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生体内の安定同位体トレーシングにより、微生物叢と宿主のヒストンアセチル化をつなぐ代謝的橋渡しが明らかになった

哉百名

記事| 41巻11号111809頁、2022年12月13日発行
生体内の安定同位体トレーシングにより、微生物叢と宿主のヒストンアセチル化をつなぐ代謝的橋渡しが明らかになった
ペダー・J・ルンド 5
Leah A. Gates
Marylene Leboeuf
C. David Allis
ゲイリー・D・ウー
ベンジャミン・A・ガルシア 7, 8
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脚注を表示するオープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111809
PlumX メトリクス


ハイライト

無菌マウスの上皮細胞ではヒストンH4のアセチル化が減少している

微生物が食物繊維を代謝して、ヒストンのアセチル化に必要な炭素を生成していることがわかった

炎症が起こると、微生物叢から宿主の脂肪酸代謝への炭素の流れが阻害される
まとめ
腸内細菌は食物繊維を酪酸に発酵させることで、宿主のヒストンのアセチル化に影響を与える。酪酸はヒストン脱アセチル化酵素を阻害することでヒストンのアセチル化を促進するが、酸化されてヒストンアセチル化酵素の補酵素であるアセチル・コエンザイムA（CoA）となる可能性もある。我々は、無菌マウスの上皮細胞において、プロモーター領域を除く全ゲノムでヒストンH4のアセチル化が消失していることを見出した。13C標識繊維を用いた生体内での安定同位体トレーシングにより、微生物がヒストンアセチル化に炭素を供給していることを明らかにした。その後、メタボロームプロファイリングにより数百の標識分子を発見し、微生物が宿主の脂肪酸代謝に寄与していることを支持した。この代謝は大腸炎に反応して低下し、脂肪酸酸化に関わる遺伝子の発現低下と相関していた。これらの結果は、食事から微生物叢を介した宿主への炭素の流れを明らかにし、その乱れが遠位腸のエネルギー恒常性に影響を与え、大腸炎の発症に寄与している可能性を示唆している。
図1 アブストラクト
図のサムネイルfx1
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キーワード
宿主-微生物叢相互作用
エピジェネティクス
ヒストンアセチル化
脂肪酸代謝
大腸炎
研究テーマ
CP：微生物学
はじめに
腸管遠位部には微生物叢が存在し、宿主生物とダイナミックな生態系を形成している。微生物群は宿主生物とダイナミックな生態系を形成しており、その相互作用は宿主の生理機能に大きな影響を及ぼしている。例えば、マイクロバイオータは、腸内感染症の予防1,2,3,4、免疫系の調節5,6,7,8,9、腸上皮の調節10,11,12,13,14、栄養吸収の補助などの役割を担っているのですが、マイクロバイオータにおける望ましくない変化は、ディスバイオシスと呼ばれる状態につながっています2,16,17,18,19,20,21,22。多様性が失われ、通性嫌気性Proteobacteriaが偏性嫌気性Proteobacteriaよりも優勢になることが特徴であり、腸内細菌の異常は、いくつかのヒト疾患、特に潰瘍性大腸炎やクローン病で顕著に見られる。23,24,25,26 この相関関係から、腸の恒常性を保つプロセスとそのプロセスが疾患においていかに破壊されているかを理解しようと、ホストとマイクロバイオータの相互作用についての研究が動機づけられている。
宿主-微生物間の相互作用は、受容体リガンド、酵素阻害剤、代謝前駆体として機能する低分子代謝産物に依存する部分があります。酪酸は、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）41 を阻害する作用があることから、注目されています。HDACは、ヒストン蛋白質の翻訳後修飾状態を調節する多くのクロマチン修飾酵素の一つであり、DNAメチル化および非コードRNAとともに、ヒストン修飾は、その下のDNA配列にコードされた情報の使用を決定し、それによってエピジェネティック（すなわち遺伝学の上位）様式で遺伝子制御に寄与しています42。ヒストンは、8量体の足場を形成し、147 bpのDNAと結合して真核生物のクロマチンをヌクレオソームに組織化する。ヒストンは、無数の翻訳後修飾を受けるが、中でもリジンのアセチル化とメチル化は最も評価が高く、よく研究されている43, 44, 45, 46, 47 。これらの修飾は、「書く」酵素と「消す」酵素によって付加・除去され、「読む」タンパク質を動員して、転写の活性化や抑制といった生物学的成果を促進することによって、部分的にクロマチン活性を調節している。したがって、酪酸によるHDACの阻害は、遺伝子発現に影響を与える可能性がある。これまでの研究から、主に偏性嫌気性菌が産生する酪酸は、Foxp3遺伝子近傍のヒストンH3のアセチル化を通じて腸管における免疫寛容を強化し、それによって制御性T細胞の分化をサポートすることが明らかになっている48。
HDAC阻害剤として働くだけでなく、酪酸は受容体リガンドおよびエネルギー源としても機能する。49 実験的に誘導された大腸炎に対する高繊維食の改善効果は、GPR43とGPR109Aに関連しています。51 上皮細胞における微生物群依存性のPPARγシグナルは、ミトコンドリアβ酸化を促進し、腸内腔の嫌気性条件と恒常性の維持に不可欠です。腸管上皮細胞のこの代謝は、微生物のSCFAに大きく依存している。SCFAは、β酸化を受けてアセチル-コエンザイムA（CoA）を生成し、それによってトリカルボン酸（TCA）サイクルとATP生成の燃料となる、容易に入手できる炭素源として機能する52,53。Donohoeらによって提案されたように、酪酸がHATの間接的な活性化因子として働くか、HDACの直接的な阻害因子として働くかは、細胞の脂肪酸代謝の傾向（腸管上皮細胞の場合、その傾向は高いと予想される）に依存すると思われる。
安定同位体標識は、下流の代謝経路やタンパク質の修飾に対するさまざまな基質の寄与を研究するための魅力的なアプローチである。放射性同位体を用いた初期の研究は、腸管遠位部における酪酸代謝の重要性を立証するのに役立ったが55,56,57,58、14CO2の測定はTCAサイクルにおける酪酸酸化の寄与のみを考慮し、酪酸由来のアセチルCoAがヒストンのアセチル化に用いられるなど、別の経路での寄与は考慮されていない。アセチルCoAは細胞代謝の中心的な役割を担っていることから、微生物叢は腸管上皮細胞においてさらに多くの代謝経路をサポートする可能性を持っている。59,60 さらに最近の安定同位体を用いた研究では、大腸菌を13C-グルコースで外部標識し、未寄生マウスに投与したところ、微生物由来の化合物が宿主組織に入り込む範囲が顕著になった61。しかし、宿主の食事から栄養を得て遠位腸に集中する無傷の微生物叢で起こる代謝変換や生態学的相互作用をより完全にモデル化する代替戦略が必要である。
本研究では、遠位腸のヒストンアセチル化パターンに対する微生物叢の影響を広く調べ、微生物叢と宿主上皮細胞の代謝的なつながりがヒストンアセチル化に食い込んでいることを直接証明することを目的とした。質量分析計を用いたヒストン修飾のディーププロファイリングとその後のクロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-seq）解析により、無菌マウスでは転写開始点付近を除いてゲノム全体でヒストンH4アセチル化が失われていることを明らかにした。また、ヒストンのアセチル化には微生物が関与していることが示唆され、同位体追跡実験によりヒストンのアセチル基には酪酸と食物繊維に由来する炭素が含まれていることを明らかにした。最後に、腸管炎症モデルマウスを用いたin vivo同位体トレーシングとアンターゲットメタボロミクスおよび補完的なハイスループット解析を組み合わせ、炎症が微生物叢と宿主脂肪酸代謝との統合をいかに阻害するかを明らかにしました。また、食物繊維の微生物代謝が宿主細胞の代謝や遠位腸でのヒストンアセチル化にどのように寄与しているかが明らかになった。
研究成果
微生物がいないと、遺伝子本体全体のヒストンH4のアセチル化が低下する。
遠位腸のヒストン修飾に対する微生物叢の影響を評価するために、従来型マウス（Conv）またはGF雌マウスから分離した黄道上皮細胞および大腸上皮細胞からヒストン抽出物を調製し、ボトムアップMS（数百のユニークな修飾ヒストンペプチドを検出できるアプローチ）によって解析した（図1A）。
図のサムネイル gr1
図1A遺伝子体全体のヒストンH4のアセチル化は、微生物相の非存在下で減少する
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全体として、統計的に有意な差のある47のヒストンペプチドが同定された（図S1AおよびS1B）。微生物叢を持たないマウスは、コロニー形成されたマウスと比較して、ヒストンH4のN末端尾部に由来するペプチドの修飾型の相対存在量に顕著な変化が見られた（図1B、S1AおよびS1B）。このペプチド（4GKGGKGLGKGAKR17）には、H4K4、H4K8、H4K12、H4K16の4カ所のアセチル化部位が含まれている。このペプチドのモノ、ジ、トリアセチル化のレベルは、GFマウスのケカとコロンで著しく減少し、それに対応して非修飾ペプチドのレベルも約50%から60%以上まで増加した（図1B）。全体として、我々の結果は、微生物が盲腸と大腸の上皮細胞でヒストンH4のアセチル化をサポートしていることを示し、全大腸組織を調べた以前の研究と一致している62。
次に、H4アセチル化の減少を特定のゲノム領域に局在させるために、ChIP-seqを実施した。ヒストンマーカーのグローバルな変化は、標準的なChIP-seqアプローチによる定量的変化の検出を困難にする可能性があるため、外部参照としてショウジョウバエS2細胞からの外来クロマチンのスパイクインを含めた63。MSで観察されたH4アセチル化の減少と一致して、外来クロマチンに由来する配列決定のリードの割合はGFサンプルで高く、マウスクロマチンがあまり濃縮されていないことを示していた（図S2A）。GFマウスでは、特定の遺伝子座におけるH4アセチル化度の低下よりもむしろ、ゲノム全体の遺伝子体におけるH4アセチル化度の緩やかな、しかし一貫した低下が観察された（図1C）。転写開始点（TSS）はこの減少から隔離され、H4アセチル化によってより顕著にマークされるようになったようである。遺伝子本体のアセチル化が全体的に減少しているにもかかわらず、GFマウスでは、125の発現増加遺伝子と161の発現減少遺伝子が比較的少数でバランスよく存在していた（図1D；表S1）。64 パスウェイ解析では、これらの発現差遺伝子の中に、低分子およびイオン輸送体活性、酸化還元酵素活性、ブラシ境界および細胞外マトリクス構成要素が濃縮されていることが示された（図S2B）。
アセチル化ヒストンには酪酸と食物繊維由来の炭素が含まれる
GFマウスにおけるH4アセチル化レベルの低下は、微生物叢に依存した酪酸の不足、したがってHDACの阻害に関する解除で説明できる。しかし、酪酸はHDAC阻害剤としての活性に加えて、HATの供与基質であるアセチルCoAへの酸化を介して腸管上皮細胞の主要なエネルギー源となっている52,53。したがって、酪酸の不足はアセチルCoAレベルおよびHAT活性も低下させて、GFマウスのヒストンH4アセチル化の減少につながるかも知れない。酪酸が代謝を介してヒストンのアセチル化に寄与しているかどうかを調べるために、Caco2細胞を1 mMの13C標識酪酸とインキュベートし、アセチル化ヒストンペプチドへの同位体取り込みをMSによって測定した（図2A）。図2Bに示すように、同位体ラベルは30分以内にアセチル化ヒストン上に現れ、24時間かけてプラトーに達した。前駆体イオンのマススペクトルは、m + 2ピークから同位体強度が増加するシフトした同位体分布を示し、2つの13C原子からなるアセチル基の存在と一致した（図S3A）。同位体導入量は1%未満から40%近くまでであり、主にペプチド上のアセチル基の総数によって決定された(図2B)。ヒストンH4テールペプチドの多重アセチル化体（ac2、ac3、ac4）は、モノアセチル化体（ac1）よりも高いレベルの標識を達成したが、これはおそらく前者がよりHAT活性の高いクロマチンの、よりアクセスしやすい領域から由来している可能性が高いためであろう。グルコースなどの代替炭素源を細胞に与えることで、酪酸からの同位体組込みが促進された（図S3B）。
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図2アセチル化ヒストンには酪酸と食物繊維由来の炭素が含まれる
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より生理的なモデルにおいて、酪酸のような微生物由来の産物がヒストンのアセチル化のための炭素源として機能するかどうかを調べるために、同位体標識した発酵性食物繊維（U-13C-イヌリン）をマウスに投与した。イヌリンは、酪酸を含むSCFAに代謝されることが知られている65,66。したがって、我々は、微生物叢がイヌリンを酪酸やその他の生成物に発酵し、それが腸上皮細胞によってアセチルCoAに酸化されてHATによって使用されると予測した（図2C）。この仮説に沿って、13C-イヌリンをマウスに投与した後、アセチル化ヒストンH4とヒストンH3への同位体の組み込みを検出した（図2D、S3C、S3E）。13C-イヌリンをマウスに投与すると、アセチル化ヒストンH4およびヒストンH3に5%から10%の濃度で、用量および時間依存的に取り込まれた（Figure 2D, 2E, S3C-S3F）。微生物相に依存することを示すように、抗生物質は同位体の組み込みを抑制した（図2E、S3D、およびS3F）。これらの結果は、食物繊維から生成される微生物叢依存性の産物がヒストンアセチル化のための炭素源として機能することの証拠を示している。
炎症は、腸内細菌叢とその関連分子の組成、活性、およびコンパートメント化を混乱させる
次に、腸内細菌叢による食物繊維の発酵と、宿主細胞におけるアセチルCoA代謝やヒストンのアセチル化をつなぐ中間的な分子の炭素の流れを追跡することに挑戦した。さらに、炎症性腸疾患は一般に細胞代謝や微生物叢の変化と関連していることから、炎症が微生物叢から腸管上皮細胞への炭素フラックスに負の影響を与えるかどうか、それがより広くヒストンアセチル化の上流の代謝経路に影響を与える可能性があるかどうかを明らかにすることも目指した。そこで、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与による大腸炎と同時にin vivo同位体トレーシングを行い、ヒストンから低分子代謝産物に注目した（図3A）。また、腸内メタボロームや炭素移動に影響を及ぼす可能性のある宿主の遺伝子発現などの要因について、さらなるハイスループット解析を並行して実施しました。
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図3炎症は、腸内細菌叢とその関連分子の組成、活性、およびコンパートメント化を破壊する
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DSSを投与した雌マウスは、体重減少から明らかなように、大腸炎を発症した（図3B）。コントロールマウスとDSSマウスの組織抽出物を、液体クロマトグラフィー（LC）-MSベースのアンターゲットメタボロミクス用プラットフォームでプロファイリングし、代謝物レベル全体の測定と13C原子の組込みが可能でした。まず一般的な代謝物レベルに着目すると、コントロールマウスでは、大腸と盲腸は密接に関連しているものの、各組織がそれぞれ異なるメタボロームを持っていることがわかりました（図3C；表S2）。これは、微生物叢が宿主ゲノムにコードされている以上の代謝変換を行う能力を持ち、上皮障壁によって区分けされていることを考えれば、驚くにはあたらない。このバリアの効果は、対照マウスの他の組織と比較したときに特に明らかで、内腔にほぼ完全に制限されるか、内腔から排除される傾向を示している（Figure 3DおよびS4A）。DSSは、糞便内容物のメタボロームに最も大きな影響を与え、結腸と盲腸の方向へのシフトを引き起こした（図3C）。この変化は、上皮のバリアーが損なわれて宿主分子の内腔への漏出が可能になること、あるいは疾患に伴う微生物群の活性または組成の変化により、微生物群の正常な出力が損なわれることが原因であると思われる。後者のケースを象徴するように、デオキシコール酸、ヒドロキシインドール酢酸、ウロビリノーゲンは、すべて微生物叢に依存することが知られている68,69,70がDSSマウスの糞便内容物で著しく減少した（図S4A）。逆に、宿主の代謝により関連する乳酸とパルミトイルカルニチンは、DSSマウスの糞便内容物で有意に上昇するようになった（図S4A）。DSSマウスの糞便内容物には、対照組織で見られるレベルを超えて発現が上昇する特徴が少数認められた。これは、おそらく微生物叢に由来する大腸炎誘発分子または炎症反応によって修飾された分子を表していると思われる。これらの機能には、カプロラクタム、ジプロピルニトロサミン、ニトロチロシン、オルニチンが含まれる（図S4A）。
腸内メタボロームは、大腸炎で変化することが知られている微生物叢の構成によって部分的に決定される。そこで、コントロールマウスとDSSマウスの群集組成を評価し、この情報をメタボロームデータと関連付けるために、サンプルのサブセットに対して16S rRNAの配列決定も実施しました。13C-イヌリンを投与したコントロールマウスでは、Firmicutes門Erysipelotrichaceae科のDubosiella newyorkensis（NYU-BL-A4株）71に完全に一致する単一の操作的分類単位（OTU）が、コミュニティ全体の約90％を占めた（図S4Bおよび表S3）。この予想外の結果は、典型的な微生物相に関連する高いレベルの多様性とは対照的である。イヌリンはErysipelotrichaceaeの増殖に関連しているが72,73、前回のイヌリン実験では同様の拡大は起こらず、予想された程度の群集の不均質性が示された（図S4C）。したがって、この偏った群集構造は、このグループのマウスの特異性または当時の飼育環境に起因するものと考えられた。DSSマウスでは、Erysipelotrichaceaeが引き続き優勢であったものの、Enterobacteriaceae、Bacteroidaceae、Verrucomicrobiaceaeの生物（図S4B）の増加が観察された。腸内細菌科を含むProteobacteriaの増殖は、炎症性腸疾患の患者によく見られる現象である23,24,25。
16Sデータを補完するために、我々は糞便内容物のメタプロテオームをMSによって特徴づけ、1000以上の宿主タンパク質と、非常に豊富なD. newyorkensisから400近くのタンパク質を同定した（図S4D; 表S4）。コントロールマウスとDSSマウスを比較すると、後者の糞便内容物では宿主タンパク質が一般に多くなり、微生物タンパク質は逆の傾向を示した（図S4C）。このこともまた、DSSマウスにおける上皮バリアの完全性の喪失、およびコントロールマウスに関連する微生物の相対的レベルまたは活性の低下と一致している。
食物繊維は何百もの代謝産物のための炭素源である
次に、13C標識イヌリンを投与した雌マウスと非標識の雌マウスを比較し、食物繊維由来の炭素を含む代謝物の特徴を明らかにしました。すべての組織において、約300の同位体標識が検出されました（図4；表S2）。このことは、標識された炭素が宿主細胞に利用可能になる前に、微生物による処理が必要であることと一致する。肝臓組織では、わずかな量の標識が表面化しただけであった。予想通り、イヌリンからの13C原子は、ピルビン酸、α-ケトグルタル酸、コハク酸、リンゴ酸などの解糖およびTCAサイクルの中間体上に現れ（図S5AおよびS5C）、最近の研究と一致した74。また以前の文献と一致して、イヌリンはSCFAs65、66、74に発酵された（図S5B）。例えば、プロピオン酸の約12%はm + 2アイソトープマーへの同位体シフトを示した。イヌリンは異化分解以外にも、アミノ酸、ヌクレオチド誘導体、NADの生合成に寄与していた（図S5D-S5F）。一般に、α-ケトグルタル酸、グルタミン酸、グルタミンなど、近縁の分子は同位体分布が似ていることが強調された。
図のサムネイル gr4
図4食物繊維は何百もの代謝産物の炭素源となる
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炎症は食物繊維の宿主脂肪酸代謝への寄与を妨害する
in vivo同位体トレーシング分析で得られた興味深い知見の1つは、遊離脂肪酸、膜脂質、アシルカルニチンなどの長鎖アシル基を持つ分子が関与していることです。我々は、コントロールマウスの糞便内容物から、ヒドロキシペンタデカン酸などのいくつかの長鎖脂肪酸（LCFA）にイヌリン由来の炭素が存在することに注目した（図5A）。これらのLCFAの同位体分布は、完全に標識されたアセチル-CoAから伸長するアシル鎖に2個の13C原子が順次移動することに特徴的なパターンを示した。LCFAは同化的に膜の生合成に使われるか、異化的に脂肪酸の酸化に使われる可能性がある。前者の証拠に、我々は腸内容物と腸内組織の両方で、いくつかの脂質の同位体標識が検出された（図5B）。しかし、盲腸および結腸からの長鎖アシルカルニチンも同位体標識を獲得したことから、これらのアシル基の一部は脂肪酸酸化のためにミトコンドリアへ輸送されると思われる（図5C）。興味深いことに、DSS誘発大腸炎は、これらのアシル化分子のラベル化を抑制した（図5A-5C）。非炎症性の高分子量DSSで処理すると75、これもまた明確なコミュニティ組成の確立につながったが、これらの分子の標識は妨げられなかった（図S6）。全体として、これらの結果は、微生物叢が食物繊維を利用して長鎖アシル基を構築すること、そして炎症が、これらの事前に構築された分子の糞便組織への移行または微生物叢から流れる炭素を用いた腸上皮細胞におけるデノボ合成のいずれをも阻害することを示している。
図のサムネイルgr5
図5炎症が食物繊維の宿主脂肪酸代謝への寄与を妨害している様子
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炎症は脂肪酸代謝を支える遺伝子のセカンダリー発現を抑制する
メタボロミクスデータの変化と宿主の遺伝子発現の変化を関連付けるため、RNAシーケンス（RNA-seq）を並行して行いました。大腸と比較して、大腸炎は盲腸の遺伝子発現に大きな影響を与え、Il1b、Il6、Il17a、Il17f、Tnf、Ccl2などのNOD様受容体（NLR）とインターロイキン（IL）-23シグナルに関連する遺伝子の発現上昇に基づく炎症の転写的シグネチャが見られた（図6A、S7A；表S5、S6）。大腸炎の古典的なマーカーであるカルプロテクチンを形成するS100a8とS100a9もまた、発現が上昇した。炎症性遺伝子の発現上昇と同時に、DSSマウスは、カルニチンシャトルシステムのメンバー（Cpt1a、Cpt2、Crat）、アシル-CoA脱水素酵素（Acads、Acadm、Acadvl）、および脂肪酸からアセチルCoAへの異化を直接担う他の酵素（Ehhadh、Hadh、Hadha、Hadhb）などの脂肪酸代謝に関する遺伝子（図6B）の発現低下を示している。大腸炎はまた、ペルオキシソーム遺伝子の発現を減少させた（図S7B）。ミトコンドリアと同様にペルオキシソームは脂肪酸の酸化が可能であり、超長鎖脂肪酸（VLCFA）、分岐鎖脂肪酸、ジカルボン酸などの特定の脂肪酸の異化に特に重要である。これらの遺伝子発現の変化は、盲腸における上皮細胞と炎症細胞の相対的な割合の変化を反映しているのかもしれない。全体として、大腸炎は盲腸の脂肪酸代謝を支える遺伝子の発現を乱し、イヌリン由来の炭素からアシル化分子へのフラックスの低下と相関していることが分かった。
図1.サムネイルgr6
図6炎症が脂肪酸代謝を支える遺伝子の糞便発現を抑制する様子
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考察
宿主と微生物叢の相互作用は、腸内の多くの生理的プロセスに影響を与えることが知られている。本研究では、まず盲腸と結腸における微生物叢が宿主のエピジェネティクスに与える影響に着目し、この重要なコミュニティーの欠如が、TSSを除くゲノム全体のヒストンH4アセチル化の減少につながることを見いだした。細胞培養の酪酸と雌マウスの食物繊維を用いた同位体トレーシング実験により、酪酸やその他の微生物代謝産物がヒストンアセチル化のための炭素源として働くことを明らかにした。また、メタボロミクスの手法を用いて、アシル化分子への同位体ラベルの追跡により、微生物代謝が宿主の生理学に広く寄与していることも明らかにしました。さらに、ヒストンアセチル化との微生物依存的な代謝の関連性が、生体内で機能していることを直接示す証拠も得ました。最後に、炎症が微生物叢から宿主の脂肪酸代謝への炭素フラックスを阻害していることを観察した。
多くの研究で、微生物叢がヒストンのアセチル化を促進することが示されている。48,62 従来型マウスとGFマウスでヒストンH4のアセチル化レベルが高いという我々の結果は、以前の発表と一致している62 ヒストンのアセチル化に対する微生物叢のプラスの効果は、酪酸などのSCFAを生成する繊維発酵に関連している。つまり、腸内細菌は、負の制御因子（HDAC）の阻害によってヒストンのアセチル化をサポートするのではなく、正の制御因子（HAT）を活性化し、HATのドナー基質であるアセチルCoAを生産する基質を供給している可能性があるのである。酪酸によるヒストンアセチル化促進のこの二つのメカニズムは、ATPクエン酸リアーゼのサイレンシングが、低用量ではヒストンH3アセチル化の増加を防ぐが、高用量では防げないという実験結果から示された52。細胞培養での先行研究は、ヒストンへの14Cの取り込みとヒストンからの13Cラベル化酢酸の検出から酪酸がヒストンのアセチル化の炭素ドナーとして働くことを示唆した52, 59。細胞培養した13C標識酪酸を用いた我々の同位体トレーシング解析とMSによる高分解能解析は、これらの結果を拡張し、ヒストンのアセチル基が酪酸由来の炭素を含むことを明白に示している。重要なことは、より生理的な環境で13C標識繊維を用いて、このヒストンアセチル化とのマイクロバイオータ依存的な代謝の関連性が生体内でも機能していることを直接示す証拠を得たことである。酪酸がHDAC活性の阻害剤として、あるいはHAT活性をサポートするアセチルCoAの供給剤としてどの程度機能するかはまだ不明だが、おそらくその濃度と細胞が代謝する速度に関係するものと考えられる。
GFマウスにおけるH4アセチル化のグローバルな減少は以前から指摘されていたが62、我々はこの以前の知見を発展させ、ChIP-seqとRNA-seqを行い、ゲノムのどこでこの減少が起こり、遺伝子発現にどのような影響を及ぼすかを明らかにした。その結果、ゲノム全域で、特に遺伝子本体でH4アセチル化が低下していることがわかった。この結果は、HDAC阻害剤で処理した細胞におけるH4アセチル化について最近報告されたものと一致している。77 GFマウスではH4アセチル化が全体的に失われているにもかかわらず、このヒストン修飾はTSSでより顕著に見られることが分かった。しかし、このようなエピジェネティックな変化は、転写にはほとんど影響を与えないようである。なぜなら、GFマウスでは、比較的少数の、バランスのとれた数の遺伝子が発現上昇と下降を示したからである。このことは、腸管の解剖学的位置がエピジェネティックな景観に影響を与えるが、コロニー形成の状況は影響を与えないという、従来型マウスとGFマウスのクロマチンアクセス性を比較した先行研究と一致している64。むしろ、コロニー形成状況による遺伝子発現の変化は、微生物叢依存性の転写因子によって、初期発生時に形成されたエピジェネティック景観に働きかけることによって生じることが提案された。その後行われたGFマウスの研究では、H3K4me1とH3K27acのゲノムパターンにいくつかの違いが認められたが、より注目すべきは、アクセス性とヒストン修飾のパターンが似ているGFマウスのクロマチン領域に核内受容体HNF4AとHNF4Gの結合が増加したことで、やはり遺伝子発現制御における刺激依存性転写因子の重要性が強調された78。この点で、微生物の代謝物が核内受容体のリガンドとして作用することは、特に注目すべきことです31,79,80。
代謝によるヒストンアセチル化に対する微生物相の貢献から、食物繊維の微生物代謝がどのように宿主細胞に前駆体を供給するのかを明らかにするために、メタボロミクスを用いて同位体組込みをより広く調査することになりました。微生物が腸内の宿主代謝をサポートするという考えは、初代結腸細胞の培養および確立された細胞株における酪酸からCO2への同位体標識された炭素の移動によって示唆されています53、55、56、57、58、59、60いくつかの研究では、さらにアセチルCoA、ヒストンおよび脂質に同位体標識を追跡しています14、59、60。宿主の代謝を支えている微生物相と一致して、GFマウスは大腸でエネルギー欠乏の兆候を示した53。注目すべきは、このエネルギー欠乏は、正常な微生物相または単一の酪酸産生生物の導入によって回復する可能性があることである。
この代謝の関連性は臨床的にも重要であり、ヒトの潰瘍性大腸炎やマウスのDSS誘発性大腸炎においても、酪酸酸化とミトコンドリア機能の低下が同様に報告されている56, 57, 58, 67, 81, 82 これらのin vitroおよびex vivoの解析に基づいて、13C標識繊維を用いてin vivoの同位体追跡を行い、生理条件において微生物叢からホストへの炭素移動の決定的証拠を取得することに成功した。最近の研究では、同様に13C標識繊維を使用して、in vitroシステムで微生物叢の代謝経路を調査しています。83 このシステムでは、標識の制御がより容易ですが、私たちや他の研究者が採用したin vivoアプローチのようにホスト組織との相互作用の可能性を扱うことはできません。これらの結果は、微生物がアセチルCoAの炭素源として働き、腸管上皮細胞がTCAサイクルの駆動、タンパク質のアセチル化、脂質合成のための長鎖アシルCoAの構築に利用するという考え方を裏付けるものである（図7）。我々の研究では、微生物相のどのメンバーが宿主に炭素を供給する役割を担っているかについては正確に触れていないが、支配的なErysipelotrichaceae（図S4B）が一つの可能性を持っているのではないかと推測している。微生物相は通常、不均一であるため、この単一の分類群の予期せぬ成長は、メタボロミクスデータにおける潜在的な注意点であると言えます。しかし、図S6Bに示した13C-H2O群と13C-DSShi群の代謝物の同位体分布は、2つの異なる群集組成（図S6A）にもかかわらず類似しており、Erysipelotrichaceae以外の分類群も宿主への炭素移行を仲介できることが示唆された。さらに、Erysipelotrichaceaeの拡大を伴わない多様なコミュニティにおいても、ヒストンアセチル化の同位体標識が観察された（図2EおよびS4C）。このことは、分類学上の差異にもかかわらず微生物相の機能的な遺伝子カテゴリーが保存されていることを示した画期的な研究と一致している85。
図のサムネイル gr7
図7食物繊維と微生物叢を腸管上皮細胞における脂肪酸代謝に関連付ける提案モデル
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DSS誘発大腸炎がアシル化分子の同位体ラベル化を阻害するという我々の観察は、大腸炎と脂肪酸代謝の欠陥とを関連づける以前の研究と一致している。大きな疑問は、この欠乏が潰瘍性大腸炎の発症の主要な要因であるかどうかである。エネルギー産生の不足は、上皮細胞の機能を低下させ、上皮の破壊を引き起こし、その結果、宿主組織に漏出した微生物産物に対する免疫反応を引き起こす可能性がある。何が脂肪酸代謝の初期低下の引き金となるかは不明であるが、抗生物質の使用、低繊維食、感染症はすべて、上皮細胞の代謝を促進するSCFAを生産する微生物叢の能力を低下させうる86。上皮の過度の再生も、未分化細胞の非酸化的代謝を促進するかもしれない86,87。一方、潰瘍性大腸炎に関連する微生物群および炎症を起こした上皮は、それぞれSCFA産生および脂肪酸酸化の能力が低いため、代謝の欠陥は潰瘍性大腸炎の主要原因というよりも、促進因子または単なる結果である可能性もある。
長鎖アシル基の標識は、その起源やLCFAが腸内のエネルギー源としてSCFAを補完するかどうかという問題を提起している。標識されたアシル基の起源として考えられるのは、標識されたSCFAが酸化されてアセチルCoAになり、これが宿主細胞によってLCFAを合成するために利用されることである。あるいは、標識アシル基は微生物脂質またはLCFAから直接もたらされ、膜小胞または分泌ホスホリパーゼの作用により宿主細胞に利用される可能性もある。88 宿主膜への同化のほかに、これらの微生物脂質は、標識パルミトイルカルニチンの検出が示すように、エネルギーのために酸化される可能性もある。実際、GFマウスで観察されたのと同じエネルギー不足は、SCFAsの利用に必要なScad活性を欠くマウスでは、我々の知る限りでは報告されていない53。このことは、SCFAsが腸内の微生物依存的な炭素源の唯一のプールを構成していない可能性を示唆している。
微生物叢が宿主の生理機能にどのような影響を与えるかについてさらに理解を深めるには、微生物叢の機能的出力である微生物タンパク質と低分子を相補的に研究する必要がある。全体として、本研究は、食物繊維の微生物発酵と宿主の脂肪酸代謝との間の関連性を同位体標識を使って実証し、宿主と微生物叢の相互作用に関する我々の知識に貢献するものであり、これは腸の恒常性にとって重要であると考えられる。
研究の限界
大腸上皮は、腸内分泌細胞、杯細胞、Paneth様細胞、腸管幹細胞、通過増幅（TA）細胞、吸収性結腸細胞を含む不均一な細胞の集まりであるため、ヒストンのアセチル化と代謝物の測定は、これらすべての亜集団からの寄与を反映したものである。大腸細胞およびTA細胞は、それぞれ30%から60%、10%から40%の頻度で報告されており、主要な亜集団であると思われる。さらに、アンターゲットメタボロミクスプラットフォームは、低分子代謝物の同位体標識の偏りのないプロファイルを提供しましたが、合成標準物質と標的メソッドを使用することにより、標識炭素原子の位置に関する情報と同様に化合物同定のさらなる信頼性を得ることができます。
STAR★Methods
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
抗アセチルヒストンH4, ウサギポリクローナル Millipore Cat# 06-866; RRID: AB_310270
生物試料
Drosophila S2 cells Maya Capelson lab N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
AIN76a ダイエット Research Diets Cat# D10001
チコリ由来のイヌリン、非標識 Isolife Cat# N-10302
チコリ由来イヌリン、U-13C 標識 Isolife 社の Cat# U-10302
チコリ由来のイヌリン、非標識 Sigma Cat# I2255
デキストラン硫酸ナトリウム、36-50 kDa MP Bio Cat# 160110
デキストラン硫酸ナトリウム、500 kDa Sigma Cat# 31395
酪酸ナトリウム、13C4-ラベル化 Sigma Cat# 488380
無水プロピオン酸 Sigma Cat# 240311
重要な市販アッセイ
NEBNext Ultra II DNA library kit for Illumina New England Biolabs Cat# E7645
イルミナ用NEBNext Ultra Directional RNA ライブラリーキット New England Biolabs Cat# E7420
NEBNext Ultra II Directional RNA ライブラリーキット（Illumina New England Biolabs用） Cat# E7765
寄託データ
アセチル化ヒストンH4 ChIP-seqデータ 本紙GEO: GSE179233
大腸上皮細胞RNA-seqデータ 本紙GEO: GSE179233
DSS大腸炎RNA-seqデータ 本紙GEO: GSE179233
黄砂大腸炎メタプロテオミクスデータ 本紙PRIDE: PXD026959
黄砂大腸炎メタボロミクスデータ 本論文 MassIVE: MSV000087752
実験モデル 細胞株
HEK293 細胞 Benjamin Garcia 研究室 N/A
Caco2細胞 Gary Wu lab N/A
実験モデル 生物／系統
マウス C57BL/6J Jackson Labs N/A
マウス C57BL/6J、無菌マウス Penn Gnotobiotic Mouse Facility N/A
ソフトウェアおよびアルゴリズム
EpiProfile Yuan et al.94 N/A
RStudio, v1.2.5033 RStudio https://www.rstudio.com/
STAR, v2.5.2a Dobin et al.95 N/A
HTSeq Anders et al.97 https://htseq.readthedocs.io/en/master/
DESEQ2 Anders and Huber98 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
GSEA Subramanian et al.99 https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp
R package, ClusterProfiler Yu et al.100 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
R パッケージ、ReactomePA Yu and He101 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ReactomePA.html
DeepTools Ramírez et al.103 https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/
ProteomeDiscoverer Thermo N/A
R パッケージ、MSStats Choi et al.104 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/MSstats.html
Compound Discoverer Thermo N/A
USEARCH Edgar and Bateman107 https://www.drive5.com/usearch/
Cutadapt v3.4 Martin110 https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/#
Dada2 v1.22.0 Callahan et al.111 https://benjjneb.github.io/dada2/index.html
QIIME2 v2021.8.0 Bolyen et al.112 https://qiime2.org/
samtools Li et al.96 http://www.htslib.org/
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトである Benjamin A. Garcia (bagarcia@wustl.edu) までお願いします。
材料の利用可能性
この研究では、新しい独自の試薬は生成されませんでした。
実験モデルおよび被験者の詳細
動物実験
すべての実験は、Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得て実施した。特に断りのない限り、マウスはJackson Labs社のC57BL/6J雌、7-8週齢であった。無菌マウスはPenn Gnotobiotic Mouse Facilityから提供された。動物はCO2による窒息と頸椎脱臼によって安楽死させた。大腸と噴門を解剖し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、縦に開き、上皮細胞分離に使用するためにPBSで再度洗浄した。イヌリン標識の時間経過については、マウスを照射したAIN76a食（Research Diets、D10001）に3日間馴化し、100μL PBSに溶解したU-13C標識イヌリン（Isolife）を1日1回、最大3日まで経口摂取させた。対照マウスにはPBSのみ、または非標識イヌリンを投与した。最後の投与から1日後、大腸組織を採取し、上皮細胞の分離を行った。抗生物質実験のために、マウスを3日間にわたりスレンダ水（10 mg/mL）に馴らし、スレンダ飲料水に抗生物質（1 mg/mL アンピシリン、1 mg/mL ネオマイシン、0.5 mg/mL メトロニダゾール、0.5 mg/mL バンコマイシン）ありまたはなしで処理し、AIN76a飼料に切り替えた。5日目および6日目に、10、50、100 mgのU-13C-イヌリンまたは100 mgの非標識イヌリンをマウスに経口投与した。7日目に大腸組織を採取し、上皮細胞の分離を行った。大腸炎実験では、マウス（8-10週）を3日間AIN76a食に馴化させ、0日目に飲料水中の2％のデキストラン硫酸ナトリウム（MP Bio、36-50kDa）で大腸炎を誘発させた。非炎症性の高分子量DSS（Sigma、500 kDa）も一部で使用された。6日目および7日目に、200μLのPBSに溶解した100mgのU-13C標識または非標識のイヌリン（IsoLife）をマウスに経口投与した。8日目、マウスは4時間の絶食後、頸椎脱臼により犠牲になった。肝臓、大腸、盲腸、糞便を採取し、液体窒素で急速凍結した。
細胞培養
HEK293（雌性ヒト胚性腎臓）およびCaco2（雄性ヒト結腸腺癌）細胞の標準培養条件は、10% FBSまたはFetalPlexおよび1X penicillin/streptomycinを添加したDMEMで、37℃の加湿インキュベーターで培養した。飢餓状態は、グルコースやピルビン酸を含まない（ただしグルタミンは含む）DMEMに1%透析FBSと抗生物質を添加したものであった。同位体標識実験のために、細胞を5cmまたは10cmディッシュに播種し、24-48時間増殖させた後、1mMの非標識またはU-13C標識酪酸ナトリウム（シグマ社）で処理した。細胞単層はPBSで洗浄し、トリプシン処理し、PBSで再度洗浄し、液体窒素で瞬間凍結した。細胞株は認証されなかった。
メソッドの詳細
上皮細胞の分離
上皮細胞ペレットを調製するため、結腸と噴門を30mM EDTAと1.5mM DTTを含むPBS中で4℃、20分間、時々反転させながらインキュベートした。その後、組織を30mM EDTAを含むPBSに移し、37℃で10分間インキュベートし、上皮から間充織が分離するまで1-2分間激しく振盪した。間充織を除去し、上皮細胞を1500 rpm、4℃で5分間ペレット化し、PBSで洗浄した。場合によっては、細胞ペレットをさらにPBS中のディスパーゼ（Corning、0.3U/ml）（50mL PBS当たり100μLディスパーゼ）と共に37℃で10分間インキュベートし、その後DNase（1ml FBS当たり10ul DNase）含有FBSの1/10容量でクエンチし、PBSでの洗浄を続けた。細胞ペレットは液体窒素で瞬間凍結し、使用するまで-80℃で保存した。ChIP-seq解析のために、以下に示すように、細胞を凍結前に架橋した。
ヒストンの抽出とLC-MS/MSによる解析
ヒストンは、酸抽出によって凍結細胞ペレットの核から単離され、以前に記載されたのと同様に無水プロピオン酸で誘導体化された93。簡単に説明すると、細胞ペレットを、15 mM Tris pH 7.5, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 250 mM sucroseに1 mM DTT, 10 mM butyrate sodium, 500 μM AEBSF, 5 nM microcystin, 0.2% NP-40 Alternativeを加えた核分離バッファ（NIB）に再懸濁させた。氷上で10分間溶解させた後、核を500×g、4℃で5分間ペレット化し、洗剤なしでNIBで2回洗浄し、0.4N H2SO4で4℃、2〜4時間回転抽出を行った。不溶性デブリを3400×g、4℃で5分間遠心分離してペレット化し、3容量の上清に1容量のトリクロロ酢酸を加えて、氷上で一晩タンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を上記のようにペレット化し、0.1% HCl in acetone、次にアセトンで洗浄し、風乾した後に100 mM NH4HCO3中に再懸濁させた。誘導体化のために、2-プロパノール中の25%無水プロピオン酸1容量を、5-20μgのタンパク質を含むサンプル2容量に加えた。また、緩衝の目的で炭酸水素アンモニウム塩を添加した。37℃で15分間インキュベートした後、サンプルをスピードバックで乾燥させ、上記と同様に2回目の誘導体化を行った。誘導体化したサンプルを次に100mM NH4HCO3中に再懸濁し、20μgのタンパク質あたり1μgのトリプシンを用いて室温で一晩消化させた。さらに2回の誘導体化の後、消化されたペプチドを質量分析による分析のためにC18ステージチップで脱塩した。
ヒストンペプチドは、ReproSil-Pur 120 C18-AQ (3 μm, Dr. Maisch GmbH) を充填した75 μm i.d. x 15-20 cm溶融シリカカラム (Polymicro Tech) を装着し、質量分析計 (Thermo Elite, Velos, Fusion, QE, or QE-HF) にインライン接続した EasyLC 1000 または Dionex UltiMate 3000 LC システムで分離された。クロマトグラフィー条件は、一般に、溶媒A (水中0.1%ギ酸) 中の溶媒B (80%アセトニトリル中0.1%ギ酸) 5から33%まで45分、その後33から98%まで5分の直線グラジェントを300 nL/分の流速で行いました。質量分析計はデータ非依存型取り込み(DIA)用にプログラムされた。1回の取り込みサイクルは、フルMSスキャン、325 m/zから始まる50 m/z分離幅の8回のDIA MS/MSスキャン、2回目のフルMSスキャン、1125 m/zに達するまでのさらに8回のDIA MS/MSスキャンから構成されます。通常、フルMSスキャンは、Orbitrap質量分析計において、最大注入時間100ms、AGCターゲット2e5で、ポジティブプロファイルモードで60,000の分解能で300～1100m/zにわたって取得されました。CIDまたはHCDフラグメンテーションからのMS/MSデータは、イオントラップ（利用可能な場合）またはOrbitrapで収集されました。これらのスキャンでは、通常、NCEが30、AGCターゲットが1e4、最大注入時間が50msで行われました。同位体組込みを含むヒストン MS データは、EpiProfile94 で解析し、さらに R で処理して、保持時間が一致するピークをフィルタリングしました。
メタボロミクス
凍結組織を凍結乾燥し、80%メタノール中でビーズビート（Precellys homogenizer, Bertin Technologies）を用いて、溶媒500μLあたり5-10 mgの組織を目標濃度となるようにホモジナイズした。量が限られた組織については、最低250μLの溶媒を使用した。10 mg を超える凍結乾燥組織は、ビーズビートで乾燥粉末にし、そのうちの約 10 mg をホモジナイズに使用した。ホモジネートのアリコートは、さらにメタノールで処理した後、遠心分離してタンパク質を沈殿させた。上清を窒素下で乾燥させた後、HPLC移動相に再懸濁し、Thermo Orbitrap ID-X質量分析計に沿ったC18またはHILICカラムでの分離を行った。C18クロマトグラフィーでは、抽出したサンプルをWaters Acquity BEH C18カラム (2.1 × 150 mm, 1.7 μm) に65℃で注入し、Thermo Vanquish UHPLCで99%溶媒A (0.1% ギ酸含有水) から100%溶媒B (0.1% ギ酸含有アセトニトリル) への13分の線形グラジエントを流速 0.6 mL/minで使用しました。質量分析計は60-1000 DaまでESI+/-モードで、分解能120,000で動作させた。HILIC では、抽出したサンプルを Agilent Poroshell HILIC-Z カラム (2.1 × 100 mm, 1.9 μm) に 30°C で注入し、95% 溶媒 B (アセトニトリル) から 70% 溶媒 A (10 mM 酢酸アンモニウム pH 9 および 0.1% メドキ酸含有水) への 10 分間の線形グラジエントを流速 0.4 mL/min で行って高極性代謝物の分離に使用しました。各サンプルには、注入順序を決定するためにランダムに生成された番号が割り当てられました。
QCのために、プールされたサンプルはランを通して定期的に注入されました。データ依存のMS/MSは、AcquireXを使用した場合と使用しない場合の両方で、組織特異的なプールを含むプールされたサンプルの別々の注入で収集されました。これらのMS/MSランでは、AGCを1e5に設定し、分解能を60,000に設定し、最大注入時間を50msに設定した四重極分離で、550～1000m/zのスキャン範囲において、0.6秒ごとにフルMSスキャンがOrbitrapで収集された。フル MS スキャンの間に、Orbitrap で分解能 15,000 の MS/MS スキャンが収集されました。四重極分離は、1.5 m/zのウィンドウで使用された。AGCは2e4に設定され、最大注入時間は22msに設定された。プリカーサーイオンは、20、35、50％の段階的な衝突エネルギーでHCD活性化により断片化された。Dynamic exclusionは2.5秒に設定し、MS/MSの強度閾値は2e4に設定した。
データ処理と同位体組込み解析には、CompoundDiscoverer (CD) を使用した。代謝物量の解析には、CD のピーク面積に補正係数をかけて抽出条件を 20 mg/mL に標準化し、log2 変換して正規化しました。CDで算出した相対交換率（RER）を用いて、標識条件と非標識条件で一貫して高いRERと非標識条件での低いバックグラウンドRERに基づいて13C取り込み機能を特定した（log2［labeled/Unlabeled］> 1; p < 0.01 from unpaired, two-tailed t test; maximum mean RER for unlabeled <1; maximum median RER for labeled > 2）。高分子量黄砂を用いた実験では、log2[labeled/unlabeled] > 1; p < 0.05 (unpaired, two-tailed t test; maximum mean RER for unlabeled <0.5; maximum median RER for labeled >0.5) と設定された。log2 FCまたはp値が未定義の特徴については、組織内の非標識状態の平均RERが<0.1であり、標識状態の平均RERが1以上であることが条件とされた。
ChIP-seqおよびRNA-seq
架橋は、PBS中1%ホルムアルデヒドで室温5分間処理し、125mMグリシンでさらに室温5分間クエンチすることにより行った。架橋されたペレットは、PBSで洗浄後、使用するまで急速冷凍した。核溶解液は、細胞を溶解バッファー1（50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% グリセロール, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100, 1× protease inhibitors）中に再懸濁し、4℃で10分間回転させて準備した。3000rpm、4℃で5分間遠心分離した後、細胞ペレットを溶解バッファー2（10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1× protease inhibitors）に再懸濁し、室温で10分間ローテートさせた。細胞をペレット化し、溶解バッファー3（10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 1 mm EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% N-lauroylsarcosine, 1× protease inhibitors）に再懸濁し、4℃水浴中でCovaris S220フォーカス超音波装置（8.4 W, 200 peak power, 200 cycles/burst, 900 seconds）により、クロマチンシェアリングした。超音波処理後、Triton X-100を最終濃度1%まで添加し、ライセートをマイクロフュージでトップスピードで10分間、4℃で遠心分離することによりクリアランスした。磁性プロテインGビーズをブロッキング溶液（PBS中0.5%BSA）で洗浄し、アセチル化ヒストンH4に対するウサギ抗血清（Millipore 06-866）または通常のウサギ抗血清とブロッキング溶液で4℃、数時間回転しながらインキュベートした。その後、ビーズをブロッキング溶液で洗浄し、上記のように調製したショウジョウバエS2クロマチンのスパイクインを含む核溶解液（P. Pascual-Garciaから寛大に提供された細胞）に添加した。4℃で一晩インキュベートした後、クロマチンを捕捉したビーズを3×1mLのRIPA洗浄バッファ（50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.7% sodium deoxycholate）および1×1mLの最終洗浄バッファ（10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA）で洗浄した。ビーズを200μLの溶出バッファー（50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS）で65℃、30分間溶出させた。その後、上清を65℃で一晩インキュベートし、架橋を逆転させた。1容量のTEで希釈した後、RNaseを0.2 mg/mL添加し、37℃で2時間インキュベートした。その後、Proteinase Kを0.2 mg/mL加え、55°Cで2時間インキュベートした。DNAは、フェノール-クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により精製した。精製したDNAを10 mM Tris pH 8に再懸濁し、NEBNext Ultra II DNA library kit for Illumina (New England Biolabs) を用いて配列決定用に調製した。75サイクルと6サイクルのインデックスリードによるペアエンドシーケンスをIllumina NextSeq500システムで実施した。
RNeasyキット（Qiagen）を用いて、上皮細胞ペレットおよび凍結組織から全RNAを抽出した。上皮細胞ペレットにはQIAshredderカラムを使用した。大腸炎研究の凍結組織については、ビーズビーティング（Precellys homogenizer, Bertin Technologies）を用いて、付属の溶解バッファー中でホモジナイズを行った。mRNA磁気分離モジュールを備えたNEBNext UltraまたはUltra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs）を用いて、1μgの総RNAからシーケンスライブラリーを調製した。
シーケンシングリードをSTAR（v2.5.2）でアライメントした。 2a）95 （ChIP-seqパラメータ： --outFilterMultimapNmax 20 --outFilterMismatchNmax 999 --alignMatesGapMax 1000000; RNA-seqパラメータ。RNA-seq parameters: --outFilterType BySJout --outFilterMultimapNmax 20 --alignSJoverhangMin 8 --alignSJDBoverhangMin 1 --outFilterMismatchNmax 999 --alignIntronMax 1000000) mm10 genome assemblyまたはmm10 genomeとDrosophila dm6 genomをコンカチネーションしたもの (exogenous spike-in とChIPのケース)との間で、1つ以上のalignを確認した後、そのアセンブリに含まれる夾雑物に基づき、夾雑物の有無を確認した。トランススクリプトームデータは、HTSeq97およびDESEQ2を用いて定量的に解析し、パスウェイ解析は、GSEA99またはRのClusterProfilerおよびReactomePAパッケージを用いて行った。簡単に説明すると、入力サンプルにおけるリファレンスクロマチンの存在量の変動を補正したダウンサンプリングファクターを計算し、すべてのサンプルで同数のショウジョウバエのリードが得られるように各サンプルに適用し、最大のファクターが1に等しいようにしました。追加の解析と可視化には、DeepToolsを使用しました。
メタプロテオミクス
糞便内容物の代謝物抽出によるタンパク質沈殿を、プロテアーゼ阻害剤を添加した 8 M 尿素、0.1 M NaCl、50 mM Tris pH 8 で再可溶化した。不溶性残渣は遠心分離によりペレット化した。約20μgの可溶性タンパク質を5mM DTTで30分間室温で還元し、20mMヨードアセトアミドで30分間室温で暗黒下でアルキル化した。4容量の0.1M重炭酸アンモニウムを加えた後、1μgのトリプシンで37℃で一晩消化し、C18ステージチップで脱塩し、質量分析に供した。ヒストン分析に関しては、ペプチドをオンラインEasyLC1000 nano-LC systemを用いた逆相クロマトグラフィーで分離した。グラジエントは、2〜30%溶媒B（80%アセトニトリル、0.1%ギ酸）52分、30〜60%溶媒B24分、60〜90%溶媒B2分を300nL/minの流速で行った。質量分析計 (Thermo QE) は、Data-Dependent Acquisition (DDA) モードで動作させました。ポジティブプロファイルモードでフルスキャンし、分解能70,000、AGCターゲット1e6、最大IT100msで300-1400 m/zの範囲を取得した。上位15個のプリカーサーイオンを選択してNCE 30でHCDフラグメンテーションを行い、セントロイドモードで分解能17,500、AGCターゲット1e5、最大IT50ms、分離幅2.0m/zのMS/MSスキャンを収集した。電荷状態が+2〜+6のイオンのみが考慮された。Dynamic exclusionは40秒に設定した。AGCの最小目標値は1e3に設定した。
メタプロテオミクスデータは、マウスプロテオームと16S配列に基づく最も豊富なOTUのバクテリアのプロテオームを連結して構築したカスタムメタプロテオームを用いて、ProteomeDiscovererで解析された。データベース検索では、トリプシンをプロテアーゼとして設定し、最大2回のミスカッティングを行った。質量公差は、前駆体が10ppm、フラグメントが0.02 Daである。Carbamidomethylation (+57.021 Da to Cys) は固定修飾として、oxidation (+15.995 Da to Met), carbamylation (+43.006 Da to Lys and peptide N-termini), acetylation (+42.011 Da to protein N-termini), methionine loss (-131.040 Da to protein N-termini) and methionine loss with acetylation (-89.030 Da to protein N-termini) は可変修飾として指定されている。Percolatorノードは偽陽性のPSMを制御するために使用された。データはさらにRでMSStatsパッケージを使って解析した104。
16S配列決定
腸管内容物のアリコートをWeill Cornell School of MedicineのMicrobiome Sequencing Coreに提出し、解析した。DNAはPromega Maxwell RSC 48システムを用いて抽出し、Earth Microbiome Project (https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/, https://doi.org/10.17504/protocols.io.nuudeww) のプロトコルに従って、16S rRNA遺伝子のV4およびV5領域を標的とする515Fおよび926Rプライマーで増幅した。105, 106 シークエンス（250 bp paired-end reads）は、イルミナ MiSeq プラットフォームで実施した。デマルチプレックス後、ペアリードはUSEARCHソフトウェア（v 11.0.667）107を用い、オプション -fastq_maxdiffs 5 -fastq_pctid 90 -fastq_minovlen 17 -fastq_minmergelen 300でusearch -fastq_mergepairs コマンドを使用してマージした。usearch filter_phixでPhiXリードを除去しました。リードは、usearch -fastq_filter -fastq_maxee 1.0で品質フィルタリングし、デフォルト設定でusearch -cluster_otusでクラスタリングしました。事前にフィルタリングされたリードをマージし、デフォルト設定で usearch -otutab により OTU にマップした。RDP 16S training set (v16) を参照データベースとして、usearch -sintax -strand both -sintax_cutoff 0.8で分類群予測を行った。複数のグループ間の差の検出には、一元配置分散分析またはKruskal-Wallis検定を使用した。
定量化および統計解析
グループサイズ、中心と広がりの測定、統計的検定、および有意性の閾値は、図の説明で示されている。解析に使用したRスクリプトは、Mendeley Data (Lund, Peder (2022), "Stable Isotope Tracing from the Microbiota to Acetylated Histones and Metabolites", Mendeley Data, V1, https://doi.org/10.17632/sdj5j3ffy7.1) でオンライン公開されています。
データおよびコードの入手方法

ChIP-seqおよびRNA-seqデータは、NCBI GEOに寄託されている。GSE179233に寄託されている。大腸炎研究の質量分析プロテオミクスデータは、PRIDE92パートナーリポジトリ経由でProteomeXchange Consortiumにデータセット識別子 PXD026959 および 10.6019/PXD026959 で寄託されています。(PRIDE: PXD026959) メタボロミクスデータはMassIVE: MSV000087752から入手可能です。すべてのデータセットは発表日現在で公開されています。本論文で報告されたすべてのデータは、依頼により主担当者が共有する予定です。

生データおよび解析スクリプトはオンライン（Mendeley Data: https://doi.org/10.17632/sdj5j3ffy7.1）にて公開されており、論文発表日現在で入手可能です。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要求に応じて主席研究員から入手可能である。
謝辞
クローン病・大腸炎財団（RFA 598467 to P.J.L.）、クローン病・大腸炎財団マイクロバイオームイニシアティブ、PennCHOPマイクロバイオームプログラム、Penn Center for Nutritional Science and Medicine（PenNSAM）、The Rockefeller University（C.D.A.）、The Shapiro-Silverberg Fund for the Advancement of Translational Research at The Rockefeller University（L. A. G. ）から資金提供を受け、寛大な謝意を表するものである。 A.G.）、St. Jude Children's Research Hospital Chromatin Consortium、Center for Molecular Studies in Digestive and Liver Diseases (P30 DK050306) の Host-Microbial Analytic and Repository Core、National Institutes of Health (T32CA009140 to P. J.L.; F32GM to P. J. L.) の各機関からなる。 J.L.; F32GM134560 and K99GM143550 to L.A.G.; P01CA196539, R01AI118891, and R01HD106051 to B.A.G.; R01GM40922 to C.D.A.) を参照した。Johayra Simithy, Sophie Trefely, Kevin Janssen, Simone Sidoli, Greg Donahue, Pau Pascual-Garcia, Nathaniel W. Snyder, and Meenakshi Bewtraに感謝の意を表したい。P.J.L.はWarren Pearの支援と指導に謝意を表する。
著者の貢献
P.J.L.はプロジェクトの構想に参加し、実験を行い、データを分析し、オリジナル原稿を作成した。L.G., M.L., S.A.S., L.C., E.S.F., Y.S., M.L., M.S.K., C.A.S., C.P. は実験を行い、サンプル調製に協力した。C.D.A.、G.D.W.、B.A.G.はプロジェクトの構想および監督に参加した。また、全著者が原稿のレビューと編集に協力した。
利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。
補足資料
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資料S1. 図 S1-S8
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表S1. GFマウスと従来型マウスの大腸上皮細胞における遺伝子発現の解析、図1および図S2関連
この表は、GFマウスとコンベンショナルマウスの大腸上皮細胞に対して行ったRNA-seqの結果をまとめたものである。log2 fold changeはlog2(GF/Conv)として計算しています。

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表S2. LC-MSベースのアンターゲットメタボロミクスによる、コントロールマウスおよびコリティックマウスの組織における低分子の全体量および同位体標識の解析（図3、4、5および図S4A、S5に関連するもの
この表は、コントロールマウスとDSS誘発性大腸炎マウスの糞便内容物、ケカ、結腸、肝臓に対して行ったメタボローム解析の結果を要約したものである。このファイルには6つのタブがあります。最初のタブ（a）は、4つのLC-MSメソッドすべてにわたる特徴量の定性的および定量的情報を報告します。正規化ピーク面積は、一定の抽出濃度20 mg/mLに標準化した後のピーク面積を表しています。2番目のタブ(b)と3番目のタブ(c)は、二元配置分散分析（疾患対組織）およびt検定（組織内のDSS対H2O）を用いて、条件間の正規化ピーク面積を比較した統計情報を報告しています。4番目のタブ(d)は、U-13C-イヌリンと非標識条件における相対交換速度の比較で、ある組織と病態における13C標識分子を同定したものである。p値は、対応のないt検定によるものである。5番目のタブ(e)には、ラベル付きとして分類された288の特徴が含まれています。最後のタブ(f)は、すべての組織におけるこれらの標識された特徴の同位体に関するデータを含んでいる。

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表S3. 図2E、3、図S3F、S4B、S4Cに関連する、16S配列決定によるコントロールマウスと大腸菌マウスの微生物叢組成の解析
この表は、16S配列決定から得られた結果を詳述したものである。最初の2つのタブ（aおよびb）は、13Cイヌリン（a）または非標識イヌリン（b）を投与したコントロールおよびDSSマウスで見つかった最も豊富なOTUをまとめたものである。代表的な16S配列を用いたBLAST検索の結果は、aのタブにのみ記載されている。3番目のタブ（c）は、Fig. 2Eのイヌリンの用量漸増実験から選択したグループにおける最も豊富なOTUをまとめたものである。タブaのOTU番号は、別々の配列決定が行われたため、タブbとcのそれとは異なることに注意されたい。

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表S4. 図3および図S4Dに関連する、コントロールマウスおよび大腸菌マウスの糞便内容物のメタプロテオーム解析
この表は、コントロールマウスとDSS誘発大腸炎マウスの糞便内容物から抽出したタンパク質に対して行った質量分析によるMSstatsの結果を報告するものである。両グループは、非標識またはU-13C-イヌリンのいずれかを経口投与された。Log2 fold change (DSS/H2O) は、"Label "の欄に記載したように、これらの処理について別々に計算された（un, unlabeled inulin; 13C, isotope-labeled inulin）。微生物生物への暫定的な割り当ては、スペクトル検索用のメタプロテオーム配列データベースを作成するために使用した16S配列データに基づいている。

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表S5. 図6および図S7に関連する、コントロールおよびコリティックマウスの盲腸および結腸組織における遺伝子発現の解析
これらの表は、コントロールマウス対DSS誘発大腸炎マウスからの凍結盲腸（表S5）または結腸（表S6）組織に対して行ったRNA-seqからの結果をまとめたものである。両グループとも、非標識またはU-13C-イヌリンのいずれかを経口投与した。同位体標識は遺伝子発現に強い影響を与えないため、ある組織および病状内において、非標識および同位体標識イヌリン条件（n = 3）の複製は、1グループ（n = 6）とみなされるようにした。log2 fold changeはlog2(DSS/H2O)として計算。

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表S6. 図6および図S7に関連する、コントロールおよびコリティックマウスの盲腸および結腸組織における遺伝子発現の解析
これらの表は、コントロールマウス対DSS誘発大腸炎マウスからの凍結盲腸（表S5）または結腸（表S6）組織に対して行ったRNA-seqからの結果を要約したものである。両グループとも、非標識またはU-13C-イヌリンのいずれかを経口投与した。同位体標識は遺伝子発現に強い影響を与えないため、ある組織および病状内において、非標識および同位体標識イヌリン条件（n = 3）の複製は、1グループ（n = 6）とみなされるようにした。log2 fold changeはlog2(DSS/H2O)として計算される。

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掲載されました。2022年12月13日
受理されました。2022年11月17日
改訂版受理 2022年3月9日
受理：2022年3月9日 2021年7月23日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111809

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図
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図表の概要
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図1微生物がいない場合、遺伝子本体のヒストンH4アセチル化が減少する。
図のサムネイルgr2
図2アセチル化されたヒストンには酪酸と食物繊維由来の炭素が含まれている
図2.サムネイルgr3
図3炎症は、腸内細菌叢とその関連分子の組成、活性、コンパートメント化を破壊する
図サムネイルgr4
図4食物繊維は何百もの代謝産物の炭素源となる
図1.図2.図3.図4.図5.図5
図5炎症は食物繊維の宿主脂肪酸代謝への寄与を妨害する
図5食物繊維の宿主脂肪酸代謝への寄与を妨げる炎症
図6炎症は脂肪酸代謝を支える遺伝子のセカール発現を抑制する
図サムネイルgr7
図7食物繊維と微生物叢を腸管上皮細胞の脂肪酸代謝に関連付けるモデルの提案
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