBIゲノムから構築されたKrakenデータベースを表す。(B) メタトランスクリプトームデータ解析ワークフロー。図S2. 患者CG（A）、DW（B）、JM（C）の発現遺伝子（転写産物）の属（左）および種（右）レベルでの分類学的構成。各患者の最も活性の高い上位12属が示されている。これらの属は分類学的に割り当てられたリードの90%以上に寄与した。相対的存在量は、各サンプルのマップされたリードの総数で正規化した。バーの空白部分は、平均存在量が1%未満の属と未知の分類群を表す。種レベルでは、平均転写産物量の多い上位17種のみを示した。図S3. 16S rRNA遺伝子配列決定（属レベル）に基づく患者CG、DW、JMの群集の構成。図S4. 患者CG（A）、DW（B）、JM（C）およびそれぞれのドナーの属レベルでの累積順位存在量曲線。図S5. 患者DW、JMおよびドナーにおけるサイトメガロウイルスリードの相対的存在量。図S6. 遺伝子発現プロファイルに基づいてPCoAで可視化したコミュニティの時間的ダイナミクス。軌跡線は、異なるFMT処理の時点にわたってサンプルをつないでいる。各FMTの開始はイタリック体で示し、「sample FMT」カラーコードで色分けしている。sample status "凡例では、形状は異なるサンプルを示し、色はステータスを示す。各FMTで使用されたドナーサンプルはマークされ、緑色で着色されている。ABTは抗生物質治療。全マッピングリードの92%を占める上位20万個の発現遺伝子を考慮した。図S7. 本研究における健康時と袋炎時（A）、およびヒトマイクロバイオームプロジェクトにおける健康時と潰瘍性大腸炎時（非UCおよびUC）（B）で、有意に異なる制御を受けた上位KEGGパスウェイ。ドットの大きさは、差次的に発現したKO遺伝子の数を表す。色は調整p値（FDR）を示す。x軸の遺伝子比率は、与えられたパスウェイにおける差次的に発現したKO遺伝子の数を、差次的に発現したKO遺伝子の総数で割ったものである。赤色のパスウェイはパネルAとBで共有されている。KEGGモジュールは、健康な場合と比較して、子宮内膜炎（A）とUC（B）で有意に変化した。赤色のモジュールは両方のデータセットで濃縮されている。図S9. FMT治療前のドナーと患者における酪酸遺伝子発現。遺伝子の相対発現レベルは、行ごとにzスコアでスケーリングした。図S10. 全サンプルにおける健常時と袋炎時のDE酪酸合成遺伝子の発現。全トランスクリプトームから、袋炎で差次的に発現した酪酸合成遺伝子（表S1シート10）を抽出し、FMT中の発現レベルをここに示す。上部の棒グラフは、そのサンプルで差次的に発現したすべての酪酸合成遺伝子の相対発現の平均を示す（サンプルあたりのマップされたリードの総数で正規化）。カラーコードは、寄与した属、パスウェイ、遺伝子を示している。ヒートマップ内の値は、各属の全遺伝子の相対発現をzスコアでスケーリングしたものである。図S11. 胆汁酸代謝に関与するDE遺伝子の全サンプルにおける健常時と袋炎時の発現。図S12. 全サンプルにおける健常時と袋炎時のDEビタミンB12合成遺伝子の発現。図S13. 全検体における健常時と袋炎時のDEビタミンB6合成遺伝子の発現。図S14. トリプトファン代謝に関与するDE遺伝子の全検体における健常時と袋炎時の発現。図S15. すべてのDE遺伝子の発現を属ごとにグループ化したもの。上の棒グラフは全属の遺伝子の発現の合計を示し、右側の棒グラフは各属のDE遺伝子の数を示す。相対リードアバンダンスが0.1%以上の属をすべて示した。図S16. トリプトファン代謝に関与する全遺伝子の発現を属ごとにグループ化したもの。図S17. FMT中のF. prausnitziiにおけるCOGカテゴリーの相対発現レベル。相対発現量は、あるCOGカテゴリーの総リード数をF. prausnitziiの総リード数で割って算出した。

追加ファイル2：表S1。
すべてのシートを以下に示す。シート1. 臨床メタデータ。シート2. 検体の説明。シート3. リードマッピング統計シート 4. 門のリード数シート5. 属のリード数シート6. サイトメガロウイルス遺伝子の発現。シート7. ドナーと袋体炎で発現が異なる遺伝子。シート8. KEGGパスウェイとモジュールの濃縮度。シート9. HMP2 IBDMデータセットにおける、UCと比較して健康で濃縮されたKEGGパスウェイとモジュール。シート10. DE酪酸生合成遺伝子のドナーと袋炎との比較。シート11. DE胆汁酸代謝遺伝子シート12. DEビタミンB12生合成遺伝子シート13. DEビタミンB6生合成遺伝子 14シート DEトリプトファン代謝遺伝子シート15. F. prausnitziiにおけるeggNOG遺伝子の発現変化。

権利と許可
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この記事の引用
Deng,ZL.、Pieper,D.H.、Stallmach,A.他、慢性抗生物質抵抗性袋炎における複数回の糞便微生物叢移植による必須機能の移植-メタトランスクリプトミクスを用いたケーススタディ。Microbiome 11, 269 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01713-9

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受領
2022年12月28日

受理
2023年10月30日

発行
2023年12月01日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-023-01713-9

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キーワード
メタトランスクリプトーム
糞便微生物叢移植
袋炎
移植
活性変化
酪酸生合成
胆汁酸代謝
フェカリバクテリウム・プラウスニッツィー
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618

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投稿に関するお問い合わせ: lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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