ヒトとマウスの腸管に存在するMHC II制限のある自然発生的な常在反応性T細胞の保存された集団

哉百名


ヒトとマウスの腸管に存在するMHC II制限のある自然発生的な常在反応性T細胞の保存された集団

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36463279/

カール・フィリップ・ハックステイン、ダナ・コスティガン、エミリー・E・ソーントン

論文追加情報

関連データ
補足資料
データ提供について
要旨
常在細菌との相互作用は、多面的に宿主免疫を形成し、ヒトの健康や疾病に極めて重要な役割を果たす。組織内に留まる抗原特異的T細胞は、局所的な刺激に反応するように準備されており、その表現型は宿主と微生物との関係において重要である。我々は、ヒトとマウスの結腸において、MHC-IIに制限された常在菌反応性T細胞が、自然免疫系に類似した転写および機能的特徴を獲得していることを明らかにした。この細胞集団は、ヒトおよびマウスの大腸に豊富に存在し、古典的なTh1-およびTh17-サイトカイン、細胞障害性分子、上皮恒常性調節因子などの多機能なエフェクター特性を備えている。この表現型を持つT細胞は潰瘍性大腸炎患者で増加し、その存在はデキストラン硫酸ナトリウム投与マウスの病態を悪化させることから、大腸炎における病原性の役割を示唆している。今回の発見は、腸管免疫監視の最前線に位置し、微生物や局所サイトカイン環境の見張り役として働く自然免疫様細胞のスペクトルを広げるものである。

専門用語 細胞性免疫、粘膜免疫学、T細胞、MHCクラスII
はじめに
腸の粘膜表面には、宿主の細胞よりも数が多い無数の常在菌が生息しており、特定の栄養素を代謝したり、潜在的な病原性微生物の増殖を抑えたりする上で重要な役割を担っている1,2。このユニークな環境では、宿主組織にダメージを与える過剰な炎症プロセスを回避しつつ、腸管内腔内に微生物を封じ込めるために抗菌免疫反応を必要最小限に制限する、微妙なバランスが要求される3。微生物抗原に反応するMHC II制限CD4+ T細胞は、腸の主要な免疫細胞集団であり、恒常性と慢性炎症の両方において重要な役割を果たすことが示された4。腸内細菌との相互作用がこれらの免疫細胞の表現型や機能をどのように形成するかを解明するために、過去にかなりの努力が払われました。これには、gnotobiotic マウスを用いた実験5-7、抗原特異的内在性細胞を分析する四量体ベースのアプローチ8-10、微生物抗原に対する応答の進化を調べるためのTCRトランスジェニックマウスの利用実験8、11-15が含まれています。これらのツールを用いて、抗原の種類や活性化時の環境が局所的なT細胞の分化に大きな影響を与え、その結果、制御性T細胞（Treg）11,16からTh1やTh17細胞まで、多様な表現型の連続性が生じることがこれまでの研究で明らかにされています8,10。

サイトカインを介したシグナルは、組織におけるT細胞の誘導、制御、維持に重要な役割を担っている17-20。IL-18R1の発現は、リンパ組織のCD4 T細胞と比較して、lamina propria CD4 T細胞でより頻繁に見られ21、IL-18、IL-12、タイプIインターフェロンを介したシグナル伝達は、腸のT細胞の表現型と機能の形成に重要な役割を果たす21,22。このサイトカイン応答性は、従来のMHC制限T細胞が、粘膜部位に濃縮された他の免疫細胞（自然免疫様T細胞など）と共有している特徴であり、TCRを介して細菌産物を認識することも可能である。興味深いことに、常在菌は、トランスジェニックマウスにおいて、多様なTCRレパートリーとPLZF発現を含む自然免疫様特性を持つCD4 T細胞サブセットの拡大を制御することも示されている23。さらに、ヒト胎児組織では、腸管CD4 T細胞に顕著なPLZF+サブセットが確認され24、成人では、多くのヒト大腸CD4 T細胞が、iNKTやMAIT細胞28と同様に、半変動Vδ2集団26、27などのヒト自然免疫様T細胞の主要マーカーであるC型レクチンCD16125を発現していることが分かっている。CD161の高発現とTCR非依存的で自然な方法でサイトカイン刺激に応答するT細胞の能力との関連は、これらの明確に定義されたサブセットに限定されず、すべてのT細胞系譜の小さな集団で観察されることができる29。腸のように刺激物質が豊富な環境でのサイトカイン応答能力は、健康と疾病の両面で重要な結果をもたらす可能性がある。

本研究では、腸内の微生物反応性細胞が、MHCIIに制限された従来のT細胞集団とサイトカイン反応性の自然免疫系T細胞集団にまたがることができるかどうかを解明しようとするものである。ヒト大腸において、微生物反応性CD4 T細胞は高いCD161発現を有し、PLZF発現や、MHCII拘束性で多様なTCRレパートリーを発現していてもTCRシグナルとは無関係にIL-12、IL-18、IL-23などのサイトカインに応答する能力を含む自然型T細胞の主要な特徴を獲得していることを報告する。CD161hi型CD4 T細胞は、いくつかの一般的な常在菌に反応するCD4 T細胞の大部分を占め、これらの細胞は、恒常性および炎症時の抗菌応答の最前線に位置している。興味深いことに、これらのMHC II制限型、自然免疫型、常在菌反応性T細胞（TMIC）を定義する転写シグナルは、既存のTRMシグナルとは強い相関がなく、独自の分化経路があることが示唆された。マウスでは、ヒトTMIC細胞の転写および機能的特徴は、MHC II制限のCD4/CD8ダブルネガティブα/βT細胞集団によって反映されている。興味深いことに、腸内細菌に反応するCbir-TCRトランスジェニックT細胞と、腸内細菌を標的としないヘリコバクター反応性TCRトランスジェニックとを比較すると、腸内細菌反応性細胞のみがマウスの腸内でTMIC表現型を獲得し、微生物抗原の利用状況に依存していることが明らかとなった。ヒトおよびマウスのTMIC細胞は、Th1/Th17混合エフェクタープロファイルを示し、TMIC細胞はマウスの大腸炎モデルの病態に寄与していた。

結果
ヒト微生物反応性CD4 T細胞は、CD161を高レベルで発現している。
腸管には様々な微生物反応性CD4 T細胞が存在し、in vitroでそれぞれの微生物に暴露されるとTNFを産生する30 (Fig. 1A, B)。我々は、従来のCD4 T細胞に焦点を当てることを意図していたので、既知の非従来型T細胞集団に関連するTCR鎖を発現する細胞を除外し、Vα7.2 (MAIT および GEM T細胞により発現), Vα24-Jα18 (iNKT 細胞により発現) および TCRγδ (Supplemental Fig. 1A) が陰性なCD4 T細胞を中心に検討した。大腸菌、黄色ブドウ球菌およびC. albicansに反応する常在菌反応性ヒト大腸CD4 T細胞を調べたところ、TNF陽性CD4細胞の大部分がC型レクチンCD161を平均以上のレベルで発現していることに気づいた（図1A）。CD161を発現する大腸CD4 T細胞は、全体としてTh17の特徴を持つ細胞集団であると以前から言われていたが25、このマーカーを最高レベルで発現する細胞内で抗菌反応が豊富に行われているようだという事実に興味を持ち、腸におけるCD161発現CD4 T細胞の役割をより詳細に研究しようと考えた。この目的のために、我々は大腸CD4集団をCD161陰性、CD161intおよびCD161hi細胞に細分化し、CD161と別のNK細胞マーカーCD56を高レベルで共発現するCD4 T細胞の個別のサブセットで観察されるCD161発現レベルに基づいてCD161hiを定義した（Fig. 1C）。このゲーティング戦略の背景には、CD56の発現を利用して、より大きなCD8 T細胞集団からサイトカイン刺激に対してより高い感受性を持つMAIT細胞のサブセットを引き出すことができるという理論的根拠があった31。CD56の発現はMAIT集団全体の均一な特徴ではないので、ほとんどのアッセイでdouble-positive (DP, CD161hiCD56+) とCD161hi CD56- CD4 T細胞の両方を調査することにした。TNFを発現する微生物応答性細胞は、CD161hiCD56-とDP CD4 T細胞の両方に見られ、TNF陽性で微生物応答性の細胞の頻度は、CD161-またはCD161int細胞のいずれかと比較して、両方の集団で有意に高かった。(Fig. 1D)。互いに比較すると、DP集団内ではTNF陽性細胞の割合が高いという有意でない傾向が見られた。

Fig.
Fig.
ヒト微生物反応性CD4 T細胞はCD161hiであり、自然界に類似した特徴を持つ多機能エフェクター表現型を示す。
つまり、我々のデータは、ヒト大腸微生物反応性CD4 T細胞の大多数が、CD56の発現に差のあるCD161hiの表現型を示すことを示している。

MHC-II制限のあるCD161hi結腸CD4 T細胞は、自然免疫系様T細胞と転写的および機能的特徴を共有する。
さらに表現型プロファイリングを行ったところ、ほぼすべての微生物反応性CD161hi CD4T細胞がIL18Rαを発現しており、一方でIFNγの発現は異なる微生物特異的集団間で異なっていた（図1E, F）。驚くべきことに、我々の実験では、自然免疫系様T細胞の発生と機能を制御する重要な転写因子であるPLZFが、非反応性TNF-細胞の大部分と比較して微生物反応性細胞で高レベルに発現し、またブドウ球菌腸毒素B（SEB、図1G、H）に反応してTNFを作り出すCD4 T細胞と比較して微生物反応性細胞でより高度に発現していたことも判明した。

これらの知見から、これらの抗菌反応が従来のCD4 T細胞の制限要素であるMHC IIに依存しているのか、あるいはMR1やCD1dのような非従来型の抗原提示分子に何らかの役割があるのかを検証することが求められた。MHC II を阻害すると、ヒト大腸CD4 T細胞による微生物誘発性TNF産生が大幅に減少または消失した（図1I, J）。これは、これらの常在菌反応性細胞がMHC-II制限を受けていることを示す以前の研究結果を裏付けるものである30。一方、タイプ I および II の NKT 細胞および MAIT 細胞にそれぞれ抗原を提示する分子である CD1d および MR1 のブロッキングは、抗菌反応に有意な影響を与えなかった。同様に、IL-12とIL-18に対する中和抗体の添加もTNF産生をブロックすることができなかった（Fig. 1I, J）。

このことは、CD161hi CD4 T細胞は、自然免疫系に関連するいくつかのマーカー（CD161、高レベルのサイトカイン受容体、PLZF）を発現しているものの、MHC-II制限CD4 T細胞集団であることを示唆している。

この発見は、この自然発生的な表現型が、グラム陰性プロテオバクテリア（大腸菌）、グラム陽性菌（黄色ブドウ球菌）、酵母（C. albicans）など、ヒト腸内の常在菌とみなされながらも、互いに著しく異なる微生物に反応する細胞集団に見出されたことが興味深い点であった。CD161hiサブセット全体のうち、これらの微生物に反応するのはごく一部であることから（図1A, D）、CD161hi集団にはさらに同じ表現型を持つ細胞集団があり、おそらくこの研究でテストされていない微生物に反応するのだろうと推測された。

この考えを検証するために、先に定義したバルクCD161hi CD4の表現型をより詳細に調べた(Fig. 1C)。微生物特異的サブセットと同様に、バルクCD161hi CD4はより高レベルのPLZFを発現し（補足図1B、C）、中間および陰性の対応するものと比較して、IL18Rαの高発現を示した（補足図1D）。驚くべきことに、ヒト腸管CD4 T細胞のRNAseqは、以前MAIT細胞やヒト血液中の他の自然免疫系T細胞集団29で同定された転写コアサイン（補足データ1）が、CD161hi CD4 T細胞でも同様に強く濃縮されていることを示し、これらのCD4は実際に確立した自然免疫系T細胞サブセットと転写の特徴を共有していることを示唆した（補足 図1F）。

サイトカイン刺激に対してTCR非依存的に応答する能力は、自然免疫系T細胞の重要な機能特性である。そこで、異なる大腸CD4 T細胞サブセットがIL-12/18刺激にどのように応答するかを評価した。バルクCD161hi CD4は、追加のTCR刺激がない場合、IL-12とIL-18の複合刺激に応答することができ（図1K）、応答CD4 T細胞の大部分を占めた（図1L）。CD56+およびCD56-MAIT細胞について報告されたように31、DP CD4T細胞はCD161hi (CD56-) 対応細胞よりも高いIFNγ産生率を示したが、全体として、両方のサブセットの反応はMAIT、iNKTおよびVδ2+γδT細胞などのCD161hi自然型T細胞のサイトカイン誘導、TCR独立反応に類似している。

γδT32-35, iNKT36,37, MAIT38-40, H2-M3-制限T細胞41などの自然免疫系T細胞は、様々な関門器官の組織修復に関与することが示されてきた。ヒトCD4 CD161hi T細胞は、大腸固有層に局在する自然免疫系の特徴を持つ微生物反応性T細胞集団を保持していることを明らかにした上で、刺激により組織修復関連因子も発現するかどうかを評価した。組織修復の制御は、多くの異なるエフェクター分子や経路が関与する複雑なプロセスである。そこで、サイトカイン（IL-12とIL-18）、プレート結合抗CD3抗体、あるいは両者の組み合わせで一晩刺激した大腸CD4 T細胞で、組織修復関連因子39,41の確立した遺伝子リストの発現をマルチモーダル単細胞シーケンス法で解析した（補遺図2）。修復関連因子の遺伝子数は、サイトカイン刺激を受けたCD161hi CD4T細胞ではほとんど影響を受けなかったが（補足図2A）、TCRまたは複合刺激によって、刺激していない対照細胞と比較して発現が増加した（補足図2B、C）。これに伴い、遺伝子セットの濃縮解析（GSEA）を行ったところ、確かに組織修復遺伝子セットはTCRおよびTCR+サイトカイン刺激CD161hi CD4T細胞に濃縮されていたが、サイトカイン単独刺激CD161hi CD4T細胞にはなかった（Supplemental Fig.） 濃縮を促進する最先端遺伝子は、CSF1と2、m-CSFとGM-CSFをコードする遺伝子、VEGFAなどの成長因子、AREG、Amphiregulinをコードする遺伝子であった（補足図2E）。結論として、ヒトCD161hi CD4T細胞は、以前に自然免疫系T細胞に見られた組織修復関連因子を産生するTCR依存性の潜在能力を示していることが判明した。

3人のドナーのTCR配列解析から、バルクCD161hi CD4T細胞は多様なプライベートTCRαおよびβ鎖を使用していることが明らかになった。これは、この集団が膨大な種類の異なる微生物に応答するMHC II制限細胞のプールからなるという考えと一致している。興味深いことに、TCRαの多様性はCD56の発現に関係なく、CD161-CD4 T細胞に見られるレパートリーの多様性と同等であったが、DP CD4 T細胞はそのTCRβ使用法にいくらかの偏りが見られた（補足図2F）。しかし、公開されているTCRβ配列は見つからなかったことから、DPの表現型は異なるTCRを持つCD161hi CD4T細胞に生じ、この集団はプライベートクローンの拡大の結果である可能性があることが示唆された。

さらに表現型解析の結果、CD161hi CD4T細胞の中にRoRγtを発現する細胞が濃縮されていることがわかった（補足図3A, B）。Th17機能の可能性を探るため、CD161hi CD4T細胞を、腸管関連炎症性疾患において極めて重要な役割を果たすサイトカインであるIL-23で刺激した42-45。興味深いことに、IL-23はTCR非依存的にIFNγとGzmBの産生を誘導した（補足図3C, D）。CD161hiのCD4 T細胞は、Th17サイトカインであるIL-17A、IL-17F、IL-22も限定的に産生することができた（補足図3D）。しかし、後者のサイトカインの産生は、TCR刺激に強く依存していた。

生得的なMHC-II制限CD161hi結腸CD4 T細胞は、エフェクターメモリー表現型を示し、古典的なTRM細胞とは異なる転写プログラムを発現している。
フローサイトメトリー解析の結果、CD161hi CD4T細胞の大部分はエフェクターメモリー表現型を示し（Tem、補足図3E）、主要なTcmおよびナイーブ集団も保有するCD161-およびCD161int CD4T細胞とは対照的であることがわかった。CD161hi CD4T細胞が示す組織起源と特徴を考えると、その転写表現型が組織常在記憶T細胞（TRM）に関連する遺伝子シグネチャーの獲得と相関しているのかどうかが気になるところである。そこで、CD161hiおよびDP CD4T細胞とCD161-CD4T細胞における遺伝子発現を比較することにより、CD161hiシグネチャー遺伝子のリストを得た。CD161hiとDP CD4T細胞で有意に発現が上昇した遺伝子（log2 foldchange >2, 調整p値 <0.05, 補足データ2）の間には、KLRB1 (CD161), IL23R, IFNGR1, GPR65、転写因子RORAとBHLHE40など26遺伝子が重複して存在していることが確認された。次に、一般に公開されている2つの腸管単細胞データセット48,49から、CD4細胞における既報の2つのTRM遺伝子シグネチャー46,47の発現を評価した。そして、両方のTRMシグネチャーの発現を、私たちのCD161hiシグネチャー遺伝子モジュールの対応する発現と、単一細胞レベルで比較した。2つの異なるTRMシグネチャーの発現は、予想通り、両方のデータセットで強い正の相関を示した（補足図3F）。一方、CD161hiシグネチャーモジュールは、両方のTRMシグネチャーと弱い相関しか示さなかった（補足図3G, H）。このことから、CD161hi CD4T細胞におけるエフェクタープロファイルと生得的特徴の獲得は、微生物反応性CD4T細胞特有の特徴であり、大腸のTRM-関連遺伝子シグネチャーに固有の構成要素ではないと結論した。

以上のことから、微生物反応性T細胞は、腸管において幅広いサイトカイン応答性を持つ自然免疫系に類似した表現型をとる可能性が示唆された。しかし、ヒトの生体外細胞を用いた実験は限られているため、より広範な生体内実験を可能にするために、MHC-II制限のある自然免疫様常在反応性T細胞（TMIC）の同等のサブセットがマウスに存在するかどうかを明らかにすることにした。

マウスのMHC-II制限型サイトカイン・微生物反応性T細胞はCD4/CD8ダブルネガティブである。
ヒト大腸に見られる微生物反応性T細胞の生得的表現型と、CD161の容易に同定できるマウスオルトログがないことから、IL-23Rレポーターマウスを用いて、マウス大腸唇固有層のサイトカイン反応性従来型（TCRα/β+、CD1dやMR1四量体を染色しない）T細胞集団を同定した（図2A）。IL23R-レポーターシグナルはIL7Rの発現と関連しており、その後、野生型動物のサロゲートマーカーとして使用された。このIL23R+ IL7R+サブセットを定義するためにさらに調べてみると、大多数はCD4もCD8aも表面に発現しておらず（図2A）、IL-23Rレポーター50の腹膜で報告された細胞と同様であった。CD4/CD8 double negative (DN) 細胞は、TCRトランスジェニック株51やループス52や脊椎関節症53のような慢性炎症環境において報告されているが、その機能は依然として謎のままであった。IL-7Rを発現している大腸のDN細胞のサブセットは、NK1.1ではなくIL-18受容体も発現しており、広くサイトカインに応答する集団であることを示している（Fig. 2B）。遺伝子発現解析と細胞内染色により、CD4とCD8の欠如はコラゲナーゼ消化や内在化によるものではないことが示された（補足図4A, B）。我々はMHC-IIブロッキング抗体を用いて、ヒト組織から得た自然免疫系細胞のMHC-II制限を証明したが、B2Mノックアウトマウスを用いることで、既知の自然免疫系T細胞集団の研究である可能性を排除することができた。B2MノックアウトはDN細胞数のわずかな減少を示したが、細胞全体の表現型は同様であり（補足図4C）、これらの細胞がMHC-I、CD1d、MR1に依存していないことが示された。このDN T細胞集団の存在が腸に特異的であるかどうかを調べるために、粘膜と非粘膜の組織部位を調べた。リンパ系器官にはDN T細胞はほとんど見られなかったが、バリア部位には豊富なDN T細胞が存在し（図2C）、肺にも同様に相当数の自然免疫様T細胞集団が存在した（図2D）。

図2
図2
マウスサイトカイン応答性CD4-/CD8-粘膜T細胞は、微生物刺激に応答する。
これらの細胞が表現型的にも機能的にもヒトのサイトカイン応答性細胞と類似しているかどうかを調べるために、フローサイトメトリーおよびin vitro刺激を行った。ヒトの細胞と同様に、マウス大腸DN T細胞はPLZFを発現する集団を含んでいた（Supplemental Fig.4D）。予想通り、これらの細胞はCD3e、Th細胞に関連する転写因子であるZbtb7b（ThPOK）、Zbtb16（PLZF）を発現したが、これらはTCRやIL-23刺激によって変化しないことが判明した。一方、IL-22の産生はIL-23処理によって、IL-17AとIFNgの産生はTCR刺激によって刺激された。GM-CSFはいずれの条件下でも産生された。これらのデータから、DN T細胞集団は、ヒト大腸に見られるサイトカインや微生物に応答する集団と類似しており、サイトカイン環境および/または抗原刺激に基づいてその応答を調整する能力を有することが示唆された（Fig. 2E）。

これらの細胞が、マウス腸管で注目されている微生物応答性T細胞である可能性が高いかどうかを判断するために、我々は、高齢のマウスはより多くの微生物に遭遇し、微生物が固有層に移動するような軽い侮辱を受けているだろうと仮定して、異なる年齢のマウスについて調べた。CD4/CD8 DN表現型を持つT細胞集団全体の割合は、年齢とともに変化しなかったが（図2F）、IL-7Rで示されるサイトカイン応答性表現型を持つ割合は、4週齢から20週齢にかけて顕著に増加し、50週齢までにはさらに増加した（図2G）。逆に、微生物のいない無菌マウスでは、DN T細胞の割合と絶対数が少なかった（図2H, I）。

MHC-IIに制限された微生物反応性細胞は、腸内で自然発生的な表現型を発達させる
腸管関連微生物反応性T細胞の機能をさらに調べるため、そして既知のMHC-II制限微生物反応性T細胞で自然界様表現型が観察されるかどうかを調べるために、我々はCbir1 TCRトランスジェニックマウスに注目した12。Cbir1トランスジェニックT細胞はClostridium cluster XIVa由来の鞭毛抗原を認識し、Rag1ノックアウトバックグラウンド（Rag-/-）と交配すると、トランスジェニックマウスには組み換えの可能性のない一つの特異性のT細胞だけが含まれる。したがって、これらのマウスは、生体内の常在菌反応性MHC-II制限性T細胞の表現型と機能を研究するための理想的なモデルである。B6マウスの結腸で観察されたように、Cbir1マウスの結腸はCD4/CD8陰性細胞の集団を含んでいたが（図3A、B）、TCRトランスジェニックという文脈では、約70%のT細胞がこの表現型を有していた。ヒトやマウスの他の微生物反応性細胞に見られるように、これらの細胞はIL-18 RやIL-7 Rを発現しており（図3A, B）、微生物反応性に加えて広くサイトカイン応答性を持っていることが示唆された。B6マウスのTMIC細胞とは異なり、Cbir1 T細胞は、腸内に存在する単一の常在菌に特異的である。DN表現型は一般に大腸に限定されており、抗原の存在がこれらの細胞の発生や保持に重要であることが示唆された（図3C）。野生型動物のDN T細胞と同様に、Cbir DN T細胞も結腸でPLZFを発現した（図3D）。しかし、肺のDN細胞の一部もPLZFを発現しており、組織間に何らかのクロストークがある可能性が示唆された。B6とCbir1マウスの胸腺を分析したところ、胸腺にごくわずかではあるがTMIC細胞の集団が認められた（補足図3E）。これは、この細胞が他の自然免疫様T細胞と同様に胸腺で発生し、粘膜部位に定着している可能性を示唆している。一方、我々の動物施設では抗原を持たない微生物Helicobacter hepaticusに特異的な別のMHC-II制限TCRトランスジェニックマウス株（Hh-TCR Rag-/-）は、多くのDN T細胞を含まなかったことから、腸での発生や保持には抗原刺激が必要であろうと考えられた（補足図4E,F）。DN T細胞が依然としてTCR/MHC-II依存的にその抗原に応答していることを確認するために、細胞をペプチドを負荷した抗原提示細胞（APC）でin vitroで刺激した。選別されたDN Cbir1トランスジェニックT細胞は、実際にその同族ペプチドに反応し、その増殖はMHC-IIブロッキング抗体でブロックすることができた(Fig. 3E)。ネイティブ抗原に対する増殖がMHC-II依存性であることをさらに証明するために、APCに定常状態またはバンコマイシン処理したマウスの糞をT細胞導入前に一晩与えたところ、増殖は再びMHC-IIブロッキング抗体によってブロックされました（図3F）。このことから、私たちの動物施設にはT細胞が反応する抗原が含まれており、増殖はMHC-IIに依存することが証明されました。これらのデータを総合すると、TMIC細胞はマウスで発生できることが示唆される。

図3
図3
Cbir1、MHC-II制限、微生物反応性TCRトランスジェニックは、腸で自然界に似た表現型を発達させる。
マウスとヒトのTMIC細胞は転写プログラムを共有している
ヒトとマウスのTMIC細胞がどの程度似ているかを調べるため、我々は選別した腸管T細胞集団といくつかの対照集団についてRNA配列を決定した。先に述べたように、共通の遺伝子IDに基づいてヒトとネズミのRNA配列データセットを統合した39,54。このアプローチにより、まず両方のデータセットに存在する遺伝子に着目し、クラスタリングと主成分分析（PCA）に基づき、類似した転写の特徴を持つ細胞集団を同定することができた。この目的のために、CD161の発現が異なる4つのCD4 T細胞集団を含むヒトデータセット（補足図5A）、大腸αβTCR+ CD4およびダブルネガティブT細胞を含むマウスデータセット（補足図5B）、さらにiNKTとImmgen由来のT細胞データセット55を比較対象として統合した。驚くべきことに、CD161intおよびCD161-ヒトCD4 T細胞は、PCA（図4A）または階層的クラスタリング（補足図5C）の最初の2成分に基づいて、ネズミのCD4と一緒にクラスター化し、CD161i CD4はネズミのiNKTおよびDN T細胞により近いクラスター化し、前述の自然型T細胞に共通する転写の特徴、ヒトとネズミTMIC細胞間で共有する転写プログラムの存在が確認される。我々の統合データセットにおける主な分散要因（PC1）は、in vitro αCD3処理を行ったサンプルを除き、ほとんどのImmgen由来のサンプルと我々のサンプルを分けていたため、これらのデータを含めることが、ヒトおよびマウス大腸T細胞のクラスター化の方法に交絡的影響を与える可能性があるかどうかを検討した。しかし、ヒトとネズミの大腸T細胞に限定して解析したところ、ネズミのDN T細胞とヒトのCD161hi CD4 T細胞は、PCAによってそれぞれの対応する細胞から分離され、一緒にクラスター化したため、同様の結果が得られた（補足図5D）。

Fig.
Fig.
ヒトおよびマウスTMIC細胞は、転写の特徴を共有し、エフェクター関連遺伝子の濃縮を示す。
マウスとヒトに見られる微生物およびサイトカイン応答性T細胞に共通する特徴を探るため、PCAでどの遺伝子がクラスター化を促進しているかを解析した（図4A、補足図5C、補足データ3）。PC1が脾臓、リンパ節、胸腺に由来するサンプルと活性化T細胞や大腸由来T細胞を分けていることに関連して、GO-term解析では、T細胞の活性化、分化、接着に関連する過程が主なドライバーであることが示された。全体として、GO: 0042110「T細胞の活性化」は、PC1と最も有意に関連するGOタームであることが判明した（補足図5E、補足データ4）。一方、統合されたデータセット全体で、PC2はより成熟したエフェクター様T細胞タイプ（iNKT、γδT細胞、CD161hi CD4 T細胞、DN）細胞を他の細胞から分離していた。興味深いことに、PCAローディング解析により、データセットに含まれるほとんどのサイトカイン受容体遺伝子がこのPCと正の相関を示した（図4B）。これは、ヒトおよびマウス細胞サブセットのIL-23、IL-12、IL-18に対するサイトカイン応答性の観察に分子基盤を与え、それがフローサイトメトリーで測定したものよりも広がっている可能性を示唆するものである。このことは、このPCを駆動する遺伝子と最も有意に関連する20のGO用語（補足データ4）のうち2つがサイトカイン応答性と生産に関連しており（GO:0001819「サイトカイン生産の正の調節」および0032609「インターフェロンγの生産」）、遺伝子IL18rap、IL12rb、IL18r1およびIFNgr1を含むことによってさらに裏付けられる（図4C）。興味深いことに、GO: 0042110「T細胞の活性化」は、PC1とは別の遺伝子によって駆動されてはいるが、再び最も正の相関を持つ用語となった。

我々が採用したデータマージ方法の重要な限界は、個々のデータセットの全てに存在しない遺伝子や、ヒトやマウスにそれぞれ直接的なオルソログを持たない遺伝子が、マージ処理の過程で削除されてしまうことである。統合されたデータセットで同定された特徴的な機能が、完全なオリジナルデータセットにも存在するかどうかを調べるために、ヒトCD161hi CD4T細胞とそのCD161int/-対応物、マウス野生型またはCbir DNとマウスCD4T細胞とを別々に比較検討した。遺伝子発現の差異解析に基づいて、ヒトCD161hi CD4 T細胞（ヒトTMIC遺伝子モジュール、補足データ2）またはマウスのDN T細胞（マウスTMIC遺伝子モジュール、補足データ5）に関連する遺伝子のリストを得た。これらの遺伝子モジュールの発現をそれぞれの他の種でGSEAにより調べたところ、ヒトCD161hi CD4 T細胞ではマウスTMIC遺伝子モジュールが、マウス野生型T細胞およびCbir DN T細胞ではヒトTMIC遺伝子モジュールがそれぞれ濃縮されていた（補足図6A, B）。TMIC遺伝子モジュールの濃縮を促す遺伝子には、IL23Rのヒトおよびマウス正ローグ、ならびに転写因子RORA、ID2、BHLHE40の遺伝子が含まれていた。ヒトおよびマウスのTMIC細胞をCD161int/-またはCD4 T細胞と区別する他の注目すべき遺伝子は、それぞれ運動性因子S100A4、pHセンサーGPR65、およびGPIトランスアミダーゼPIGSだった（補足図6C, D）。さらにGSEAを行うと、ヒトCD161hi CD4とマウスDN T細胞は、サイトカイン産生と免疫反応の制御に関連するGOタームと遺伝子に濃縮を示すことがわかった（図4D、E、補足図5E）。また、両細胞集団は、統合されたデータセットでは同定されなかったGO用語0001906「細胞死」（図4F）にも濃縮されていることがわかった。この発見は、先に見たCD161hi CD4T細胞がGzmBを産生する能力と一致し（図1E）、ヒトおよびマウスTMIC細胞に起因する潜在的エフェクター機能の配列を確認し、拡大するものであった。これとは対照的に、GO:0042110「T細胞の活性化」は、分析したどの集団においても有意な濃縮を示さなかった（補足図6F）。これは、我々の解析でPC1と2の両方と関連していたことと一致し、この用語に関連する遺伝子は、大腸T細胞全般である程度発現が上昇していることが示唆された。

ヒトおよびマウスの大腸炎では、TMIC細胞が腸内に存在する
ヒトおよびマウスのTMIC細胞が持つ潜在的なエフェクター機能の幅の広さを考慮し、我々は次に、疾患設定における機能的影響を探ろうと考えた。

潰瘍性大腸炎患者の炎症組織から採取した生検では、一般にCD4 T細胞の数が増加していることがわかった。最大の増加はCD161-およびCD161intサブセットで見られたが、CD161hi表現型を持つ細胞が、炎症を起こしていない組織や正常組織から得たサンプルと比較して、組織1グラム当たり同等かわずかに増加した数で存在することも見出した（Fig.5A）。また、2つの大腸炎マウスモデルでこの細胞型の持続性が観察され（補足図7A）、健常対照者とIBD患者48の単細胞データを含む既報のデータセットの解析では、TMIC関連遺伝子ZBTB16、KLRB1、IL18R1、IL23Rを含む遺伝子モジュールが、非炎症および炎症を起こした組織試料のCD4T細胞で健常対照者と比較して高い発現を示し（補足図7B）、炎症を起こした大腸組織でTMICセルが存在しているという考えが支持されています。さらに、非炎症ヒト組織から分離した細胞と比較して、UCのTMIC細胞はTIGIT、TIM3、LAG3、CD39などの抑制性受容体の高い発現を示し（図5B）、CD161-およびCD161int対応する細胞よりさらに顕著だった（補足 図7C）。これらの観察は、ヒトTMIC細胞がIBDの文脈で誘発されることを示唆しており、これはまた、前述のTMIC関連遺伝子モジュールを発現する細胞を比較すると、炎症を起こしたIBD組織からのCD4 T細胞におけるCTLA4およびTIGITの発現増加によっても支持された（補足図7D）。

図5
Fig.
TMIC細胞は、ヒトUC患者の炎症組織に存在し、マウス大腸炎モデルにおいて病態を悪化させる。
TMIC細胞が示す高いエフェクター能と微生物応答性と合わせて考えると、これらの知見はTMIC細胞がUCの病態に関与している可能性を示唆している。

大腸炎モデルマウスにおけるTMIC細胞の大腸病態への関与
微生物反応性T細胞が大腸病理学に寄与しているかどうかを調べるために、我々は正常マウスの微生物叢に存在する微生物を認識するCbir1トランスジェニックマウスモデルに立ち戻った。分離した組織常在細胞を別の宿主に移植してその挙動を調べるのは理想的な実験だが、他の組織常在細胞集団と同様に、大腸から分離したDN細胞は、内因性T細胞との競合がないRag-/-の場合でさえ、レシピエントマウスの腸内に再増殖しない（補足図8A-C）。この問題を回避し、自然免疫様T細胞集団を分離して研究するために、抗CD4で処理したCbir1 Rag-/-マウスをThおよびリンパ組織誘導細胞（〜90%DN T細胞）を枯渇させたマウスと抗CD4処理Rag-/-（T細胞なし）マウスを比較した（補足図8D、E）。これらの細胞が、炎症促進環境下でその抗原に遭遇したときに、病態形成に寄与しうるかどうかを理解するために、バリア破壊と細菌の移動をもたらすデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）モデルの大腸炎を用いた。DSSを投与すると、CD4欠損Cbir1マウスは、病気のピーク時にCD4欠損Rag-/-同腹子よりも有意に体重を落とした（図5CおよびD）。全身性疾患の特徴は、上皮損傷と陰窩膿瘍を特徴とする結腸病理学の増加傾向と関連していた（図5F, G）。全身性炎症はさらに、TMICを発症したCbir Rag-/-マウスの脾臓の肥大化によって特徴付けられた（Fig. 5E）。組織レベルでの疾患の違いを理解するために、大腸組織からRNAを単離し、TMICに関連する興味ある遺伝子についてqPCRを実施した。CbirマウスにTMICが存在すると、Tnf、Il1b、Csf2（GM-CSF）のレベルが有意に上昇したが（図5H）、他の炎症性サイトカインや修復関連遺伝子Aregは認められなかった（図5I）ことから、黄砂の文脈で特定の応答モジュールが存在することが示唆された。これらのデータを総合すると、我々は、バリア破壊に伴う腸管病態の形成に寄与する、サイトカインに応答する常在T細胞というまだ知られていない集団を同定したことが示唆される。

考察
腸管における恒常性維持には、常在菌と免疫の相互作用が重要である。ヒトの組織サンプルとマウスモデルを用いて、大腸の常在菌反応性MHC-II制限T細胞が自然界に類似した特徴を獲得していることを明らかにした。これらの特徴から、ヒトおよびマウスのTMIC細胞は、自然免疫と適応免疫の橋渡しをするT細胞集団として、拡大しつつある。itk-/-マウスやヒト胎児組織で報告されているT細胞サブセットと同様に23,24、TMICは、PLZFなどの自然免疫様因子と高レベルのCD161（ヒト）を発現する集団としてMAITやiNKT細胞などの確立した自然免疫様T細胞サブセットと古典的組織常在記憶T細胞の間に位置し、同時に多様でMHC-II制限されたTCRレパートリーを特徴としている。粘膜バリアに位置するTMIC細胞は、微生物の監視と局所的なサイトカインミリューの形成に重要な役割を果たすと考えられる。

TMIC細胞は、いくつかの主要なTh17サイトカインを含むエフェクター分子を強力に産生する。このことは、クローン病においてヒト大腸CD161 + CD4 T細胞集団がTh17集団としてより広範に存在するとした先行研究25や、細胞内病原体に対するマウスDN T細胞によるIL-17産生50、ループスにおけるヒトDN T細胞の観察52と一致する。我々の発見は、これを発展させたもので、特にCD161hiサブセットは、Th17機能に限定されず、ヒトの自然免疫様T細胞56によく似たTh1/Th17二重エフェクタープロファイルを示し、細胞傷害性に関連する因子を産生できることを実証したものである。注目すべきは、CD4発現の違いにもかかわらず、これらの機能的特性がマウスTMIC細胞で保存されていることである。本研究では、炎症のない正常な組織から得た細胞を分析したため、ヒトの炎症性疾患の文脈では、TMIC細胞はTh17表現型に偏り、我々の発見は、健康な組織を代表する、より恒常的な状態を表していると考えることができる。実際、最近発表されたいくつかの論文によると、ヒトの腸管CD4 T細胞では、エフェクター表現型が異なるサブセットとしてではなく、集団全体に勾配として存在することが分かっており57-59、これらの細胞の多くが、幅広いエフェクター分子を産生する可能性を持っているという考えが支持されている。

粘膜組織には、感染やワクチン接種に応答して発生し、特定の病原体に再遭遇した場合に局所的な防御を行うTRM細胞が豊富に存在する。興味深いことに、単一細胞のシークエンスデータを解析したところ、生得的な遺伝子発現プロファイルの発現は、確立されたTRM遺伝子シグネチャーの発現と密接な相関がないことがわかった。このことは、TMIC表現型が大腸における一般的なTRMプログラムの一部ではなく、特別な状態を構成していることを示唆している。TMIC形成に至る経路は今のところ完全には解明されていないが、ほとんどのTRMモデルは、TRM細胞を誘導するために、LCMVやHSVなどの急性感染症、あるいはモデル抗原やワクチンによる正確に制御されたチャレンジを用いている46、47、60、61ことは、抗原曝露が激しくかつ一過性であることは注目に値する。対照的に、常在菌に反応するT細胞は、限られた量の抗原で、長期間にわたって何度も、あるいは構成的に誘導されることになる。この疑問を完全に解決するには今後の研究が必要であるが、このモデルは、微生物に反応するCbir-またはHh-TCRトランスジェニックT細胞の間で観察される違いによって支持されるであろう。前者がどこにでもある常在抗原に反応し、腸内でTMIC表現型を獲得するのに対し、後者は通常存在しない細菌に反応し、定常状態では典型的なCD4表現型を示し、感染宿主に移植すると従来のCD4表現型が維持されるのである11。他の微生物反応性TCRトランスジェニック9を用いたさらなる研究が、他の微生物がこの表現型を促進する能力について明らかにする可能性がある。

既存のデータは、粘膜以外の器官に存在するCbir T細胞は自然発生的な表現型を持たないため、粘膜組織に特異的な局所因子がTMIC表現型の支持に不可欠な役割を果たすことを示唆している。B6およびCbirマウスの胸腺では少数のTMIC細胞が確認されるが、生涯を通じてこの表現型を持つ細胞が蓄積するのは、局所的な条件に適応した結果であると考えられる。一部の細胞が組織内でこの表現型を獲得している可能性を無視することはできず、これはマウスTMIC細胞が調べたすべての粘膜組織で見いだせるという知見によって裏付けられているのかもしれない。TMICの維持に必要な抗原提示細胞、サイトカイン、シグナル伝達機構を明らかにするためには、今後の実験が必要であるが、我々は、固有層に存在する局所的なミエロイド集団が関与している可能性を仮定している。これらの抗原提示細胞は、TCRとIL-23Rを介してTMIC細胞を同時に刺激する可能性がある一方、IL-18などの上皮細胞からのサイトカインは、TMIC細胞が異なる一連の応答を生じるように調整する可能性がある。

我々の結果は、微生物反応性T細胞の大腸形成能を報告した他のいくつかの研究62-64を裏付け、さらにヒトTMIC細胞が潰瘍性大腸炎患者の炎症組織に正常あるいは亢進した数で存在するという事実によって支持されるものである。しかしながら、TMIC細胞がlamina propriaで果たす役割は、おそらくそれだけにとどまらない。MAIT細胞を含む自然免疫系様T細胞は、最近、ヒトやマウスにおいて組織修復能力39-41を有することが示されており、TMIC細胞はこれらの集団と転写的特徴を共有しているので、TMIC細胞は適切な状況下で同様の機能を発揮する可能性がある。MAITsでは、活性化がTCRまたはサイトカインシグナルによって誘導されるかどうかが、それぞれ修復関連因子または純粋な炎症性プログラムのどちらを発現するかを決定する上で重要である38,39。TMIC細胞も同様に、定常状態では、TCRを介したシグナルによって限定的に活性化され、実際に組織の恒常性や限定的な傷害の修復に寄与する可能性がある。これとは対照的に、広範囲に炎症が広がっている状況、例えば我々がテストした黄砂による大腸炎モデルのように上皮のバリアが大きく破られた後では、サイトカインやTCRを介した複合型の活性化が優勢となり、Th1やTh17エフェクター分子の大量生産が起こり、大腸炎を引き起こすと思われた。

TMIC表現型を持つT細胞は固有層では決して珍しい細胞集団ではなく、ヒトでは特に豊富である。その高いエフェクター能と大腸炎発症能、微生物に対する反応性を考えると、今後、これらの細胞がどのように誘導・制御され、定常状態でどのような挙動を示すのかについての研究が必要である。これらの機能を完全に理解することは、IBDやチェックポイント誘発性大腸炎などのヒトの関連疾患における新たな治療標的の開発につながる可能性があり、また、あらゆる種類のマイクロバイオーム療法を受けている患者やマイクロバイオームの変化を伴う疾患に苦しむ患者にとって重要な意味を持つ可能性があります。

研究方法
倫理的承認
本研究におけるすべての実験は、国際的および地域的な倫理基準に従って実施されています。ヒト組織サンプルは、適切な患者の同意を得て収集され、NHS RECが倫理的承認を与えた（参照番号16/YH/0247）。ヒトのドナーは報酬を受け取っていない。マウスを用いた実験は、地域の動物管理委員会（UK Scientific Procedures Act of 1986）に従って実施された。マウスの研究を管理するプロジェクトライセンス（P508FFA1F）は、オックスフォード大学の動物福祉・倫理審査委員会の審査を受け、陛下の政府の内務省によって承認された。

実験モデルおよび被験者の詳細
ヒト試料 手術中の大腸がん（CRC）患者から正常な隣接組織をTGUバイオバンクが収集した。生検は、John Radcliffe病院に通院中の潰瘍性大腸炎（UC）患者または健常対照者から採取した。すべての組織サンプルは、適切な患者同意のもとに収集され、NHS RECによる倫理的承認（参照番号16/YH/0247）が得られた。
CRC患者の特徴
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健常対照者の特徴
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UC患者の特徴
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マウス マウスは、オックスフォード大学の特定病原体不使用（SPF）動物施設で繁殖・維持した。実験は、プロジェクトライセンスP508FFA1Fのもと、地元の動物管理委員会（UK Scientific Procedures Act of 1986）に従って実施された。マウスは病原体が存在しないかどうか定期的にスクリーニングされ、環境エンリッチメントを施した個別換気ケージで、20-24℃、45-65%の湿度、12時間の明暗サイクル（7時-19時）、30分の明け暮れ時間で飼育された。特定の病原体を持たないマウスにはSDS RM3飼料（LBS Biotechnology社製）をアドリビで与え、無菌マウスには50kGyに照射した同じRM3飼料を与えた。C57BL/6年齢コホートはCharles River社から購入した。B2MkoマウスはThe Jackson Laboratoryから入手し、Benaroya Research InstituteのOliver Harrisonが維持した。Cbir1 TCRトランスジェニックマウスは、Charles Elson IIIからの親切な贈り物であった。Il23rgfp/+はDaniel Cua (Merck Research Laboratories, Palo Alto, USA)から入手した。Hh7-5TCRトランスジェニックマウスはDan Littmanから譲り受けた。B6Jとの戻し交配はTransnetyx社によるSNP解析で確認した。マウスは年齢と性別を一致させ、DSS実験を除き、可能な限り同数の雌雄を用いた。DSS実験では、ケージ数を減らし、闘争による病態の交絡の可能性を減らすため、雌で実施した。マウスはケージに分けられ、各ケージにすべての遺伝子型が存在することを確認し、実験者は実験期間中、遺伝子型に対して盲検化された。
方法の詳細
CRC組織切除の処理 滅菌ハサミおよび鉗子を用いて脂肪および筋肉組織を表面的に除去した後、40μg／mlゲンチシン（Thermo Fisher）、10μg／mlシプロフロキサシン、0. 025 μg/ml amphotericin B、100 U/ml penicillin、0.1 mg/ml streptomycin (all from Sigma-Aldrich) を加え、37℃、200 rpmに設定したシェーカー内で15分間振盪した。上皮細胞を除去するために、試料はその後、5 mM EDTA（VWR）を含む同じPBSベースの緩衝液で3回洗浄された。最後に、試料は重量を測定し、小片に切断し、直接消化するか、または後の使用のために-80°で1ml凍結培地（90% FCS, 10% DMSO）上に保存した（バイアルあたり 0.2-0.4 g）。
切除した組織の直接消化
微生物反応性CD4 T細胞の検出を目的としたアッセイでは、切除した組織を、10％FCS（Sigma-Aldrich）、40μg／mlゲンチシン（Thermo Fisher）、10μg／mlシプロフロキサシン、0. 025 μg/ml アンフォテリシンB、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン（すべてSigma-Aldrichから）、0.1 mg/ml コラゲナーゼAおよび0.01 mg/ml DNase I（ともにRocheから）。HEPES (10 mM, GIBCO) は消化前にバッファーに新たに添加した。試料は、37° Cで200 rpmに設定したシェーカーで20分間インキュベートし、100 µmのセルストレーナーでろ過して遊離した細胞を単離した。このプロセスを、組織が完全に消化され、それ以上細胞が得られなくなるまで数回繰り返した。遊離した細胞を集め、R10培地（10% FCS、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミンを含むRPMI 1640）にプールし、4℃で保存した。単核細胞を濃縮するため、消化物を2層のPercoll（Sigma-Aldrich）勾配で20分間遠心分離し（400 g、室温、ノーブレーキ）、40%/80%間期で回収した。

保存組織および生検からの単細胞懸濁液の作製
DMSOを含む凍結培地を除去するために、切除由来の組織試料をあらかじめ温めたR10培地で70 µmのCellストレーナー上で洗浄した。UC患者または健常対照者から得た洗浄済み切除標本または生検をgentleMACS Cチューブ（Miltenyi）に移し、1 mg/ml コラゲナーゼDおよび0.01 mg/ml DNase I（ともにRocheから）を含むRPMI 1640ベースの消化培地5 mlを加えた。試料をgentleMACS（Miltenyi）上でbrain01_02プログラムを用いてホモジナイズし、37℃で200rpmに設定したシェーカー内で60分間インキュベートした。その後、すべての標本をgentleMACS上でプログラムB01を実行して完全に破砕し、Cチューブの内容物を70μmのセルストレーナー上でR10培地に濾過した。細胞をR10培地で2回洗浄し（10分、300×g、4℃）、再度、密度Percoll（Sigma-Aldrich）遠心分離（20分、400×g、室温、ノーブレーキ）により単核細胞を濃縮し、40％／80％の間相で回収した。

微生物反応性ヒトCD4 T細胞の検出 直接消化した大腸切除物からの単核細胞を数え、R10培地で107細胞／mlに調整し、96Uプレートに106細胞／ウェルでプレートアウトした。いくつかの実験において、細胞を、10μg／mlのULTRA-LEAF精製マウス抗ヒトMHC-II（Tü39）、CD1d（51・1）、MR1（26・5）、IgG2ακ（MHC-IIおよびMR1についてはMOPC-173）もしくはIgG2bk（CD1dについてはMCP11）の対照抗体、またはULTRA-LEAF精製抗ヒトIL-12p40（C8. 9, 5 µg/ml）、抗 IL-18（W17071A, 5 µg/ml）または（Biolegend）を37℃で30分間混合し、観察された反応のこれらの受容体およびサイトカインへの依存性を評価した。次に、細胞を加熱殺菌した微生物と混合した。大腸菌Nissle（Ardeypharm GmbH）、黄色ブドウ球菌（National collection of type cultures 6571）およびC. albicans（InvivoGen）を1：10の割合で混合した。37℃で2時間培養した後、Brefeldin A (Invitrogen) を添加してサイトカイン放出を阻害し、さらに6時間培養を続けた。最後に、細胞をPBSで洗浄し（2分、300×g、室温）、遠心分離によりペレット化し、CD154（24-31）およびTNF（Mab11）のFACS染色により微生物反応性細胞を検出した。両抗体はBiolegend社から購入し、1:50で使用した。
ヒトCD4 T細胞のTCRおよびサイトカイン刺激
ヒトCD4 T細胞にTCR刺激を与えるため、NUNC Maxisorpプレート（BioLegend）に、滅菌PBSで1.25μg/mlに希釈した精製抗ヒトCD3抗体（BioLegend）を37℃で2時間、または4℃で一晩コートした。コントロールウェルはPBSのみで満たした。細胞を加える前に、プレートをPBSで2回、R10培地で1回洗浄した。

単核細胞は、R10培地で4×106cells/mlのいずれかに調整し、100μlの細胞懸濁液をコーティングしたプレートの適切なウェルに添加した。精製抗ヒトCD28抗体（BioLegend）を、抗CD3抗体（OKT3）であらかじめコーティングしたすべてのウェルに最終濃度1 µg/mlになるように添加した。リコンビナントヒトIL-23（Miltenyi）をR10培地で400ng/mlに希釈し、最終濃度50ng/mlになるように細胞に添加した。

IL-12（Miltenyi）およびIL-18（BioLegend）による刺激では、細胞を通常の96Uプレート上のR10培地で107細胞/mlの濃度でプレートアウトし、組み換えサイトカイン（IL-12およびIL-18ともに最終濃度50ng/ml）と混和した。すべての実験において、一部の細胞は、分析したエフェクター分子のベースライン発現を決定するために未処理のままとした。

細胞は、抗体またはサイトカインの異なる組み合わせで、合計24時間インキュベートした。最後の4時間は、サイトカイン放出を防ぐため、すべてのウェルにブレフェルディンA溶液（Invitrogen）を添加した。

FACS
単細胞懸濁液をLIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell dye (Invitrogen)をPBSで1：1000に希釈し、室温で20分間染色した。その後，細胞を洗浄し（2分間，300×g，室温），Biolegend，BD，Miltenyi，Invitrogen，またはThermo Fisherから購入した抗体を0.5% FCSおよび2mM EDTA添加PBS中で室温20～30分染色した。

その後の染色工程または取得の前に、細胞を2%ホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）中で室温で10分間固定した。細胞内サイトカイン染色では、細胞を透過処理し、BD Cytofix/Cytoperm Kitを使用して、製造者の指示に従って適切な抗体で染色した。転写因子の核内染色は、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit (Invitrogen)を用いて、製造元の指示に従い行った。ヒト細胞の染色には、以下の抗体を使用した。

FITC-CCR7（クローン：G043H7、Biolegend Cat＃353215、1：100）、BV570-CD3（クローン：UCHT1、Biolegend Cat＃300436、1：100）、PE／Dazzle 594-CD3（Clone：UCHT1, Biolegend Cat＃980006, 1：100）, PerCp／Cy5. 5-CD3（clone: UCHT1, Biolegend Cat # 300430, 1:100）, BV605- CD4（clone: OKT4, Biolegend Cat # 317438, 1:100）, BV650-CD4（clone: OKT4, Biolegend Cat # 317436, 1:100）, BV650-CD8（clone: SK1, Biolegend Cat # 344730, 1:100）, BV421-CD39（clone: A1, Biolegend Cat # 328214, 1:200), PE/Dazzle594-CD45RA (clone: HI100, Biolegend Cat # 304145, 1:100), PE/Cy7-CD45RO (clone: UCHL1, Biolegend Cat # 304229, 1:50), BV421-CD56 (clone: HCD56, Biolegend Cat # 318328, 1:100), BV480-CD56 (clone: NCAM16. 2、BD Bioscienes Cat # 566124、1：100）、PE/Cy7-CD154（クローン：24-31、Biolegend Cat # 310832、1：50）、BV421-CD161（クローン：HP-3G10、Biolegend Cat # 339914、1：100）、PE-CD161（クローン：191B8、Miltenyi Cat # 130-113-593, 1: 200）、APC-GzmB（クローン：GB11、Invitrogen、1：100）、Alex Fluor 700-GzmB（クローン：QA16A02、Biolegend、1：100）、PE／Vio770-ICOS（クローン：REA192、Milteny、1：50）、Alex Fluor 700-IFNγ（Clone：4 S． B3、Biolegend、1：100）、BV711-IFNγ（クローン：4 S.B3、Biolegend、1：100）、BV785-IFNγ（クローン：4 S． B3、Biolegend、1：100）、FITC-IFNγ（クローン：45-15、Miltenyi、1：100）、Alexa Fluor 647 mouse IgG1κ（Clone：MOPC-21, BD Biosciences Cat # 557732、1：50）、PE mouse IgG2bκ（Clone: 27-35, BD Biosciences Cat # 555058, 1:50), BV421-IL-17A (clone: BL168) Biolegend Cat # 512322, 1:100), FITC-IL-17A (clone: BL168, Biolegend Cat # 512304, 1:00), PE-IL17F (clone.Biosciences Cat # 512305), 1:00), FITC-IL-17A(Clone.Biosciences Cat # 555058, 1:100), BE-IL-17A (Clone: eBio18F10-Invitrogen Cat # 12-7471-82、1：100）、PE/Cy7-IL17F（clone: SHLR17、Thermo Fisher Cat # 12-7169-42、1：100）、PE/Cy7-IL18Rα（clone: H44、Biolegend Cat # 31381、1：125）、APC-IL18Rα（clone: H44、Biolegend Cat＃313814、1：100）、PerCp／eFluor 710-IL-22（clone：22URTI, Thermo Fisher Cat＃46-7229-42, 1:50）, PE／Cy7-LAG3（clone：7H2C65, Biolegend Cat＃369208、1：100）, BV785-PD-1（clone：29 F.... 1 A12、Biolegend Cat # 135225、1:50）、Alex Fluor 647-PLZF（clone: R17-809、BD Biosciences Cat # 563490、1：50）、BV711-TCR Vα7.2（clone: 3C10, Biolegend Cat # 351732, 1:100）, FITC-TCR Vα7.2（clone: 3C10、Biolegend Cat # 351730）。 2（クローン：3C10、Biolegend Cat # 351704、1：50）、PerCp/Cy5.5-TCR Vα7.2（Clone：3C10, Biolegend Cat # 351710, 1:100）, BV711-TCR Vα24-Jα18（Clone：6B11, Biolegend Cat # 342922, 1:100）, PerCp/Cy5.1（Clone：3C10, Biolegend Cat # 351710, 2:50) 5-TCR Vα24-Jα18 (クローン: 6B11、Biolegend Cat # 342914、1:100)、PerCp/Cy5. 5-TCRγδ （クローン：B1、Biolegend Cat＃331224、1：100）、APC／Fire 750-TCRγδ （クローン：B1、Biolegend Cat＃331228、1：100）、APC-TIGIT（クローン：A15153G、Biolegend Cat＃372706, 1：100）, BV605-TIM3（Clone: F38-2E2, Biolegend Cat＃345018、1：50），PerCp／Cy5． 5-TNF (clone: MAb11, Biolegend Cat # 502926, 1:50), PE-RoRγt (clone: Q21-559, BD Biosciences Cat # 563081, 1:50)を用いた。

マウス細胞の染色には、以下の抗体を使用した。

PerCP/Cyanine5.5-CD45R/B220 (クローン: RA3-6B2, Biolegend Cat # 103236, 1:200), PerCP/Cyanine5.5-CD11b (クローン: M1/70, Biolegend Cat # 101228, 1:200), PerCP/Cyanine5. 5-CD11c Antibody (clone: N418, Biolegend Cat # 117328, 1:200), APC-TCR γ/δ Antibody (clone: GL3, Biolegend Cat # 118116, 1:200), Alexa Fluor® 700-CD45 (clone.D3, Biolegend Cat # 118116), 5-CD11c Antibody (clone:D3, Biolegend Cat # 117328, 1:200) 30-F11, Biolegend Cat # 103128, 1:300）, Brilliant Violet 421™-CD127 (IL-7Rα) (clone: A7R34, Biolegend Cat # 135023, 1:100), Brilliant Violet 605™-CD8a (clone: 53-6. 7, Biolegend Cat # 100743, 1:300), Brilliant Violet 785™-CD4 (clone: RM4-5, Biolegend Cat # 100552, 1:200), FITC-TCR β鎖(clone: H57-597, Biolegend Cat # 109206, 1:200), Alexa Fluor 488-PLZF(clone: Mags.21 F7、Life Technologies Cat # 53-9320-82、1:100）、PE/Dazzle™ 594-CD8a（clone: 53-6. 7, Biolegend Cat # 100762, 1:300), PE/Cyanine7-TCR β (clone: H57-597, Biolegend Cat # 109222, 1:200), APC-CD127 (IL-7Rα) (clone: A7R34, Biolegend Cat # 135012, 1.100), APC-CD127 (クローン: A7R34, Biolegend Cat # 100762, 1:400) 100）、BV421-RORγt（クローン：Q31-378、BD Biosciences Cat # 562894、1：200）、Brilliant Violet 605™-CD4（Clone：RM4-5, Biolegend Cat # 100548、1：200）、Brilliant Violet 605™-CD8a（Clone：53-6. 7, Biolegend Cat # 100744, 1:300）、Brilliant Violet 650™-CD25（clone: PC61, Biolegend Cat # 102037, 1:200), Brilliant Violet 785™-CD45 Antibody (clone: 30-F11, Biolegend Cat # 103149, 1:300), Brilliant Violet 650™-NK1. 1 (クローン: PK136, Biolegend Cat # 108735, 1:200), Alexa Fluor® 700-TCR β(clone: H57-597, Biolegend Cat # 109224, 1:200), PE/Cyanine7-TCR γ/δ (clone: GL3, Biolegend Cat # 118124, 1:200), Brilliant Violet 421-CD8a (clone: 53-6. 7、Biolegend Cat＃100737、1：300）、Brilliant Violet 605-CD11c（clone：N418） Biolegend Cat＃117334、1：200）、PE-CD218a （IL-18Ra）（clone：P3TUNYA, Life Technologies Cat＃12-5183-80、1: PE-またはAPC-標識マウスCD1d-およびMR1-四量体は、NIH Tetramer Core Facilityから入手し、脾臓および肝臓NKTおよびMAITへの結合について、CD1dについては概ね1：1000、MR1については1：500でロットごとに滴定を行った。

すべての細胞は、FACS Divaソフトウェア（BD）を用いてLSR IIまたはFortessa（BD）で取得した；データは、FlowJoソフトウェア（Treestar）を用いて解析した。

ヒト細胞の核酸抽出とバルクTCRシークエンス
TRIzol（Thermo Fisher）核酸抽出を使用して、ソートしたヒト大腸CD4 T細胞から高純度RNAを抽出した。簡単に言うと、ソーティング後、細胞を遠心分離し（500×g、5分）、1mlのTRIzolに再懸濁し、RNA抽出まで-80℃で凍結した。RNA抽出のため、サンプルを室温に戻し、200μlのクロロホルム（Sigma-Aldrich）と混合し、12,500rpmで5分間遠心分離した。水相500μlを採取し、RNAdvance Tissue Isolation kit (Agencourt)を用いてRNAを抽出した。RNAは、2100バイオアナライザー装置（いずれもアジレント）のRNAピコアッセイを用いて、濃度と純度を評価した。一括TCRレパートリー配列決定はamplicon-rescued multiplex (ARM)-PCR method (iRepertoire Inc)を用いて行った。ライブラリ作成は、製造元の説明書に従って社内で行った。簡単に説明すると、抽出したRNA、酵素ミックス、バーコードプライマー反応ミックスを氷上で混合した後、iRepertoire low-input protocolを用いてサーマルサイクラーでRT-PCRと初期増幅のステップを複合的に行った。次に、キットの固相逆方向固定化（SPRI）ビーズとエタノール洗浄を使用して生成物を精製し、水で溶出した。この生成物を酵素ミックスとユニバーサルプライマーと組み合わせて、2回目の増幅を行った。最終生成物はSPRIビーズを用いて再度精製され、水に溶出された。最終生成物の品質、サイズ分布、濃度、汚染プライマー二量体の有無は、アガロースゲル電気泳動、分光光度計（Nanodrop, Thermofisher Scientific）、2100 Bioanalyzer装置（Agilent）を用いたDNA 1000キットで適切なサイズのクリアバンドの識別を含むいくつかのQCステップで評価された。ライブラリーは、CFX96 Thermal Cycler 装置 (Bio-Rad) で KAPA Library Quantification Kit (Roche) を用いて定量した後、等モルプーリングした。サンプルはOxford Genomics Centreに提出され、TCRライブラリーの多様性が低いため、PhiXライブラリースパイクイン（10%）を加えた後、Illumina MiSeq装置（WTCHG、University of Oxford）で300 bpペアエンドシーケンスが実行された。

TCRレパートリー一括解析 TCRレパートリーライブラリーのデータ処理は、iRepertoire解析パイプラインを使用して行った。簡単に説明すると、サンプルに関連する6-N分子バーコードに基づいて、リードをデマルチプレックスした。低品質のリードはトリミングされ（Phred scoreが30未満のものは削除）、R1およびR2リードはオーバーラップしてステッチされた。オーバーラップした部分の同一性が100%であるステッチされたリードのみが下流解析に含まれました。次に、リードをIMGTデータベースにマッピングし、参照配列にマッピングされ、正規のCDR3モチーフを含むリードのみを、さらなる解析に含めました。最後に、シーケンスアーチファクト、PCRアーチファクト、挿入、欠失、置換エラー、低頻度（n = 1）リードを取り除くために、いくつかのフィルター（irepertoire.com/irweb-technical-notesを参照）を適用しました。初期データ解析は、iRwebデータ解析プラットフォーム（iRepertoire, Inc.、米国）を用いて行った。追加の解析とプロットの作成は、SeeTCR (friedmanlab.weizmann.ac.il/SeeTCR)を用いて行った。
BD Rhapsody標的シングルセル・トランスクリプトミクス 3人のドナーからLamina propria単核細胞を分離し、IL-12/18、プレート結合αCD3、またはその両方の組み合わせで、上記のように一晩中刺激した。サンプルは、BD Human Single-Cell Multiplexing Kit のオリゴヌクレオチド結合サンプルタグと 50 種類の Abseq 抗体のパネルで、製造元のプロトコールに従って BD stain buffer 中で並行して染色されました。
以下のBD AbSeq抗体はBD Biosciencesから購入し、サンプルあたり2 µlで使用しました。CD4（クローン：RPA-T4）、CD7（クローン：M-T701）、CD9（クローン：M-L13）、CD25（クローン：M-A251）、CD26（クローン：M-A261）、CD27（クローン: M-T271）、CD39（クローン：TU66）、CD45RA（クローン：HI100）、CD45RO（クローン：UCHL1）、CD49a（クローン：SR84）、CD49d（クローン：9F10）、CD56（クローン：NCAM16. 2）、CD58（クローン：1C3）、CD62L（クローン：DREG-56）、CD69（クローン：FN50）、CD72（クローン：J4-117）、CD73（クローン：AD2）、CD83（クローン：HB15e）、CD94（クローン: HP-3D9）、CD95（クローン：DX2）、CD103（クローン：Ber-ACT8）、CD119（クローン：GIR-208）、CD122（クローン：MIK-BETA3）、CD123（クローン：7G3）、CD124（クローン: hIL4R-M57）、CD126（クローン：M5）、CD127（クローン：HIL-7R-M21）、CD131（クローン：3D7）、CD132（クローン：TUGh4）、CD134（クローン：ACT35）、CD137（クローン：4B4-1）、CD140A（クローン: αR1）、CD140B（クローン：28D4）、CD154（クローン：TRAP1）、CD178（クローン：NOK-1）、CD181（クローン：5A12）、CD183（クローン：1C6／CXCR3）、CD192（クローン：LS132. 1D9）、CD197（クローン：3D12）、CD212（クローン：2. 4E6）、CD215（クローン：JM7A4）、CD278（クローン：DX29）、CD294（クローン：BM16）、CD335（クローン：9E2/Nkp46）、GITR（クローン：V27-580）、IL-21R（クローン：17A12）、Itgb7（クローン：FIB504）、LAG3（クローン：T47-530）などがある。

また、以下のカスタマイズAbSeq抗体はBD Biosciences社から提供され、2 µl/testで使用されました。CD161 (クローン: 191B8, Miltenyi ベース: RRID:AB_871628) および CD196 (クローン: G034E3, Biolegend ベース: RRID:AB_10918625).

その後、FACS実験と同様に、より小さなパネルの蛍光標識ソーティング抗体（CD4, CD8, Vα7.2, TCRγδ, Vα24-Jα18, CD45）およびLIVE/ DEAD Fixable Near IR Dead Cell dyeで細胞を染色した。実験医学部門フローサイトメトリー施設で、ドナーおよび刺激条件ごとに20,000-40,000個の細胞を、ライブ、CD45+ CD4 CD8- Vα7.2- Vα24-Jα18- TCRγδ- としてBD ARIA IIIでソーティングした。選別した細胞をスピンダウンし (300×g、5分間)、200 µlの冷やしたBDサンプルバッファに再懸濁し、全12サンプルから2万個の細胞をプールし、その後、BD Rhapsodyカートリッジにロードした。BD Rhapsody expressシステムによる単一細胞の捕捉とcDNA合成は、製造元の試薬とプロトコルを用いて行った。簡単に説明すると、このプロセスには、マイクロウェルプレートでのビーズによる細胞捕獲、その後の細胞溶解、ビーズ回収、cDNA合成、BD Rhapsody Targeted mRNA and Abseq Amplification kitを用いたライブラリー調製が含まれていた。

サンプルタグ、Abseq、標的mRNA用に、基本免疫パネル(BD Rhapsody免疫応答パネルHs)と145の追加遺伝子をカバーするカスタムパネルを組み合わせて、別々のライブラリーを作成した(補足データ6)。重要なのは、後者には、マウス皮膚における非従来型T細胞集団の組織修復に関連する遺伝子41が含まれており、これらはマウスおよびヒトMAIT細胞でも発現していることが示されていることである38,39。プールされたライブラリーの配列決定は、Novogene (英国ケンブリッジ) のNovaSeq6000 (Illumina, San Diego, CA) で行われた。

BD Rhapsodyデータ解析 Rhapsody実験から生成されたFASTQファイルは、mRNAおよびAbseqターゲットに関する配列情報を含むFASTAファイルとともにSeven Bridges Genomicsオンラインプラットフォームにアップロードされ、BD Rhapsody Targeted解析パイプラインに供された。データ解析はSeqGeq (BD)で行われた。簡単に説明すると、低遺伝子発現のイベントをゲーティングすることで品質管理を行い、Lex-BDSMKプラグインを用いてサンプルを脱多重化して異なる刺激条件から細胞を分離し、CD161およびCD56に対するDNAバーコード抗体を用いたゲーティングによりCD161-, CD161int, およびCD161hi細胞を同定した。CD161hi細胞の遺伝子発現プロファイルをエクスポートし、サイトカイン、TCR、または複合刺激による組織修復関連遺伝子のzスコアを算出した。組織修復遺伝子シグネチャー全体の発現は、fgsea Rパッケージ（下記参照）を用いた遺伝子セット濃縮解析により解析した。
既発表のデータセットにおける遺伝子シグネチャーの発現解析
既報の大腸単細胞データ48,49 を、Seurat R パッケージのバージョン 4 を用いて、パッケージのビネットに従って再解析した65。簡単に言うと、特徴数が異常に多い細胞やミトコンドリア遺伝子の割合が高い細胞は削除し、データを正規化（NormalizeData関数のmethod = LogNormalize）し、スケーリング（ScaleData）した。細胞クラスターは FindClusters および RunUMAP 関数を用いて同定した。CD4 T細胞にデータセットを限定するため、クラスタを区別するマーカーをFindAllMarkers関数とFeatureplot関数で同定・可視化し、CD3E、CD4、CD8B、CD8A、ZBTB7の発現に基づいて、データセットをサブセット化した。Smillieデータセットはさらにサブセット化され、IBD患者から分離された細胞を除き、「健康」と注釈された細胞のみが保持されました。

処理された遺伝子数を抽出し（GetAssayData関数）、AUCell Rパッケージ66のAUCell_buildrankings関数を使用して、各細胞のすべての遺伝子について発現ベースのランキングを構築した。TRM 細胞46,47 または CD161 発現細胞29 に関連する遺伝子のリストを含むファイルを読み込み、GSEABase R パッケージ67 の getGMT および setGeneSetNames 関数を使用して R で AUCell と互換性があるように処理した。また、それぞれのデータセットから150遺伝子をランダムに選択し、追加のコントロールデータセット（150 Genes random）を作成した。AUCells AUCell_calcAUC関数を用いて曲線下の面積（AU）値を算出した。異なる遺伝子セット間の関係を解析するために、AUCell 値をエクスポートし、Prism でピアソン相関を計算した。

ヒトおよびマウスRNAseqデータセットのマージ
異なるソース54および異なる種38,39からのシーケンスデータのマージは、以前に説明されています。簡単に説明すると、ImmGen55からのRNAseqデータセットの一部を、本研究で記述したヒトおよびマウスRNA-シーケンスデータセットとマージしたのである。各データセットにおいて、ゼロカウントおよび低発現遺伝子は、まずedgeR Rパッケージ68を使用して生のリードカウントから除去された。その後、limma Rパッケージのvoom関数を用いて生カウントをlog2変換した69。ヒトのデータセットに存在する遺伝子のマウスのオルソログは、biomaRtパッケージのgetLDS関数70を使用して特定され、すべてのデータセットが共通の遺伝子記号に基づいてマージされた。sva R パッケージの ComBat 関数71 を使用して、経験的ベイズ法72 に基づいてバッチ効果を除去した。得られた統合データセットから遺伝子を分散（IQR > 0.75）でフィルタリングし、主成分分析およびユークリッド距離メトリックを用いた階層的クラスタリング分析に供した。

マージされたデータセットのPCAロードとGOターム解析
PCAtools R パッケージ73 の biplot 関数を用いて、先にマージしたデータセットの最も変動する遺伝子を基に PCA プロットを作成した。次に、同じパッケージのplotloadings関数を使用して、主要な主成分に沿った細胞集団のクラスタリングを駆動する遺伝子のリストを取得した。主成分1または2のいずれかと正の相関を持つ遺伝子のリストは、次に、ヒトCD161hi CD4およびマウスDN T細胞に関連する生物学的プロセスを予測するために、clusterprofiler Rパッケージ74が提供するenrichGO関数を用いてGO用語分析（ont引数は「BP」に設定、p値カットオフ0.01、q値カットオフ0.05）に供されることになった。

マウスおよびヒトRNAseqデータセットの遺伝子セットエンリッチメント解析
ヒトおよびマウスRNAシーケンス実験からの生の遺伝子カウントデータをRにロードし、基本的なRコマンドとedgeR Rパッケージ68のfilterByExpr関数を使用して、発現していない、または低頻度（10カウント未満または少なくとも一つの実験グループから全てのサンプルで発現しない）遺伝子は除去された。次に、フィルタリングされた遺伝子カウントは、DESeq2 Rパッケージ75からのDESeqDataSetFromMatrix、vst、DESeq関数をそれぞれ使用して処理、変換、標準化された。同じパッケージのresults関数を使用して、ヒトCD161hiとCD161int/- CD4T細胞、またはマウスwtまたはCbir DNとCD4T細胞間でそれぞれ差次的に発現する遺伝子のリストを作成した。GSEAを行うために、msigdbr Rパッケージ76を用いて生物学的プロセスのリストを取得し、fgsea Rパッケージ77のfgseaMultilevel関数を用いてGSEAを行い、p値、BH調整p値および正規化濃縮スコア（NES）を計算した。同じパッケージのplotEnrichment関数は、関連するプロセスの濃縮曲線を可視化するために使用された。

マウスからの組織白血球の単離
結腸結腸組織を ~1 cm の断片に切り出し、1% BSA (Sigma-Aldrich) および 5 mM EDTA (Sigma-Aldrich) を含む RPMI で 37 C の振盪インキュベータでインキュベート (2×) した。残りの組織を消化するために、1％BSA、15mM HEPESおよび300U／mlのコラゲナーゼVIII（Sigma-Aldrich、St Louis、MO）を含むRPMI中でインキュベートした。細胞集団は、37.5% Percoll (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) gradient centrifugation (600×g, 5 min)によって精製した。ペレットからリンパ球を単離した。
肺
肺組織は、メスで1mmに切り、1% BSA、15mM HEPES、300U/mlのCollagenase VIII (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) を含むRPMI中で37℃振盪インキュベーターで30分間インキュベートし、途中からピペッティングして組織を破断させた。リンパ球は、Ficoll-Hypaque (GE-Healthcare, 600 × g, 20 min) を用いた勾配遠心によって単細胞懸濁液から単離した。

皮膚
耳介を採取し、PBS/BSA中で氷上保存した。耳を機械的に分割し、細かくミンチにし、BSA、コラゲナーゼD（Roche）、リベラーゼTM（Roche）を含むRPMI中で37℃、80分間消化した。白血球は、Lymphoprep (StemCell Technologies, Inc.)を用いた勾配遠心分離により分離した。

リンパ系組織
リンパ組織（脾臓およびリンパ節）は、ピンセットを用いて周辺組織から分離し、PBS/BSA中で氷上で維持した。組織は、70μmメッシュを通した浸漬により、単細胞懸濁液に処理された。脾臓サンプルは、赤血球を溶解するために、1 ml ACK溶解バッファーと3分間インキュベートした。

RNA配列決定
4匹のB6マウスの5つのプールは、CD127 + DN、MAIT、NKT、CD127 + CD4の細胞数が等しくなるように選別された（300）。2匹のCbir Rag-/-マウスの5つのプールは、Cbir DN集団のためにソートされた。RNA配列決定用の細胞は、上記のように組織から分離し、FACSAria IIIで300 µl RLT (Qiagen)に直接ソーティングした。RNAはRNAeasy micro kit (Qiagen)を用いて単離した。品質管理、ライブラリー準備、配列決定は、Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Oxford Genomics Centreにて、SmartSeq2プロトコルを用いて行った。

ヒトのデータを得るために、3人のドナーからのCD4 T細胞は、CD161-、CD161int、CD161hiCD56-またはCD161hi CD56+細胞としてCD161とCD56の発現に基づいてBD ARIA IIIソーターでソートされた。各ドナーおよび細胞集団について、合計800個の細胞を4バッチ（各200個）、4 µl SmartSeq2 ライシスバッファーの入ったPCRチューブに直接ソーティングした。逆転写は、MRC WIMMシーケンス施設でPicelliら78によって公開されたプロトコルに従って、ソートされ溶解した細胞から直接行った。cDNAライブラリーcDNAライブラリーは、8bpバーコードを使用してNextera XTキットで処理し、NextSeq500シーケンサーで配列決定した。

組織qPCR 3mmの結腸組織片を犠牲後直接RNAlater（Qiagen）に入れ、使用まで-20℃で保存した。RNAはRNAeasy mini kit (Qiagen)を用いて製造者の指示に従い単離した。cDNAはSuperscript III reverse transcription kit (Life Technologies)を用いて合成した。候補遺伝子の定量的リアルタイムPCRは、Taqmanシステムを用いて二重に行い、Hprtとの相対値で示した。プローブは全てLife Technologies社から入手した。Cd3e (Mm01179194_m1), Zbtb16 (Mm01176868_m1), Zbtb7b (Mm00784709_s1), Il22 (Mm01226722_m1), Il17a (Mm00439618_m1), Csf2 (Mm01290062_m1), Ifng (Mm01168134_m1), Areg (Mm00437583_m1), Tnf (Mm00443258_m1), Il1b (Mm01336189_m1), IL12a (Mm00434165_m1), IL17f (Mm00521423_m1), Il10 (Mm00439614_m1)．
DSS大腸炎
マウスは、DSS処理の3日前に枯渇量の抗CD4抗体（GK1.5、BioXCell Cat # BE0003-1、バッチにより試験した0.5-1 mg）で前処理し、実験期間中7日ごとに処理した。1.5％デキストラン硫酸ナトリウム塩（36,000-50,000 M Wt、大腸炎グレード、MP biomedical）を0-5日目に飲水で投与した。マウスは毎日体重を測定し、モニターした。マウスは19日目に淘汰され、組織が採取された。

統計学と再現性
サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。データは GraphPad 9 または R (Version 4.0.3) で収集され、処理された。統計解析: Dunnettの多重比較検定を伴う反復測定ANOVA、Dunnの多重比較検定を伴うFriedman検定、TuckeyまたはDunnettの多重比較検定を伴う混合効果分析、両側Mann-Whitney検定、Sidakの多重比較検定付き2-way ANOVA、Dunnの多重比較検定付きKruskal-Wallis検定、通常の一元的ANOVAはGraphPad 9で計算された。Rのすべての検定は、本研究のデータセットの正規性が、Shapiro-WilkとKolmogorov-Smirnov正規性検定の両方を使用してGraphPad 9で検定された後に選択された。フィッシャーの正確検定、適応的多段分割モンテカルロ法によるGSEAのp値計算、および差次的発現遺伝子を同定するためのWalds検定はRで計算された。すべての検定は、特に断りのない限り、両側検定とした。0.05より小さいP値は有意であるとみなした。各実験のn数およびマウスを含む実験数は、各図の凡例に報告されている。ヒトのサンプルは入荷時に個別に処理されたため、各データポイントは個別の実験を表す。除外されたデータはない。実験は無作為化されておらず、研究者は実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていない。

報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。

補足情報
補足情報(7.0M, pdf)
ピアレビューファイル(880K, pdf)
追加補足ファイルの説明(5.9K, pdf)
補足データ1(11K, xlsx)
補足データ2(2.8M, xlsx)
補足データ3(861K, xlsx)
補足データ4(102K, xlsx)
補足データ5(547K, xlsx)
補足資料6(24K, xlsx)
報告書概要(280K, pdf)
謝辞
C.-P.H.はDeutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, 2018-2020)のResearch Fellowship (403193363),Wellcome Trust (222426/Z/21/Z, awarded to P.K.) and a Medical Sciences Internal Fund (Pump-Priming: award 0009784) により支援を受けています。H.H.U.はHelmsley Charitable TrustおよびNIHR Biomedical Research Centre Oxfordから研究支援を受けた。F.P.はWellcome Trust (095688/Z/11/Z and 212240/Z/18/Z)の支援を受けている。P.K.はWellcome Trust (222426/Z/21/Z), National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), an NIHR Senior Fellowship, and the National Institutes of Health (NIH, U19 AI082630) から支援を受けている。E.T.はWellcome Trust (095688/Z/11/Z and 212240/Z/18/Z, awarded to F.P.), Nuffield Department of Medicine, MRC core grant reference MC_UU_00008, and the University of Oxford COVID Rebuilding Research Momentum Fund (CRRMF) によって支援されている。このプロジェクトを通して動物の飼育と実験をサポートしてくれたLuke Barkerに感謝したい。Cbir1マウス系統を提供してくれたCharles O. Elson III、Hh7-2マウス系統を提供してくれたDan Littman、IL-23RGFPマウス系統を提供してくれたDan Cuaに感謝の意を表する。組織処理と染色については、Kennedy Institute of Rheumatology Histology ServiceのIda Parisi博士、Bryony Stott博士、Rhiannon Cook嬢に感謝したい。配列データの作成と初期処理については、Wellcome Centre for Human GeneticsのOxford Genomics Centre (Wellcome Trust grant reference 203141/Z/16/Zによる)に感謝する。以下の試薬は、NIH Tetramer Core Facility から入手したものである。CD1dおよびMR1四量体。MR1 tetramerは、Dr. James McCluskey、Dr. Jamie Rossjohn、Dr. David Fairlieが共同で開発し、メルボルン大学から配布を許可されているNIH Tetramer Core Facilityによって製造されたものである。我々は、EMD/TGUフローサイトメトリー施設でフローサイトメトリーパネルの設計と細胞選別を行ったHelen Ferryと、C.-P.H.に与えられたHuman Immune Discovery Initiative（HIDI）プロジェクトの一環として行われたWIMM Single Cell Genomics FacilityでのRNA配列決定にNeil Ashleyに謝意を表したい。記載された見解は著者のものであり、必ずしもNHS、NIHR、または保健省のものではありません。オックスフォード大学TGUバイオバンクのメンバー、特にJ. Chivenga、A. Isherwood、R. Williams、M. Cabritaが患者サンプルの収集を円滑に進めたことに感謝する。さらに、Oxford IBD Investigatorsコンソーシアムのメンバーの貢献にも感謝する。Dr. Carolina Arancibia, Dr. Adam Bailey, Professor Ellie Barnes, Dr. Noor Bekkali, Dr. Elizabeth Bird-Lieberman, Dr. Oliver Brain, Dr. Barbara Braden, Dr. Jane Collier, Professor James East, Dr. Lucy Howarth, Professor Paul Klenerman, Professor Simon Leedham, Dr. Rebecca Palmer, Dr. Fiona Powrie, Dr.Dr. R. R. M. Cabrita, Dr.M. R. R. Powry, Dr.Dr.Dr. R. R. Powry Fiona Powrie, Astor Rodrigues, Francesca Saffioti, Alison Simmons, Peter Sullivan, Holm Uhlig, Jack Satsangi, Philip Allan, Timothy Ambrose, Jan Bornschein, Jeremy Cobbold, Emma Culver, Michael Pavlides そして Alissa Walshの各博士です。この研究は、ImmGenコンソーシアム55によって収集されたデータの恩恵を受けています。

ソースデータ
ソースデータ(1.2M, xlsx)

著者による貢献
C.-P.H.は、概念化、データキュレーション、形式的分析、調査、方法論、プロジェクト管理、検証、可視化、執筆（原案）、レビュー、編集に貢献した。D.C.は調査、検証、分析、執筆-レビュー、編集に貢献した。L.D.は調査、検証、分析に貢献した。C.P.は、コンセプト立案、リソース、調査、プロジェクト管理、執筆・レビュー・編集に貢献した。S.B.は調査、プロジェクト管理、執筆-レビュー-編集に貢献した。N.I.は、データの管理、正式な分析、および執筆・編集に貢献した。H.A.D.は調査に貢献した。Y.G.は調査、執筆-レビュー-編集に貢献した。M.E.B.F.は、調査・執筆・レビュー・編集に貢献した。O.J.H.氏は、調査、資料、執筆、レビュー、編集に貢献した。L.C.G.は調査、方法論、執筆-校閲・編集に貢献した。E.H.M.は調査および執筆-レビューと編集に貢献した。S.P.は調査に貢献した。M.F.は調査および執筆-レビューと編集に貢献した。N.M.P.は監修と執筆-レビュー-編集に貢献した。H.U.は監修-査読-編集に貢献した。E.M.は、方法論、検証、可視化に貢献した。F.P.は、コンセプト立案、資金獲得、監修、検証、執筆-レビュー-編集に貢献した。P.K.は、コンセプト立案、資金獲得、監督、検証、執筆-レビュー-編集に貢献した。E.T.は、コンセプト立案、データキュレーション、形式的分析、調査、方法論、プロジェクト管理、監督、検証、可視化、執筆（原案作成）、レビュー、編集に貢献した。

査読
査読情報
Nature Communicationsは、Avery August、Agnes Lehuen、Johan Sandbergの各氏がこの研究の査読に貢献したことに感謝します。査読者のレポートがあります。

データの利用可能性
本研究で得られたヒトRNAシーケンスデータは、EMBL-EBI ArrayExpressデータベースのアクセッションコードE-MTAB-11440に登録されています。本研究で得られたマウスRNA配列データは、EMBL-EBI ArrayExpressデータベースのaccession code E-MTAB-11397に寄託されています。本研究で作成したRhapsody単細胞データは、Gene Expression OmnibusデータベースにアクセッションコードGSE207159で寄託されている。ソースデータはこの論文に添付されています。

コードの公開
データの複製を可能にするRスクリプトは、https://github.com/saxifragus-oxf/TMIC-project から入手可能である。

競合利益
F.P.はGSK、Novartis、Janssen、Genentech、Rocheからコンサルタント業務または研究支援を受けている。H.H.U.はJanssen, UCB Pharma, Eli Lilly, AbbVie, Celgene, OMass, and MiroBioから研究支援またはコンサルタント料を受けている。P.K.はUCBとMedimabのコンサルタントをしている。残りの著者は、競合する利害関係を宣言していない。

脚注
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図および所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。

本研究は、以下の著者により共同監修されました。Paul Klenerman, Emily E. Thornton.

寄稿者情報
Paul Klenerman, Email: ku.ca.xo.mdn@namrenelk.luap.

Emily E. Thornton, Email: ku.ca.xo.mmi@notnroht.ylime.

補足情報
オンライン版には、10.1038/s41467-022-35126-3で利用可能な補足資料が含まれています。

論文情報
Nat Commun. 2022; 13: 7472.
2022年12月3日オンライン公開。doi: 10.1038/s41467-022-35126-3
PMCID: PMC9719512
PMID: 36463279
Carl-Philipp Hackstein,1,2 Dana Costigan,3 Linnea Drexhage,2,9 Claire Pearson,4 Samuel Bullers,4 Nicholas Ilott,4 Hossain Delowar Akther,1,2 Yisu Gu,4 Michael E. B. FitzPatrick,2 Oliver J. Harrison,5,6 Lucy C. このような状況下において、本論文は、「日本学術振興会特別研究員奨励賞」を受賞しました。
1Peter Medawar Building for Pathogen Research, University of Oxford, Oxford, UK
2Translational Gastroenterology Unit, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK
3MRC人間免疫学ユニット、MRC分子医学ウェザーオール研究所、オックスフォード大学、オックスフォード、英国
4ケネディリウマチ研究所、NDORMS、オックスフォード大学、オックスフォード、英国
5基礎免疫学センター、ベナロヤ研究所、1201 9th Ave、Seattle、WA 98101 USA
6ワシントン大学免疫学部、750 Republican St、Seattle、WA 98108 USA
7トランスレーショナル消化器病学ユニット、バイオメディカル研究センター、小児科、オックスフォード大学、オックスフォード、OX39DU イギリス
8Nuffield医学部、オックスフォード大学、オックスフォード、英国
9現住所 Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, Oxford, UK
Paul Klenerman, Email: ku.ca.xo.mdn@namrenelk.luap.
投稿者情報
corresponding authorCorresponding author.
Received 2022 Feb 24; Accepted 2022 Nov 20.
著作権 © The Author(s) 2022
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可しています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法令上の規制で許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
Nature Communicationsの記事は、Nature Publishing Groupの好意によりここに提供されています。
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