腸内細菌叢による二次胆汁酸は、マウスのTGR5-cAMP-PKA-NF-κB/NLRP3経路を介して黄色ブドウ球菌誘発性乳房炎を緩和させる

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公開日：2023年2月8日
腸内細菌叢による二次胆汁酸は、マウスのTGR5-cAMP-PKA-NF-κB/NLRP3経路を介して黄色ブドウ球菌誘発性乳房炎を緩和させる

https://www.nature.com/articles/s41522-023-00374-8

Caijun Zhao, Keyi Wu, ...Yunhe Fu 著者紹介
npj Biofilms and Microbiomes volume 9, Article number: 8 (2023) Cite this article

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指標詳細

概要
腸内細菌叢を介した代謝の変化が腸内病原体の侵入を制御しているという新たな証拠が示されているが、腸内細菌叢を介した代謝物が遠位臓器の病原体感染に影響を与えるかどうか、またどのように影響するかについてはほとんど分かっていない。本研究では、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対する感受性が上昇した乳房炎モデルである亜急性ルーミナルアシドーシス（SARA）関連乳房炎モデルにおける代謝変化を明らかにするために、アンターゲットメタボロミクスを実施した。その結果、SARAを発症した牛は、健常牛と比較してコール酸（CA）およびデオキシコール酸（DCA）濃度が低下していることが判明した。CAではなくDCAをマウスに投与すると、マウスの炎症と血液乳汁バリアーの完全性が改善され、S. aureus誘発乳房炎が緩和されました。DCAは、マウス乳腺上皮細胞におけるS. aureusによるNF-κBおよびNLRP3シグナルの活性化を抑制し、TGR5の活性化に関与していた。DCAによるTGR5の活性化は、cAMPおよびPKAの活性化を介して、NF-κBおよびNLRP3経路とS. aureusによる乳房炎を抑制した。さらに、腸内環境異常マウスでは、TGR5活性化が損なわれ、S. aureusによる乳房炎が悪化したが、芽胞形成菌によるTGR5活性化の回復により、これらの変化は回復した。さらに、二次胆汁酸生産菌Clostridium scindensをマウスに補充すると、TGR5が活性化し、S. aureus誘発乳房炎が緩和されることも確認された。これらの結果は、腸内細菌叢の異常による二次胆汁酸産生の障害がS. aureus誘発乳房炎の発症を促進することを示唆し、腸内細菌代謝の調節による遠位感染への介入戦略の可能性を浮き彫りにするものである。

はじめに
腸内細菌叢は、宿主の生理的恒常性の維持や感染症を含む疾患の転帰を制御する上で重要な役割を果たすことが証明されている1,2。腸内細菌叢が介在する代謝産物は、宿主と微生物叢の相互作用の最も一般的なメカニズムの1つであり、したがって病原体の侵入の病因に関与していることを明らかにする証拠が増えている3. 腸内細菌叢由来の代謝産物は、複数の様式で病原体のコロニー形成を促進することが明らかにされている。例えば、腸内細菌叢由来の1,2-プロパンジオールは、Citrobacter rodentiumの代謝経路を制御し、病原性発現を増加させ、代謝的適応と病原性を可能にすることが明らかになった4。シアル酸やフコースなどの微生物が解放した宿主糖は、優先的なエネルギー源となり、Salmonella typhimuriumやClostridium difficileの抗生物質投与後の拡大を促進した5。また、Tovaglieriらは、4-メチル安息香酸、3,4-ジメチル安息香酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸などの腸内細菌叢由来の代謝産物が、フラジェリンの発現を促進することにより腸管出血性大腸菌による腸管壁損傷を増悪させることを発見している6。しかし、常在菌由来の有益な成分が病原体の侵入を制限し、その結果、疾患の予後を改善することも示されている。Sun Xらは、常在嫌気性微生物叢が産生するコール酸（CA）由来の二次胆汁酸であるデオキシコール酸（DCA）がCampylobacter jejuni（C.jejuni）誘発大腸炎を軽減し、clindamycinによる二次胆汁酸（BAs）生産菌の枯渇がこの大腸炎を増悪させることを明らかにした7。また、腸内細菌が事前に感染していると、BA代謝由来の代謝産物であるタウリンが増加し、それが硫化物に変換されて病原体の呼吸を抑制することにより、その後の感染に対する微生物叢の抵抗性が増加することが分かっている8。また、感染症を制御する腸内細菌叢由来の代謝物として、短鎖脂肪酸（SCFAs）もよく知られている。バクテロイデスが産生するプロピオン酸は、細胞内pHの恒常性を乱すことにより、サルモネラ菌に対する腸管コロニー形成抵抗性を高める9。酪酸は、低酸素誘導因子1αを安定化させることにより、腸管バリアを改善し、細菌の移動を制限して、Clostridium difficile誘発性大腸炎からマウスを保護します10。腸内常在菌Bacteroides vulgatusの枯渇による腸内細菌叢構造の制御は、SCFAを含むコレラ菌増殖抑制代謝物を減少させる一方で、N-アセチルグルコサミンやグルコノラクトンなどのコレラ菌増殖促進代謝物を上昇させることにより、マウスにおける腸内ビブリオコレラ菌の病原化を促進させることが明らかとなった11。これらの知見は、腸内細菌叢が介在する代謝プロファイルの違いにより、宿主の病原体に対する感受性や腸疾患の転帰が異なることを示唆している。しかし、腸内細菌叢由来の代謝産物が遠位病原体感染症の発症に及ぼす影響については、ほとんど知られていない。

黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、ヒトや動物に重篤な疾患を引き起こし、死に至ることもある手強い細菌である12。黄色ブドウ球菌は、ほとんどの抗生物質に対して耐性を持ち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）などの新しいクローンが出現することが報告されているため、市中感染の主要な原因となっており、安全で効果的な予防・制御戦略が欠如している13。黄色ブドウ球菌による乳房炎は、授乳中の女性や動物に最もよく見られる疾患のひとつであり、乳がんのリスクを高め、莫大な経済的損失をもたらしている14,15。近年、腸内細菌叢などの宿主因子が病原体誘発性乳房炎の発症に関与していることを示す証拠が増えてきている。例えば、腸内細菌が減少したマウスでは、乳腺の炎症反応が増加し、細菌感染時に乳腺炎症状が増悪することが示されている16,17。さらに、糞便微生物移植、プロバイオティクス、直接代謝産物の補充による腸内細菌叢および代謝の改変は、病原体誘発性乳房炎を緩和する16,17。酪農場では、黄色ブドウ球菌関連乳房炎は亜急性ルーミナルアシドーシス（SARA）18などの消化器系疾患と関連している。以前の研究では、SARAを経験した牛がリポポリサッカライド（LPS）を乳房内に投与された場合、より強い代謝異常と自然免疫の変化が生じることが示された19。また、我々の以前の研究結果では、SARA牛は黄色ブドウ球菌による乳房炎への感受性が高いことが示された20。これらのことから、SARA を発症した牛では乳腺炎のリスクが高まることが示唆されるが、その根本的なメカニズムはまだ不明である。これまでの研究で、異なる食事パターンが乳腺の微生物組成および代謝プロファイルに影響を与え、乳腺疾患に対する感受性の上昇につながることが示されている21,22。地中海食の摂取は、西洋食と比較して、BAやトリプトファン由来のアリール炭化水素受容体（AhR）リガンドを含む有益な微生物関連代謝産物を増加させた21。これらの代謝物は、細菌感染に対する感受性の変化やその後の炎症反応に関連している7,17。しかし、SARA牛の乳腺における微生物に関連した代謝の変化が、黄色ブドウ球菌に対する感受性の上昇に関与しているかどうかは、その基礎となるメカニズムとともに十分に理解されていない。

本研究では、アンターゲットメタボロミクスを用いて、SARA牛は健常牛と比較して乳汁中の代謝プロファイルが異なり、特にCAとDCAレベルが低下していることを明らかにした。CAではなくDCAを摂取することで、S. aureus誘発性乳房炎がマウスで改善された。その根本的なメカニズムは、武田薬品のGタンパク質共役型受容体5（TGR5）を介した環状アデノシン一リン酸（cAMP）-プロテインキナーゼA（PKA）経路に関与し、乳腺における炎症性NF-κBおよびNLRP3の活性化を抑制するものであった。バンコマイシンによる腸内環境破壊マウスでは、乳腺のTGR5活性が低下し、黄色ブドウ球菌による乳房炎にかかりやすくなった。一方、有胞子性細菌（SFB）投与によりTGR5の活性化が回復し、黄色ブドウ球菌による乳房炎が緩和された。さらに、DCA産生能を有する常在クロストリジウム・シンデンス（C. scindens）も、マウスのS. aureusによる乳房炎を減弱させた。これらの結果は、腸内細菌叢を介したDCAが病原体誘発性乳房炎の防御に寄与していることを示し、腸内細菌叢とその代謝を調節することが病原体の遠位感染への介入戦略として可能であることを示唆している。

結果
高濃度飼料に関連したSARAは乳腺中のBA濃度を低下させる
我々の以前の結果では、SARA牛はS. aureus誘発性乳房炎に対して感受性が高いことが示された20。代謝の変化の背景にあるものを調べるため、健常牛とSARA牛のミルクサンプルに対して、アンターゲットメタボロミクスを実施しました。安定かつ正確なメタボローム結果を得るために、ピアソン相関分析によりデータの品質管理（QC）を行いました。ルーミンQCサンプルのピアソン相関は高く、信頼できるデータ品質であることが示唆されました（補足図1A）。さらに、主成分分析（PCA）スコアプロットにおいて、QCサンプルは緊密にクラスタリングされており（補足図1B、C）、データの品質がさらに確認されました。HMDBアノテーション、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、LIPID MAPSを用いて、全乳サンプルから合計213種類のアノテーション代謝物を同定しました（補足図2A-C、補足表1）。PCAの結果、SARA発症牛（SM）の乳検体は健常牛（HM）と有意に分離していた（PC1が37.24%、PC2が18.60%、Fig. 1A）。さらに、部分最小二乗法による判別分析（PLS-DA）のスコアプロットにより、SMとHMのクラスタが明確に分かれていることが確認された（p < 0.001, Fig.1B）。また、7重クロスバリデーションにより、PLS-DAの安定性と信頼性が確認された（R2Y:0.97, Q2Y:0.86, Fig. 1B）。さらに、200回のランダム並べ替えテストによりPLS-DAをフィッティングして代謝情報を含むモデルを作成し、PLS-DAが新しいサンプルを正しく分類する能力を確認した。その結果、適合度（R2）の切片が予測度（Q2）より大きく、Q2の切片が0より小さいことから、モデルがオーバーフィットしておらず、信頼できることが示された（Fig. 1C）。

図1：健常牛とSARA牛の牛乳サンプルの代謝プロファイルを示す。
図1
A ミルクサンプルのPCAスコアプロット（n = 6）。B ミルクサンプルの PLS-DA スコアプロット (n = 6)。C順列検定を200回繰り返したクロスバリデーションプロット。R2 = (0.0, 0.80) と Q2 = (0.0,-1.05) の切片は、PLS-DAモデルがオーバーフィットしていないことを示しています。D ボルケーノプロットは、健常牛とSARA牛の代謝物を一対一で比較した結果を示しています。縦と横の破線は、それぞれ2倍の存在量差の閾値とp = 0.05の閾値を示す。比較にはStudentのt-testを行った。有意な代謝産物は、赤色（アップレギュレート）または緑色（ダウンレギュレート）で表示されている。E 健常牛と SARA 牛の異なる乳汁代謝産物の階層的クラスター分析。1-メチル-N-（3-メチル-5-シノリニル）-1H-イミダゾール-4-スルホンアミド、2-N-（1，1-ジオキソテトラヒドロ-1H-1λ6-チオフェン-3-イル）-4-メトキシベンズアミドは、1-N-メチル・N-（3-メチル-5-シノリニル）-1H-イミダゾール・スルホンアミドと呼ばれます。F SARA サンプルで有意に上昇した代謝物の KEGG パスウェイに従ったパスウェイ濃縮解析。健常者とSARAサンプルのコール酸（G）およびデオキシコール酸（H）の相対レベルを測定した。データはボックスプロットで表示され、中央の線は中央値、ひげの境界はデータセットの最小値と最大値、ボックスの境界はデータセットの25％と75％を表す（GとH）。Mann-Whitney U 検定を行った(G, H)。*p < 0.05, **p < 0.01。PLS-DA, 部分最小二乗法判別分析; VIP, 投影における変数の重要度.

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VIP（Variable Important in the Projection）、FC（Fold Change）、P値を用いて、SMとHMで有意に異なる44の代謝物を同定した（upregulated 5、downregulated 39、補足表1、2、3）。また、異なる代謝物のグローバルな分布をボルケーノプロットで示したところ、SMとHMの間で代謝物レベルが異なることが示された（図1D）。さらに、ヒートマップを用いた差分代謝物クラスター解析により、SM の代謝物量は HM の代謝物量と有意に異なっていた（図 1E）。KEGGパスウェイ濃縮解析の結果、SMに濃縮されたパスウェイは主に胆汁分泌、不飽和脂肪酸の生合成、脂肪酸生合成、フェロプトーシスであった（Fig. 1F）。病原体による乳房炎の発症における腸内細菌叢の役割16,17、および腸内病原体の侵入を制御する微生物叢を介したBA代謝7,8を考慮し、さらに胆汁代謝に着目し、SMサンプルではHMグループのものと比較して、第二胆汁酸DCAおよび第一胆汁酸CAが著しく枯渇していることを示した（図1G、H）。注目すべきは、我々が以前に発表した SARA 牛のルーメン微生物学的解析によると、SARA 牛にはクロストリジウムが少なく、その中には CA から DCA を作る能力を持つものが含まれているかもしれないが、属レベルのデータでは確証を得るには不十分であることである20。これらの結果を総合すると、SARA牛は乳汁中の代謝プロファイルが変化しており、特にBAが減少しているため、黄色ブドウ球菌による乳房炎を促進する可能性があることが示された。

二次胆汁酸DCAは、一次胆汁酸CAではなく、S. aureus誘発性乳房炎を軽減する。
次に、S. aureus誘発マウス乳腺炎モデルを用いて、乳腺炎におけるBAsの役割について検討した。その結果、S. aureus投与により、対照マウスと比較して、乳腺傷害、炎症浸潤および反応が増加し、著しい乳腺炎形質を誘発した（図2A-G）。CAではなくDCAを腹腔内に前処理することにより、S. aureus投与群と比較して、DCAが乳腺傷害（図2A、B）、乳腺S. aureus負荷（図2C）、TNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症性マーカーおよびMPO活性（図2D-G）を改善することから明らかなように、DCAはS. aureusによる乳腺炎を緩和させることが明らかとなった。S. aureus誘発乳房炎に対するDCAの保護効果を確認するために、マウスを異なる用量のDCAで前処理した結果、DCAは用量依存的にS. aureus誘発乳腺障害（図2H、I）および炎症パラメータ（図2J-M）を改善することが判明した。乳腺の免疫細胞浸潤および炎症反応の増加は、血液-乳腺バリアー統合性の障害と関連していた16,17,20。実際、DCA前処理により、タイトジャンクション（TJ）タンパク質であるZO-1、OccludinおよびClaudin-3が、S. aureus処理群と比較して回復したことから明らかなように、S. aureusによる乳腺バリアの崩壊が改善した（図2N-Q）。これらの結果は、一次胆汁酸CAではなく、二次胆汁酸DCAがS. aureus誘発乳房炎を改善することを示唆するものである。

図2：DCAはCAではなく、S. aureus誘発マウス乳腺炎を改善する。
図2
マウスに30 mg/kgのCAまたはDCAを2時間腹腔内に前投与した後、S. aureus誘発乳房炎を行った。S. aureus感染後24時間後に乳腺組織を採取し、判定を行った。A 表示された群の乳腺の代表的なH&E染色切片（スケールバー、50μm）。B H&E染色切片に基づく乳腺の組織学的スコア（n = 6）。C 乳腺の黄色ブドウ球菌負荷（n = 6）。TNF-α（D）、IL-1β（E）、およびIL-6（F）濃度およびMPO活性（G）を含む、異なる群からの乳腺の炎症性パラメータを行った（n＝6）。H-Q マウスを異なる用量のDCA（10、20、および30 mg/kg）で2時間腹腔内前処置し、その後24時間黄色ブドウ球菌で刺激した。 H 表示したマウスの乳腺H&E染色切片の代表例（スケールバー、50 μm）。I 異なる処理群からの乳腺の組織学的スコア（n = 6）。異なる処置群からの乳腺の炎症パラメータ、TNF-α（J）、IL-1β（K）、およびIL-6（L）濃度、ならびにMPO活性（M）を測定した（n＝6）。N 示したマウスの乳腺におけるZO-1、Occludin、およびClaudin-3の画像を表す。ZO-1、Occludin、およびClaudin-3の強度を測定した（O-Q）。データは平均値±SDで表し（B-G, I-M, およびO-Q）、一元配置分散分析を行い、その後Tukeyの検定を行った（B-G, I-M, およびO-Q）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001は有意であることを示す。

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DCAはTGR5-cAMP-PKA-NF-κB/NLRP3経路を介してS. aureus誘発乳房炎を減弱させる
BAが異なる抗菌力を持つこと、S. aureusのバイオフィルムがその感染に寄与していることはよく知られている7,23。そこで，DCAとCAがS. aureusの増殖とバイオフィルム形成を制御しているかどうかを調べた．その結果，DCA（636.82 μMでOD600をほぼ50％減少）は，CA（1835.67 μMで阻害効果をほとんど示さない）よりもin vitroでS. aureusの増殖を制限する能力が高かった（補足図3A-B）．また、60μM以下のDCAおよびCA処理群では、S. aureusのバイオフィルム形成に大きな影響は認められなかった（補足図3C、D）。他の細胞種で認められた結果24と同様に，黄色ブドウ球菌の増殖を抑制しない量のDCAは，マウス乳腺上皮細胞（MMECs）における黄色ブドウ球菌誘発TNF-α，IL-1βおよびIL-6 mRNAを減少させた（図3A-C）ことから，DCAによる黄色ブドウ球菌誘発炎症は，黄色ブドウ球菌増殖抑制に完全に依存していないことが示唆された．二次的なBAは、ビタミンD受容体（VDR）、武田Gタンパク質共役型受容体5（TGR5）、α5β1、グルココルチコイド受容体（GR）、構成的アンドロスタン受容体（CAR）、ファルネソイドX受容体（FXR）、プレグナンX受容体（PXR）などの複数の受容体で報告されていた25, 26,27. 次に、DCA処理したMMECでは、TGR5だけが対照群に比べ顕著に増加していることを見出した（図3D）。DCAの効果におけるTGR5活性化の役割を確認するために、特異的阻害剤SBI-11528またはsiRNA-TGR5でTGR5の活性化を阻害した。SBI-115およびsiRNA-TGR5は、いずれもMMECにおけるS. aureus誘発炎症性サイトカイン産生に対するDCAの保護効果を逆転させた（図3E-J）。CAもTGR5を活性化することが報告されているが、CAを30μM処理しても、MMECにおけるS. aureus誘発炎症性サイトカイン産生に大きな影響を及ぼさないことがわかった（補足図4A-C）。これらの結果は、DCAによるS. aureus誘発乳房炎に対する保護効果には、TGR5の活性化が関与していることを示している。

図3 DCAはTGR5を活性化することにより、MMECにおけるS. aureus誘発炎症を軽減させる。
図3
DCA（10、20、30μM）で細胞を2時間前処理し、その後24時間S. aureus処理し、表示されたグループからの炎症性TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）の相対mRNAレベルをqPCRにより検出した。D 細胞をDCA（30μM）で24時間処理し、TGR5、VDR、FXR、CAR、PXR、GRおよびα5β1の相対mRNAレベルをqPCRを用いて決定した。細胞をSBI-115で2時間前処理し、さらにDCA（30μM）で2時間処理し、その後24時間黄色ブドウ球菌処理した。異なる処理群からの炎症性TNF-α（E）、IL-1β（F）、IL-6（G）の相対mRNAレベルをqPCRにより検出した。H-J 細胞をsiRNA-TGR5またはsiRNA-negで48時間前処理した後、上記のようにDCA（30μM）および黄色ブドウ球菌処理し、相対mRNAレベルをqPCRで検出した。データは平均値±SDで表し（A-J）、一元配置分散分析に続いてTukeyの検定（A-CおよびE-J）およびStudentのt-検定（D）を行った（D）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001は有意であることを示す。

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炎症性サイトカインの分泌は、NF-κBやNLRP329などの炎症性経路の活性化に起因するものであった。予想通り、DCA処理は、S. aureus処理MMECにおけるNF-κBおよびNLRP3経路の活性化を用量依存的に抑制した（図4A-G）。さらに、これらの作用がTGR5の活性化を介したものかどうかを検討した。その結果，SBI-115およびsiRNA-TGR5処理により，S. aureus処理MMECにおけるDCA処理に起因するp-p65，p-IκB，NLRP3およびIL-1βの減少が回復し（図4H-U），TGR5活性化がS. aureusによるNF-κBおよびNLRP3経路の活性化を抑制することにつながった。これまでの研究で、TGR5がリガンドと結合するとcAMPが産生され、PKAの活性化につながることが示されている24,26。そこで、アデニル酸シクラーゼ阻害剤MDL12330AおよびPKA阻害剤H8930,31を用いて、TGR5によるNF-κBおよびNLRP3の阻害にcAMP-PKA経路が関与しているかどうかを検討した。MDL12330AとH89の両方で前処理すると、NF-κBとNLRP3の活性化に対するTGR5活性化の保護効果が逆転した（図5A-G）。これらの結果を確認するために、別のcAMP阻害剤KH7、およびsiRNA-PKAも実施した。一貫して、KH7およびsiRNA-PKA処理は、S. aureus処理MMECにおけるDCAによって誘導されるNF-κBおよびNLRP3活性化の減少を逆転させた（図5H-N）。さらに、阻害剤およびsiRNAによるcAMPおよびPKAの阻害は、S. aureus処理MMECにおけるDCAによって引き起こされるTNF-α、IL-1βおよびIL-6の発現低下を逆転させた（図5O、P）。これらの結果は、DCAがTGR5-cAMP-PKA-NF-κB/NLRP3軸を介してS. aureus誘発乳房炎を緩和することを示している。

図4：DCAは、MMECにおいてTGR5を活性化することにより、S. aureus誘導のNF-κBおよびNLRP3の活性化を抑制する。
図4
A-G 細胞をDCA（10、20、および30μM）で2時間前処理し、その後24時間S. aureus処理し、示したグループからのNF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより決定した（A）。p-p65、p-IκB、NLRP3、ASC、およびIL-1βの相対強度を決定した（B-G）。H-N 細胞をSBI-115で2時間前処理し、DCA（30μM）でさらに2時間処理し、その後24時間黄色ブドウ球菌処理した。NF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルをウェスタンブロットで決定し（H）、p-p65、p-IκB、NLRP3、ASC、およびIL-1βの相対強度を決定した（I-N）。O-U。細胞をsiRNA-TGR5またはsiRNA-negで48時間前処理した後、上記のようにDCA（30μM）および黄色ブドウ球菌処理し、NF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより決定した。データは平均値±SDで表し（B-G、I-N、P-U）、一元配置分散分析を行った後、Tukeyの検定を行った（B-G、I-N、P-U）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001は有意であることを示す。

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図5：DCAは、cAMP-PKA- NF-Κb/NLRP3 経路を通じてMMECsにおける黄色ブドウ球菌誘発炎症を緩和する。
図5
A-GおよびO. 細胞をH89（30μM）およびMDL12330A（10μM）で2時間前処理し、次にDCA（30μM）でさらに2時間処理し、その後24時間S. aureus処理し、示したグループからのNF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより測定した（A）。p-p65、p-IκB、NLRP3、ASC、およびIL-1βの相対強度を決定した（B-G）。表示されたグループからの炎症性遺伝子の相対的mRNAレベルは、qPCRによって検出された（O）。H-NおよびP. 細胞を48時間siRNAで前処理し、さらに2時間DCA（30μM）およびKH7（10μM）で処理し、その後24時間黄色ブドウ球菌処理した。示したグループからのNF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングによって決定し（H）、p-65、p-IκB、NLRP3、ASCおよびIL-1βの相対強度を測定した（I-N）。表示されたグループからの炎症性遺伝子の相対mRNAレベルは、qPCRによって検出された（P）。データは平均値±SDで表し（B-G、I-N、O、P）、一元配置分散分析を行った後、Tukeyの検定を行った（B-G、I-N、およびO、P）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001は有意であることを示す。

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腸内細菌叢が産生するDCAは、TGR5の活性化と黄色ブドウ球菌によるマウス乳腺炎の発症を媒介する
腸内細菌は、CAが腸内細菌を介した酵素によってDCAに変換されるなど、一次BAから二次BAへの変換に重要な役割を担っている32,33。そこで，S. aureusによる乳房炎に対するDCAとCAの効果の違いとともに，S. aureusによる乳房炎の病態における腸内細菌叢の役割について検討した．Vancomycin感受性の嫌気性微生物は、二次的なBA産生の優勢な分類群として知られている34,35。そこで、バンコマイシンを用いて腸内嫌気性微生物を枯渇させ、嫌気性SFBで補うことにより、腸内細菌叢を改変した。Bray-Curtis距離に基づく主座標分析により、バンコマイシン処理群の腸内細菌叢構造は、対照群またはSFB処理群と顕著に分離していた（R = 0.4342, P = 0.001）（図6A）。ベン図解析の結果、バンコマイシン投与マウスはコントロール群と比較して腸内細菌叢の種が減少していたが、SFB補正後には逆転していた（補足図5A）。Shannon、Chao1、ACE、Simpson指標を含むα多様性解析では、バンコマイシン投与群は対照群およびSFB補償群と比較して腸内細菌叢の豊かさと多様性が減少していた（図6B、Cおよび補足図5B、C）。門レベルでは、バンコマイシン処理により偏性嫌気性ファーミキューテスおよびバクテロイデスの存在量が減少し、FusobacteriotaおよびProteobacteriaの存在量が増加したが、これらの変化はSFB移植後逆転した（図6D）。属レベルでも、バンコマイシン投与マウスは対照群やSFB補償群とは異なる微生物組成を示した（補足図5D）。線形判別分析の効果量（LEfSe）では、ClostridiumとFusobacteriumが異なる群間で有意に変化していることが示された（補足図5E）。次に、バンコマイシン投与により、乳腺中のDCAが減少し、CA量がコントロール群およびSFB投与群と比較して増加することを示した（Fig.6E）。同様に、バンコマイシン処理により、乳腺におけるTGR5の発現は、コントロール群と比較して減少したが、SFB補償後に回復した（図6F）。さらに、バンコマイシン投与マウスは、黄色ブドウ球菌感染時に、乳腺障害の悪化、細菌負荷、炎症性パラメータで示されるように、コントロールおよびSFB補償マウスよりも重度の乳腺炎を発症した（図6G-L）。しかし、コントロールマウスからのSFB移植は、バンコマイシン処理マウスと比較して、S. aureus誘発乳房炎を緩和した（図6G-L）。同様に、バンコマイシン投与マウスは、コントロール群に比べ、TJ発現が低下し、NF-κBおよびNLRP3の活性化が増大していたが、SFB投与によりバリア機能が回復し、黄色ブドウ球菌によるNF-κBおよびNLRP3活性化が抑制された（図6M〜U）。S. aureus誘発乳房炎における腸内細菌叢代謝型DCAの保護的役割を確認するため、従来型マウスおよび腸内細菌叢破壊型マウスにCAおよびDCAを経口投与したところ、S. aureus誘発乳房炎はS. aureusの増殖を抑制した。興味深いことに、CAを経口投与すると、従来型マウスではS. aureus誘発乳房炎が緩和されたが、抗生物質カクテルで常在菌を枯渇させると、乳腺のDCAレベルの変化を伴って回復した（補足図6A-F）。さらに、腸内細菌叢破壊マウスにDCAを投与すると、やはりS. aureus誘発乳房炎は緩和された（補足図6A-F）。これらの結果は、腸内細菌叢が産生するDCAがTGR5の活性化およびS. aureus誘発乳房炎の発症を媒介することを示している。

図6：腸内細菌叢の異常は、TGR5の活性化を損ない、マウスのS. aureus-誘導性乳房炎を悪化させる。
図6
マウスにバンコマイシンを投与し、SFBを補充した後、S.aureus誘発乳房炎を発症させた。A 主座標分析スコアプロットは、Bray-Curtis距離に基づき、バンコマイシン投与マウスにおける腸内細菌叢構造の分離（R = 0.4342, P = 0.001）をコントロールまたはSFB移植マウスのそれと示す（n = 6）。B-C シャノン指数（B）およびチャオ1指数（C）により、バンコマイシンは腸内細菌の多様性と富を減少させたが、SFB移植により回復した（n = 6）。D異なる処理群からの腸内細菌組成を門レベルで示した。E 示した群からの乳腺DCAおよびCAレベルを検出した（n = 6）。F異なる処理群からのTGR5 mRNAの相対的発現（n = 6）。G 異なる群からのH&E染色切片の代表画像（スケールバー、50μm）。H 異なるグループからの乳腺の組織学的スコア（n = 6）。I 乳腺のS.aureus負荷。TNF-α（J）、IL-1β（K）、およびMPO活性（L）の炎症性マーカーを測定した（n＝6）。M 示したマウスの乳腺のZO-1、Occludin、Claudin-3の代表的な画像である。ZO-1、OccludinおよびClaudin-3の強度を測定した（N-P）。Q 乳腺におけるNF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルは、ウェスタンブロッティングを用いて検出した。乳腺におけるp-p65、NLRP3、ASC、およびIL-1βの相対強度が検出された（R-U）。データは箱ひげ図として表し、中央の線は中央値、ひげの境界はデータセットの最小値と最大値、箱の境界はデータセットの25％と75％を表す（B、C）または平均±SD（E、F、H-L、N-P、R-U）、一元配置分散分析を行った後、テューキーのテストを行った（E、F、H-L、N-P、R-U）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001は有意であることを示す。

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二次的BA産生能を有するC. scindensはS. aureus誘発マウス乳房炎を軽減させる
次に、一次BAを二次BAに変換することが知られている常在微生物C. scindensのS. aureus誘発マウス乳腺炎に対する影響を調べた。予想通り、C. scindens のコロニー形成は、S. aureus 誘発乳腺障害（図 7A, B）、S. aureus 負荷（図 7C）、炎症マーカー発現（図 7D-F）を軽減させた。特に、C. scindens 植え付けマウスは、コントロールマウスと比較して、乳腺における TGR5 遺伝子発現と DCA レベルが増加していた（Fig. 7G, H）。さらに、C. scindens の補給は、S. aureus による血液乳汁バリアの損傷を緩和した。これは、S. aureus 処理群と比較して、ZO-1、Occludin、および Claudin-3 を含む TJ タンパクが回復したことからも明らかである (Fig. 7I-L)．さらに、C. scindensを処理すると、乳腺におけるS. aureus誘発のNF-κBおよびNLRP3活性化が改善された（図7M-Q）。これらの結果は、二次BA生産者がマウスのTGR5の活性化を通じて、S. aureus誘発乳房炎を改善したことを示唆するものである。

図7：DCA産生能を有するClostridium scindensは、マウスのS. aureus誘発乳房炎を緩和する。
図7
A 異なるグループのH&E染色切片の代表画像（スケールバー、50μm）。B 異なる群からの乳腺の組織学的スコア（n = 6）。C 乳腺のS. aureus負荷（n = 6）。TNF-α（D）、IL-1β（E）、MPO活性（F）の炎症誘発性マーカーを測定した（n = 6）。G 異なる処理群からのTGR5 mRNAの相対的発現（n = 6）。H 示したマウスからの乳腺DCAレベル(n = 6)。I 示したマウスの乳腺のZO-1、Occludin、およびClaudin-3の代表的な画像である。ZO-1、Occludin、およびClaudin-3の強度を測定した（J-L）。M 乳腺のNF-κBおよびNLRP3経路のタンパク質レベルは、ウェスタンブロッティングを用いて検出した。乳腺のp-p65、NLRP3、ASC、およびIL-1βの相対強度を検出した（N-Q）。データは平均値±SDで表し（B-H、J-L、N-Q）、一元配置分散分析を行った後、Tukeyの検定を行った（B-H、J-L、N-Q）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001は有意であることを示す。

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考察
MRSA に関連する感染症は、ヒトおよび動物にとって重大な懸念事項である13。宿主の交代状態が MRSA を含む病原体に対して異なる感受性を付与することを示唆する証拠が増えており6,16,17 、これは宿主および腸内細菌叢による異なる代謝プロファイルに起因すると考えられる3,4,11。しかし、腸内細菌叢に由来する代謝の変化が、遠位臓器におけるMRSA関連疾患の発症に寄与しているかどうか、またどのように寄与しているかは、依然として不明である。本研究では、SARA牛の乳腺において、S. aureus誘発性乳腺炎に対する感受性の変化に関与していると考えられる有意に異なる代謝特性を同定した20。腸内細菌叢に関連する代謝物のうち、BA代謝はSARA牛ではCAとDCAの減少によって特徴づけられる。CAではなくDCAをマウスに投与すると、炎症反応が抑制され、血液乳汁バリアーが改善され、S. aureus関連乳房炎が軽減された。この基本メカニズムは、TGR5がcAMP-PKA経路を介してNF-κBおよびNLRP3の抑制に関与していた。乳腺のTGR5の活性化は腸内細菌叢によって制御され、黄色ブドウ球菌による乳房炎に対して異なる反応と発達を可能にした。これは、バンコマイシンによる腸内細菌の異常が、乳腺TGR5の発現を低下させ、SFB補償後に回復させたことから明らかである。さらに、BA二次生産者をマウスに投与すると、乳腺TGR5が活性化され、S. aureus誘発性乳房炎が緩和されることも明らかになった。

宿主または微生物叢を介した代謝の変化は、感染症の発症や転帰に中心的な役割を果たすことが証明されている3,9,37。そこで、病原体誘発性乳房炎の感受性に影響を与える可能性のある代謝産物を同定するために、アンターゲットメタボロミクスを実施しました。その結果、SARA牛の乳汁中の代謝プロファイルは、健常牛とは異なることがわかりました。これまでの研究で、SARAは全身性の炎症反応を増加させ、循環中の代謝物を変化させ38、乳量と脂肪合成の減少に関連することが示されていました。我々の結果は、一貫して、SARA 牛は脂肪酸生合成に富む代謝物を変化させたことを示していた。最近の研究では、乳房炎にかかった牛の血清中の代謝形質が異なることも示され39、乳房炎は宿主のホメオスタシスの変化と関連していることが導かれた。注目すべきは、SARA牛では腸内細菌関連BA、特にCAとDCAが減少しており、これらは宿主機能および疾患の転帰を調節する重要な因子として作用していることである7,25,40。これと同様に、以前の研究では、繊維強化食の摂取により、不顕性乳房炎を発症した牛の血清二次胆汁酸レベル（DCA とリトコール酸を含む）が上昇することが示された41。別の研究では、地中海食飼育動物の乳腺では、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸およびチェノデオキシコール酸を含む胆汁酸代謝物のレベルが高いことが示され21、これは食事の成分が二次胆汁酸代謝の主たる決定要因であることを示唆している。臨床および不顕性乳房炎牛では、DCA および 12-ケトリトコール酸を含む血清二次胆汁酸の低下も検出された42。興味深いことに、Thomas らは Streptococcus uberis を乳房内に投与した後、乳汁中の BA 濃度がダイナミックに変化することを発見しており43 、病原体が誘発する乳房炎において BA が関与する可能性が示唆されている。さらに、胆汁酸塩は乳房炎に関連した病原性大腸菌44の亜鉛の取り込みとカプセル合成を調節することが報告されており、異なる胆汁酸が宿主または病原体に異なる影響を及ぼす可能性が示唆された。

本研究では、CAではなくDCAで処理することにより、S. aureusによるマウスの乳腺炎が緩和された。同様の結果は他の疾患モデルでも認められ、CA ではなく DCA がマウスの自己免疫性ぶどう膜炎の転帰を改善した26。また、DCAの非抗菌性用量はS. aureus誘発炎症を抑制したことから、我々はDCAが細菌の増殖を抑制するのではなく、宿主の反応を調節する役割を担っていることを確認した。この結果は、非抗菌量のDCAがマクロファージにおけるLPSや病原体誘発の炎症反応を抑制する能力を持つという以前の知見と一致している24。DCA処理により、S. aureusによるTJタンパク質の減少が回復したことから、血液-乳汁バリアーの完全性が改善されたことが示唆された。腸管上皮細胞においても、DCAがTJレベルを調節することが見出された45。バリア機能の低下は、NF-κBやNLRP3経路などの活性化された炎症性シグネチャーに起因する炎症反応の亢進に共通する反応である。黄色ブドウ球菌の侵入は、NF-κBおよびNLRP3経路を活性化することが知られており、これらのシグネチャーは乳腺炎の病因に不可欠な役割を担っている16。しかし、DCAはMMECにおけるNF-κBおよびNLRP3の活性化を抑制し、これはDCAが炎症性経路の活性化を抑制することができるという知見と一致している24。DCAは、TGR5、FXR、VDR26などの複数の宿主受容体を介して作用することができる。そして、乳腺においてDCA処理後にTGR5が有意に増加することを突き止めた。その代わり、SBI-115でTGR5をブロックすると、DCAの保護作用が逆転した。別の研究でも、SBI-115 が自己免疫性ぶどう膜炎に対する DCA または特異的 TGR5 アゴニストである INT777 の効果を逆転させることが示された26。さらに、TGR5 の活性化の増加は、cAMP の発現とそれに続く PKA24,26 を調節する。MDL12330AおよびH89でcAMPとPKAをブロックすると、MMECにおけるNF-κBおよびNLRP3、それに続く炎症性サイトカインに対するDCAの作用が損なわれた。これらの結果は，TGR5を介したcAMP-PKA経路が，DCAのS. aureus誘発乳房炎に対する効果に寄与していることを示していた．

S. aureus誘発マウス乳房炎におけるDCAおよびCAの役割とBA代謝および乳房炎における腸内細菌叢7,25を考慮し、次に乳房炎の病態における腸内細菌叢によるTGR5活性化について検討した。バンコマイシンを投与したマウスは、コントロールマウスに比べ、DCAレベルとTGR5の活性化が低下し、より重篤な乳腺炎を発症していた。同様の結果は、クリンダマイシンによる腸内偏性嫌気性微生物の枯渇が、腸内DCAレベルを低下させることにより、特定病原体フリー（SPF）IL10-/-マウスのC jejuni誘発大腸炎を悪化させた以前の研究でも見られた7。 Huらはまた、抗生物質による二次BAリザーバーの障害が、マウスの自己免疫性ブドウ炎を悪化させることを明らかにした26。SFB を補給すると乳腺の DCA と TGR5 レベルが回復し、マウスの S. aureus 誘発性乳房炎が改善されたことから、芽胞形成性クロストリジウムが二次 BA の生成に不可欠な役割を果たすことが支持された25,35。C. scindensは、コントロールマウスと比較して乳腺のTGR5活性化を増加させ、S. aureus誘発性乳房炎を減少させることが示された。また、別の研究では、C. scindensはぶどう膜炎におけるDCAまたはTGR5活性化の役割を反映していることが示された26。これらの結果は、腸内細菌叢が介在する二次的なBA産生が、マウスのS. aureus誘発性乳房炎からの保護に寄与していることを示唆している。なお、今回の結果では、腸内細菌叢に由来する宿主免疫の変化と同様に、S. aureus誘発乳房炎の発症における他の代謝物の役割を否定することはできない。さらに、腸内細菌叢が介在する二次的なBAによるS. aureusに対する防御効果が、他の臓器においても保存的であるかどうかは証明される必要がある。今後の研究では、他の種類の一次および二次BAがS. aureus感染に及ぼす影響と潜在的なメカニズムも探る必要がある。

結論として、SARA牛は健常牛と比較して代謝に明確な変化があることが示された。乳房炎の発症に影響を及ぼす可能性のある代謝物の中に、DCAがある。DCAを投与するとS. aureusによるマウス乳房炎が緩和され、その根本的なメカニズムはTGR5の活性化に関与し、TGR5はcAMPおよびPKAによるNF-κBおよびNLRP3シグナルの活性化を抑制する。腸内細菌叢の異常はDCA産生とTGR5の活性化を阻害し、マウスのS. aureus誘発乳房炎を悪化させるが、SFBや常在菌のC. scindensによる細菌叢の回復がマウスのS. aureus誘発乳房炎を改善させることがわかった。この結果は、腸内細菌叢を介した二次酸産生がS. aureus関連乳腺炎の病態における重要な制御因子であり、乳腺炎や他の疾患を治療するために腸内細菌叢を介した代謝を調節する基礎として働くことを示唆するものであった。

研究方法
倫理的記述
すべての動物実験は、吉林大学（中国）のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）による承認を受けた。IACUC倫理委員会では、全提案が検討され、動物飼育・使用許可証が承認された。すべての実験は、米国国立衛生研究所が発行した実験動物の世話と使用に関するマニュアルに準拠している。

材料
Deoxycholic acid (DCA), cholic acid (CA), and vancomycinはSigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)から購入した．SBI-115、MDL-12330A、H89はMedChemExpress (MCE, USA)から購入した。リン酸化p65（p-p65、#AF2006；RRID：AB_2834435）、p-65（#AF5006；RRID：AB_2834847）、p-IκB（#AF2002；RRID：AB_283443）、IκB（#AF5002；RRID：AB_283492）を含む一次抗体は、MedChemExpress社から購入した。AB_2834792）、Occludin（#DF7504；RRID：AB_2841004）、ZO-1（#AF5145；RRID：AB_2837631）、Claudin-3（#AF0129；RRID：AB_283313）およびβ-アクチン（#AF7018；RRID：AB_2839420）はアフィニティー・バイオサイエンス（OH、米国）から入手した。NLRP3（#15101）、ASC（#67824）、およびIL-1β（#12242）は、Cell Signaling Technology（CST、Boston、USA）から購入した。ヤギ抗ウサギまたはウサギ抗マウス二次抗体は、ImmunoWay Biotechnology Companyから購入した。マウスTNF-α（Cat #430915）およびIL-1β（Cat #432615）ELISAアッセイキットは、Biolegend（CA、USA）から入手した。ミエロペルオキシダーゼ（MPO）アッセイキットは、Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute（中国、南京市）から購入した。

牛の処理と試料採取
中国上東省青州市の農場から合計12頭のホルスタイン牛（4〜6歳、平均体重〜600kg）を入手し、いずれの動物も6ヶ月以内に疾病にかかったり、抗生物質や薬剤で治療されたりしていない。牛は無作為に健常群とSARA群に分けられた。健常群には牧草-豆科植物乾草の標準飼料を、SARA群には高濃縮飼料（穀物飼料70%）を給与した20,46。すべての牛が泌乳のための1日の栄養所要量を満たしていた。8週間の治療後、異なる治療群の乳サンプルを採取し、メタボローム解析まで液体窒素で保存した。ルーミーナルpHはSARAの診断に使用した47。

非標的メタボロミクス
牛乳サンプル（100 mL）をあらかじめ冷やしておいたメタノール（400 μL）とボルテックスで混合した。氷上で5分間インキュベートした後、15,000 × g、4 ℃で5分間遠心分離を行った。上清をLC-MSグレードの水で53%メタノールを含む最終濃度に希釈した。その後、新しいエッペンドルフチューブに移し、15,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離を行った。最後に、上清をLC-MS/MSシステムに注入し、分析を行った。

LC-MS/MS分析は、Vanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher）とOrbitrap Q Exactiveシリーズ質量分析計（Thermo Fisher）の組み合わせで行った。サンプルは，Hyperil Gold カラム (100 × 2.1 mm，1.9 μm) に 0.2 mL/min の流速で 16 分間の線形グラジエントで注入した。UHPLC-MS/MSで生成された生データファイルは、Compound Discoverer 3.1 (Thermo Fisher) を用いて処理し、各代謝物のピークアライメント、ピークピッキング、定 量を実施しました。主なパラメータは、保持時間許容範囲0.2分、実質量許容範囲5ppm、シグナル強度許容範囲30%、シグナル/ノイズ比3、最小強度100000に設定した。ピーク強度は全スペクトル強度に対して正規化された。正規化されたデータは、付加イオン、分子イオンピーク、フラグメントイオンに基づいて分子式を予測するために使用された。その後、ピークを mzCloud (https://www.mzcloud.org/), mzVault, MassList データベースとマッチングさせ、正確な定性・相対定量結果を得ました。統計解析は、統計ソフトウェアR（R version R-3.4.3）、Python（Python 2.7.6 version）、CentOS（CentOS release 6.6） を用いて行い、データが正規分布しない場合は、面積正規化法を用いて正規変換を試みました。

これらの代謝物は、KEGGデータベース（http://www.genome.jp/kegg/）およびLipidmapsデータベース（http://www.lipidmaps.org/）を用いてアノテーションを行いました。PCA および PLS-DA は metaX で実施した。メタボロームの安定性と正確性を判断するために、QCサンプルの相関性を評価するためにピアソン相関分析を行いました。単変量解析（t検定）を適用し、統計的有意性（P値）を算出した。VIP>1かつP値<0.05かつfold change≧2またはFC≦0.5の代謝物を差分代謝物とした。Volcano プロットは、代謝物の Log2 (FC) と -log10 (P-value) に基づいて、関心のある代謝物をフィルタリングするために使用されました。クラスタリングヒートマップは、差分代謝物の強度領域のzスコアを用いてデータを正規化し、R言語のPheatmapパッケージでプロットした。これらの代謝物および代謝パスウェイの機能を KEGG データベースを用いて検討した。差分代謝物の代謝パスウェイ濃縮を行った。x/n > y/N を満たす場合、その代謝パスウェイは濃縮されていると判断した。代謝パスウェイの P 値が 0.05 未満の場合、代謝パスウェイは有意に濃縮されていると判断した。

マウスと処理
SPFグレードのBABL/cマウス（6〜8週、22〜24g）はすべて遼寧省長生生物科技有限公司（Liaoning Changsheng Biotecnology Co. (Benxi, China)から入手した。このマウスは、毎日12時間明暗のSPFグレードの飼育環境で、十分な餌と水を与えて1週間飼育した。このマウスを飼育環境に適応させた後、同じ飼育条件の分離ケージに雌3匹、雄1匹の割合で混在させた。膣内精子の観察により妊娠を確認した後、雄マウスを取り出した。

DCA補充実験では、出産後7日目のマウスに、黄色ブドウ球菌誘発乳房炎モデル24を誘発する前に、DCA（10、20、30 mg/kg）を2時間腹腔内投与する前処置を行った。CAをDCAに変換し、乳房炎の病態を制御する腸内細菌叢の役割を確認するため、マウスにCA（30 mg/kg）またはDCA（30 mg/kg）を抗生物質処理（200 mg/kgアンピシリン、ネオマイシンおよびメトロニダゾール、100 mg/kgバンコマイシン）ありまたはなしにて1週間経口投与した。バンコマイシン処理実験では、マウスにバンコマイシン（0.5g/L）を3週間、飲料水に混ぜて投与した。C. scindens処理実験では、マウスを抗生物質（200 mg/kgアンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾール、100 mg/kgバンコマイシン）で5日間処理して常在微生物相を枯渇させ48、C. scindens（109 CFU/マウス）を連続7日間経口摂取により補充した26。

細菌胞子の調製と移植
SFB移植実験では、無菌状態で通常飼育のマウスから糞便内容物を採取し、氷上で1.5 mLマイクロチューブに加えた。PBS（w/v）で1：10に希釈し、クロロホルムを最終濃度3％（v/v）で添加し、糞便内容物を調製した。次に、調製した糞便内容物を200×gで37℃、30分間振盪してインキュベートした。室温でクロロホルムをチューブの底に沈殿させた後（約20分）、上部の水層を除去し、SFBを200μLのPBSで再懸濁し、滅菌1.5mLチューブに入れた35, 49. 移植のために、マウスをvancomycinで14日間前処理した後、毎日200μLのSFBで連続7日間処理した。

黄色ブドウ球菌誘発乳房炎モデル
分娩後7日目の授乳期マウスを3時間かけて子マウスから分離し、その後ウレタン（100 mg/kg）で麻酔をかけた。次に、これらのマウスにS. aureus USA300（107 CFU/50μL）を第4乳首に乳管内注入して処置した16,50。24時間後、乳腺組織を採取し、測定まで-80℃で保存した。

細菌培養と増殖アッセイ
S. aureus USA300をトリプトン大豆ブロス（TSB）培地で37℃にて培養した。C. scindens ATCC35704はAmerican Type Culture Collection (ATCC) から購入し，嫌気条件下で培養した．DCAとCAの菌体増殖への影響を調べるため，DCA（0，25.47，63.68，127.36，191.04，254.73，636.82，1273.65，1910.48および2547）を添加したTSB培地でS. aureus USA300をインキュベーションした． 31 μM）またはCA（0, 24.47, 61.18, 122.37, 183.56, 244.75, 611.89, 1223.78, 1835.67 and 2447.56 μM）を用い、37℃で24時間培養後、600nm光学密度（OD600）で細菌強度を測定した。

バイオフィルムアッセイ
DCAが黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成に影響を与えるかどうかを調べるために、黄色ブドウ球菌を、異なる濃度のDCAを添加した96ウェルプレートのTSB培地で培養した（0、25.47、63. 68, 127.36, 191.04, 254.73, 636.82, 1273.65, 1910.48 and 2547.31 μM）またはCA（0, 24.47, 61.18, 122.37, 183.56, 244.75, 611.89, 1223.78, 1835.67 and 2447.56 μM）の濃度を変えたものを加え、37℃、24時間振盪せずに培養を続けた。培養後，上清を注意深く除去し，プレート内のバイオフィルムを1%クリスタルバイオレット溶液で10分間染色した．最後に，各ウェルに200μLのエタノール（75%）を加え，OD57051で細菌バイオフィルムの検出を行った．

細胞培養と炎症反応アッセイ
マウス乳腺上皮細胞（MMECs、HC11細胞）は、American Type Culture Collection（ATCC、CRL-3062）から入手し、10％牛胎児血清、1％アンピシリンおよびストレプトマイシン添加DMEM中、37℃、5％CO2で培養を行った。BA処理実験では，アンピシリンとストレプトマイシンを除去した細胞（106 cells/mL）を6ウェルプレートで24時間培養し，用意した細胞をDCAの前にSBI115（100 μM），KH7（10 μM），MDL12330A（10 μM）またはH89（30 μM）で2時間処理した．DCA処理については、実験要求に応じて、最終濃度10、20、または30μMで、S. aureus処理の2時間前に実施した。siRNAトランスフェクション実験では、TGR5 siRNA、cAMP siRNA、PKA siRNA、およびネガティブコントロールsiRNAを、Opti-MEMおよびLipofectamine52を用いてトランスフェクションした。すべての siRNA を RNase フリー水で希釈し、最終濃度を 40 nM とした。細胞は、抗生物質と血清を含まないDMEMで24時間インキュベートし、その後完全培地で24時間インキュベートし、DCAをsiRNA感染後48時間添加した。準備した細胞を、予備実験の結果に従ってさらにS. aureus (MOI 100:1) で24時間処理し、細胞を採取して測定した。

組織学的解析
組織学的解析に用いた全ての試料は、4％パラホルムアルデヒドで48時間以上固定し、パラフィンに包埋して5μmのパラフィン切片を作製した。すべての切片は、脱脂と水和後にヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。乳腺の組織学的変化は、光学顕微鏡（Olympus、東京、日本）を用いて行い、組織学的スコアを評価した17。

サイトカインの検出
血清、乳腺、培養細胞上清中の炎症性サイトカインである TNF-α と IL-1β の優位性を ELISA アッセイで測定した。乳腺試料は、PBSを用いて10％組織ホモジネートを調製し、12,000×gで10分間遠心分離して上清を回収した。乳腺のTNF-αおよびIL-1βの濃度は、製造者の説明書（Biolegend, CA, USA）に従って算出した。

MPO活性アッセイ
MPOレベルを測定するために、10％組織ホモジネートをMPOバッファーを用いて調製し、製造業者の説明書に従ってMPOアッセイキット（A044-1-1）により検出した（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute、Nanjing、China）。

DCAおよびCA分析
乳腺 CA および DCA のレベルを検出するため，乳腺試料をセラミックビーズを含む溶解管で予め加重し，メタノール（MeOH）含有内部標準を添加した。MeOHで抽出したサンプルを遠心分離し、50％MeOH：水で1：1に希釈し、UPLC-MS52に注入しました。CAとDCAの濃度は，シグマから購入した市販の標準物質を用いて測定した。

全細菌のDNA抽出と配列決定
腸内細菌叢の解析のために、個々のマウスから糞便サンプルを採取した。FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, U.S.)を用いて、微生物ゲノムDNAの抽出を行った。V3-V4領域に特異的なプライマー（338 F（5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′），806 R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′））を用いて16S rRNA遺伝子ライブラリーを構築し、ABI GeneAmp® 9700 PCR サーモサイクラー（ABI．CA, USA）で行い、Illumina MiSeq PE300 platform/NovaSeq PE250 platform (Illumina, San Diego, USA) でペアエンドシーケンスを行い、Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.によるものである。Ltd. (中国、上海)によるものである。類似度97%のカットオフを持つ操作型分類単位（OTU）をUPARSEバージョン7.1を使ってクラスタリングし、キメラ配列を同定・削除した。各OTU代表配列の分類は、16S rRNAデータベースに対してRDP Classifier version 2.2を用い、信頼度閾値0.7で解析した。主座標分析により、Bray-Curtis距離に基づいて異なる治療群間の腸内細菌叢の分離を同定し、ANOSIMにより有意性を分析した。LEfSeを用いて、異なる治療群における差のある細菌分類群を同定した（LDAスコア（log10）> 3）。

Total RNA 抽出および定量的 RT-PCR
乳腺組織の total RNA は Trizol（Invitrogen, CA, USA）17によって抽出した。簡単に言えば、100 mg の組織または採取した細胞を 1 mL の Trizol で抽出し、RNase フリー条件下でクロロホルム、イソプロパノール、75%エチルアルコール処理に供した。TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Beijing, China) を用いて逆転写後、FastStart Universal SYBR Green Master Mix (ROX) (Roche, Switzerland, Basel) を用いて、Step One Plus装置 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) でcDNAと特定プライマーを反応させた。反応条件は既述17と同様に行った。本研究で使用したプライマーを補足表4に示し、GAPDHを内因性対照とした。2-ΔΔCt 法は、対照群とのキャリブレーションにより、遺伝子の相対発現量を算出するために行った。

ウェスタンブロッティング
組織タンパク抽出キット（Thermo Fisher Scientific, USA）17を用いて、乳腺の総タンパク質を採取した。10％または15％のSDS-PAGEでタンパク質を分離し、0.45μmのPVDF膜に結合させた。5％スキムミルクでブロッキングした後、調製したPVDF膜を、p-p65（#AF2006；1：1000）、p-65（#AF5006；1：1000）、p-IκB（#AF2002；1: 1000）、IκB（#AF5002；1：1000）、Occludin（#DF7504；1：1000）、ZO-1（#AF5145；1：1000）、Claudin-3（#AF0129；1：1000）、NLRP3（#15101；1：1000）、ASC（#67824；1：1000）、IL-1β（#12242；1：1000）及びβアクチン（#AF7018；1：1000）であった。TBSTで3回洗浄した後、PVDF膜をヤギ抗ウサギまたはウサギ抗マウスIgG（1：20000）で室温で2時間処理した。最後に、ECL plus western blotting Detection System (Tanon, China)を用いて、タンパク質を検出した。すべてのブロットまたはゲルは、同じ実験に由来し、並行して処理されたものである。オリジナルのブロットはSupplementary Informationに掲載されている。

統計解析
すべてのデータはGraphPad Prism 8 (San Diego, CA, USA)を用いて分析し、箱ひげ図または平均±SDとして表した。2群の比較にはStudentのt検定（パラメトリック）およびMann-Whitney検定（ノンパラメトリック）を実施した。2群以上の比較には一元配置分散分析（ANOVA）を行い，その後，Tukeyの検定で群間差を求めた．p < 0.05は統計的有意性を示す。その他の特別な解析は、凡例に記載されている。

報告書の要約
研究デザインに関する詳細な情報は、この論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryに掲載されています。

データの入手方法
16S rRNA遺伝子配列データは、NCBI Sequence Read Archive (SRA) リポジトリのアクセッション番号PRJNA892063で公開されています。

参考文献
Schnupf, P., Gaboriau-Routhiau, V. & Cerf-Bensussan, N. Modulation of the gut microbiota to improve innate resistance（腸内細菌叢を調節して自然免疫力を改善する）。Curr. Opin. Immunol. 54, 137-144 (2018).

論文

CAS

Google Scholar

Monedero, V., Collado, M. C. & Rodríguez-Díaz, J. Therapeutic opportunities in intestinal microbiota-virus Interactions（腸内細菌とウィルスの相互作用における治療の機会）。Trends Biotechnol. 36, 645-648 (2018).

論文

キャス

Google Scholar

Troha, K. & Ayres, J. S. Metabolic adaptations to infections at the organismal level（生物レベルでの感染症に対する代謝的適応）。Trends Immunol. 41, 113-125 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

Connolly, J. P. R. et al. Host-associated niche metabolism controls enteric infection through fine-tuning the regulation of type 3 secretion.（宿主関連ニッチ代謝は、3型分泌の制御を通じて腸管感染を制御する。Nat. Commun. 9, 4187 (2018).

論文

Google Scholar

Ng, K. M. et al. 微生物が解放した宿主の糖は、腸内病原体の抗生物質投与後の拡大を促進する。ネイチャー 502, 96-99 (2013).

論文

CAS

Google Scholar

Tovaglieri, A. et al.マイクロバイオーム代謝産物を介した腸管出血性大腸菌の病原性の種特異的な増強. Microbiome 7, 43 (2019).

論文

Google Scholar

Sun, X. et al. Microbiota由来の代謝因子はマウスのカンピロバクター症を軽減する。Gastroenterology 154, 1751-1763.e1752 (2018).

論文

キャス

Google Scholar

Stacy, A. et al. Infection trains the host for microbiota-enhanced resistance to pathogens.感染症は病原体に対する宿主の抵抗力を鍛える。Cell 184, 615-627.e617 (2021)。

論文

CAS

Google Scholar

Jacobson, A. et al. A gut commensal-produced metabolite mediates colonization resistance to Salmonella Infection.腸内常在菌が産生する代謝産物がサルモネラ菌感染に対するコロニー形成抵抗性を媒介する。Cell Host Microbe 24, 296-307.e297 (2018).

論文

キャス

Google Scholar

Fachi, J. L. et al. Butyrate protects mice from Clostridium difficile-Induced Colitis through an HIF-1-Dependent mechanism.酪酸はクロストリジウム・ディフィシル誘発性大腸炎からマウスを保護する。Cell Rep. 27, 750-761.e757 (2019).

論文

キャス

Google Scholar

You, J. S. et al. Commensal-derived metabolites governes Vibrio cholerae pathogenesis in host intestine.（宿主腸管におけるビブリオコレラの病原性を支配する。マイクロバイオーム 7, 132 (2019).

論文

グーグル スカラー

Park, S. & Ronholm, J. Staphylococcus aureus in Agriculture.農業における黄色ブドウ球菌。Lessons in Evolution from a Multispecies Pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 34, https://doi.org/10.1128/cmr.00182-20 (2021).

Lakhundi, S. & Zhang, K. Methicillin-resistant staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clin. Microbiol. Rev. 31, https://doi.org/10.1128/cmr.00020-18 (2018).

Holmes, M. A. & Zadoks, R. N. Methicillin resistant S. aureus in human and bovine mastitis（ヒトおよびウシ乳房炎におけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌）。J. Mammary gland Biol. Neoplasia 16, 373-382 (2011).

論文

Google Scholar

Ding, S. T. et al. メチシリン耐性およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌感染症による乳房膿瘍と超音波ガイド下吸引の治療効果. Breastfeed. Med: Off. J. Acad. Breastfeed. Med. 15, 471-474 (2020).

論文

Google Scholar

Hu, X. et al. 腸内細菌叢はマウスにおける黄色ブドウ球菌誘発性乳腺炎の発症に寄与している。ISMEJ. 14, 1897-1910 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

Zhao, C. et al. Lactobacillus reuteriトリプトファン代謝によるアリール炭化水素受容体活性化は、マウスの大腸菌誘発性乳腺炎を緩和する。PLoS Pathog. 17, e1009774 (2021).

論文

CAS

Google Scholar

Wang, Y. et al. Rumen microbiome structure and metabolites activity in dairy cows with clinical and subclinical mastitis（乳房炎の乳牛におけるルーメン微生物群の構造と代謝産物の活性）. J. Anim. Sci. Biotechnol. 12, 36 (2021).

論文

Google Scholar

Humer, E., Aditya, S. & Zebeli, Q. subacute ruminal acidosis後にリポポリサッカライドを乳房内にチャレンジした乳牛における自然免疫とメタボローム応答。Animal 12, 2551-2560 (2018).

論文

キャス

Google Scholar

Hu, X. et al. Rumen Microbiota contributes to the development of mastitis in dairy cows.（ルーメンマイクロバイオタは乳牛の乳腺炎発症に寄与する）。Microbiol. Spectr. 10, e0251221 (2022).

論文

Google Scholar

Shively, C. A. et al. 地中海式食事と西洋式食事の摂取は、異なる乳腺マイクロバイオーム集団につながる。Cell Rep. 25, 47-56.e43 (2018).

論文

キャス

Google Scholar

Soto-Pantoja, D. R. et al. Diet alters entero-mammary signaling to regulate the breast microbiome and tumorigenesis.（ダイエットは腸乳腺シグナルを変化させ、乳腺マイクロバイオームと腫瘍形成を制御する。Cancer Res. 81, 3890-3904 (2021).

論文

CAS

Google Scholar

Wang, S. et al. Diet-induced remission in chronic enteropathy is associated with altered microbial community structure and synthesis of secondary bile acids.慢性腸疾患における食事誘発性寛解は、微生物群集構造の変化と二次胆汁酸の合成と関連している。Microbiome 7, 126 (2019).

論文

Google Scholar

Guo, C. et al. 胆汁酸はNLRP3インフラマソームの阻害を介して炎症と代謝障害を制御する. Immunity 45, 802-816 (2016).

論文

CAS

Google Scholar

Long, S. L., Gahan, C. G. M. & Joyce, S. A. Interactions between gut bacteria and bile in health and disease（健康と病気における腸内細菌と胆汁の相互作用）. Mol. Asp. Med. 56, 54-65 (2017).

論文

CAS

Google Scholar

Hu, J. et al. 腸内細菌叢が介在する二次胆汁酸は、TGR5シグナルを介して樹状細胞を制御し、自己免疫性ブドウ膜炎を減弱させる。Cell Rep. 36, 109726 (2021).

論文

CAS

Google Scholar

Sorrentino, G. et al. 胆汁酸はTGR5を介したシグナルにより腸管幹細胞を活性化し、上皮再生を行う。Gastroenterology 159, 956-968.e958 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

Masyuk, T. V. et al. TGR5は、環状アデノシン一リン酸/Gαsシグナルを介して、多嚢胞性肝疾患を持つネズミの肝嚢胞形成に寄与している。Hepatology 66, 1197-1218 (2017).

論文

キャス

Google Scholar

Yu, S., Liu, X., Yu, D., Changyong, E. & Yang, J. Morin protects LPS-induced mastitis via inhibiting NLRP3 Inflammasome and NF-κB signaling pathways.モリンはLPS誘発乳房炎を予防する。Inflammation 43, 1293-1303 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

Ye, J. et al. Scutellarin inhibits caspase-11 activation and pyroptosis in macrophages via regulating PKA signaling.スクテラリンは、マクロファージにおけるカスパーゼ11の活性化およびパイロプトーシスを抑制する。Acta Pharm. Sin. B 11, 112-126 (2021).

論文

CAS

Google Scholar

H89はプロテインキナーゼA（PKA）の阻害剤であり、ラット胎児肺胞Ⅱ型上皮の上皮性Na+チャネル（ENaC）を転位させることによりNa+輸送を促進させる。Biochem Pharm. 66, 1083-1089 (2003).

論文

CAS

Google Scholar

Wang, Y. et al. 総説：腸管障害関連肝疾患における胆汁酸-腸内細菌叢軸への洞察-治療アプローチの再定義. Aliment. Pharmacol. Ther. 55, 49-63 (2022).

論文

Google Scholar

Ma, J. et al. Gut microbiota remodeling reverses aging-associated inflammation and dysregulation of systemic bile acid homeostasis in mice sex-specific. Gut Microbes 11, 1450-1474 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

Vrieze, A. et al.腸内細菌叢、胆汁酸代謝、インスリン感受性に対する経口バンコマイシンの影響。J. Hepatol. 60, 824-831 (2014).

論文

CAS

Google Scholar

Grizotte-Lake, M. et al. Commensals suppress intestinal epithelial cell retinoic acid synthesis to regulate Interleukin-22 Activity and prevent microbial dysbiosis.腸管上皮細胞のレチノイン酸合成を抑制し、微生物によるディスバイオシスを防ぐ。Immunity 49, 1103-1115.e1106 (2018).

論文

キャス

Google Scholar

Studer, N. et al. Clostridium scindensによる機能的な腸内胆汁酸7α-脱ヒドロキシル化とGnotobioticマウスモデルにおけるClostridium difficile感染からの保護との関連性. Front. Cell. Infect. Microbiol. 6, 191 (2016).

論文

Google Scholar

Debnath, N., Kumar, R., Kumar, A., Mehta, P. K. & Yadav, A. K. Gut-microbiota derived bioactive metabolites and their functions in host physiology.腸内細菌由来の生理活性代謝物と宿主生理におけるその機能. バイオテクノ. Genet. Eng. Rev. 37, 105-153 (2021)に掲載されました。

論文

Google Scholar

Zhang, T. et al. 亜急性ルーメンアシドーシスに対する感受性の異なる乳牛におけるルーメン微生物とメタボロームの応答性の変化。Anim. Nutr. 8, 331-340 (2022).

論文

CAS

Google Scholar

Zhang, G. et al. 乳牛の不顕性乳房炎の血清予測バイオマーカーの同定と本疾患の病理生物学への新たな洞察。J. Agric Food Chem. 70, 1724-1746 (2022).

論文

CAS

Google Scholar

Wang, J. et al. DCA-TGR5シグナル活性化は、心筋梗塞における炎症反応を緩和し、心機能を改善する。J. Mol. Cell. Cardiol. 151, 3-14 (2021).

論文

CAS

Google Scholar

Wang, Y. et al. 不顕性乳房炎を発症した乳牛にイヌリンを給与した後の糞便中の微生物叢および代謝物、血清中の代謝物およびプロテオームのプロフィールにおける変化。Front. Microbiol. 13, 809139 (2022).

Google Scholar

Wang, Y. et al. 健常牛、潜在性乳房炎牛、臨床性乳房炎牛の糞便マイクロバイオームおよびメタボロームと血清メタボロームにおける不一致。J. Dairy Sci. 105, 7668-7688 (2022).

論文

CAS

Google Scholar

Thomas, F. C. et al. Mastitomics, the integrated omics of bovine milk in an experimental model of Streptococcus uberis mastitis: 3. Untargeted metabolomics. Mol. Biosyst. 12, 2762-2769 (2016).

論文紹介

CAS

Google Scholar

Olson, M. A. et al. 胆汁酸塩は、乳房炎関連腸管外病原性大腸菌株における亜鉛の取り込みおよびカプセル合成を調節する。Infect. Immun. 89, e0035721 (2021).

論文

Google Scholar

Raimondi, F. et al. 胆汁酸はEGFRの活性化を介してCaco-2単層膜のタイトジャンクション構造およびバリア機能を調節する。Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, G906-G913 (2008).

論文

CAS

Google Scholar

Orton, T., Rohn, K., Breves, G. & Brede, M. Alterations in fermentation parameters during and after induction of a subacute rumen acidosis in the rumen simulation technique.ルーメンシミュレーション技術における亜急性ルーメンアシドーシスの発生とその後の発酵パラメータの変化。J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 104, 1678-1689 (2020)に掲載されました。

論文

CAS

Google Scholar

Eger, M., Riede, S. & Breves, G. Induction of a Transient Acidosis in the rumen simulation Technique. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 102, 94-102 (2018).

論文

CAS

Google Scholar

Chen, X. et al. Gut dysbiosis induces the development of pre-eclampsia through bacterial translocation.腸内細菌異常症は子癇前症の発症を誘発する。Gut 69, 513-522 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

Velazquez, E. M., Rivera-Chávez, F. & Bäumler, A. J. Spore preparation protocol for enrichment of clostridia from murine intestine.（マウス腸管からのクロストリジウムの濃縮のための胞子調製プロトコル）. Bio-protocol 7, https://doi.org/10.21769/BioProtoc.2296 (2017).

Jiang, K. F. et al. Polydatin ameliorates Staphylococcus aureus-induced mastitis in mice via inhibiting TLR2-mediated activation of the p38 MAPK/NF-κB pathway. Acta Pharmacol. Sin. 38, 211-222 (2017).

論文

CAS

Google Scholar

Qiu, M. et al. 牛乳由来のコメンサル枯草菌は、マウスにおける黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成と乳房炎を抑制する。FEMS Microbiol. Ecol. 98, https://doi.org/10.1093/femsec/fiac065 (2022).

Chaudhari, S. N. et al. Bariatric surgery reveals a gut-restricted TGR5 agonist with anti-diabetic effects.（肥満手術により、抗糖尿病効果を持つ腸内制限されたTGR5アゴニストが明らかになった。Nat. Chem. Biol. 17, 20-29 (2021)に掲載されました。

論文

CAS

Google Scholar

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謝辞
本研究を進めるにあたり、Zhang研究室から建設的なご指摘をいただいたことに感謝する。また、中国国家自然科学基金（32122087, 32102738, 31972749）および吉林省自然科学基金（20220101298JC）に謝意を表したい。

著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Caijun Zhao, Keyi Wu.

著者と所属
吉林大学獣医学部臨床獣医学部、吉林省長春市、130062、中国

Caijun Zhao, Keyi Wu, Haoyang Hao, Yihong Zhao, Lijuan Bao, Min Qiu, Yuhong He, Zhaoqi He, Naisheng Zhang, Xiaoyu Hu & Yunhe Fu, 吉林大学獣医学部臨床獣医学科

貢献度
C.Z.、Y.F.、N.Z.は研究の設計を行った。C.Z.とK.W.はマウス動物実験、メタボロミクス、およびすべての統計解析を行った。L.B.、H.H.、Y.Z.はin vitroの実験を行った。X.H.は牛の実験とサンプル採取を行った。M.Q.、Z.H.、Y.H.は、動物実験および実験パラメータの決定を支援した。N.Z.、X.H.、Y.F.は資金を得た。C.Z.は原稿を執筆し、全著者が原稿を修正・承認した。C.Z.とK.W.はこの研究に等しく貢献した。

対応する著者
Xiaoyu HuまたはYunhe Fuにご連絡ください。

倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。

追加情報
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補足情報
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権利と許可
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転載と許可

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この記事の引用
Zhao, C., Wu, K., Hao, H. et al. Gut microbiota-mediated secondary bile acid alleviates Staphylococcus aureus-induced mastitis through the TGR5-cAMP-PKA-NF-κB/NLRP3 pathways in mice. npj Biofilms Microbiomes 9, 8 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00374-8。

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受付終了
2022年5月6日

Accepted
2023年1月17日

公開
2023年2月8日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41522-023-00374-8

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研究テーマ
細菌学
病原体
バイオフィルムとマイクロバイオーム（npj Biofilms Microbiomes） ISSN 2055-5008 (オンライン)

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