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膣内好中球の浸潤は卵巣周期に依存し、病原体の感染には依存しない

哉百名

ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Immunol., 2022年12月08日
Sec. 粘膜免疫
https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1031941
膣内好中球の浸潤は卵巣周期に依存し、病原体の感染には依存しない
M. C. Latorre1、C. Gómez-Oro1、I. Olivera-Valle1、E. Blazquez-Lopez2、J. Gallego-Valle3, A. Ibañez-Escribano4, P. Casesnoves1、C. González-Cucharero1、M. A. Muñoz-Fernandez5、L. Sanz6、J. Vaquero2、P. Martín-Rabadań7, F. Perez-Milan1,8*†‡ and M. Relloso1*†‡ 1.
1スペイン・マドリッド、グレゴリオ・マラニョン衛生研究所、免疫再現研究室
2肝臓・消化器病センター、グレゴリオ・マラニョン総合病院、肝疾患・消化器病センター（CIBEREHD）、カルロス3世医学研究所（ISCIII）、マドリード、スペイン
3スペイン・マドリード、グレゴリオ・マラニョン衛生研究所、免疫制御研究室
4マドリード・コンプルテンセ大学農学部微生物学・寄生虫学教室（スペイン、マドリード
5グレゴリオ・マラニョン衛生研究所分子免疫学研究室（スペイン・マドリッド
6生物医学研究所分子免疫学ユニット、ウニベルシタリオ・プエルタ・デ・ヒエロ・マジャダホンダ病院、マドリード、スペイン
7スペイン、マドリッド、グレゴリオ・マラニョン総合病院（HGUGM）、臨床微生物学および感染症科サービス
8スペイン、マドリッド、グレゴリオ・マラニョン総合病院、産科・婦人科病棟




女性の生殖管の粘膜は、常在微生物叢の存在と外来精子の通過、および性感染症の病原体の除去を調和させる必要がある。膣では、好中球が自然免疫の主要な細胞軍であり、感染症や傷害に反応して防御の第一線を構成している。排卵期には、精子が受精できるようにするためか、好中球は膣内腔に存在しない。しかし、攻撃に応じて膣への好中球流入を制御するメカニズムについては、依然として議論のあるところである。我々は、マウスの人工授精とNeisseria gonorrhoeae、Candida albicans、Trichomonas vaginalis、HSV-2モデルへの感染を用いた研究を行った。膣粘膜への好中球の浸潤は、卵巣周期の位相に明確に依存し、精子や病原体のチャレンジとは無関係であることを示し、おそらく精子が好中球に攻撃されるのを防ぐためであると考えられる。好中球の血管外遊出は、内皮細胞のセレクチン（E、P、L）やインテグリンを介した接着を含む多段階のイベントカスケードである。我々は、子宮頸部内皮細胞がセレクチンE（SELE, CD62E）を発現して好中球の動員を促進し、排卵期にエストラジオールがSELEの発現を低下させ、好中球の内皮移動と精子耐性を制御することを見いだした。プロゲステロンがSELEの発現を上昇させ、排卵後の監視体制を回復させた。

図解抄録
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(A) 好中球は、正常な修復の一部として、微生物叢の調節として、あるいは炎症刺激がない場合の免疫監視として、概日リズムに従って組織に浸潤している。(B）腸、肝臓、白色脂肪組織など、概日リズムに依存しない組織浸潤もある。しかし、炎症性シグナルは組織における好中球の血管外遊出をアップレギュレートする。子宮頸部組織は、炎症刺激がない場合（発情期2〜4日）、好中球の免疫監視と常在微生物叢のバランスを一定に保つために、例外的に高い持続的な好中球浸潤を仲介している。しかし、発情期（12〜20時間）と排卵期（12〜20時間の暗期）には、エストラジオール（C）は膣粘膜からの好中球の撤退（D）を誘導し、STI発症に影響を与える可能性と引き換えに繁殖に有利な防御を行う。驚くべきことに、膣チャレンジは、膣内における好中球数の多い時期（発情期）にも少ない時期（発情期）にも好中球の浸潤を増加させないことがわかった。

はじめに
性的接触により、多種類の細菌、ウイルス、真菌、寄生虫が感染する。これらのうち、いくつかの病原体は人口に膾炙しているが、現在治療可能なものは一部であり（Treponema pallidum、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Trichomonas vaginalis）、その他のものは対症療法しかできない不治のウイルス感染症（Hepatitis B virus（HBV）、Herpes simplex virus（HSV）、Human immunodeficiency virus（HIV）、Human Papillomavirus（HPV））である。性感染症（STI）や微生物耐性菌の感染例は年々増加し（CDC STDサーベイランス）、STIは生殖年齢人口に大きな影響を与え、感染そのもの以外にも圧倒的な経済効果、労働時間の損失、深刻な健康被害（不妊症）をもたらしています（WHO STIサーベイランス 2015）。実際、世界保健機関（WHO）は、あらゆる予防努力にもかかわらず、世界中で毎日100万人以上がSTIを獲得していると推定しています。したがって、より効率的な予防戦略を設計するために、STIの原因となる病原体と宿主の免疫反応との相互作用を理解することが、満たされていないニーズとなっています。

女性の生殖管は、月経周期において性ホルモンの影響を非常に受けやすい。月経周期は、(a) 卵胞期（マウスでは前駆期）、(b) 排卵期または発情期、(c) 黄体期（発情期）の3つの主要段階から構成されており、このうち、卵胞期（マウスでは前駆期）と黄体期（発情期）は、女性の生殖管が影響を受ける。エストラジオール（E2）は前駆期に増加し、発情期にピークに達し、発情期の終わりには徐々に低下する。排卵後、プロゲステロン（P4）の値はピークに達し、発情期には低下します。月経周期中のホルモンレベルの変動は、膣内腔の主要な貪食免疫細胞である好中球を含む組織常在白血球(1-4)によく影響を与える。

好中球は、侵入してきた細菌（5）、単細胞性寄生虫（6）、真菌（7）に対する自然免疫反応に不可欠な存在である。白血球の異常な動員は組織損傷や炎症性疾患の原因となるため、定常状態では、好中球の輸送は概日リズムによって厳密に制御されている(8)。しかし、感染症や傷害に応答して、好中球は病原体を除去するために炎症部位に急速に動員される(9)。好中球の組織への動員には、内皮細胞壁を介した接着と遊走が必要である。最初のプロセスは好中球のローリングであり、これはPSGL-1とCD44がEC上の内皮セレクチンEとP（SELEとSELP）に結合することから始まり、EC上での好中球のローリングを媒介する。これに続いて、ECのインテグリン（ICAM1およびVCAM1）と好中球のリガンド（CD11aおよびCD49d）がしっかりと相互作用し、最終的に組織への血管外移動を可能にします［レビューについては（10）］。膣内腔は通常、膣の免疫監視とSTI保護を維持するために好中球を含んでいます。重要なことは、外来精子を殺すのに非常に効率的な好中球が、排卵期には膣内腔から消失し、外来精子の生存と通過を容易にするということです（11、12）。排卵期の膣粘膜がどのように病原体に対処し、精子の質を傷つけ不妊の原因となりうる炎症反応を回避しているのか（13, 14）については、まだ不明である。我々は、好中球が性ホルモンによって制御されながら、感染刺激や授精とは無関係に膣内腔に構成的かつ高度に動員され、STI発症のリスクを高めるという代償を払ってでも生殖にグローバルに有利に働くことを明らかにした。

材料と方法
動物、膣細胞診、およびin vivoホルモン処理
IiSGM動物愛護使用委員会およびComunidad de Madridは、すべての動物手順を承認した（PROEX-188/18および198/19）。

8週齢の雌BALB/c（H-2d）マウスは、IiSGMの動物施設において、特定の病原体を含まない、12時間の明暗、温度と湿度が制御された条件下で、環境エンリッチメントを用いて維持された。卵巣周期のステージを決定するために、5μLのPBSを膣の入り口に静かに置き、流し、採取し、光学顕微鏡で観察した(15)。

雌の卵巣周期を模倣するため、あらかじめホルモンで処置したマウスを麻酔下で両側卵巣摘出した(16)。2週間の回復後、雌に、100μlのゴマ油（Sigma-Aldrich、米国）に溶解した0.006mgの17β-E2（Calbiochem、ドイツ）を48時間皮下注射した。その後、マウスを0.2mgのP4（Calbiochem, Germany）または17β-E2で12時間処理した。その後，マウスに20μlのPBS中2×106個のC. albicans blastoconidiaを膣内にチャレンジさせた（17, 18）。最後に、12時間後に膣サンプルを採取した。

微生物の培養
Candida albicans (ATCC® MYA2876™)株は、実験前にSabouraud dextrose chloramphenicol agar plate (Conda, Spain) で30℃にて一晩培養した (19)．Trichomonas vaginalis（ATCC®C-1：NIH）は、実験に先立ち、TYM培地上、37℃、5％CO2雰囲気で48時間培養した(20)。Neisseria gonorrhoeae (ATCC® 700825™) はCG寒天培地にて35-37℃、5% CO2雰囲気で48時間培養した(21)。HSV-2 333株のストックを調製し、Vero細胞（ATCC® CCL-81™, Manassas, VA, USA）でのプラークアッセイにより滴定し、-80℃で保存した(22)。

精子の採取
マウスの精子は CD1 Crl : CD1(ICR) (outbred) 精巣から採取した (16).

膣および腹膜への接種
概日リズムを制御するため、発情終了（12〜20時間暗期）および発情開始（12〜20時間明期）である暗期終了時（点灯1時間前）に膣塗抹によりマウスを選択した。マウスは膣（20μl）または腹膜（100μl）にPBSまたはPBS単独で淋菌（2×106 ufc）（21），Trichomonas vaginalis（2×106 trichomonads）（20），Candida albicans（2×106 ufc）（19），マウス精子（2×106）（11，16，18）またはHSV-2（2×104 pfu）（22）を植え付けた．2時間後にマウスを屠殺し、膣内塗抹標本でホルモンの状態を確認した。

膣分泌物および腹膜分泌物の採取
腹膜腔に5mlのPBSを流し、腹膜細胞を採取した(23)。膣分泌物は、50μlの滅菌PBSで膣を4回洗浄し、穏やかに採取した（16, 19）。いずれの場合も、洗浄した培地を遠心分離し、PBS 5%FBSに再懸濁し、細胞を4℃で回収して解析に用いた。

フローサイトメトリーによる細胞表現型解析
細胞表現型の解析は、以下の抗体を用いて直接免疫蛍光法で行った。CD11b M1/70 (eBioscience), Ly6g 1A8 (eBioscience) F4/80 BM8 (Biolegend), MHCII 2G9 (Biosciences), NK1. 1 S17016D (Biolegend), CD3 145-2C11 (eBioscience), CD31 390 (Biolegend), αSMA (α smooth muscle actin) 1A4 (eBioscience), CD62-E REA369 (Miltenyi Biotec), CD62P RMP-1 (Biolegend), CD54 (Biolegend), CD106 (Biolegend), CD192 (CCR2) REA538 (Miltenyi Biotec).CD514 (バイオサイエンス), CD515 (Biolegend), CD6152 (生物化学), CD5152 (CD5502) (生物化学),CD61 (バイオサイエンス),CD63 (バイオサイエンス), CD63 (生物化学) , PSGL-1 34 RA10 (Thermofisher), CD44 IM7.8.1 (Miltenyi Biotec), CD11a 121.7 (Thermofisher), CD49d 9C10 MFR4.B (Biolegend). すべてのインキュベーションは、50μg/mlのマウスIgGまたはヒトIgGの存在下で行われた。陰性対照として常に同じアイソタイプコントロール抗体を含み、死細胞はアネキシンV染色（Sigma, USA）により除外した。フローサイトメトリーは10色ガリオス装置（Beckman Coulter, USA）を用いて行い，Flow-Count蛍光球（Beckman Coulter, USA）を用いて，製造者の指示に従って細胞をカウントし，Flowjoソフトウェア（Tree Star, Inc, USA）を用いてデータを分析した．

共焦点顕微鏡検査
FRT 組織を Tissue-Tek OCT（Sakura, Netherlands）に包埋した。切片をアセトンで固定し、ブロック（50μg／mlマウスIgGおよび10％BSA）し、そして染色した。Ly6g 1A8 (Biolegend), F4/80 BM8 (Biolegend), MHCII 2G9 (BD Biosciences), CD31 2H8 (Invitrogen), α-SMA 1A4 (eBioscience), CD62-E (BD Bioscience), CD62P REA344 (Miltenyi Biotec), ICAM-1 M-19 (Santa Cruz Biotechnology), CD106 429 (Miltenyi Biotec). タンパク質発現の定量化のために、組織は共焦点蛍光顕微鏡（SPE、Leica Microsystems）のグリセロールACS APO 20x NA 0.60 対物レンズを用い、各サンプルおよびサンプル間で取得設定をずっと維持しながら、以前に説明したように画像化した（19）。平均蛍光強度（MFI）は、グリセロールACS APO 63x対物レンズを使用して、フィールドごとに複数の関心領域（ROI）で評価し、FRTの静脈床の特定の領域でランダムに描出された。すべての定量化は、FIJI（Fiji Is Just ImageJ）ソフトウェア（NIH）を用いて行った。

好中球の枯渇
好中球を枯渇させるために、200mgの抗マウスLy6G-1A8（Bio-X-Cell, EE.UU.）を0，1mlのPBSで静脈内投与した(17)。

ESR阻害剤とP4処理
雌のBALB/cを発情期に選択し、E2受容体（ESR）阻害剤としてFaslodex（AstraZeneca）（250mg）、P4処理としてProlutex（IBSA）（25mg）を100μl皮下投与した。その後、12時間後にマウスを犠牲にし、FRT組織を共焦点顕微鏡で解析した。

SELE阻害剤
In vivoでのSELE遮断発現は、200mgのラットモノクローナル抗マウスSELE抗体（9A9）または対照アイソタイプ抗体（Bio-X-Cell、米国）を12時間前に0.1ml PBS滅菌で静脈内投与することにより行った(24)。内皮細胞におけるSELEの遮断は、抗マウスCD62-E-REA369抗体（Miltenyi Biotec）を用いた共焦点顕微鏡により確認した。

統計解析
各実験における処理間の有意性を決定するために使用した検定は、図の説明文に記載されている。統計解析には、GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc, USA)を使用した。p値<0.05を統計的に有意とした。

結果
定常状態における膣内好中球の浸潤は卵巣周期の位相に依存する
正常（非感染）マウスの膣内腔の免疫細胞および腹膜細胞を10色フローサイトメトリーで調べた（図1A）。その結果、膣内腔の免疫細胞は好中球（CD11B+, LY6G+, F4/80-, CCR2-、補足図1A；補足表1）が優勢であり、膀胱や腹膜ではほとんど存在しないことと対照的であることがわかった（図1B；補足図1B）。しかしながら、膣内腔の好中球は月経周期に伴ってその量が変化した。前駆期（12〜20時間）の明期には、膣内腔の好中球は減少するが、発情期（12〜20時間）の暗期には膣内腔から好中球が消失し、その末期にゆっくりと組織に浸潤し始める。その後、再び発情期（12〜20時間）の明期になると、好中球は膣組織および内腔に高度に浸潤する（発情期I〜11倍、発情期II〜17倍）。次に、発情期（2〜4日）には、膣内腔の好中球数は非常に多くなる（〜35倍）（図1C；補足図1C）。そこで、膣内腔の常在免疫細胞を決定することができる標準的なゲーティング戦略（25, 26）を用いた（27）。その結果、定常状態では、好中球は膣内腔に構成的に多く動員され、それは卵巣周期の位相に大きく影響され（28）、概日リズムとは無関係であることが確認された。

図1
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図1 フローサイトメトリーによる膣内腔免疫細胞の解析。(A) フローサイトメトリーによるゲーティング戦略。骨髄系細胞の解析。A: ドットプロットは、CD11b陽性と高いSSC特性に基づいて骨髄系細胞を同定するゲーティング領域（R1）を示している。B: M1、M2、PMNおよびDCを選別するためのf4/80およびMHC-IIに基づくゲートを示すプロットである。それらの集団は、Ly6G、Ly6C、CD11c、CCR2マーカーによってさらに特徴づけされた（CおよびD）。リンパ系解析：E: f：CD3とNK1.1に基づくゲートにより、リンパ球、NKおよびNKT細胞を分類したプロット。(B）フローサイトメトリーによる、未刺激雌マウスの膣および腹膜洗浄液中の明確な免疫細胞の同定。データは箱ひげ図10-90パーセンタイルで表した（1群あたりn=8〜10匹のマウス）。(C)成体雌マウスを膣塗抹により選択した。腹腔および膣における卵巣周期中の免疫細胞頻度を積み重ねた棒グラフ表示（データは補足図1Cより）。(D) 発情期および発情期の成熟雌マウスを膣塗抹により選択し、膣または腹腔内に精子を2時間チャレンジさせた。データは箱ひげ図10-90パーセンタイルで表した（1群あたりn=8から12匹のマウス）。p＜0.05、p＜0.01およびp＜0.001。Mann-Whitney検定。PerC、腹膜腔；Mac、マクロファージ；M1、炎症性マクロファージ；M2、常駐マクロファージ；PMN、好中球多形核；DC、樹状細胞；NK、ナチュラルキラー；T Lym、Tリンパ球；NKT、ナチュラルキラーT細胞；Die、Diestrus；Pro、Proestrus；Est、Estr；Me I、Mestrus I および Me II、Mestrus II.

膣内好中球の流入は授精に依存しない
我々は、精子チャレンジが膣内腔への好中球の流入を誘発するかどうかを検討した。注目すべきは、授精したマウスと授精していないマウスの間に有意な差が見られなかったことである。膣内腔の好中球数は発情期には同様に少なく、発情期には同様に多かった（図1D）。接種量を検証するために、腹腔内の精子でマウスにチャレンジした。同じ用量の精子チャレンジは、非チャレンジマウスと比較して、発情期（〜200倍）および発情期（〜80倍）において腹膜への好中球流入の有意な増加を誘発した（図1D）。これらの結果から、腹膜とは対照的に、膣内腔の好中球量は卵巣周期の位相にのみ依存し、授精には影響されないことが明らかとなった。我々のデータは、排卵期には膣から好中球が消失し、精子は急激な好中球の流入を誘導しないことを指摘した。

膣内の好中球の流入は、局所的な微生物による攻撃とは無関係である
病原体が膣内腔への好中球の急速な流入の波を引き起こすかどうかを調べるために、マウスに膣内で細菌N. gonorrhoeae、原虫T. vaginalis、または真菌病原体C. albicansをチャレンジした。2時間後、膣内腔の好中球数は、チャレンジしたマウスとチャレンジしていないマウスの膣内腔では、発情期には同様に少なく、発情期には同様に多かった（図2A-C）。注目すべきは、N. gonorrhoeae、T. vaginalis、C. albicansの同じ接種液を腹腔内投与すると、発情期および発情前期に非チャレンジマウスと比較して腹腔内の好中球流入が著しく増加した（それぞれ〜40倍、〜350倍、〜200倍）点である。さらに、5倍高い濃度の病原体を膣からチャレンジしたマウスでは、発情期の膣内好中球の浸潤も検出できなかった（図2A-C）。我々のデータは、膣内の好中球の存在は、卵巣周期の位相にのみ依存し、N. gonorrhoeae、T. vaginalis、C. albicansの存在とは無関係であることを示していた。

図2
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図2：病原体チャレンジ後の膣内腔および腹腔内の好中球。成熟雌マウスを膣塗抹で選別し、(A) 淋菌、(B) トリコモナス膣炎、 (C) カンジダ・アルビカンスおよび (D) HSV-2を膣または腹腔内にチャレンジさせた。好中球の数はフローサイトメトリーで解析した。データは少なくとも3回の実験（各群n=8マウス）で算出し、箱ひげ図10-90パーセンタイルで表現した。p＜0.01および*p＜0.001、Mann-Whitney検定。PerC、腹膜腔；Vg．Lav, 膣洗浄、Ng, Neisseria gonorrhoeae、Tv, Trichomonas vaginalis、Ca, Candida albicans ns, non significant.

次に、HSV-2のような性感染症ウイルスが、差のある反応を引き起こすかどうかを検討した。ここでも、HSV-2チャレンジマウスと非チャレンジマウスの間で膣内腔の好中球数の差は検出されず（図2D）、病原体チャレンジも膣白血球流入の卵巣周期パターンを変更しないことを示唆した（補足図2A, B）。

発情期は頸管外組織への好中球の動員を阻止する
発情期の膣内腔への好中球流入の阻害は、血管外遊出の減少または経粘膜移動の阻害に起因している可能性がある。我々は、この2つの可能性を区別するために、発情期および発情後マウスの膣組織中の好中球数をフローサイトメトリーおよび子宮頸部切片で解析した(19)。その結果、発情期の膣組織、子宮頸部上皮（〜20倍）および間質（〜7倍）において、それぞれの発情期サンプルと比較して低い（〜10倍）好中球数が検出された。注目すべきは、淋菌またはC. albicansに感染したマウスでは、発情期と発情期の子宮頸部好中球数は非感染マウスと同程度だったことである（図3A, B）。これらのデータから、子宮頸部組織における好中球の存在は、卵巣周期の位相にも依存し、病原体の存在とは無関係であることが示された。さらに、発情期には間質または上皮に好中球が集積しないことから、上皮移行が阻害されるのではなく、血管床からの動員力が低下することが、潜在的な作用機序として指摘された。そこで、毛細血管および静脈床の数を評価したところ、発情期および発情後の子宮頸部組織で同程度であった（図3C）。しかし、静脈床に付着する好中球の数は、発情期に比べ、中旬期に多く（〜4倍）なっていた（図3D）。これらのデータは、発情期には子宮頸管の血管床からの好中球の動員は減少することを示唆し、これは発情期の膣内腔の好中球の存在度が低いことと矛盾しない。そこで次に、月経周期による好中球-内皮細胞（EC）相互作用の調節に注目した。

図3
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FIGURE 3 卵巣周期中の子宮外頸部の好中球。成熟雌マウスを膣内塗抹により選択した。(A) フローサイトメトリーによる膣組織内の好中球の数。(B) 発情期および発情期マウスの子宮外頚部の顕微鏡写真。モックまたはNeisseria gonorrhoeaeまたはCandida albicansにチャレンジした発情期および発情前期マウスの頸部上皮および間質中のLy6g+細胞（好中球）。データは各サンプルの少なくとも3つの異なるセクションで計算された。(C）発情期および発情後マウスの子宮外膜における血管および静脈床の染色写真と定量化。(D)血管・静脈床の好中球内付着の定量化。データは箱ひげ図10-90パーセンタイルで表した（n=5-6マウス/群）。*p < 0.05、**p < 0.01、ns p > 0.05 Mann-Whitney。スケールバー, 50 µm. Est, Estrus; Metest, Metestrus; αSMA, α平滑筋アクチン; Ep, epithelium; St, Stroma; Ng, Neisseria gonorrhoeae および Ca, Candida albicans.

膣組織内皮細胞における好中球接着分子発現の卵巣周期調節機構
好中球のPSGL-1、CD44、CD11a、CD49dの発現は強い概日振動を示し、その結果、夜間に白血球-内皮相互作用と遊走過程の有効性が増加する（8、29）。我々は、マウスの同じ日周時間におけるPSGL-1、CD44、CD11a、CD49dの発現が（8, 29）、発情期と発情期で同程度であることを確認し（補足図3A）、このことは、採用の差は内皮の変化と関連しているかもしれないと示唆するものである。次に、発情期と発情後の頸部静脈床のECにおけるICAM1、VCAM1、SELP、SELEの発現を評価した。共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーで評価したところ、SELEのみが頸部静脈床のECで発現の差を示した（発情期では約3倍）（図4A-C；補足図3B、C）。発情期のSELE（24）を遮断すると、頸部外側の静脈床の好中球の数が減少した（図4D）。次に、発情期と発情期のSELE発現の違いは、静脈床への好中球の付着に起因するのかどうかを検討した。しかし、好中球を除去した後（11）でも、発情期よりも中間期の方が静脈床にSELEの高い発現が検出された（補足図3D）。したがって、ECにおけるSELEの発現は、好中球の付着とは無関係に、発情期の好中球の血管外遊出に重要な役割を果たす可能性があると結論づけた。

図4
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図4 子宮外膜静脈床におけるSELEおよびSELPの発現。成熟雌マウスを膣内塗抹標本で選択した。(A) 発情期および発情期マウスの子宮外頸部におけるSELPまたはSELEを染色した血管および静脈床の顕微鏡写真と定量化。(B）発情期および発情後マウスの子宮外頚部に染色した（A）静脈床の内皮細胞SELEの黄色い四角の写真と発現の定量化。AとBのデータは、各サンプルの少なくとも3つの異なるセクションで計算した（n=6マウス/グループ）。(C）膣静脈内皮細胞におけるSELPまたはSELE発現のフローサイトメトリー平均MFI（n＝6マウス／群）。(D)抗SELE処理マウス。内皮細胞におけるSELE発現と静脈床における好中球の腔内接着の定量化。 (E) ホルモン投与卵巣摘出マウス。内皮細胞におけるSELEの発現と静脈床における好中球の内腔内接着の定量化。 (F) ESR1阻害剤ファスロデックス（250 mg）またはP4プロルテックス（25 mg）投与による有精子症マウス。P4またはE2阻害剤で処理した前駆期マウスの内皮細胞におけるSELE発現の定量化。データは箱ひげ図10-90パーセンタイルで表した（n=5-6マウス/群）。*p < 0.05 および **p < 0.01 Mann-Whitney。Est, Estrus; Metest, Metestrus; E2, Estradiol; P4, Progesterona; Vh, Vehicle; Endo. cells, Endothelial cells and A.U., arbitrary units.性的ホルモンによるSELE発現の調節は、SELEの発現を調節する。

性ホルモンによる子宮頸部内皮細胞におけるSELE発現の制御
我々のデータは、SELEの発現が卵巣周期中の子宮頸部好中球の血管外遊出の主要な制御因子である可能性を世界的に示唆した。卵巣周期を模倣し、性ホルモンが子宮頸部のSELE発現を制御しているかどうかを評価するために、卵巣摘出マウスをE2とP4で連続的に処理しました（17）。その結果、E2/P4投与マウスの静脈床のSELE発現はE2/E2投与マウスよりも高く（約2倍）、好中球数も多かった（図4E）ことから、E2がSELE発現を抑制し、P4が促進することが示唆された。この2つの可能性を区別するために、安楽死の12時間前にFaslodex（ESR1阻害剤）またはProlutex（P4）で発情期のマウスを処理した。このことから、子宮頸部の静脈性ECにおけるSELEの発現は、発情期にはESR1を介したE2によってダウンレギュレートされ、発情期にはP4によってアップレギュレートされることが示唆された（図4F）。

考察
本研究では、マウスの膣への好中球流入は、感染症や精子の存在にかかわらず、もっぱら卵巣周期の段階に依存していることを明らかにした。正常な状態では、子宮頸管組織は非常に高い好中球の連続的な浸潤を媒介した。しかし、排卵期には、E2が子宮頸部組織の静脈性EC上のSELEの発現を低下させることによって好中球の滲出を抑制し、免疫防御よりも生殖を優先させた。排卵後、P4はSELEの発現をアップレギュレートし、免疫監視機能を回復させた。これらの卵巣周期に依存した変化はすべて、様々な微生物の侵入や精子の存在とは無関係であり、その影響も受けなかった。

好中球は、骨髄からの放出が多いため、日中に血中で増加する。夜間は、組織（脾臓、肺、皮膚、骨格筋、リンパ節、腎臓、心臓など）に日常的な修復、微生物叢の調節、あるいは炎症刺激がない場合の免疫監視の一部として浸潤するため、循環好中球は減少する(29)。したがって、ほとんどの組織では、その静脈床のECにSELP、ICAM-1、VCAM-1がほとんど発現していないが、それらの発現は夕方にピークに達し、監視、修復、死のために古い好中球の組織ホーミングをわずかに増加させる（8, 30）。同様に、ECは正常な状態ではSELEを発現しないが、炎症性シグナルによって発現が上昇し、好中球の血管外遊出を促進したり（31-34）、ECを介して好中球を誘導したりする（35）。子宮頸管粘膜は、生殖の成功と膣の免疫学との調和に重要なユニークな部位である。重要なことは、常在菌の微生物相を制御し、不妊を誘発する性感染症や日和見病原体から保護しなければならないことである(36)。他の組織とは対照的に、子宮頸部静脈床のECでは、SELE、SELP、ICAM1、VCAM1が高い構成的発現を示し、基礎条件において例外的に高い好中球の連続浸潤が確認された。したがって、膣内腔および頸部組織への好中球浸潤は、腸、肝臓、白色脂肪組織のように概日リズムとは無関係であった(37)。それにもかかわらず、好中球は病原体に対する好中球免疫監視を常に維持し、常在菌の微生物相バランスを制御するために膣内腔に大量にリクルートされるのである。

膣内の構成的に高い好中球含有量は精子の質を害する可能性があるが（11、12）、卵巣周期の排卵期には頸管粘膜は精子が泳ぎ上がることを許容しなければならない。SELEを発現していないECでは好中球がしっかりと停留しないことはよく知られている(38)。ここでは、排卵期において、好中球はSELEを発現していないEC上ではしっかりと停止しないため（38）、E2はE2受容体（ESR1）を介して静脈ECのSELE転写をダウンレギュレートし（39）、好中球の膣内腔への侵入を防ぐと推測されます（11）。そして、黄体期初期にP4がピークを迎え、ESR1の作用を阻害することにより、おそらくSELEの発現をアップレギュレートし、速やかに好中球の流入をリフレッシュして免疫力を回復させるのである。

ヒト組織における我々の知見の評価は、標準的な方法で感染症を評価する適切なモデルがないこと、また、すでに感染症が成立する前の早期の段階でサンプルを入手することが困難であることから、限界があります。ヒトとマウスの違いはあるものの、膣内腔への好中球流入は排卵期を除いて排卵周期期にのみ依存し、非感染マウスでは高かったことから、感染状態では組織への好中球流入が早く、多くなるという現在の普遍的なモデルに対して、我々の結果は疑問を投げかけている。これらの好中球浸潤の変化は、概日リズムや精子や感染性物質への曝露の影響を受けなかった。排卵期には、好中球は生殖機能を損なわないように子宮頸管粘膜から退却した。したがって、膣のSTI（40）に対する基本的な粘膜保護自然戦略は、精子と共存し、膣のエストロゲン依存性分泌環境（41）を作り出すように進化してきたのである。臨床的には、ホルモンの異常は好中球による精子の攻撃による不妊の原因となり、STDに対してより脆弱にすることで膣の免疫力を低下させる可能性がある。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著は、論文／補足資料に含まれています。その他のお問い合わせは、対応する著者にお願いします。

倫理に関する声明
この動物実験は、The IiSGM Animal Care and Use CommitteeおよびComunidad de Madridの審査・承認を受けた。

著者による貢献
MRは本研究を構想した。ML, CG-O, IO-V, EB-L, JG, CG-C, PCが実験を実施した。AI-E、MM-F、PM-Rは病原体感染実験、試料採取、主要試薬、プロトコルの作成に協力した。データの解析はML、FP-M、LS、MRが行った。MRは原稿を執筆し、ML、AI-E、MM-F、JV、LS、PM-Rは原稿を修正した。提出された原稿は全著者によって承認された。

資金提供
この研究は、欧州委員会からの欧州連合基金、"A way of making Europe "とIiSGM学内助成II-PI-MRC-2017によって共同出資された経済産業省ISCIII-FIS補助金（PI19/00078とPI19/00132）によって部分的に支援されました。MLはIiSGM学内契約を締結している。

謝辞
フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡、細胞培養、統計解析のユニットに感謝する。J. Villarejo, P. Sanchez-Mateos, F. Asensio, F. Sanchez-Cobosの専門家の協力と支援に感謝します。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係のない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしもその関連組織のもの、あるいは出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1031941/full#supplementary-material でオンライン公開されています。

補足図1｜(A) 受精卵マウスの膣内塗抹標本の光学顕微鏡による写真。矢印は好中球を示す。 B）未刺激雌マウスの膀胱洗浄液中の明確な免疫細胞の同定。(C) 成体雌マウスを膣塗抹標本で選択。腹膜腔および膣洗浄液中の卵巣周期中の免疫細胞の頻度。データは箱ひげ図10-90パーセンタイルで表した（n=8〜10匹/群）。*p<0.05. Mann-Whitney。PerC、腹膜腔；M1、炎症性マクロファージ；M2、常在マクロファージ；PMN、多形核；DC、樹状細胞；NK、ナチュラルキラー；T Lym、Tリンパ球；Die、発情期；Pro、発情期；Est、発情；Me I、発情I、およびMe II、発情II

補足図2｜成熟雌マウスを膣塗抹で選別し、膣内または腹腔内で（A）淋菌、（B）HSV-2にチャレンジした。細胞数はフローサイトメトリーで解析した。データは少なくとも3回の実験で算出し（各群n=8マウス）、箱ひげ図10-90パーセンタイルで表現した。p>0.05、p<0.01およびp<0.001、Mann-Whitney。PerCは腹腔、NgはNeisseria gonorrhoeae、Spは精子。

補足図3｜成熟雌マウスを膣内塗抹で選択した。(A）発情期および中間期マウスの血中好中球におけるPSGL-1、CD11A、CD44およびCD49dの発現のフローサイトメトリー解析。(B）VCAMおよび（C）ICAM-1で染色した発情期および発情前期マウスの静脈床の共焦点顕微鏡写真とフローサイトメトリー解析。(D）好中球枯渇マウス（抗Ly6g IV投与）におけるSELE発現。発情期および発情後マウスの静脈床におけるSELE発現の共焦点顕微鏡による解析。データは箱ひげ図10-90パーセンタイルで表した（n=5-6マウス/群）。**p<0.01 Mann-Whitney。スケールバー、50 µm。Ep, epithelium; St, Stroma; Est, Estrus; Metest, Metestrus; Endo. cells, Endothelial cells, A.U., arbitrary units.

補足表1｜調査した細胞集団を定義するために使用したマーカーのまとめ。

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引用 Latorre MC, Gómez-Oro C, Olivera-Valle I, Blazquez-Lopez E, Gallego-Valle J, Ibañez-Escribano A, Casesnoves P, González-Cucharero C, Muñoz-Fernandez MA, Sanz L, Vaquero J, Martín-Rabadań P, Perez-Milan F and Relloso M (2022) Vaginal neutrophil infiltation is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front. Immunol. 13:1031941. doi: 10.3389/fimmu.2022.1031941

Received: 2022年8月30日; Accepted: 2022年11月17日
公開：2022年12月8日

編集者

キャサリン・メアリー・オコネル（ノースカロライナ大学チャペルヒル校、アメリカ合衆国
査読者：Karthika Rajeeve, University of North Carolina at Chapel Hill, United States:

Karthika Rajeeve, Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology, India（インド、ラジブ・ガンジー・バイオテクノロジーセンター
Morgane Bomsel, 国立科学研究センター(CNRS), フランス
Copyright © 2022 Latorre, Gómez-Oro, Olivera-Valle, Blazquez-Lopez, Gallego-Valle, Ibañez-Escribano, Casesnoves, González-Cucharero, Muñoz-Fernandez, Sanz, Vaquero, Martín-Rabadań, Perez-Milan and Relloso. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されています。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*Correspondence: M. Relloso, miguel.rellosoc@salud.madrid.org; F. Perez-Milan, federicom.perez@salud.madrid.org

これらの著者は最終的な著者名を共有しています。

‡ORCID: F. Perez-Millan, or. Perez-Millan, orcid.org/0000-0002-5320-3739
M. Relloso, orcid.org/0000-0002-9181-2244

免責事項：本記事で述べられているすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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