ミクログリアは中枢神経系ミエリンの成長と完全性を制御する

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公開日：2022年12月14日
ミクログリアは中枢神経系ミエリンの成長と完全性を制御する

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05534-y

Niamh B. McNamara, David A. D. Munro, ...Veronique E. Miron 著者紹介を見る
Nature (2022)この記事を引用する

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指標詳細

概要
ミエリンは中枢神経系における神経細胞の軸索の機能に必要であるが、ミエリンの健康を支えるメカニズムは不明である。中枢神経系のマクロファージがミエリンの健康に関与していることは知られているが1、どのマクロファージ集団が関与し、どのような側面に影響を及ぼすかは不明である。我々は、マウスとヒトの成体において、常在ミクログリアがミエリンの健康維持に重要であることを明らかにした。我々は、ミクログリアが発生期のミエリン鞘形成に必要でないことを明らかにした。しかし、その後のミエリンの成長や認知機能の制御、ミエリンの変性防止による完全性の維持には、ミクログリアが必要であることがわかった。我々は、ミクログリアの欠如によるミエリンの健全性の喪失が、脂質代謝の変化を伴うミエリン化オリゴデンドロサイトの状態の出現と関連していることを示す。さらに、このメカニズムはTGFβ1-TGFβR1軸の乱れによって制御されている。今回の研究成果により、ミクログリアは、加齢や神経変性疾患など、ミエリンの成長や完全性が制御されない状態における有望な治療ターゲットとなることが明らかになった2,3。

主な内容
ミエリンは、神経細胞の軸索を保護し、その健全性と電気信号の迅速な伝達を保証することで、中枢神経系（CNS）の機能（例えば、認知機能）を支えています。学習や記憶にはミエリンの形成が関与しており、ミエリンの構造的完全性が必要である。ミエリン層は、軸索の直径に比例した厚さに圧縮されている4。しかし、加齢や神経変性疾患では、ミエリン過剰形成により、こうしたミエリンの特性が破壊される。コンパクト化されていないミエリンの領域（ミエリンが成長する領域）が拡大すると、ミエリンが厚くなり、ほぐれ、突起（アウトフォールディングと呼ばれる）が形成され、変性によるミエリンの完全性の喪失もこの文脈で生じる2,3,5。これらのミエリンの変化は、マウスでは認知機能の低下につながり、高齢の霊長類やヒトでは認知能力の低下が予測される6,7,8,9。しかし、中枢神経系ミエリンの適切な形成、成長、および完全性を調整する基本的なメカニズムは不明である。最近の研究では、この過程にCNSに常在するマクロファージであるミクログリアが関与していることが明らかにされている。ミエリン形成オリゴデンドロサイトの生成と髄鞘形成は、生存を促すコロニー刺激因子1受容体（CSF1R）の機能喪失によるミクログリアの枯渇によって損なわれる1。しかし、この方法は、CNSに常駐する境界関連マクロファージ（血管周囲マクロファージを含む）や血中単球も標的としている。したがって、どのマクロファージ集団がミエリンを制御しているかは不明であり、ミエリンの形成と健康に対するミクログリアの具体的な関与もわかっていない。

ミクログリアはミエリン形成に必要ない
これらの疑問に答えるため、我々は最近開発したCsf1r遺伝子のFmsイントロン制御要素（Fire）スーパーエンハンサーを欠失させたトランスジェニックマウス（FireΔ/Δ；図1a）を利用した。この欠失により、発生時（通常出現時）から成体までミクログリアが存在しないが、他の中枢神経系マクロファージは存在する10,11。これらのマウスには、発生段階の死亡、骨の異常、CNS血管周囲のマクロファージや単球の欠如など、他のミクログリア欠損モデルで起こる多くの交絡的問題がない10。ミクログリアマーカーであるTMEM119を用いて、脳の最大の白質路である脳梁でミクログリアが枯渇していることを確認した（図1b）。FireΔ/Δマウスで保持されていた少数のIBA1+マクロファージは、血管周囲マクロファージマーカーLYVE1が陽性であった（図1c,d）。さらに、これらの細胞の存在は、CD31+血管に隣接するCD206+細胞の観察によって確認された（Extended Data Fig.1a）。血管周囲のマクロファージ密度は、CSF1Rの発現が低下しているにもかかわらず、この時点（図1e）でも高齢（拡張データ図1b、c）でもFireΔ/Δマウスでは有意に変化しなかった（拡張データ図1d-f）。FireΔ/ΔマウスとFire+/+同腹子の脳梁では、同様のアストロサイト数（GFAP+SOX9+細胞；拡張データ図1g,h）が観察された。注目すべきは、髄鞘形成が進行する年齢（生後25日目（P25）〜P30）において、FireΔ/Δマウスは成熟オリゴデンドロサイト（OLIG2+CC1+）を生成し（図1f、g）、そのオリゴデンドロサイト系（OLIG2+）はFire+/+ 同胞と同様の割合を占めていることである（図1h）。FireΔ/Δマウスでは、ミエリンタンパク質であるMAG、MBP、CNPase、MOG、PLPが脳梁（図1i、拡張データ図2a〜c）および小脳（拡張データ図2d、e）で発現していることから、ミエリンが形成されていることが確認された。超微細構造解析の結果、FireΔ/Δマウスでは髄鞘化が進行しており（図1i）、軸索径に関わらずFire+/+マウス（図1j）と比較して髄鞘化した軸索数に有意差がないことが確認された（図1k）。この結果は、ミクログリアがオリゴデンドロサイトの成熟と発達的なミエリン鞘形成に必要でないことを示している。この結果は、CNSのマクロファージ集団がすべて枯渇した後、これらの機能がミクログリアに起因するとされたこれまでの知見とは対照的である。

図1：ミクログリアはオリゴデンドロサイトの成熟と髄鞘形成に必要ない。
図1
a, FireΔ/Δマウスは、Csf1rのイントロン2に位置するFireスーパーエンハンサーをCRISPR9-Cas9で欠失させて作製した。 b, 1ヶ月齢のFire+/+およびFireΔ/Δマウスからの脳梁試料中のミクログリア（TMEM119+；緑）の画像、ヘキスト（青）で対比染色した。c, Fire+/+およびFireΔ/ΔマウスのCNSマクロファージ（IBA1+; マゼンタ）および血管周囲（PV）マクロファージ（LYVE1+; 白）の画像。d, Fire+/+およびFireΔ/ΔマウスにおけるIBA1+LYVE1+ PVマクロファージのcからの拡大画像。 e, Fire+/+およびFireΔ/Δマウスにおける平均LYVE1+IBA1+細胞/mm2 ± s.e.m. n = 7マウス/グループ。f, Fire+/+およびFireΔ/ΔマウスにおけるOLIG2（緑）およびCC1（白）の両方を発現している成熟オリゴデンドロサイトの画像。g, Fire+/+およびFireΔ/ΔマウスにおけるOLIG2+CC1+細胞/mm2±s.e.m.の平均値。h、オリゴデンドロサイト系（OLIG2+）の細胞の平均割合、成熟（CC1+；黒）または未熟（CC1-；灰）（±s.e.m.）。CC1+、P = 0.9472; CC1-、P = 0.9472; Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析（ANOVA）。 i, Fire+/+およびFireΔ/Δマウスの脳梁をミエリンタンパク質MAG（緑）およびMBP（マゼンタ）で染色し（左および中央）、電子顕微鏡で撮影（右）した画像。j, Fire+/+およびFireΔ/Δマウスの脳梁における1mm2あたりの有髄軸索の平均数±s.e.m. n = 3 Fire+/+マウスおよび4 FireΔ/Δマウス. k, Fire+/+およびFireΔ/Δマウスの脳梁における有髄軸索の平均数/軸索径。P = 0.9139, Sidakの多重比較検定による二元配置のANOVA。スケールバー、25μm (b,d,i (左と中)), 75μm (c,f) and 1μm (i (右))。

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ミクログリアがミエリン化亢進を抑制
しかし、FireΔ/Δマウスでは、ミエリン過形成を示すミエリン構造の異常が見られた。P25-P30において、FireΔ/Δマウスでは、ミエリンが折れ曲がったり、ほどけたりすることが増加し（図2a-c）、これは鞘の44%で記録されたが、Fire+/+対照では14%に過ぎなかった。FireΔ/Δマウスでは、直径の小さい軸索上の未圧縮ミエリン領域（内舌）の拡大が見られた（図2d-f）。内舌の拡大により従来のg比解析ができなくなったため、ミエリンの厚さを直接測定したところ、FireΔ/Δマウスでは、大径軸索で優先的にミエリンの厚さが増加した（図2g,h）。軸索径に依存した観察結果は、大径軸索のミエリン化が小径軸索よりも先に起こり、まず舌内側の成長が起こり、その後圧縮されてミエリン鞘が厚くなることを反映しているのかもしれない。我々は、FireΔ/Δマウスにおいて、これらのミエリンの変化が軸索の健全性に及ぼす影響を評価した。生後1カ月ではリン酸化ニューロフィラメントの発現に影響はなかったが、それ以降の年齢では、軸索輸送障害を示す軸索スフェロイドが有髄軸索の0.1%未満で時折観察された（拡張データ図2f-h）。FireΔ/Δマウスでは、3-4ヶ月齢でもミエリンの折れ曲がりやほぐれが持続し（図2i-k）、Fire+/+マウス（図2l-o）や若いFireΔ/Δマウスと比較して、すべての軸索径で内舌の肥大とミエリン厚の増加が認められた（Extended Data図3）。したがって、ミエリン過増殖はミクログリア非存在下で起こり、ミクログリアがミエリン増殖の制御に必要であることが示された。

図2: ミエリンの成長を制御するミクログリア。
図2
Fire+/+およびFireΔ/Δマウスの生後1ヶ月（a-h）および3-4ヶ月（i-o）における評価。 a, FireΔ/Δマウスのミエリン異常（矢頭）の画像。 b, mm2あたりの正常髄鞘軸索数の平均± s.e.m. n = 3 Fire+/+マウスおよび4 FireΔ/Δマウス。**c, 外巻きのある軸索と外巻きのない軸索の平均割合/mm2 ± s.e.m. n = 3 Fire+/+ マウスと 4 FireΔ/Δマウス. d, 内側舌の画像（オレンジ色） e, 内側舌の厚さ（μm）対軸索直径 n = 200軸索/マウス、Fire+/+マウス3匹、FireΔ/Δマウス4匹 f, 軸索直径あたりの平均内側舌厚 n = 3 Fire+/+マウス、FireΔ/Δマウス4匹 <0.3 µm, *P = 0.0417, Sidakの多重比較検定による二元配置分散分析。 g, ミエリンの厚さの画像（アスタリスクは同サイズの軸索を示す）。***i, FireΔ/Δマウスのミエリン異常（矢頭）の画像。 j, 1mm2あたりの平均正常有髄軸索数 ± s.e.m. n = 3 mouse per group. *k, 外延と外延のある軸索とない軸索の平均割合/mm2 ± s.e.m. n = 3 mice/group.内。l, 内側舌の画像（オレンジ色） m, 内側舌の厚みと軸索の直径 n = 100軸索/マウス、各グループ3匹。***n, ミエリンの厚さの画像（アスタリスクは同サイズの軸索を示す） o, ミエリンの厚さ対軸索の直径 n = 100 axons per mouse, 3 mice per group. ***P < 0.0001、傾きの単純な線形回帰。スケールバー、1μm (a,d,g,i,l,n).

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ミエリン構造におけるこれらの変化は、他のモデルにおいて認知障害を引き起こすのに十分であることを考慮して12,13、我々は、バーンズ迷路空間学習および記憶課題（拡張データ図4a）を用いてFireΔ/Δマウスの認知を評価した。FireΔ/ΔマウスとFire+/+マウスの両方が、逃避室がある標的の穴を見つける速度が徐々に速くなり（一次潜時）、これらのマウスにおける空間学習が示された（Extended Data 図4b、c）。逃避室を取り除いた後、1時間後と3日後のプローブ検査では、標的の四分円内にいた時間の割合と、標的の穴の周辺を鼻でつついた回数から、記憶形成の障害はないことが示された（Extended Data Fig.） 次に、ミエリンの構造的完全性に大きく依存する、古い状況から新しい状況へと思考を適応させる学習である認知的柔軟性をテストした6,14,15。この実験では、元の目標から180°離れた場所に設置された脱出孔の位置を学習する（Extended Data Fig.4g-k）。FireΔ/Δマウスでは、新しい目標を見つけるまでの時間は損なわれていなかったが、目標に到達するまでに著しく多くの誤りを犯し（Extended Data Fig.4h、i）、これらのマウスは認知の柔軟性が低いことが示唆された。FireΔ/Δマウスには、交絡する不安や運動障害はなかった（Extended Data Fig.4l-r）。したがって、ミクログリアの欠如は、認知的柔軟性の障害と関連している。

最近の研究では、学習と記憶の符号化には新しいオリゴデンドロンの形成が必要であり、この情報の長期的な定着には髄鞘の増加が必要であることが指摘されている16,17。そこで我々は、これらのプロセスがミクログリア非存在下で起こるかどうかを評価した。増殖中の前駆細胞からの新しいオリゴデンドロサイトの生成は、認知テストの段階で提供された5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU）の取り込みによって同定された。FireΔ/ΔマウスとFire+/+マウスでは、新たに生成されたオリゴデンドロサイトの数は同程度であり（拡張データ図5a-d）、これはFireΔ/Δマウスで観察された学習と記憶の符号化がほとんど損なわれていないことと一致する。しかし、Fire+/+マウスでは認知課題終了6週間後に脳梁の有髄軸索の数が有意に増加していたのに対し、未訓練のFireΔ/Δマウスと訓練したFireΔ/Δマウスではこの差は認められなかった（Extended Data Fig.） これらの結果は、ミクログリアが存在しないことで、新しい空間情報の統合に伴って通常起こる髄鞘の増加が妨げられることを示唆している。注目すべきは、あるマウスの有髄軸索の数とその反転認知能力との間に関連が見られなかったことである（Extended Data Fig.） この結果は、認知機能の柔軟性には、閾値のある髄鞘軸索の数が必要であるか、あるいは髄鞘の構造変化がこの機能により関係している可能性を示唆している。

ミクログリアは脱髄を防ぐ
生後6ヶ月のFireΔ/Δマウスのミエリンを評価したところ、実質的に脱髄している領域（図3a）とパッチ状に脱髄している領域があった。その結果、Fire+/+マウスと比較して、ミエリン化した軸索の数と割合が著しく減少していた（図3b-d）。また、脱髄が斑状であっても、脳梁全体のミエリンタンパクが広範囲に失われることはなかった（拡張データ図6a-c）。軸索のスフェロイドはほとんど観察されなかった（軸索の0.1％未満）。6ヶ月齢のFireΔ/Δマウスの軸索は、Fire+/+マウス（図3e、f、拡張データ図6d）および3-4ヶ月齢のFireΔ/Δマウス（拡張データ図3）と比較して、内舌尖が小さく、ミエリンが細くなっていた。脱髄は、この月齢以下ではオリゴデンドロサイトの消失とは関連していなかった（Extended Data Fig.6e-h）。FireΔ/Δマウスでは4.5ヶ月齢で脱髄が始まり（拡張データ図6i-l）、未脱髄軸索のサイズは中～大口径（平均0.73μm ± 0.1s.e.m. ）であった（拡張データ図6l）。この結果は、中〜大口径の軸索が生後3〜4ヶ月の脱髄の直前に多髄化を示したことから、これらの軸索が先に脱髄を受けたことを示している（拡張図6k）。したがって、多髄化が脱髄に先行する可能性がある。これらの知見は、年齢が上がるにつれて、ミクログリアの欠如が中枢神経系の脱髄を誘導するのに十分であることを示している。

図3: ミクログリアの欠如が脱髄を引き起こす。
図3
a, 6ヶ月齢のFireΔ/Δマウスの脳梁における実質的な脱髄を、年齢を合わせたFire+/+マウスと比較した画像。b, FireΔ/Δマウスの斑状脱髄の画像（年齢を合わせたFire+/+マウスと比較）。アスタリスクは同程度の大きさの軸索を示す。スケールバー、1 µm. c, 平均有髄軸索数/mm2 ± s.e.m. n = 3 Fire+/+マウスと4 FireΔ/Δマウス。*d, 有髄軸索（黒）と無髄軸索（灰）の平均割合/mm2 ± s.e.m. n = 3匹のFire+/+マウスと4匹のFireΔ/Δマウス. 有髄、**P = 0.0051; 無髄、**P = 0.0051; Tukeyの多重比較検定付きone-way ANOVA。 e, 舌内部の厚さ vs 軸索直径。*f, ミエリンの厚さ 対 軸索径。**P = 0.0062、傾きの単純な線形回帰。

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ミクログリアは既存のミエリンを維持する
次に、ミエリンの成長と完全性におけるこれらの変化は、ミエリン形成の崩壊を反映しているのか、それともミエリンの維持を反映しているのかについて検討した。そこで、発生期のミエリン形成が完了したマウス（生後2ヶ月以降）の成体Fire+/+マウスの食事にCSF1R阻害剤PLX5622を1ヶ月間投与し、マイクログリアを枯渇させた。その結果、生後3カ月でIBA1+細胞が50%以上減少した（Extended Data Fig.7a-c）。対照食を与えたマウスと比較すると、2〜3ヶ月齢のミクログリア減少により、内舌が拡大し、ミエリンが厚くなった（拡張データ図7d-g）。オリゴデンドロサイトの数は変化しなかった（拡張データ図7h,i）。したがって、成体マウスにおけるミクログリアの枯渇は、FireΔ/Δマウスで同等の年齢で観察された髄鞘の過形成とミエリン変性を反映しており、ミクログリアはすでに形成されたミエリンの維持に必要であることが示された。

ヒトのミクログリア欠損がミエリンの健康状態に影響を与える
マウスでミクログリアがミエリンの健康維持に必要であることを証明した後、我々はこれらの知見がヒトにどのような影響を与えるかを調べた。私たちは、軸索スフェロイドと色素沈着グリアを伴うまれな白質脳症である成人発症型白質脳症（ALSP）の患者から得たサンプルを分析しました（Extended Data Table 1）。ALSPでは、ヘテロ接合性のCSF1R変異が、特に前頭葉白質におけるIBA1+実質細胞の減少と関連して、認知機能障害を引き起こすが、灰白質におけるそれらは比較的保存されている18。年齢をマッチさせた非神経疾患で死亡した人と比較して、ALSP患者の前頭葉白質ではIBA1+ミクログリアとマクロファージの有意な減少が見られた（図4a,b）。さらに、血管周囲のマクロファージ（IBA1+LYVE1+）の割合が相対的に増加していた（拡張データ図8a-d）。ALSP白質の超微細構造解析では、ミエリンの脱落やほころび（図4c）、ミエリンの厚さ（図4c,d）、内舌の拡大（図4c,eおよび拡張データ図8e-g）などが確認された。脱髄も観察され、年齢とともに悪化していた（Fig.4f）。軸索の直径は、ALSPでは非罹患者に比べて大きいことがわかった（図4d,e）。この結果は、軸索の膨張がこの疾患の典型的な病理学的特徴であることと一致するが、ミエリンはこれらの軸索直径から予想されるよりもまだ厚い。ALSPにおける極厚のミエリンは、ミエリンの解離と関連しており（図4c）、これはミエリン過剰形成から脱髄への移行の初期段階を示しているのかもしれない。これらの知見は、ヒトの白質ミクログリアの減少が、髄鞘形成の亢進と最終的な脱髄に関連していることを示している。

図4：ヒトの白質におけるミクログリアの減少は、髄鞘形成の亢進と脱髄に関連している。
図4
a, ALSP患者と非罹患者の前頭葉白質におけるIBA1+マクロファージ（マゼンタ）の画像（ヘキスト（シアン）で対比染色）。*c、非罹患者とALSP患者の前頭部白質画像（i）。アスタリスクは同程度の大きさの軸索を、矢印はミエリン異常を示す。パネル(ii)と(iii)はALSPの拡大した内舌（オレンジ色）を示している。パネル(iv)はALSPにおけるミエリンの折りたたみとほぐしを示す（矢印）。**e, 舌内膜厚(μm)対軸索径。***f, ALSP患者（22歳および40歳）の前頭部白質における脱髄の程度を示す画像。スケールバーは0.5μm（c（ii）-（iv））、1μm（c（i））、10μm（f）、40μm（f）。10 µm（f）または50 µm（a）。

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ミクログリアはオリゴデンドロサイトの状態を抑制する
次に、ミクログリア非存在下でのミエリンの健全性喪失を支える細胞および分子メカニズムを明らかにすることを目指した。そこで、生後1カ月のFireΔ/ΔマウスとFire+/+マウスの脳サンプルを用いて、単一細胞RNA配列解析を行った（Extended Data Fig.） ミエリン遺伝子（Plp, Mog, Mag, Mbp）の発現と、他の細胞種のマーカーの発現がないことから、成熟したオリゴデンドロサイトが同定された（Extended Data Fig.） オリゴデンドロサイトは4つの状態（オリゴ1〜オリゴ4）に分類された（図5aおよび拡張データ図9k,l）。特に、クラスタ1のオリゴデンドロサイト（Oligo1）はFireΔ/Δマウスにほぼ存在し（図5b,c）、Serpina3nやC4bなどの遺伝子（補足表1、図5d）の高発現により区別できることが確認された（図5d,e）。SERPINA3N+OLIG2+細胞の存在はFireΔ/Δマウス白質にほぼ限定して確認されたが、これらの細胞はいずれの遺伝子型でも灰白質では検出されなかった（図5f,g）。オリゴ1クラスターで差次的に発現した遺伝子を解析したところ、上位のカノニカルパスウェイは脂質の合成と代謝に関連していることが明らかになった。具体的には、ingenuityパスウェイ解析により、以下の有意なパスウェイが強調された：superpathway of cholesterol biosynthesis (P = 8 × 10-12) およびcholesterol biosynthesis I-III (P = 1.23 × 10-7)。DAVIDバイオインフォマティクスリソースを用いた解析では、以下のパスウェイが強調された：脂質生合成（P = 3.8 × 10-8）、脂質代謝（P = 5.1-7.0 × 10-6）、コレステロール代謝（P = 9.2 × 10-4）。特に、コレステロールはミエリンに濃縮されており、ミエリンの成長に必要である19。FireΔ/Δマウス白質のリピドミクス解析では、コレステロールエステルの増加とトリグリセリドの減少が見られ（図5h）、それぞれコレステロールの過剰と脂質の輸出障害を示唆するものであった。この結果は、FireΔ/Δマウスで観察されたミエリン膜形成の余剰と一致する。さらに、ALSP20では、コレステロール輸送に関連する遺伝子の制御異常が報告されている。

図5：FireΔ/Δマウスではオリゴデンドロサイトの状態が濃縮されている。
図5
a, Fire+/+とFireΔ/ΔマウスのオリゴデンドロサイトクラスターのT-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE)プロット。オリゴ1（黄）、オリゴ2（紫）、オリゴ3（オレンジ）、オリゴ4（赤）。 b, Fire+/+（緑）とFireΔ/Δ（マゼンタ）マウス間のオリゴデンドロサイトクラスターの分布。c, Fire+/+およびFireΔ/Δマウスにおけるオリゴデンドロサイトクラスターの割合。各遺伝子の正規化発現レベルはヒートマップで示されている。1:赤、-1:青。e, C4bとSERPINA3Nの発現のt-SNE投影。 f, 脳梁でSERPINA3N（マゼンタ）を発現し、DAPI（青）で対比染色したOLIG2+細胞（白）の画像。g、白質（脳梁（CC）およびフィンブリア）および灰白質（間脳および海馬（Hpp））においてSERPINA3Nを発現するOLIG2+細胞の平均割合±s.e.m. n = 5 Fire+/+マウスおよび3 FireΔ/Δマウス。CCとフィンブリア、****P < 0.0001; 間脳とHpp、それぞれP = 0.9989とP > 0.9999; Sidakの多重比較検定付き二元配置ANOVA. h, FireΔ/ΔマウスとFire+/+マウスのlog2(fold change (FC))で表したリピドミクス解析。上昇した脂質種を赤で、低下した脂質種を青で示し、脂肪酸の脱飽和（二重結合）と総クラス値（0-6）に基づいて並べた。ボックスは注目する脂質種を示す。SM、スフィンゴミエリン；CE、コレステロールエステル；CER、セラミド；DCER、ジヒドロセラミド；HexCER、ヘキソシルセラミド；TG、トライアグリセリド；DG、ジアシルグリセリド；PC、ホスファチジルコリン；LPC、リゾホスファチジルコリン；PC-O、1-アルキル、2-アシルホスファチジルコリン；PC-P、1-アルキル,2-アシルホスファチジルコリン。PC-P, 1-alkenyl,2-acylphosphatidylcholines; PE, phosphatidylethanolamine; LPE, lysophosphatidylethanolamine; PE-O, 1-alkyl,2-acylphosphatidylethanolamines; PE-P, 1-alkenyl,2-acylphosphatidylethanolamines; PG, phosphatidylglycerol; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine.の各群を選択。n = 3 マウス/群。0の値に対するlog2（FC）の1サンプルt-検定：SM-0、**P = 0.0058; SM-3, *P = 0.0202; SM-0-6, *P = 0.0347; CE-2, *P = 0.0384; CE-6, *P = 0.0474; CE-0-6, *P = 0.076. 0276; cer-1, *P = 0.0171; TG-1, *P = 0.0301; TG-2, *P = 0.0116; TG-3, *P = 0.0432; TG-0-6, *P = 0.0412; LPC-0, *P = 0.0415; PG-6, **P = 0.0055; PS-2, *P = 0.0459...（以上、参考値

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TGFβ1シグナルはミエリンの健全性を制御する
ミクログリアの不在がこれらの知見にどのように寄与しているかを明らかにするために、オリゴ1クラスターに含まれる遺伝子の予測される上流制御因子を評価した。TGFβ1は、マウスとヒトの脳の両方でミクログリアによって優勢に発現されており（https://www.brainrnaseq.org）21,22、脂質代謝に影響を与えることが知られているため、有力な候補として同定された23。従って、FireΔ/Δマウス白質では、TGFβ1レベルが有意にダウンレギュレートされていた（図6a）。次に、オリゴデンドロサイトのTGFβ1に対する応答能力を評価した。Fire+/+マウスではTGFβR1+OLIG2+細胞が豊富に存在したが、FireΔ/Δマウスではその数と割合が有意に減少していた（図6b-d）。これらの知見から、オリゴデンドロサイトにおけるTGFβR1シグナルの除去は、ミエリン病変を引き起こすのに十分であるか否かを問うことになった。CNSにおけるTgfb1ノックアウトは、ミクログリア数の減少、ミクログリアの恒常性の喪失、単球の浸潤という交絡をもたらすので24、成熟オリゴデンドロサイトにおけるTgfbr1の条件付きノックアウト（PlpcreERT；Tgfbr1fl／fl）を利用した。P14からP18までのタモキシフェン投与後（図6e）、オリゴデンドロサイト系細胞によるTGFβR1発現は、1ヶ月齢のPlpcreERT;Tgfbr1fl/flマウスでコントロールと比較して著しく減少した（拡張データ図10a,b）。有髄軸索の数には有意な影響は見られなかった（Extended Data Fig.10c）。しかし、P28になると、コンディショナルノックアウトマウスは、タモキシフェン処理したフロックスドマウスや野生型コントロールと比較して、小径軸索の内舌が拡大し（図6f-hおよび拡張データ図10d）、大径軸索のミエリンが厚くなった（図6f,g,iおよび拡張データ図10e）。この結果は、FireΔ/Δマウスにおける生後1ヶ月の観察結果を模倣している。

図6：TGFβR1シグナルは、ミエリンの完全性を制御する。
図6
a, 脳梁におけるTGFβ1レベル（pg µg-1 ± s.e.m.）は、それぞれの総タンパク質に対して正規化した。*b、1ヶ月齢のマウスにおけるTGFβR1（白）を発現するOLIG2+細胞（緑）の画像（矢頭） c、平均OLIG2+TGFβR1+細胞 ± s.e.m. n = 4 mouse per group. *d, TGFβR1+（黒）またはTGFβR1-（灰色）のOLIG2+細胞の平均割合（± s.e.m.）、それぞれ、*P = 0.0120 および *P = 0.0120, n = 3 mouse per group. e, P14からP18までタモキシフェンを投与し、1ヶ月後に評価。 f, PlpcreERT;Tgfbr1fl/fl マウスの画像とコントロールの比較。 g, PlpcreERT;Tgfbr1fl/fl マウスの画像。内舌の拡大（オレンジ）および髄鞘形成促進（アスタリスク）をコントロールと比較して示す。***P < 0.0001、切片の単純線形回帰。PlpcreERT;Tgfbr1fl/fl 対野生型および対 Tgfbr1fl/fl, ***P < 0.0001; 野生型 対 Tgfbr1fl/fl, P = 0.3228; Dunnの多重比較検定によるクラスカル・ウォリス. i, ミエリン厚 対 軸索径. ***P < 0.0001、傾きの単純な線形回帰。PlpcreERT;Tgfbr1fl/fl 対野生型、***P = 0.0008 および対 Tgfbr1fl/fl 、***P = 0.0001; 野生型対 Tgfbr1fl/fl 、P > 0.9999 Dunnの多重比較検定によるクラスカル・ウォリス。 j、FireΔ/Δマウスに、生後2〜3ヶ月から塩酸 SRI-011381 (SRI; 30 mg kg-1) またはベークルを投与した。k、ビヒクルまたはSRI-011381で処理したFireΔ／Δマウスの画像。l、内舌のサイズ（オレンジ）およびミエリンの厚さ（アスタリスク）を示すビヒクルまたはSRI-011381で処理したFireΔ／Δマウスの画像。m、内舌の厚さと軸索直径。n＝マウスあたり100軸索、n＝ビヒクル処理3、SRI処理4。***p＜0.0001、傾きの単純な線形回帰。ビヒクル対SRI、対Fire+/+、***P < 0.0001; SRI対Fire+/+、P = 0.0519, Kruskal-Wallis with Dunn's multiple comparisons test。***P < 0.0001、傾きの単純な線形回帰。ビヒクル対SRIおよび対Fire+/+, ***P < 0.0001; SRI対Fire+/+, P > 0.9999, Dunnの多重比較検定付きKruskal-Wallis. スケールバー：1 µm (f, g, k, l) または 25 µm (b).

ソースデータ

フルサイズ画像
次に、FireΔ/ΔマウスのTGFβR1シグナルを刺激することで、ミエリンの健康状態が回復するかどうかを検討した。FireΔ/ΔマウスではオリゴデンドロサイトによるTGFβR1の発現が十分でないため、下流のTGFβシグナルの低分子活性化物質であるSRI-011381塩酸塩を用いた。このアプローチは、SMAD2-SMAD3経路を活性化することにより、受容体を刺激する必要性を回避するものである25。生後2ヶ月からFireΔ/Δマウスに塩酸SRI-011381を投与し、生後3ヶ月までに観察される顕著なミエリン病理への影響の可能性を観察した（図6j）。SRI-011381は、ミエリン軸索数には影響を及ぼさなかったが（拡張データ図10f）、車両投与したFireΔ／Δマウスと比較して、舌内膜厚（図6k-mおよび拡張データ図10g）およびミエリン厚（図6k、l、nおよび拡張データ図10h）は有意に減少した。SRI-011381塩酸塩投与後、これらのパラメータは年齢をマッチさせたFire+/+マウスのパラメータと重なった（図6m,n）。この結果は、FireΔ/Δマウスでは、TGFβR1シグナルの破綻がミエリン形成不全の主要なメカニズムであることを示唆している。これらの結果から、TGFβ1-TGFβR1軸がミクログリア-オリゴデンドロサイト間のコミュニケーションに重要であり、ミエリンの健康状態を制御していることが明らかとなった。

考察
我々は、CNSミエリンの健全な維持にミクログリアが必要であることを明らかにした。CNSのマクロファージが存在し、ミクログリアが存在しない新しいトランスジェニックモデルを使用した結果、ミクログリアは発生期のオリゴデンドロサイトの成熟やミエリンの鞘化には必要でないことが明らかになった。むしろ、ミクログリアはミエリンの構造的完全性を維持する。また、成人期には、ミエリン鞘の脱髄を防ぎ、ミエリン過形成を抑制するために、ミクログリアが重要な役割を果たすことも明らかになった。この結果は、胚発生のミエリン形成過程におけるミエリン鞘の数の制御26や、視神経損傷後の再生軸索のミエリン化抑制27にミクログリアが関与していることを示す最近の研究結果を補うものである。このことは、血管周囲や末梢のマクロファージなど他のマクロファージ集団が発生期の髄鞘形成に影響を与えるのか、あるいはアストロサイトなど他のグリア細胞タイプがミクログリア不在の場合に代償的役割を果たすのか、という問題を提起している。私たちの研究から、マウスやヒトの白質ミクログリアが50〜60%減少するだけでも、ミエリンの完全性が失われることから、ミエリンの健全性を維持するためには、閾値以上のミクログリアが必要であることが示された。これらの知見を総合すると、がんや神経疾患において、CSF1R阻害剤を用いてミクログリアを減少させるという現在の試みは慎重であるべきであり、ミエリンの健康に対する標的外作用の可能性を監視することが必要であることがわかる。

我々は、ミクログリア非存在下でのミエリンの構造変化と、認知柔軟性の低下、および通常長期記憶の定着を支えるde novo髄鞘形成の障害とを関連付けた17,28。これは、ミエリンの構造と認知機能を破壊するには、（化学療法に反応する）ミクログリアの異常が十分であることを明らかにした以前の研究に基づいており、これらの病態の予防に健康なミクログリアが必要であることを明らかにしたものである。また、ミエリン構造と神経細胞の活動が密接に関係していることから29、今回の発見は、認知回路を強化するための適応的な髄鞘形成に影響を及ぼすミクログリアの役割の可能性をも示している。しかし、ミクログリアの不在が神経細胞の活動やシナプスの健全性に及ぼす影響については、さらなる調査が必要である。さらに、加齢に伴う認知機能の低下には、高髄鞘化3,12、脱髄、新生髄鞘の障害5,28、ミクログリア機能不全21,30,31が顕著であるが、これらの細胞ネットワークの解明にも重要である。また、アルツハイマー病モデルマウスでは、主にミクログリア（およびアストロサイト）に関連する遺伝子モジュールが、オリゴデンドロサイトや髄鞘に関連する遺伝子モジュールとは逆の変化を示すことから、このことは認知症に関連する神経変性疾患にも関連している可能性がある32。この研究では、オリゴデンドロサイトに関連するモジュールは、βアミロイドが最も多く蓄積する微小環境において、最初に発現が上昇し、その後、低下することも確認されている。これは、ミエリン形成の初期段階と、それに続く脱髄の段階を表しているのかどうかは、まだ解明されていない。

ミエリンの病態が加齢とともに悪化していることから、加齢とともにミエリンの健全性を保つための健康なミクログリアへの依存度が高まっていることが示唆される。したがって、ミクログリアの機能不全は、加齢や神経変性疾患におけるミエリン損傷を引き起こす可能性がある。これまでの研究では、末梢免疫系や一次オリゴデンドロサイトの異常が、脱髄の誘発に関与しているとされてきた。今回、我々は、ミクログリアの寄与も考慮する必要があることを提案する。我々のデータは、ミエリン過剰形成が脱髄に先行する可能性を示唆しており、この一連の現象が加齢や神経変性疾患におけるミエリン損傷を支えているのかどうかという疑問を投げかけている。注目すべきは、マイクログリア欠損マウスと他の神経損傷モデルとの間で、制御不能な細胞プロファイルと分子メカニズムに類似性があることである。これらの結果は、ミエリン病態の重要な制御因子としてミクログリアが関与していることを示唆している。例えば、脱髄、加齢、アルツハイマー病のマウスモデルで最近報告されたのと同様に、マイクログリアは通常、制御不能なオリゴデンドロサイト状態（Serpina3nとC4bを発現）の出現を抑制することがわかった33,34, 35,36,37. このことは、病的な状況において、ミクログリアの制御異常がこれらのオリゴデンドロサイトの出現を許している可能性を示唆している。我々は、FireΔ/Δマウスモデルにおけるこの（および他の）オリゴデンドロサイト集団のデータマイニングを以下のウェブサイトで公開している: https://annawilliams.shinyapps.io/shinyApp_oligos_VM/. これらのオリゴデンドロサイトの出現がもたらす機能的な影響や、その機能に関与する分子メカニズムはこれまで不明であった。このオリゴデンドロサイトと脂質プロファイルの変化（例えば、コレステロールエステルの増加）との関連は、FireΔ/Δマウスの髄鞘形成亢進と一致する。このことは、ハンチントン病や多発性硬化症など、コレステロールエステルが増加するヒトの神経疾患における潜在的な病態メカニズムの解明につながる可能性がある38,39。成熟したミエリン化オリゴデンドロサイトの脂質プロファイルを制御するという発見は、最近発見されたミエリン再生中のオリゴデンドロサイト前駆細胞の成熟を、コレステロール経路中間体の供給を通して促進するというマイクログリアの役割を補うものである40。これらのオリゴデンドロサイトのパスウェイ解析により、TGFβ-TGFβR1軸の制御異常が確認され、これがミエリン病変のメディエーターであることが示された。ALSPの脳サンプルのトランスクリプトーム解析では、特に白質におけるTGFβ経路の調節異常が指摘されており20、最も影響の少ない白質領域ではTGFB1のアップレギュレーションが見られる41。TGFβ受容体の下流のシグナル伝達もまた、加齢や神経変性疾患において減少している42,43。

我々は以前、TGFβスーパーファミリーの一員であるアクチビンAを発現するミクログリアのサブセットが、再髄鞘化効率を制御していることを発見した44,45。発生、恒常性、脱髄、再ミエリン化、加齢に伴うミクログリアの転写産物の不均一性30, 44, 46, 47, 48, 49, 50と合わせて考えると、ミエリンの成長と完全性を制御するのに、特定のミクログリア状態が必要かどうかを問うことができるようになってきたと言える。最近、白質に関連するミクログリアの状態が明らかにされ、発生における死にかけた細胞の貪食50や老化におけるミエリンの残骸の貪食30に関与することがわかった。また、機能的なミクログリア状態の変化が再ミエリン化を支援する能力を支えていることがわかった44,46。加齢や疾患による不均一性の変化が、ミエリン病態の進行に寄与する支持的なミクログリア状態の喪失と関連しているかどうかは、調査する必要がある。本研究は、成人期におけるミエリンの健全性と完全性の維持におけるミクログリアの役割を明らかにし、加齢と疾患におけるミエリンの破綻という状況において、ミクログリアが重要な治療標的であることを明らかにした。

研究方法
動物
すべての実験は、英国内務省によって承認され、動物（科学的手順）法に基づき発行されたプロジェクトライセンスの下で実施された。この研究では、Csf1rFireΔ／Δマウス、Csf1rFireΔ／＋交配による野生型コントロール、PlpcreERTマウス（Jackson Laboratories）およびTgfbr1fl／flマウス（S. Karlsson、Lund Universityから提供）を使用した。PlpcreERT;Tgfbr1fl/fl マウスに、エタノールとコーン油（1：9）混合液に溶解した4-hydroxytamoxifen（100 mg kg-1, 腹腔内; Sigma-Aldrich） をP14からP18まで5日間連続投与して組換えを誘導し、P28で殺処分とした。すべての動物は、1ケージあたり最大6匹で12時間の明暗サイクルで飼育し、餌と水に無制限にアクセスできるようにした。動物実験では、サンプルサイズは、OpenEpiソフトウェア（Openepi.com）を用いて正規近似法による両側95％信頼区間で計算した検出力分析によって決定し、すべての実験について80％以上の検出力に到達した。オープンフィールド実験では雄マウスのみが使用された以外は、研究全体を通して雄と雌の両方が使用された。動物は分析する時間帯に無作為に割り振られた。実験、定量、報告の詳細については、ARRIVE2ガイドラインに従った。

遺伝子型判定
ゲノムDNAは、Wizard SV genomic purification system（Promega）を用いて耳生検組織から製造者の説明書に従って抽出された。Csf1rFireΔ／Δマウスは、以前に記載されたようにPCR戦略を用いて遺伝子型を決定した10。PlpcreERT;Tgfbr1fl/fl マウスの遺伝子型決定は、PlpcreERT マウス51および Tgfbr1fl/flmice52 について以前に記載したように、尾から抽出したゲノム DNA を使用して行った。

マウス組織の免疫蛍光染色
マウスを4%パラホルムアルデヒド（PFA; w/v; Sigma）で心内灌流し、脳を一晩後固定し、スクロースで凍結保護してからOCT（Tissue-Tech）で埋め込み、-80℃で保管した。凍結切片（10μm）を風乾し、透過処理し、PBS中の5％正常馬血清（Gibco）および0.3％Triton-X-100（Fisher Scientific）で1時間ブロッキングした。ミエリンタンパク質の染色には、切片をメタノール中、-20℃で10分間、透過処理した。EdU可視化のために，免疫染色の前にAlexaFluor-555 Click-iT EdU Cell Proliferation Assay Kit（Invitrogen）を適用した．切片は0.5% Triton X-100 in PBSで20分間室温（20-25℃）で透過処理した後、Click-iT反応カクテルで30分間暗所で室温でインキュベートし、PBSで洗浄した。一次抗体塗布前に熱による抗原賦活を行った。一次抗体は、湿潤チャンバー内で4℃にて一晩適用し、以下のものを使用した。MBP（AbD Serotec、1：250；MCA409S、クローン12）；MAG（Millipore、1：100；MAB1567、クローン513）；MOG（Millipore、1：100；MAB5680、クローン8〜18C5）；CNPase（Sigma-Aldrich、1：100；AMAB91072、クローンCL2887）；TMEM119（Abcam、1: 100；ab209064、クローン28-3）；IBA1（Abcam、1：500；ab5076）；CD206（Abcam、1：100；ab64693）；CD31（R＆D Systems、1：100；AF3628）；LYVE1（Abcam、1：100；ab14917）；OLIG2（Millipore、1：100；AB9610、クローン211F1. 1）；APC／CC1（Abcam、1：100；ab16794、クローンCC1）；SOX9（Millipore、1：500；AB5535）；GFAP（Cambridge Bioscience、1：500；829401）；神経線維H（BioLegend、1：100，000；Covance、PCK-592P）；及びPLP（Abcam、1：100；ab28486）であった。SERPINA3N免疫染色のために、6μm厚のホルマリン固定パラフィン包埋切片を脱パラフィンし、再水和し、次にクエン酸ベースの抗原アンマスキング溶液（H-3300-250、Vector Laboratories）中で85℃の水浴に30分間置いた。その後、切片をPBSで洗浄し、10％ロバ血清（D9663、Sigma Aldrich）および0.2％Triton X-100（T8787, Sigma Aldrich）入りPBSを用いて1時間ブロッキングした。次に、切片を、5%ロバ血清および0.1% Triton X-100を含むPBS中の抗SERPINA3N (R&D Systems, 1:100; AF4709) および抗OLIG2 (Millipore, 1:500; AB9610) で4℃において一晩インキュベートし、0.05% Tween-20 (P1379, Sigma Aldrich) を含むPBS中3回洗滌した。蛍光結合二次抗体を湿式チャンバー内で室温にて1-2時間適用した（1:500, Life Technologies-Molecular Probes）。HoechstまたはDAPIで対比染色した後、Fluoromount-G（Southern Biotech）でスライドをカバースリップさせた。FireΔ/ΔマウスのTGFβR1免疫染色のために、0.001% Triton X-100（Sigma）入りTBSでの洗浄後、切片を抗原アンマスキング液（pH6のクエン酸緩衝液、Vector Laboratories）中で10分間マイクロウェーブし、次に60℃で30分間加熱した。冷却後，切片をTBSと0.001% Triton X-100で1回洗浄し，Bloxall（Vector）で内因性ホスファターゼとペルオキシダーゼ活性を10分間ブロッキングした．ブロッキングは10%熱不活性化ウマ血清（Gibco）および0.5% Triton X-100をTBSに溶解した溶液で1時間行った。ブロッキング液で希釈した一次抗体を、4℃の湿式チャンバー内で一晩適用した。使用した抗体には、TGFβR1 (Abcam, 1:100; ab31013) およびOLIG2 (Millipore, 1:100; MABN50)が含まれる。0.001% Triton X-100を含むTBSで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体（Vector）を湿潤室内で室温で1時間塗布した。さらに洗浄後、Opal 520（Akoya）を用いて、Plus Amplification Diluent（Akoya）中1：100で、湿気のある室内で10分間切片を現像した。スライドを洗浄し、残存するペルオキシダーゼ活性をBloxall（Vector）を10分間適用してクエンチした。共染色のために、別の一次抗体を適用し、ペルオキシダーゼ標識二次抗体とOpal 650（アコヤ）を用いて、上記のようにPlus Amplification Diluentで1：100で現像した。TBSで洗浄後、切片をHoechstで対比染色し（1:10,000）、Fluoromount-Gでマウントした（Invitrogen）。

切片はLeica SPEまたはZeiss LSM 510共焦点顕微鏡で画像化した。細胞数は、Fiji/ImageJ（Fiji.sc）を用いて円形の仮定に基づき測定した面積から算出し、1切片あたり3つの関心領域を定量化した。SOX9とGFAPの共焦点解析は、Imaris software v.9.7を使用して行った。

フローサイトメトリー
CSF1R (CD115) 表面タンパク質レベルを調べるために、酵素フリーの脳解離プロトコルを用いて、骨髄系細胞濃縮細胞懸濁液を採取した。10-11週齢の雌マウスを氷冷PBSで経心的に灌流した後、脳を解剖し、25mM HEPES (10041703, Fisher Scientific) を含むHBSS (Ca2+ と Mg2+ なし; 14175-053, Gibco) 中で22Aメスでミンチした。次に、脳を、25mM HEPESを含むHBSS（Ca2＋およびMg2＋なし）中でDounceホモジナイザー（D9938、Kimble）を用いてホモジナイズした。脳ホモジネートは、35％パーコール勾配を用い、800gで20分間、4℃で遠心分離して分離した（ブレーキなし）。細胞ペレットを集め、0.1%低エンドトキシンBSA (A8806, Sigma Aldrich) を含むPBS (Ca2+ とMg2+なし; 14190-094, Gibco) 中で洗浄した。Fcレセプターをブロッキング（1:100; 101302, BioLegend）し、4℃、シェーカー上で15分間反応させた。次に、細胞を、CD11b (PE; 1:200; 101207; BioLegend, clone M1/70), CD45 (PECy7; 1:200; 103114; BioLegend, clone 30-F11) およびCD115 (APC; 1:200; 135510; BioLegend, clone AFS98) に対する一次抗体で30分間4℃でシェイカー上で染色した。その後、サンプルを洗浄し、0.1%低エンドトキシンBSAを含むPBS（Ca2+とMg2+を含まない）に再懸濁した。単一蛍光染色ビーズ、未染色サンプル、蛍光マイナス1サンプルはコントロールとして使用した。DAPIは細胞生存率のゲーティングに使用された。データは、BD LSRFortessaフローサイトメーターを用いて取得した。取得後のデータ解析には、FCS express 7を使用した。

マウス組織の電子顕微鏡観察
マウスを0.1Mリン酸緩衝液中の4％PFA（w/v）および2％グルタルアルデヒド（v/v；TAAB Laboratories）で心内灌流させた。組織は4℃で一晩後固定し、1%グルタルアルデヒド（v/v）に移し、埋め込むまでとした。組織切片（1 mm）を1%四酸化オスミウムで後固定し、脱水してからアラルダイト樹脂ブロックに加工した。次に、1μmのミクロトームカット切片を1%トルイジンブルー/2%ホウ酸ナトリウム溶液で染色した後、Zeiss Axio顕微鏡を用いた明視野イメージングを行った。脳梁から超薄切片（60 nm）を切り出し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、JEOL透過電子顕微鏡でグリッドを撮像した。軸索の直径、ミエリンおよび舌内膜の厚さは、Fiji/ImageJ (Fiji.sc) を用いて円形の仮定に基づき測定した面積から計算した（直径 = 2 × √[面積/π]）、動物1匹あたり100-200個の軸索を分析した。

行動学的試験
実験者は、行動試験およびデータ解析の間、遺伝子型について盲検化された。すべての実験は、20℃の一定温度に維持された行動試験室で行われた。オープンフィールド試験は、運動活性および不安関連行動を評価するために、4〜8週齢および11〜13ヶ月齢の雄マウスに対して実施した。取り扱いは試験の3-4日前に行った。マウスはオープンフィールド(47×47cm)に入れられ、10分間自由にアリーナを探索した。装置は各試験の間に70%エタノールで洗浄し、臭気を除去した。ビデオ追跡ソフトウェアAny-Maze (Stoelting Europe, v.6.3) を用いて、総歩行距離 (メートル) と端 (壁から9 cm) と中央 (29 × 29 cm) に滞在した時間を自動的に定量化した。バーンズ迷路試験は、空間学習、記憶、認知の柔軟性を評価するために、2〜4ヶ月齢の成体マウスで実施した。迷路は、外縁に20個の円形穴を持つ白色円形プラットフォーム1台からなり、直径91.5cm、高さ115cm（San Diego Instruments）であった。穴の1つには暗黒の逃避室が取り付けられており、逃避室の位置は各マウスで一定であったが、嗅覚の手がかりの持ち越しを避けるため、連続したマウス間では時計回りに90°移動させた。迷路の照明にはランプとオーバーヘッドライト(450ルクス)を使用した。試行を開始すると、マウスが逃避室に入るまで85dBの回避的なホワイトノイズ刺激を流した。視覚的な合図は迷路の周囲のカーテンと壁に存在した。動物は各試行開始時に白色保持筒(直径10.5cm)内に保持させた。迷路と逃避室は、動物間の嗅覚的手がかりの持ち越しを避けるため、各試験の間にエタノールで洗浄した。すべての試行はビデオベースの自動追跡ソフトウェアAny-Maze (Stoelting Europe, v.4.99)を用いて記録された。試験前に、実験者はマウスを1日あたり3-5分間、6-7日間取り扱った。動物を試験室に運び、保持筒に入れ、2日間10秒間試験環境に馴染ませてから馴化させた。学習段階開始の1日前に迷路と逃避室への馴化を行い、各マウスをホールディングシリンダーに10秒間入れた後、3分間嫌悪刺激のない迷路を自由に探検させた。その後、マウスはエスケープチャンバーに誘導され、1分間保持された。学習期(T1-T6)には、1日2回の試行(試行間隔1時間)を6日間連続して行い、マウスが逃避室を見つけるように訓練した；1日あたりのデータを平均化した。3分間の試行期間中にマウスが脱出室に入れなかった場合は、実験者が脱出室まで誘導した。空間学習は各試行で逃避室を見つけるまでに要した総時間(一次潜時：頭部が逃避室に入ることで定義)、空間ワーキングメモリは逃避室を見つけるまでのエラー数(一次エラー：頭部と首または後肢を多少伸ばして鼻を穴に故意に入れることで定義)によって評価した。さらに、試行中の総移動距離と速度も測定した。除外基準はデータ解析前に以下のように定義した：マウスは最初の5回の試行のうち2回以内に迷路の少なくとも3つの象限に入ること、最初の3回の試行で脱出室に入ること。野生型マウス1匹とノックアウトマウス1匹は、チャンバーへの入室を拒否したため、解析から除外された。最終試行から1時間後と3日後に、逃避箱を外した状態でマウスに1分間迷路を探索させるプローブテストを実施した。逃避箱の位置の記憶を評価するため、迷路の標的四分円の滞在時間と各穴のノーズポークの回数を記録した。認知的柔軟性を評価するため、マウスは逃避箱を元の場所から180°移動させる逆転学習期(R1-R3)を行い、上記のように測定した。また、最終的な反転試行の3日後にプローブテストを実施した。訓練されたマウスと訓練されていないマウスの評価年齢の中央値は、免疫蛍光法または電子顕微鏡分析のための安楽死時に遺伝子型間で同等であった：訓練されていないFire＋／＋およびFireΔ／Δマウスは118日齢、訓練したFire＋／＋マウスは119日齢、および訓練したFireΔ／Δマウスは120日齢であった。

EdUの取り込み
試行1日目の終了から実験終了までの14日間、EdUを0.2 mg ml-1で飲料水に溶解させた。水は1日おきに交換し、摂取量をモニターして、一定量を摂取したかどうかを評価した。

成人期におけるミクログリアの枯渇
CSF1R阻害剤PLX5622（ケムグッド社、C-1521）を1200ppmの濃度でチャウに配合し（リサーチダイエット社、D11100404i）、2ヶ月齢および5ヶ月齢の野生型（Fire+/+）マウスに1ヶ月間与え、上記のように安楽死させた。

SRI-011381塩酸塩の投与
DMSO（10％）とPEG300（40％）を含むPBSに溶解したTGFβシグナル作動薬SRI-011381塩酸塩（HY-100347A、Cambridge Bioscience/MedChem Express）を30mg kg-1の用量でFireΔ／Δマウスに腹腔内に週3回3週間注射（合計9回の注射）し、上記のように死亡させた。

ELISAによるTGFβ1レベルの測定
PBSで灌流後、FireΔ／Δおよび野生型脳の2mm冠状切片から脳梁を剥離し、液体窒素中でスナップ凍結させた。試料を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Sigma-Aldrich、4906845001および11836170001）を含むRIPA緩衝液（Millipore、20-188）中でホモジナイズした。角膜溶解物サンプルを活性化し、TGFβ1タンパク質レベルを、1：10の最終希釈で血清および血漿サンプルについて製造業者の説明書に従ってELISA（BioLegend、436707）により測定した。BCAアッセイは、製造者の説明書に従って総タンパク質を測定するために行い（Thermo Fisher Scientific、23225）、値は各サンプルについてこれに正規化された。

単一細胞RNA配列決定のための脳解離および細胞選別
6-7週齢の雌マウスから、各動物について同じ時間帯に脳を採取した。マウスは頸椎脱臼により淘汰され、脳は嗅球と小脳を除去して解剖された。両半球の海馬と左半球の残り（海馬なし）を、5％トレハロース（T0167、Sigma Aldrich）および30μMアクチノマイシンD（A1410、Sigma Aldrich）を含む氷冷HBSS（Ca2＋およびMg2＋なし；14175-053、Gibco）中に集め、22Aメスで細かくミンチ状にした。脳は、An Adult Brain Dissociation kit (130-107-677, Miltenyi Biotec)を用いて、以下の修正を加えながら消化した。(1) Neural Tissue Dissociation kit protocol (130-092-628, Miltenyi Biotec) の "manual dissociation" の項に記載されているように組織を解離した； (2) 35℃で酵素消化を行った； (3) 半量の酵素Pを用いた； (4) 解離による転写の変化を抑えるためにアクチノマイシンDを用いた； (5) 解離による転写変化を抑制するために5％トレハロースを用いた； (6) 酵母消化を行うために、1.5％のトレハロースを用いた．(5) 細胞生存率を高めるため、すべての緩衝液に5%トレハロースを加えた； (6) あらかじめ湿らせた70μm (352350, Falcon) および40μm (352340; Falcon) のセルストレーナーでろ過して細胞クラスターを除去した； (7) 赤血球とミエリン破片の除去ステップは、分散ステップ中に省略した； (8) すべての遠心は200gで4℃のときに実施された。解離後、細胞を0.2%BSA入りPBSに回収し、Sony SH800 cell sorterでソーティングを行った。ミエリン片、赤血球、ダブレットを除くために、前方散乱と側方散乱に基づいてゲートが選択された。非生細胞は、DRAQ7および/またはDAPI染色に基づいて除外した（DRAQ7highおよび/またはDAPIhighの細胞を非生細胞と分類した）。トリパンブルーとヘモサイトメーターを用いてソーティング後の細胞の生存率を確認した後、Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM Library and Gel Bead kit (v.3.1 chemistry, PN-1000121, 10x genomics) とChromium Next GEM Chip G kit (PN-1000120) を用いて、製造元の指示に従ってシングルセル・プラットフォームで処理した。ライブラリーはNovaSeq 6000シーケンスシステム（PE150（HiSeq）、イルミナ）を用いてシーケンスした。

シーケンシングデータの前処理と単一細胞RNAシーケンシング解析
参照ゲノムへのアライメント、フィーチャーカウンティング、セルコーリングは、10x Genomicsが提供するデフォルトのmm10ゲノムを用いて、10x Genomics CellRanger (v.5.0.0) pipelineに従って行った (https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz)．出力から、フィルタリングされたマトリックスを下流の解析に使用した。前処理はエジンバラ大学のコンピュートクラスタEddieで行った。解析はR v.4.1.1を用いて行った。以下に説明する解析パイプラインを再現するための詳細は、GitHub (https://github.com/Anna-Williams/Veronique-Firemice) で公開されているコードスクリプトに記載されています。細胞は、細胞あたりの遺伝子とユニーク分子識別子（UMI）、これら2つのパラメータの比率、細胞あたりのミトコンドリア遺伝子リードの割合に基づいて、データセット固有のパラメータを使用してフィルタリングされました。閾値は、バッチ6が他のバッチよりも品質が悪く、異常値を持つため、scater (v.1.20.1) のisOutlier関数で計算され、subset引数が使用された。少なくとも2つの細胞で検出された遺伝子のみを保持した。scran (v.1.20.1) を用いて、デコンボリューションによりデータを正規化し、上位15%の高変動遺伝子を選択した。主成分分析（PCA）により、25個の主成分を選択した（カットオフはElbowplotにより選択）。非線形次元表現とt-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE)、バッチで説明される遺伝子発現分散（scaterで計算）により、バッチ補正の必要性が判明した。バッチ補正はfastMNN、batchelor（v.1.8.0）を用いて相互最近傍により行われた。最後に、グラフベースのクラスタリングアプローチにより、scranのclusterCells関数を用いて、k = 60で細胞のクラスタリングを行った。オリゴデンドロサイトマーカー（Plp1、Mog、Mag、Mbp）の発現が最も高く、他の細胞型マーカー（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、ミクログリアマーカー）を発現しないクラスターをサブセットし、別々に分析した。細胞および遺伝子の品質管理はさらに調整され、より厳しい最小UMI数閾値（5,000 UMI）と細胞あたりのミトコンドリア遺伝子リードの最大割合（10%）を設定した。また、新しい閾値に基づく品質の低い細胞の小さなクラスタも解析から除外した（Extended Data Fig.10）。最終的に、合計19,506の遺伝子と13,583の細胞を対象とした。正規化、特徴選択、次元削減、バッチ補正は、上記のようにサブセットデータセットで繰り返された。クラスタリングは異なる解像度で行い、clustree (v.0.4.4) で検討した結果、k = 100 を選択し、4つのクラスタに統合した（図6aおよび拡張データ図10）。クラスタ1（FireΔ/Δマウスに特異的）と他のすべての細胞の平均発現との間の遺伝子発現の差は、Seurat（v.4.1.0）のFindMarkersを用いて行った（Supplement Table 1）。インタラクティブなアプリケーションを作成するために ShinyCell v.2.1.0 を、遺伝子のアノテーションを行うために org.Mm.eg.db v.3.13.0 を、カスタムプロットを行うために ggplot2 v.3.3.5 を、再現性の高いパスを保証するために here v.1.0.1 を、スパースマトリックスを扱うために Matrix v.1.3.4 を使用しました。

リピドミクス
Fire+/+およびFireΔ/Δマウスの脳梁サンプルを、800μlの1N HCl:CH3OH 1:8 (v/v), 900μl ChCl3および200μg ml-1の抗酸化剤2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT; Sigma-Aldrich) でPBS 700μl中にて希釈した。Splash Lipidomix Mass Spec standard (3 μl; Avanti Polar Lipids) を抽出物ミックスに添加した。有機画分をSavant Speedvac spd111v (Thermo Fisher)を用いて室温で蒸発させ、残った脂質ペレットを100%エタノールに再構成した。脂質種を、ハイブリッドトリプル四重極／リニアイオントラップ質量分析計（6500+ QTRAPシステム；AB SCIEX）と結合したNexera X2 UHPLCシステム（Shimadzu）上で液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（LC-ESI-MS／MS）により分析した。クロマトグラフィー分離は、XBridgeアミドカラム（150×4. 6 mm、3×5μm；Waters）を用いて35℃に維持し、移動相A（水とアセトニトリル中の1mM酢酸アンモニウム5：95（v／v））と移動相B（水とアセトニトリル中の1mM酢酸アンモニウム50: 0-6分：0％B；6％B；6-10分：6％B；25％B；10-11分：25％B；98％B；11-13分：98％B；100％B；13-19分：100％B；19-24分：0％Bのグラデーションで実施した。流速は0.7 ml min-1とし、13分以降1.5 ml min-1に増加させた。スフィンゴミエリンとコレステリルエステルは、ポジティブイオンモードで、184.1, 369.4のプリカーサースキャンで測定した。トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドは、ポジティブイオンモードで、脂肪アシル部分の1つに対してニュートラルロスキャンで測定されました。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシチド、ホスファチジルセリンは、脂肪アシル断片イオンにより負イオンモードで測定されました。脂質の定量は、上記の中性損失または代表的なプロダクトイオンに基づくトランジションで、スケジュールされた多重反応モニタリングによって行われました。装置のパラメータは次のように設定した：カーテンガス＝35 psi；コリジョンガス＝8 a.u. (medium); IonSpray 16 電圧＝5,500 V および -4,500 V；温度＝550 ℃；イオン源ガス1＝50 psi；イオン源ガス2＝60 psi；デクラスター電位＝60 V および -80 V；入口電位＝10 V および -10 V；コリジョンセル出口電位＝15 V および -15 V. ピークの統合には MultiquantTM ソフトウェア v.3.0.3 が使用されています。脂質種のシグナルは同位体の寄与を補正し（Python Molmass 2019.1.1 を用いて計算）、内部標準シグナルに基づいて定量化し、Lipidomics Standards Initiative のガイドラインに準拠させた。

ヒト組織の免疫蛍光染色
ALSP患者および非神経学的原因で死亡した非罹患者の死後組織（拡張データ表1）は、UCL Queen Square Institute of NeurologyのQueen Square Brain Bank for Neurological Disordersから完全な倫理承認を得て入手し、その使用はドナー組織および情報の使用に関するインフォームドコンセントの条項と一致した。組織の使用については、ロンドン中央研究倫理委員会を通じて、National Health Service Health Research AuthorityからQueen Square Brain Bankに倫理的な承認を得た。ALSPの診断は、CSF1Rの変異に基づき、神経病理学的手段によって確認され、臨床歴はZ. Jaunmuktane（University College London）により提供された。ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを厚さ10μmに切断した。切片は60℃のオーブンに10分間入れ、ヒストクリア（2×10分）とエタノール（100％×2回、95％、70％、50％、各5分）での一連の洗浄により脱パラフィン化した。PBSで洗浄後、スライドをVectorアンマスキング液の圧力釜に20分間入れ、冷却し、1回洗浄し、PBS中の5％正常ウマ血清（Gibco）と0.3％Triton X-100（Fisher Scientific）で1時間ブロッキングした。組織は一次抗体とともに湿潤槽で一晩インキュベートした。その後、切片をPBSで洗浄し、蛍光結合二次抗体を湿式チャンバー内で室温で2時間適用した（1:500、Life Technologies-Molecular Probes）。PBSと水での洗浄後、切片をHoechstで対比染色し、蒸留水で20分間洗浄した。その後、Fluoromount-G (Southern Biotech)でカバースリップした。一次抗体には、IBA1 (Abcam, 1:500; ab5076) とLYVE1 (Abcam, 1:100; ab14917)が含まれる。組織切片全体を，Zeiss AxioScan Z.1 SlideScannerとZeiss Zen2ソフトウェア（青版）を用いて画像化した。150×150μmの3フィールドをそれぞれの関心領域ごとにカウントし、カウントを乗算して1mm2あたりの免疫陽性細胞の密度を決定した。

ヒト組織の電子顕微鏡観察
ALSP 組織は Charité-Universitätsmedizin Berlin の Department of Neuropathology から、非罹患者の組織は Medical Research Council Edinburgh Brain and Tissue Bank から、それぞれの倫理審査委員会の承認を受けて入手した。白質ALSP組織サンプルは、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドで4℃、48時間固定した。サンプルは0.05Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の1%四酸化オスミウムで3時間後固定し、70%アセトンステップで1%酢酸ウラニルと0.1%リンタングステン酸によるエンブロック染色を含む段階的アセトンシリーズで60分間脱水し、アラルダイト樹脂に包埋した。非罹患者の組織については、超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、Zeiss P902電子顕微鏡で画像化した。ALSP 組織については、限界アーチファクトが実質的に存在しない超薄切片を作製し、Zeiss Gemini 300 走査透過電子顕微鏡を使用して完全にデジタル化した。簡単に説明すると、デジタル化には29 kVの加速電圧、5 nmのピクセルサイズ、1.5 µsのビーム滞在時間、スティッチングにはFiji/TrakEM2を使用し、QuPath 0.3.0による詳細な解析ができるようにしました。

統計と再現性
すべての手動による細胞カウントは、盲検下で行われた。データは平均値±s.e.m.として示される。すべての顕微鏡写真は、独立して最低3回繰り返された結果の代表画像である。正確なn値は、定量化の対応するグラフに示される。統計的検定の前に、データはShapiro-Wilk検定を用いて分布の正規性を評価した。統計学的検定には、正規分布データに対する両側Studentのt検定、ノンパラメトリックデータに対するMann-Whitney検定、2群以上の比較に対するSidakの多重比較検定付き二元配置分散分析（ANOVA）、log2（倍変化）の値0との比較に対する1標本のt検定が含まれた。バーンズ迷路の一次遅れとエラーの解析には、シダックの多重比較検定による反復測定二元配置ANOVAを用いた。プローブテストデータにおける群間差の検定の前に、各遺伝子型を1標本のt検定を用いて偶然性（25％）に対して検定した。ミエリンおよび舌内膜の厚さ対軸索径の傾きは、単純な線形回帰分析を用いて比較し、2群以上の比較には、ダンの多重比較検定によるクラスカル・ワリスを用いた。P値＜0.05を有意とした。データの取り扱いおよび統計処理は、Microsoft ExcelおよびGraphPad Prism Softwareを使用して行った。

報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。

データの入手方法
生細胞RNA配列データは、Gene Expression OmnibusにアクセッションコードGSE215440で寄託されている。解析されたオリゴデンドロサイトのシーケンスデータは、以下のShinyアプリケーションで利用可能です：https://annawilliams.shinyapps.io/shinyApp_oligos_VM/. 解析パイプラインを再現するための詳細は、GitHub (https://github.com/Anna-Williams/Veronique-Firemice) で公開されているコードスクリプトに記載されています。参照ゲノムへのアライメント、フィーチャーカウンティング、セルコーリングは10x Genomics CellRanger (v.5.0.0) pipelineに従い、10x Genomicsが提供するデフォルトのmm10ゲノムを用いて行った (https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz)．ソースデータは本論文に添付されています。

コードの入手方法
以下に説明する解析パイプラインを再現するための完全な詳細は、GitHub (https://github.com/Anna-Williams/Veronique-Firemice) で公開されているコードスクリプトに記載されています。

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謝辞
ALSP組織および免疫蛍光分析用の非罹患者組織の提供を受けたUniversity College London Queen Square Institute of NeurologyのQueen Square Brain Bank for Neurological Disordersのスタッフ（Z. Jaunmuktane）、生物科学部電子顕微鏡ユニットのスタッフ（Wellcome Multi-User Equipment Grant WT104915MA）、シャリティーの電子顕微鏡コアファシリティーのスタッフ、M. Mohammadによるデータ取得の支援、CRM Flow Cytometry Core Facility（University of Edinburger）のA. Mohammad にはデータ取得のサポートを、CRM Flow Cytometry Core Facility (University of Edinburgh) の A. Corsinotti と F. Rossi には単細胞 RNA 解析のための細胞処理のサポートを受けた。Queen Square Brain Bankは、Reta Lila Weston Institute of Neurological Studies, University College London Queen Square Institute of Neurologyの支援を受けています。この研究は、エジンバラ大学のウェルカムトラスト助成による組織修復の4年間の博士課程（N.B.M., 108906/Z/15/Z）、医学研究評議会と英国多発性硬化症協会からのキャリア開発賞（V.E.M., MR/M020827/1 ）、医学研究評議会のシニア非臨床研究員（V.E.M.., MR/V031260/1 ）の支援により行われたものである。MR/V031260/1）、Barlo Multiple Sclerosis CentreのJohn David Eaton Chair in Multiple Sclerosis Research（V.E.M.へ）、医学研究評議会生殖医療センター（MR/N02256/1）、発達中の脳のためのサイモンズ・イニシアティブ（C. P. へ）。 P.）、英国認知症研究所（UK DRI）（UK DRI Ltd、英国医学研究評議会、アルツハイマー病協会、アルツハイマー病研究連合王国から資金提供を受けている）（J.P.へ。ARUK-PG2016B-6）、Alzheimer's Research United Kingdom（K.H., ARUK-PG2016B-6）、欧州連合の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」の欧州研究会議（ERC）（番号681181）、日本学術振興会の科学研究費補助金（B）（to R.M.., 番号22H02962）、フランダース研究財団（FWO Vlaanderen, to J.F.J.B. and J.J.A.H., number 1S15519N, G099618FWO and 12J9119N）、インターレジ V-A EMR (EURLIPIDS, to J.F.J.B. and J.J.A.H..), 番号EMR23）、ベルギー・シャルコー財団（J.F.J.B.とJ.J.A.H.へ）、MRC/MS Society UK Award（A.W. と N.B.-C. へ、番号MR/T015594/1）であった。図は、BioRender.comを使用して、出版ライセンスに基づき作成した。オープンアクセスのため、著者はこの投稿から生じるすべてのAuthor Accepted ManuscriptバージョンにCreative Commons Attribution (CC BY) ライセンスを適用している。

著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Josef Priller, Veronique E. Miron

著者と所属
エディンバラ大学英国認知症研究所（英国エディンバラ市

Niamh B. McNamara, David A. D. Munro, Alana Hoffmann, Rebecca K. Holloway, Irene Molina-Gonzalez, Jamie Rose, Stefan Szymkowiak, Barry W. McColl, Tara L. Spires-Jones, Anna Williams, Josef Priller ＆ Veronique E. Miron.

エジンバラ大学発見脳科学センター（英国・エジンバラ市

Niamh B. McNamara, Alana Hoffmann, Rebecca K. Holloway, Irene Molina-Gonzalez, Katharine E. Askew, Jamie Rose, Stefan Szymkowiak, Barry W. McColl, Tara L. Spires-Jones, Karen Horsburgh & Veronique E. Miron, 英国医学研究評議会生殖医療研究センター

医学研究評議会生殖医療センター，エディンバラ大学クイーンズ医学研究所，エディンバラ，イギリス

Niamh B. McNamara、Alana Hoffmann、Rebecca K. Holloway、Irene Molina-GonzalezおよびVeronique E. Miron

臨床脳科学センター、エディンバラ大学（英国エディンバラ市）理事長ビル

デビッド・A・D・マンロー＆ジョセフ・プリラー

再生医学センター、再生・修復研究所、エジンバラ大学、エジンバラ、英国

Nadine Bestard-Cuche、Jonathan Moss、Anna Williams

国立精神・神経センター神経研究所・分子薬理部

上田晶子・村松理恵子

ハッセルト大学バイオメディカル研究所免疫・感染症学部

Jeroen F. J. Bogie & Jerome J. A. Hendriks

ハッセルト大学大学MSセンター（ベルギー、ハッセルト

Jeroen F. J. Bogie & Jerome J. A. Hendriks（ジェローム・J・ヘンドリクス

カナダ、オンタリオ州、トロント、セント・マイケルズ病院、バルロ多発性硬化症センター

レベッカ・K・ホロウェイ、ヴェロニク・E・ミロン

カナダ、オンタリオ州、トロント、セント・マイケルズ病院、キーナン・バイオメディカル・サイエンス研究センター

レベッカ・K・ホロウェイ＆ヴェロニク・E・ミロン

トロント大学免疫学部（カナダ、オンタリオ州、トロント

レベッカ・K・ホロウェイ＆ヴェロニク・E・ミロン

ウェルカム・トラスト細胞生物学センター（英国・エディンバラ大学キングス・ビルディングズ

スティーブン・ミッチェル

生物・獣医学サービス、エジンバラ大学、理事長ビル、エジンバラ、UK

ウィリアム・マンガル＆マイケル・ドッズ

シャリテ大学メディシンベルリン神経病理学教室およびニューロキュア臨床研究センター（ドイツ・ベルリン

カーステン・ディットマイヤー＆ウェルナー・ステンツェル

神経病理学研究所、神経調節基礎センター、フライブルグ大学医学部（ドイツ・フライブルグ

Lukas Amann & Marco Prinz

シグナル研究センターBIOSSおよびCIBSS（フライブルク大学、ドイツ・フライブルク

ルーカス・アマン＆マルコ・プリンツ

エディンバラ大学クイーンズ医学研究所 炎症研究センター （英国・エディンバラ

クレア・プリダンズ

英国エディンバラ大学 発達脳科学研究センター サイモンズ・イニシアチブ

Clare Pridans

英国エディンバラ大学ミュアマックスウェルてんかんセンター

Clare Pridans（クレア・プリダンス

ミュンヘン工科大学医学部精神医学・精神療法学科（ドイツ・ミュンヘン

ヨーゼフ・プリラー

ドイツ・ベルリン・シャリテ大学医学部・DZNE神経精神医学・分子精神医学研究室

ヨーゼフ・プリラー

貢献
N.B.M.は研究の設計、実験の実施、データの解析と解釈を行い、原稿を共同で執筆した。D.A.D.M.は、単一細胞RNA配列決定のための組織処理、検証研究、行動分析のサブセットを実施した。N.B.-C.とA.W.は、シングルセルRNAシーケンスデータのバイオインフォマティクス解析を行い、Shinyアプリケーションを作成した。A.U.とR.M.はTgfbr1コンディショナルノックアウトマウスモデルを作成した。J.F.J.B.とJ.J.A.H.はリピドミクス解析を実施した。A.H.、R.K.H.、L.A.、S.S.、B.W.M.、M.P.はマウス実験に協力した。I.M.-G.はアストロサイトの解析を行った。K.E.A.とK.H.は、認知課題トレーニング、データ解析、解釈をサポートした。S.M.、J.M.、A.W.、C.D.、W.S.、J.R.、T.L.-J は組織の処理と電子顕微鏡の観察をサポートした。W.M.とM.D.は灌流と脳抽出を行った。C.P.はFireΔ/Δマウスを作製し、マウスプロジェクトの共同監督を行い、研究の方向性に貢献した。A.W.とJ.P.は、単一細胞RNA配列の解釈を手伝い、研究の指導と監督を行い、原稿の編集に参加した。V.E.M.は、研究の監督、実験デザインと解釈の指導、原稿の共同執筆を行った。

共著者
Veronique E. Mironに連絡する。

倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

査読
査読情報
Natureは、Michelle Monje氏、Xianhua Piao氏、およびその他の匿名の査読者の方々に対し、本論文の査読に貢献したことに感謝します。査読者のレポートがあります。

追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。

拡張データ 図と表
Extended Data Fig. 1 FIREΔ/Δマウスの特徴。
a) 生後1ヶ月のFIRE+/+およびFIREΔ/Δマウス脳梁における血管周囲マクロファージ（CD206+; マゼンタ）と血管（CD31+; 白）（矢印）の関連画像。b) 3-4ヶ月および6ヶ月齢の脳梁における血管周囲マクロファージ（LYVE1+ CD68+）の画像。スケールバー、75μm。 c) 生後3-4ヶ月および6ヶ月におけるLYVE1+ CD68+細胞/mm2±s.e.m.の平均密度を示す。有意ではない、P > 0.9999および0.7698、それぞれMann Whitneyおよび2-tailed unpaired Student's t-test。3-4ヶ月で、n = 5 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δマウス、6ヶ月で、n = 5 FIRE+/+と3 FIREΔ/Δマウス。 d) パネル（e）および（f）の非ミログリアミエロイド細胞（BAMs；CD11b+ CD45hi）を評価するフローサイトメトリゲート法。e) FIRE+/+およびFIREΔ/ΔマウスにおけるCD11b+CD45loミクログリア（MG）対CD11b+CD45hiミエロイド細胞でのCSF1Rの発現強度。 f) FIRE+/+およびFIREΔ/Δマウスにおける非ミクログリアミエロイド細胞（BAMを含む）でのCSF1R ± s.e.m. 平均蛍光強度 (MFI)．****n = 4 FIRE+/+および5 FIREΔ/Δマウス g) 1ヶ月齢の脳梁におけるアストロサイト（SOX9；緑、GFAP+；マゼンタ）の画像。スケールバー：75μm。挿入図は、二重陽性細胞の拡大図。h) 1ヶ月齢の脳梁におけるSOX9+ GFAP+細胞/mm2±s.e.m.の平均値。有意差なし、P = 0.4799、2-tailed unpaired Student's t-test.

出典データ

Extended Data 図2 FIREΔ/Δマウスにおけるミエリンタンパク質と軸索の評価。
a) 生後1ヶ月の脳梁におけるMAGとMBPの平均画素強度±s.e.m.。b) 生後1ヶ月の脳梁におけるCNPase、MOG、PLP（白色）の画像。スケールバー、75μm。 c) 生後1ヶ月の脳梁におけるCNPase、MOG、およびPLPの平均画素強度±s.e.m.。d) 生後1ヶ月の小脳におけるMBP（マゼンタ）およびMAG（緑）の画像。e) 生後1ヶ月の小脳におけるMBPとMAGの平均画素強度±s.e.m.．f) 生後1ヶ月の脳梁におけるニューロフィラメント（NF；緑色）の画像。スケールバー、75μm。g) 生後1ヶ月の脳梁におけるNFの平均画素強度±s.e.m.。n = 5 FIRE+/+と6 FIREΔ/Δ。 h) 3-4ヶ月と6ヶ月のFIREΔ/Δマウスの脳梁における軸索スフェロイドの画像（矢印で示す）。スケールバー：それぞれ2μm、1μm。

出典データ

Extended Data 図3 時点ごとのミエリンの比較。
a) 1ヶ月、3-4ヶ月、6ヶ月齢のFIRE+/+マウスのミエリン厚さ/軸索径(μm)。****b) FIREΔ/Δマウスの1、3-4、6ヶ月齢のミエリン厚さ/軸索径（μm）。****P < 0.0001, ns P = 0.9232, Kruskal-Wallis with Dunn's multiple comparisons test. 1ヶ月：n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δ；3-4ヶ月：n = 3マウス/グループ；6ヶ月：n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δ。 c) 1ヶ月、3-4ヶ月、6ヶ月齢のFIRE+/+とFIREΔ/Δマウスにおけるミエリン厚/軸索径（µm）。Dunnの多重比較検定によるKruskal-WallisのP値の表、1ヶ月：n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δマウス；3-4ヶ月：n = 3マウス/グループ；6ヶ月：n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δ。 d) 1, 3-4, 6ヶ月齢のFIRE+/+とFIREΔ/Δマウスでの内舌厚/軸索径（µm)。1ヶ月：n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δマウス；3-4ヶ月：n = 3マウス/グループ；6ヶ月：n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/ΔによるP値の表。e) 1ヶ月、3-4ヶ月、6ヶ月齢のFIRE+/+とFIREΔ/Δマウスの平均ミエリン厚さ（μm）/軸索径bin±s.e.m. 1 f) 1ヶ月、3-4ヶ月、6ヶ月齢のFIRE+/+とFIREΔ/Δマウスの平均舌内厚（μm）/軸索直径ビン±s.e.m. 。1ヶ月：n = 3 FIRE+/+および4 FIREΔ/Δマウス；3-4ヶ月：n = 3マウス/グループ；6ヶ月：n = 3 FIRE+/+および4 FIREΔ/Δ。

ソースデータ

Extended Data Fig. 4 FIREΔ/Δマウスでは、学習と記憶の符号化は損なわれないが、認知の柔軟性は損なわれる。
a) バーン迷路の訓練段階：マウスは空間学習と記憶想起の試行において、脱出室のあるターゲットホール1（オレンジ色）を見つけることを学習する。b) 6回の訓練日の平均一次潜時（秒）±s.e.m. n = 13 FIRE+/+マウスと10 FIREΔ/Δマウス。すべての訓練日において遺伝子型間で有意差なし、1日目。**P = 0.0011; Day 2: P = 0.9787; Day 3: P = 0.9627; Day 4: P = 0.9574; Day 5: P = 0.9990; Day 6: P > 0.9999, Sidakの多重比較検定付き反復測定2元配置分散分析。有意ではない、Day 1: P = 0.9649; Day 2: P = 0.5968; Day 3: P = 0.8884; Day 4: P = 0.6028; Day 5: P = 0.9215; Day 6: P = 0.9437, Sidakの多重比較検定付き反復測定2ウェイANOVA。 d) 目標象限にいた時間の割合± s.e.m. , n = 13 FIRE+/+ および10 FIREΔ/Δ. 点線は25%の確率を示す。遺伝子型間で有意差なし、1hr: P = 0.7337、3d: e) 1時間のプローブテストにおける穴へのノーズポークの平均回数 ± s.e.m., n = 13 FIRE+/+マウスと9 FIREΔ/Δマウス. ターゲット **P = 0.0019, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. f) 3dプローブテストにおけるノーズポークの平均回数 ± s.e.m., n = 13 FIRE+/+マウスと9 FIREΔ/Δマウス. 有意差なし、P = 0.9329, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test: h) 3日間の平均一次潜時（秒）±s.e.m. n = 13 FIRE+/+と9 FIREΔ/Δ。遺伝子型間のすべての訓練日において有意ではない、1日目：P = 0.9999; 2日目：P = 0.5186; 3日目：P = 0.9622, Sidakの多重比較検定付き反復測定2ウェイANOVA。1日目。*P = 0.0488、2日目。*j) 反転プローブテストにおける標的象限に滞在した時間の平均割合 ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ マウスと 9 FIREΔ/Δ マウス。点線は25%の確率を示す。有意差なし、P = 0.6933、2-tailed unpaired Student's t-test k) n = 13 FIRE+/+マウスと9 FIREΔ/Δマウス。m) 10分間のOpen Fieldテストでの総移動距離（m）±s.e.m. n = 37 mouse: n = 15 FIRE+/+マウス（若年7、中年8）; n = 22 FIREΔ/Δマウス（若年12、中年10）. 若齢マウス＝4-8週齢、中年マウス＝11-13ヶ月齢。有意差なし、Young: P = 0.9997、中高年。n) Open Field testにおいてアリーナの中央に滞在した時間の割合(%)±s.e.m. n = 37 mouse: n = 15 FIRE+/+マウス（若齢7、中年8）; n = 22 FIREΔ/Δマウス（若齢12、中年10）. 若齢マウス＝4-8週齢、中年マウス＝11-13ヶ月齢。有意差なし、Young: P = 0.7899、中年期。o) 訓練日中の平均移動距離（m）±s.e.m. n = 13 FIRE+/+マウスと9 FIREΔ/Δマウス. p) 反転日の平均移動距離（m）±s.e.m. n = 13 FIRE+/+マウスと9 FIREΔ/Δマウス. 訓練日の平均速度（m/s） ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ マウスと 9 FIREΔ/Δ マウス。非有意, P = 0.9998, >0.9999, 0.6667, 0.9995, 0.9831, 0.9995, Sidakの多重比較検定付き反復測定2元配置分散分析 r) 反転日の平均速度 ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+マウスと9 FIREΔ/Δマウス. 有意ではない、P = > 0.9999, 0.9940, 0.1561, Sidakの多重比較検定付き反復測定2元配置ANOVA。

ソースデータ

Extended Data 図5 学習後のオリゴデンドロゲン形成と髄鞘形成。
a) EdU（マゼンタ）とOLIG2（白）二重陽性細胞（矢印）の代表的な画像、点線輪郭の拡大図。b) 平均OLIG2+ EdU+ cells/mm2 ± s.e.m. n = 9 FIRE+/+マウスと4 FIREΔ/Δマウス。c) 成熟オリゴデンドロサイト（CC1+; 黒）または未熟系統細胞（CC1-; 灰）であるOLIG2+ EdU+細胞の平均割合 ± s.e.m. n = 9 FIRE+/+マウスおよび4 FIREΔ/Δマウス。有意差なし、CC1+。P > 0.9999; CC1-: d) EdU+ (magenta) CC1+ (green) OLIG2+ (white) triple positive cellsの代表画像(矢印)。e) 認知機能テスト6週間後の脳梁の画像。f) 未訓練マウスと訓練マウスの平均有髄軸索数/mm2 ± s.e.m. n = 未訓練カテゴリー3マウス/グループ、訓練FIRE+/+マウス4匹、訓練FIREΔ/Δマウス6匹。FIRE+/+ マウス *P = 0.0364, FIREΔ/Δ マウス 無意, P = 0.8537, 2-tailed unpaired Student's t-test. g) FIRE+/+ と FIREΔ/Δ マウスにおける有髄軸索増加率の平均値。h) FIRE+/+とFIREΔ/Δマウスにおける、平均有髄軸索/mm2と反転1日目（RD1）一次エラーまたは平均一次エラーとの相関。n = 4 FIRE+/+および6訓練済みFIREΔ/Δマウス。

ソースデータ

Extended Data 図6 FIREΔ/Δマウスの脱髄。
a) 生後6ヶ月のMAG（緑）およびPLP（マゼンタ）の画像。スケールバー、75μm。 b) 6ヶ月齢の脳梁におけるMAG±s.e.m.の平均画素強度。n = 5 FIRE+/+と3 FIREΔ/Δ。 c) 6ヶ月後の脳梁におけるPLP ± s.e.m.の平均画素強度。n = 5 FIRE+/+マウスと3 FIREΔ/Δマウス。 d) 6ヶ月齢における平均舌内厚（μm）/軸索直径ビン±s.e.m. n = 3 FIRE+/+マウスと4 FIREΔ/Δマウス。有意差なし、P = 0.4837、2-tailed unpaired Student's t-test. 平均ミエリン厚さ（μm）/軸索直径bin ± s.e.m.、6ヶ月時。n = 3 FIRE+/+と4 FIREΔ/Δマウス。>1 µm以上。*e) 6ヶ月齢のOLIG2（白）およびCC1（マゼンタ）を共発現する成熟オリゴデンドロサイトの画像。f) 平均OLIG2+ CC1+細胞/mm2 ± s.e.m. n = 5 FIRE+/+と3 FIREΔ/Δ。有意ではない、P = 0.6400、2-tailed unpaired Student's t-test. オリゴデンドロサイト系（OLIG2+）の細胞のうち、成熟（CC1+; 黒）または未熟（CC1-; 灰）± s.e.m. n = 5 FIRE+/+および3 FIREΔ/Δの平均割合。有意ではない、CC1+。g) 生後3-4ヶ月のOLIG2（白）とCC1（マゼンタ）を共発現している成熟オリゴデンドロサイトの画像。h) 平均OLIG2+ CC1+細胞/mm2 ± s.e.m. n = 5 mice/group。有意差なし、P = 0.9825、2-tailed unpaired Student's t-test. 成熟（CC1+；黒）または未熟（CC1-；灰）オリゴデンドロサイト系（OLIG2+）の細胞の平均割合 ± s.e.m. n = 5 mouse/group。有意差なし、CC1+。P = 0.7076、CC1-: i) 4.5ヶ月齢のFIRE+/+とFIREΔ/Δの脳梁の画像。後者では脱髄が始まり、中・大径の有髄軸索が緑のアスタリスクで示されている（マゼンタアスタリスク）。j) 平均有髄軸索数/mm2 ± s.e.m. n = 3 マウス/グループ。**p = 0.0042、2-tailed unpaired Student's t-test k) 生後3-4ヶ月の小軸索（0.6μm未満）または中大軸索（0.6μm以上）直径ビンあたりの平均ミエリン厚±s.e.m. n = 3匹/群。<0.6 µm：有意差なし、P = 0.8978; >0.6 µm：有意差なし。*l) FIREΔ/Δマウスにおける代表画像あたりの脱髄軸索の直径（0.7290μm）の平均値±s.e.m. n = 3マウス.

出典データ

Extended Data Fig. 7 成体におけるミクログリアの枯渇は、髄鞘形成亢進と脱髄を引き起こす。
a) 成体FIRE+/+マウスにCSF1R阻害剤PLX5622を2-3ヶ月齢まで飼料として与えた。 b) 3ヶ月齢のFIRE+/+マウスの普通食対PLX5622（PLX）食における脊髄膠のIBA1+細胞（マゼンタ）の代表画像である。スケールバー、25μm。 c) 3ヶ月齢のFIRE+/+マウスにおけるIBA1+細胞/mm2 ± s.e.m. の密度。n = 5匹の通常食マウスと3匹のPLX食マウス、 ***P = 0.0004, 2-tailed unpaired Student's t-test d) PLX投与後の2ヶ月齢〜3ヶ月齢の脳梁における多髄化の代表的画像。e) 生後2-3ヶ月のPLX投与による内舌の肥大（オレンジ）とミエリンの厚み（アスタリスク）の代表的な画像。f) 2〜3ヶ月齢のFIRE+/+マウスに通常食またはPLX食を与えたときの内舌の厚さ（μm）対軸索直径。***g) ミエリン厚さ（μm）対軸索直径（FIRE+/+マウス、生後2ヶ月から3ヶ月まで通常食またはPLX食） n = 100軸索/マウス n = 5マウス、PLX食3マウス。***h) 2-3ヶ月齢のFIRE+/+マウスのOLIG2（白）およびCC1（マゼンタ）を共発現する成熟オリゴデンドロサイトの画像（普通食またはPLX食）。スケールバー：75μm i) 2-3ヶ月齢のFIRE+/+マウスの通常食またはPLX食におけるOLIG2+ CC1+ cells per mm2 ± s.e.m.の平均値。有意差なし、P = 0.3645、2-tailed unpaired Student's t-test. オリゴデンドロサイト系（OLIG2+）の細胞のうち、成熟（CC1+；黒）または未熟（CC1-；灰色）± s.e.m. 3ヶ月時点での平均割合。有意差なし、CC1+。P = 0.3779; CC1-: j) 成体FIRE+/+マウスにCSF1R阻害剤PLX5622を5～6ヶ月齢まで食餌投与した。 k) PLX投与後の6ヶ月齢FIRE+/+マウスの脳梁における脱髄像（アスタリスク）5～6ヶ月齢まで。スケールバー：1μm l) 5-6ヶ月齢のFIRE+/+マウスの通常食とPLX食の平均有髄軸索数±s.e.m. n = 3マウス/グループ。**P = 0.0024、2-tailed unpaired Student's t-test.

ソースデータ

Extended Data Fig. 8 ALSP組織の特性評価。
a) ヒトALSPおよび年齢をマッチさせた非罹患対照前頭葉白質におけるLYVE1+（緑、上）およびIBA1+（マゼンタ）LYVE1+マクロファージの画像（下）。b）ヒトALSPおよび年齢をマッチさせた対照前頭葉白質におけるIBA1+ LYVE1+血管周囲マクロファージの（A）の点線輪郭の拡大画像。スケールバーは50μm。p = 0.1000, Mann Whitney test. d) ALSPおよび非罹患コントロールにおける、血管周囲マクロファージ（LYVE1+; 灰）またはミクログリア（LYVE1-; 黒）であるIBA1+細胞の平均割合 ± s.e.m.. n = 3 case/group.。**f) 対照群とALSP患者における平均舌内膜厚（μm）/軸索直径ビン n = 2 症例/群 g) 対照群とALSP患者における平均ミエリン厚（μm）/軸索直径ビン n = 2 症例/群

ソースデータ

Extended Data 図9 FIREΔ/Δマウスの単細胞RNAシーケンス解析。
(a）Fgfr3（アストロサイト）、b）Cd68（ミクログリア／マクロファージ）、c）Pdgfra（OPCs）、d）Gpr17（コミット型オリゴデンドロサイト前駆体）のオリゴデンドロサイト（Mbp）と他の細胞種の比較を示すフィルタリング前のデータセットのt-SNE（t分布確率的隣接埋め込み）プロットとサブセットのオリゴデンドロサイトを中心とした輪郭。(e-h) t-SNEプロットでは、各点は以下の基準で色分けされた細胞である。(e）カウントされたユニーク分子識別子（UMI）の合計、（f）ミトコンドリア遺伝子の割合、（g）検出された遺伝子の数、（h）フィルタリング。青色はその後の解析に残した細胞、オレンジ色は UMI とミトコンドリア遺伝子の割合に基づいてフィルタリングしたもので、閾値は方法を参照。(i) t-SNE プロット（バッチ補正なし）。各ポイントは、その起源バッチに従って色付けされた細胞である（黄色=3、紫=4、オレンジ=5、赤=6）。(j) fastMNNでバッチ補正を行った後のt-SNEプロット。各点は、その原点のバッチによって色分けされたセルである（黄=3、紫=4、オレンジ=5、赤=6）。(k) 近傍探索の数(k)を変更することで得られる4つの異なる解像度を持つクラスタリング。各解像度は別々のt-SNEプロットで表現されている。(l) clustree v0.4.4で作成したクラスタリングプロット。このプロットの各レベルは、細胞のクラスタリングに使用された異なる解像度を示す。線は以前のクラスタからの寄与を表し、円の大きさは細胞の数を表す。最終的なクラスタは、クラスタ2と6、クラスタ3と5（ピンクのボックス）を、k = 100（水色）のクラスタリングからマージすることによって得られたものである。

Extended Data 図10 TGFβ受容体操作によるミエリン健全性への影響。
a) 4-ヒドロキシタモキシフェン（OHT；100 mg/kg/日、P14-18）を投与し、P28で犠牲にしたTgfbr1fl/flおよびPLP-creERT；Tgfbr1fl/flマウスの脳梁におけるOLIG2+細胞によるTGFβR1発現（緑）像（マゼンダ）。b) Tgfbr1flマウスとPLP-creER;:Tgfbr1fl/flマウスにおけるOLIG2+細胞あたりの平均相対TGFβR1強度±s.e.m. n = 3マウス／グループ。*c) 野生型マウス（WT；緑）、Plp-creER;Tgfbr1fl/flマウス（マゼンタ）およびTgfbr1flマウス（青）における有髄軸索の平均数/軸索直径ビン±s.e.m. n = 3マウス/グループ．d) 野生型マウス（WT；緑）、Plp-creERT;Tgfbr1fl/flマウス（マゼンタ）、Tgfbr1fl/flマウス（青）における平均舌内厚（μm）/軸索径bin±s.e.m. n-3 mice/group. <0.3 µm WT vs. Plp-creERT;Tgfbr1fl/fl。*e) 野生型マウス（WT；緑）、Plp-creERT;Tgfbr1fl/flマウス（マゼンタ）およびTgfbr1flマウス（青）における平均ミエリン舌厚（μm）/軸索直径ビン±s.e.m. n = 3匹/グループ. <0.3 µm WT vs. Tgfbr1fl/fl。*1 μm以上 WT vs. Plp-creERT;Tgfbr1fl/fl **P = 0.0037 および Plp-creERT;Tgfbr1fl/fl vs. Tgfbr1fl/fl ***P = 0.0003, Sidakの多重比較検定付き2元配置分散分析. f) 無髄軸索平均数 ± s. e.m./axon diameter bin 3ヶ月齢のFIREΔ/Δマウスに、2ヶ月齢から3ヶ月齢までビヒクル対照またはSRI-011381塩酸塩を投与した場合の平均値。g) 3ヶ月齢のFIREΔ/Δマウスの軸索直径ビンごとの平均舌内厚（μm）±s.e.m.、2～3ヶ月齢にビヒクル対照またはSRI-011381塩酸塩で処理。0.5-1.0 µm。*P = 0.0334、>1 µm: ****h) 3ヶ月齢のFIREΔ/Δマウスに2ヶ月齢から3ヶ月齢までビヒクル対照またはSRI-011381塩酸塩を投与したときの平均ミエリン厚（μm）±s.e.m.／軸索径bin。0.5-1.0 µm。**P = 0.0027、>1 µm。****P < 0.0001、シダックの多重比較検定付き2元配置ANOVA。

出典データ

Extended Data 表1 ヒト組織解析による臨床情報
フルサイズの表
補足情報
報告書概要
ピアレビューファイル
補足表1
FireΔ/ΔマウスでOligo1に濃縮された差次的発現遺伝子。Oligo1オリゴデンドロサイトクラスターと他のオリゴデンドロサイトクラスターで濃縮されている遺伝子。P値（p_val）、平均log2（fold change）（avg_Log2FC） 、Oligo1の細胞割合（pct.1）、他のオリゴデンドロサイトクラスターの細胞割合（pct.2）を記載した。

補足表2
オリゴ1の上流制御因子候補。ingenuity pathway analysis (IPA)を用いて予測されたOligo1差分発現遺伝子の上流制御因子の上位に、分子タイプ、重複のP値、データセット中の標的分子を示した。

ソースデータ
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この記事の引用
McNamara, N.B., Munro, D.A.D., Bestard-Cuche, N. et al. Microglia regulate central nervous system myelin growth and integrity（ミクログリアは中枢神経系のミエリンの成長と完全性を制御する）. Nature (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05534-y

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受付終了
2021年6月9日

受理済
2022年11月05日

掲載
2022年12月14日発行

DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05534-y