n-6系高脂肪食による腸内細菌叢の異常増殖と大腸炎症の誘発

哉百名

n-6系高脂肪食による腸内細菌叢の異常増殖と大腸炎症の誘発

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8269411/

オルネラ I. セルミン、アンドレアス・J・パポウティス、［...］、ドナート・F・ロマニョーロ

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関連データ
補足資料
データ提供について
要旨
背景 n-6系PUFA（n-6HFD）を多く含む高脂肪食は、腸内細菌叢を変化させ、腸内障害のリスクを高める可能性があることが懸念されている。離乳期からのn-6HFDの摂取と成人期における腸内細菌の異常および大腸炎症の発症との関係をモデル化する研究が必要である。我々は、C57BL/6Jマウスモデルを用いて、炭水化物、脂質、タンパク質からそれぞれ58.4%、27.8%、13.7%のエネルギー（%E）を供給する典型的なアメリカの西洋食（WD）への曝露が、総脂質と炭水化物からそれぞれ50%と35.9%のエネルギーを供給する等カロリーと等蛋白の大豆油に富んだn-6HFDへの曝露と腸の炎症とマイクロバイオームプロファイルに与える影響を比較するために使用する。方法 離乳期の雄子供を、10-16週齢までWDまたはn-6HFDのいずれかに割り付けた。WDはパーム油由来の脂肪のみを含み、n-6HFDは大豆油由来の脂肪のみを含んでいた。体重、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）発現、結腸組織病理学、および腸内マイクロバイオームプロファイルの変化を記録した。結果 WDと比較して、n-6HFDは、n-6脂肪酸の血漿レベル、COX-2の大腸発現、および大腸の炎症性および過形成性病変の数を増加させた。16週齢において、n-6HFDは腸内のFirmicutes, Clostridia, Lachnospiraceaeの存在を著しく減少させ、BacteroidetesとDeferribacteraceaeの成長を誘発した。種レベルでは、n-6HFDは炎症性のMucispirillum schaedleriとLactobacillus murinusの腸内成長を維持する。結論 離乳期から成人に至るまで摂取したn-6HFDは、大腸の炎症に関連する腸内細菌プロファイルのシフトを誘発する。

キーワード：オメガ6、脂肪酸、腸内細菌、ディスバイオーシス、大腸、炎症

  1. はじめに
    過去20年の間に、小児および成人の炎症性腸疾患（IBD）の発生率が増加している[1,2]。米国だけでも、約140万人の成人がIBDに苦しんでいます。遺伝的要因は、クロノ病（CD）の約14％から潰瘍性大腸炎（UC）の約7.5％までと、わずかな割合に過ぎません[3]。飽和脂肪酸（SFA）の摂取制限を推奨する最近の動きと同時に [4] 、主に 18:2n-6 リノール酸（LA）を多く含む植物油からの n-6 多価不飽和脂肪酸（PUFA）の摂取が著しく増加している [5]．しかし、n-6系PUFAを多く含む高脂肪食（HFD）（n-6HFD）は、腸の病気 [6,7] と肥満 [8] のリスクを悪化させるという懸念が出てきた。これらの懸念は、一価不飽和脂肪酸（MUFA）とn-3 PUFAが豊富で [9] n-6 PUFAが少ない他の食事パターンを順守することで腸の炎症のリスクが低下するという証拠からも導かれる [10]。後者は大腸がんを誘発しやすい状態である[11,12]。

食事脂肪の種類と相対量、暴露のタイミングと期間は、腸内細菌の異常と腸の炎症のリスクに影響を与える可能性がある。例えば、脂肪から10%のエネルギー（%E）を供給する低脂肪食（LFD）と比較して、n-6 PUFAを豊富に含むHFD（脂肪から60%E）（脂肪の総量は約30%）は、グラム陰性腸内細菌数およびシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）とサイトカインの発現増加、腸管透過性上昇によって特徴づけられる腸の炎症を増加させます [13]（※1） ．しかしながら、ヒトの n-6HFD 摂取をモデル化したほとんどのげっ歯類研究は、短期間の摂食（～2～8 週間）に焦点を当てている [13,14,15,16,17,18] が、若年成人（8～12 週間）から成人（>12 週間）の n-6HFD 摂取をモデルとした微生物生態のげっ歯類腸管調査はほとんどない [19]．この知識のギャップに対処するために、この研究の目的は、マウスモデルにおいて、離乳期から成体までn-6HFDを与えることが、西洋食（WD）によって誘発されるものと比較して、大腸炎症および腸内細菌プロファイルのエンドポイントに与える影響を調べることであった。n-6HFDは、脂肪から50％Eを供給するように処方され、そのうち28％Eは大豆油からのLAであった。WDは等カロリーかつ等タンパクで、12歳から29歳のアメリカ人の典型的な食事をモデルとして設計されており、炭水化物、脂肪、タンパク質からそれぞれ〜50％E、35％E、15％Eを構成し、SFAが〜13％Eであるのに対し、PUFAからはわずか〜7.5％Eである [20]．WDはパーム油からの脂肪のみを含み、n-6HFDは大豆油からの脂肪のみを含む。我々は、WDと比較して、離乳期からのn-6HFDの長期（16週間）摂取は、成人期に、大腸の炎症性病変と前腫瘍性病変の数および炎症マーカーCOX-2の発現に変化をもたらすことを報告する。さらに、n-6HFDは、腸の顕著な病的成長を誘発する。

  1. 結果
    2.1. 体重および血漿脂肪酸プロファイル
    餌の栄養および脂肪組成（材料および方法を参照）は、WDがパーム油のみから脂肪を供給するのに対し、n-6HFDは大豆油のみから脂肪を含むことを示している。16週齢までに、n-6HFD飼料を与えた動物はWDを与えた動物よりも平均で約25%体重が増加し（図1）、両群間の体重増加は10週齢から有意に分岐し、それ以降は増加した。これらの結果は、齧歯類モデルおよび同様の期間でのHFDを用いた以前の摂食試験の結果と平行するものであった[21]。

図1
図1
n-6HFDはWDと比較して雄C57BL.J6マウスの高体重を誘導する。アスタリスクは統計的有意性を示す（p < 0.05, n = 15）。
血漿中の脂肪酸を測定したところ（図2）、WDと比較して、n-6HFDを与えると10週間および16週間において、16:0パルミチン（〜24%から17%）、16:1n7パルミトレイン（〜2.5%）のレベルが低下することがわかった。 8％から0.5％）、18：1n9オレイン酸（〜22.0％から8.0％）、20：4n6アラキドン酸（〜13％から10％）、および10週目の20：3n6ジホモ-γ-LA（〜2.0％から0.8％）であった。逆に、WDと比較して、n-6HFDは10週と16週で18:2n6 LA（〜20％から〜40％）、18:3n3 α-リノレン酸（検出不能から〜2.0％）、22:6n3 ドコサヘキサエン酸（〜1.2から〜4.0％）、そして16週で18:0ステアリン酸（10から12％）の血漿中の濃度が増加する。統計的な差異が認められなかった他の血漿脂肪酸のデータは、図S1（補足資料）に報告されている。全体として、これらのデータは、WDのマウスと比較して、n-6HFDを与えた動物の血漿脂肪酸プロファイルにおける重要なシフトを記録している。

図2
図2
WDまたはn-6HFDを10週齢および16週齢まで与えたC57BL/J6雄マウスの血漿脂肪酸プロファイル。棒グラフは、16:0パルミチン酸；16:1n7パルミトレイン酸...の血漿総脂肪酸の平均パーセント値＋SD（10および16週の各餌についてn = 5）を表す。
2.2. 病理組織学的解析とCOX-2の発現
大腸の炎症性病変および過形成病変の例を図 3 に示す。

図3
図 3
WDまたはn-6HFDを摂取させたC57BL/J6雄マウスの大腸組織の組織学的解析。(A) WDを与えた10週齢の雄マウスにおける陰窩の配置を示す正常な大腸の切片の例。矢印は粘膜関連リンパ組織（MALT）...を指す。
10週齢では、WDを与えたすべての動物が正常な結腸の病理組織を示し、16週齢までには、WD群の1/5の動物だけが慢性活性から慢性炎症と中程度の過形成の証拠を示している（Table 1）。

表1
表1
観察された大腸の炎症事象。
n-6HFDとの関連では、10週齢で1匹だけが最小の慢性活動性炎症を呈するが、16週齢までに5匹中3匹が過形成病変と軽度の線維化を特徴とする異常組織病理学を示す。COX-2の過剰発現はIBDのマーカーであるため[22]、対照として、大腸粘膜のCOX-2のタンパク質レベルを評価した（図4A）。n-6HFD食を与えた動物は、WD群と比較して、平均してCOX-2レベルが約3.0倍増加した（図4B）。全体として、病理組織学的およびCOX-2発現データは、n-6HFDの長期摂食が結腸における炎症および過形成病変の有病率を増加させることを示す。

図4
図4
n-6HFDは大腸粘膜でCOX-2の発現を誘導する。(A) WDまたはn-6HFDを与えた代表的な16週齢のC57BL/J6雄マウス2匹の腸管粘膜からのタンパク質抽出物におけるCOX-2のウェスタンブロット。(B)総タンパク質染色コントロール。(C)棒グラフは平均値．
2.3. ネコ科微生物叢の多様性
マウス糞便のDNAからショットガンNGSを行った結果、20匹のマウスから合計5200万リードがフィルターを通過し、平均264万3520リード/サンプル、標準偏差は±19万3453であった。Chao1法を用いたマイクロバイオームのα-多様性（サンプル内）の計算では、10週齢または16週齢の食餌間の種の豊かさに有意な変化があることは示唆されなかった（図5A）。しかし、シンプソン（均等性）（図5B）およびシャノン（豊かさと均等性）（図5C）指数はともに、10週齢ではなく16週齢においてWD給餌マウスと比較してn-6HFD給餌マウス間で発散を示した。これらの解析は、2つの食餌グループ間のマイクロバイオームプロファイルの時間依存的な変化を示している。

図5
図5
WDまたはn-6HFDを与えたC57BL/J6雄マウスの腸内細菌叢のα多様性。箱ひげ図は、(A) Chao1, (B) Simpson, ... を用いて推定したWDまたはn-6HFDを与えた10週齢および16週齢のC57BL/J6雄マウスの腸内細菌叢のα多様性を示すもので、(B) Simpson, ... は、C57BL/J6雄マウスの腸内細菌のα多様性(C.D.D.D.D.)を示している。
ベータダイバーシティ解析（図6）により、10週齢時点ではWD群とn-6HFD群の動物が混合していることが明らかになった（図6A）が、16週齢時点では食餌によって糞便マイクロバイオームが大きく異なる（p＜0.01）ことがわかった（図6B）。

図6
図6
WD-およびn-6HFDを与えたC57BL/J6雄マウスの糞便微生物叢のBray-Curtis Distance Matrix（ブレイカーティス距離行列）。A）10週および（B）16週における各マウスの細菌プロファイルに基づくBray-Curtis順序付けプロット。の間の微生物相の距離...
10週目に採取したサンプル（図7A）と比較して、主成分（PC）分析では、16週目のn-6HFD給餌マウスと比較してWD-からの糞便サンプルの明確な分岐が明らかになり（図7B）、PC1が変動の67.76％を捉え、食餌曝露による時間依存的分岐が強調されている。

図7
図7
WDおよびn-6HFD給餌C57BL/J6雄マウスの腸内細菌叢の主成分分析。図軸は、主成分1（PC1）およびPC2によって説明される分散のパーセントを表す。プロットは、...の細菌相対存在量プロファイルに基づくものである。
2.4. 微生物叢の構成
10週齢の時点では、有意水準（p = 0.10）が時間依存的な差異の傾向を示唆しているものの、WDとn-6HFD食の間の腸内細菌組成に差異はない（データは示していない）。興味深いことに、16週齢までに（図8A）、我々は、セカルサンプルにおける相対的なファイラ存在度の違いを見ており、WDグループの74.2％からn-6HFDマウスの44.5％までFirmicutesが減少し、これはBacteroidetes（19％から32％）、Deferribacteres（1.5％から7.0％）およびVerrucomicrobia（0.1から2.8％）の相対存在度が濃縮されて並行している（図8B）。

図8
図8
16週齢のC57BL/J6雄マウスの糞便サンプルにおける細菌のPhyla相対存在量。(A) 列はWDまたはn-6HFDを与えた個々のマウスを表し、バーは細菌門存在量の相対パーセント（全体の％）を捕捉している。(B) Box-and-whisper ...
腸内細菌叢の大部分は堅果類であり[19]、脂肪源は微生物プロファイルに影響を及ぼす[23]という事実を踏まえ、この門の大部分を占めるクラスChlostridiaの存在量を分析した。その結果、16 週齢の n-6HFD は、クロストリジウムの割合を 58.0% から 25% へと顕著に減少させることがわかった (図 9)。

図9
図9
16 週齢の C57BL/J6 雄マウスの糞便サンプルにおけるクロストリジウム属菌の相対存在量。箱ひげ図は、16週齢のWDおよびn-6HFD給餌マウスの糞便サンプルにおける相対的なパーセント存在量である。データは、Mann-Whitney ... を用いて解析した。
ファミリーレベルでは、n-6HFD群では、Deferribacteraceae (1.0% to 7.3%), Porphyromonadaceae (5.2% to 8.0%), Lactobacillaceae (1.0% to 6.0%) のメンバーの存在量が増加し（図10A）、Chlostridiaクラスに属するLachnospiraceaeは50%から16%へと相対存在量が減少している（図10B）。

図10
図10
16週齢のC57BL/J6雄マウスの糞便サンプルにおける細菌のファミリー相対存在量。(A) 列はWDまたはn-6HFDを与えた個々のマウスを表し、バーは細菌のファミリー存在比（全体の％）を捉えている。(B)箱と...
n-6HFDマウスの腸内細菌叢では、例えばLachnospiraceae bacterium 10-1は38.0%から2.0%に減少しており、これに対応する減少傾向が種レベル（図11）でも観察されている。逆に、Mucispirillum schaedleriとLactobacillus murinusはそれぞれ1.5%から7.20%、1.0%から6.0%へと増加している。

図11
図11
生後16週齢の細菌の種間相対量。アスタリスク（*）の付いた中央値は異なる、p < 0.05。
全体として、この分類学に基づく糞便微生物叢の解析は、WDおよびn-6HFD食が腸内微生物叢に及ぼす影響の差について重要な洞察を与える。

  1. 考察
    米国では、主に植物油からのn-6系脂肪酸の消費量が過去20年間にかなり増加している[5]。MUFAやn-3脂肪酸を多く含む他の食事パターンと比較して[24]、n-6脂肪酸を多く含む食事は腸の炎症 [6]、大腸がん [7]、肥満 [8] のリスクを増大させる。ヒトのn-6HFDの消費をモデル化したほとんどのげっ歯類研究は、短期間の摂食（〜2〜8週間）に焦点を当てている[13,14,15,16,17,18]が、若年成人（8〜12週間）〜成人（12週間以上）のヒトによるn-6HFDの消費をモデルとした微生物生態のげっ歯類腸の調査はほとんどない [19]．以前、我々は、LAを豊富に含むn-6HFDの大腸に対する炎症促進効果を報告した[25]。ここでは、離乳から成体までの食事摂取をモデル化するために、雄マウスの仔マウスを離乳時にWDまたはn-6HFDのいずれかに10週齢と16週齢まで割り当てた。WDは炭水化物から58E％、脂肪から27.8Eを供給し、大豆油からのLAで強化した等カロリー、等タンパク質のn-6HFDと比較した。WDはパーム油由来の脂肪のみを含み、n-6HFDは大豆油由来の脂肪のみを含んでいた。以前の報告[14]と一致して、我々は、10週齢と16週齢において、WDの動物と比較して、n-6HFDは血漿LAの2倍の増加、パルミトレイン酸とオレイン酸の減少を維持し、高い体重増加を伴うことを示す。この肥満反応は、大腸のCOX-2発現の増加、炎症性および過形成性病変の蓄積と関連している[26]。

腸内細菌は、IBDの発症に重要な役割を果たします[1]。一般に、腸内細菌叢の約90%は、ヒトとマウスの両方で、ファーミキューテスとバクテロイデットによって構成されています[19]。我々は、16週齢のWD飼育動物において、ファーミキューテスとバクテロイデテス門がそれぞれ全微生物叢の〜70％と20％を占めることをここに示す。しかし、n-6HFDを与えた動物の糞便サンプルでは、この相対的な微生物プロファイルが変化し、Firmicutesが失われ、Bacteroidetes、Deferricateteres、Verrucomicrobiaが優先されるようになった。これらのシフトは、ファーミキューテス門の主要なクラスであるクロストリジウムの大幅な減少を伴っている。紅花油からのLAとして約38%のEを含む餌を与えたマウスでは、バクテロイデーテスの存在率が高く、ファーミキューテスの増殖が低いことが報告されている[27]。FirmicutesとClostridiaの減少、BacteroidetesとVerrucomicrobiaの増加は、azoxymethaneとdextran硫酸ナトリウムに誘発された大腸の炎症と腫瘍形成に特徴的な微生物シフトである[28]。腸内細菌群の変化は、腸内胆汁酸（BA）再吸収を活性化するファルネソイドX受容体（FXR）の能力 [29] とCOX-2発現抑制 [30] に影響を与える可能性がある。クロストリジウム属菌の減少は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性の低下に関連する。後者はBAの脱共役に寄与し、FXR拮抗薬として認識されているタウリン共役β-ムリコール酸（TβMCA）（ヒトではほとんどがグリシン共役）のネズミの腸内蓄積につながる[31]。最近、我々は、WDと比較して、n-6HFDは小腸、結腸、肝臓でFXRの発現を誘導し、また、糞便試料中の一次chenodeoxycholic（CDCA）とcholic（CA）胆汁酸、および肝臓の総BAsレベルを増加させることを明らかにした。しかし，n-6HFD食は，TβMCA の糞便レベルを増加させた[32]．したがって、ここで記録されたn-6HFD依存性のCOX-2発現刺激は、Firmicutes、より具体的にはClostridiaのコロニー化の減少、およびFXR発現が増加したにもかかわらずTβMCAが蓄積したことによるFXR活性阻害に関連していると思われる。この推論は、飽和パームが豊富でLAが豊富な大豆油が少ないHFDは、腸内のファーミキューテスおよびクロストリジウム属の濃縮を促進するという証拠によって支持されている[16,17]。

ヒトの場合、CD患者ではFirmicutes属の減少が見られ[33]、IBDの重症度の上昇と相関している[34]。また、肥満の人は正常体重の人と比べて、バクテロイデット目の腸内細菌がより頻繁に増加することが分かっています[35]。これらの観察と一致するように、我々は、16週齢までにn-6HFDがLachnospiracease（Clostridia）の相対存在度を低下させ、病原性DeferribacteraceaeとPorphyromonadaceaeファミリーの寄与を増加させることを示す。LachnospiraceaeとClostridiaceaeの減少は、UC [33]、子供、そして新たにCDと診断された青年で見られる[36]。逆に、DeferribacteraceaeとPorphyromonadaceaeの蓄積は、DSS誘発性潰瘍性大腸炎に特徴的である[37]。

種レベルでは、n-6HFDを与えた16週齢のマウスは、Lachnospiraceae bacterium 10-1の減少を示し、Mucispirillum schaedleriとLactobacillus murinusが増加した。グラム陰性嫌気性菌である Mucispirillum schaedleri (Bacteroidetes/Deferibacteraceae/Bacteroidetes) の濃縮は、ネズミのCD様大腸炎の発症に関連している [38]．Mucispirillum schaedleriは、腸内炎症時の微酸性および酸化還元条件によく適応するようであり[39]、リポポリサッカライド産生を介してdecapentaplegic homolog-3-deficient mouseにおける腸内炎症および大腸ガンに寄与している[40]。通常、乳酸菌は腸内疾患予防のプロバイオティクスとして考えられているため、LactobacillaceaeとLactabacillus murinusの蓄積は他に類を見ないほど興味深いものである[41]。一方、n-6HFD（脂肪由来45％E；n-6／n-3＝13）を与えたマウスの後腸では、乳酸菌の存在量が増加するようで、これは炎症性サイトカイン、レプチン、TNFαの血漿濃度の上昇と相関している[42]。同様に、高炭水化物（66％）食と比較してHFD（60％脂肪）食を与えたマウスでは、乳酸菌の割合が高く、Clostridialesの存在量が低いことが記録されている[43]。Lactobacillus murinusの存在量の増加は、一次CAと二次デオキシコール胆汁酸の高い血清レベルと相関している。したがって、WDと比較して、LAを豊富に含むn-6HFDは、Lactobacillus属の相対的な存在量を変化させ、Lactobacillus murinusの過繁殖を有利にする可能性がある[44]。

高繊維食のヒト被験者では、酪酸などの短鎖脂肪酸（SCFA）の腸内レベルが上昇し、大腸炎症のリスクが低下している[45]。酪酸は、COX2の転写活性化に関与する転写因子である核因子k-Bの抑制を通じて、炎症に拮抗する[46]。WDと比較して、この研究で与えられたn-6HFDは、より高いレベルのセルロース（290対155g/kg食）およびより低いレベルのコーンスターチ（87.5対267g/kg食）を提供する。非デンプン性多糖類（NSP）ベースの飼料では Lachnospiraceae の強い蓄積が予想される [47]。逆に、n-6HFDのセカールペレットは、大腸のNSPからの酪酸の主な生産者であるLachnospiraceaeを含むFirmicutesの減少を示す[48]。この微生物のアンバランスは、LAがFirmicutes門の細菌（すなわち、Lactobacillus属）の成長を阻害している腸内の脂肪酸のレベルの変化 [43] に起因すると考えられる [49]。HFD食のマウスでは、LAを補給すると腸内のFirmicutesの存在量が減少するが、Lactobacillaceaeの増殖は維持される[50]。まとめると、これらのデータは、LAを多く含むn-6HFDは、比較的高いレベルの食事性NSPにもかかわらず、LachnospiraceaeとClostridiaを含むFirmicutesを選択的に抑制し、一方で炎症性Bacteroidetesの成長を促進することによって腸の系統的変化を引き起こすことを示唆している[51]。実験上の制約から、また焦点を合わせるために本研究は雄マウスに限定されたが、性特異的な要因がn-6HFDに対する微生物叢および腸の炎症反応に影響を与える可能性があることを認める。したがって、雌のモデルでn-6HFDへの食物曝露をモデル化する比較研究が正当化され、我々のグループが現在行っている研究の主題である。

  1. 材料と方法
    4.1. 動物、飼料および試料の採取
    C57BL/6J マウス (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) のブリーダーペアに、AIN93M 精製飼料 (Envigo/Teklad, Indianapolis, IN, USA) を与えた。ダムは、妊娠中および授乳期の間、この飼料で維持された。離乳時、雄マウスは10週齢または16週齢まで、脂肪由来27.8%Eを含むWD（パーム油11重量%）または脂肪由来50.3%Eを含む等カロリーのn-6HFD（大豆油20重量%）に割り当てられた（図12）。

図12
図12
実験デザインおよびマウス動物モデル。C57BL/J6 ダムに妊娠期および授乳期を通じて精製飼料 AIN-93 を与えた。離乳時に、雄マウスは10-16週まで西洋食（WD）またはn-6高脂肪食（n-6HFD）のいずれかに割り当てられた．
WDとn-6HFDは、炭水化物（コーンスターチ）と食物繊維（セルロース）の割合を調整することにより、等カロリー（kcal/g）となるように配合したが、タンパク質、糖質、ビタミン、ミネラルの割合は両者の間で変更しなかった（表2および表3）。

表2
表2
飼料の栄養組成 a.
表3
表3
飼料の脂肪酸組成 a.
仔牛には餌と水を自由に与え、体重は毎週測定した。実験期間終了後、動物を犠牲にし、血液、セカルペレットおよび結腸粘膜を採取した。ヘパリン処理した血液から14,000 rpm、4℃で10分間遠心分離後、血漿を抽出し、凍結保存した。粘膜細胞の採取は、既報の通り行った[51]。掻き出した大腸細胞をPBSで洗浄した後、14,000 rpm、4℃で10分間遠心分離することにより分離した。

4.2. ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロッティングは、以前に記載したように行った[52]。簡単に言えば、1%濃度のプロテアーゼ阻害剤（VWR International, Radnor, PA, USA）を含むPierce RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) に30 mgの組織を懸濁させ、結腸粘膜から総タンパク質を抽出した。サンプルは氷上で45分間、時々ボルテックスしながらインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを16,000×g、4℃で10分間遠心分離し、タンパク質溶解液から細胞残屑を分離した。タンパク質濃度は、Nanodrop1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)を用いて決定した。サンプルは、100μgのタンパク質（水で規格化）を65℃で4分間加熱することにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用に調製した。次に、1％のβ-メルカプトエタノールを含む等量のLaemlliバッファー（Biorad，Hercules，CA，USA）を添加した。この混合物を水浴中で4分間加熱し、室温まで4分間冷却した後、10,000×gで30秒間遠心した。タンパク質をNovex Wedgewell 4-12% tris-glycine gels (Invitrogen, Waltham, MA, USA) で100Vの一定電圧で約75分間かけて分離した。タンパク質をMini Blot Module and Mini Gel Tank (Invitrogen) wet-transfer systemを用いてニトロセルロース膜 (Amersham, Amersham, UK) にトランスファーした。転写はトリスグリシン転写バッファー（15％メタノール）中、15Vで45分間実施した。ブロッキングは、1% NaClを含むトリス緩衝生理食塩水に溶解した1%カゼインブロッキングバッファーで室温で1時間行った。COX-2に対するポリクローナル抗体（Novus Biologicals, Littleton, CO, USA）および抗ウサギ二次抗体（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA）をTBS + 0.01% tweenに溶解した1%カゼインブロッキングバッファで希釈し、4℃で一夜インキュベーションを実施した。その後、ニトロセルロース膜を二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。免疫複合体はOdyssey CLx scanner (LI-COR Biosciences)を用いて近赤外線で検出した。シグナル定量のコントロールとして総タンパク質の染色を行った[53]。染色は Revert Total Protein Stain と ImageStudio Lite (LI-COR Biosciences) を用いて行った。

4.3. セカルペレット中の微生物相の塩基配列決定
DNA/RNA Shield（Zymo Research, Irvine, CA, USA）で保存したマウス糞便ペレットから、QiagenのPowerFecal Pro DNA kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってDNAの抽出を行った。抽出した DNA は、Quantus Fluorometer (Promega, Madison, WI, USA) 上の ONE dsDNA QuantiFluor Dye System を用いて定量した。定量後、精製したサンプルDNAは、Nextera DNA Flex kit (Illumina, San Diego, CA, USA) を用いて、下流のタグ付けとライブラリ作製用に標準化した。調製し、インデックスを付けたライブラリーを、NextSeq 500/550 Mid-Output Kit v2.5 (300 cycles) (Illumina) を用いて次世代シーケンス (NSG) のためにプールした。

4.4. 血漿脂肪酸プロファイル
マウスの血漿を、確立されたプロトコルに従って脂肪酸メチルエステル誘導体化に供した[54]。簡単に言うと、100 µLの血漿に100 µgのC17（トリヘプタデカノイン）内部標準を加えました。次に、サンプルを鹸化して脂肪酸を遊離させ、12%三フッ化ホウ素を使用して100 ℃で5分間誘導体化した。37 種類の脂肪酸を J&W DB20-FastFAME カラムで分離し、Intuvo 9000 ガスクロマトグラフおよび炎イオン化検出器 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) [55] を使用して分析した。データは、総脂肪酸のパーセントとして表した。パーセントの総計算は、ベースラインより4倍大きいシグナルを示した脂質のみを含んでいた。

4.5. 大腸の病理組織学
動物からのヘマトキシリンおよびエオシン染色した結腸切片を顕微鏡で調べた。大腸炎症のサンプルブラインド採点は、以前のガイドライン[56]に従って、認定病理学者（Integrated Laboratory Systems, Research Triangle Park, NC, USA）により実施された。報告された場合、炎症は、粘膜構造の破壊および単核炎症細胞による固有層の可変的拡大を伴い、線維化を伴うかまたは伴わないものであった。好中球の有無および/または線維化の証拠に基づき、炎症はそれぞれ慢性活動性または慢性としてスコア化された。小嚢の過形成を伴う炎症は、好塩基球性、核層状化、および有糸分裂の変化について検査した。過形成病変は、局所的に広範な病変として分類され、前腫瘍性病変としてスコア化された。

4.6. マイクロバイオームと統計解析
生物学的配列とそれに対応する品質スコアの両方を格納するために生成・処理されたテキストベースのフォーマットは、分類学的分類とマイクロバイオーム分析のためにOne Codexのメタゲノムパイプラインに渡された。One Codexデータベースは、約114Kの完全な微生物ゲノムから構成されています（One Codex, San Francisco, CA, USA）。処理中、リードはまずヒトゲノムに対してスクリーニングされ、次にk-merに基づく分類を用いて微生物参照データベースにマッピングされました。個々の配列（NGS リードまたはコンティグ）は、k-mer（k = 31）を用いた正確なアライメントによって One Codex データベース（One Codex）と比較されました[57,58]。相対的な頻度に基づいて、ユニークなk-mersは、シーケンスまたは参照ゲノムアーチファクトを制御するためにフィルタリングされました。各微生物種の相対的な存在量は、利用可能なすべての参照ゲノムにわたる配列決定の深さとカバー率に基づいて推定された。アルファ多様性およびベータ多様性の計算を含む分類学的分類の二次解析は、すべてOne Codex Library (One Codex) を用いて行われた。α-多様性と存在量の差の統計解析は、科学計算用ソフトウェアライブラリSciPyに実装されているMann-Whitney U検定を用いて実施した。β-diversityの統計解析は、Scikit-bioソフトウェアライブラリに実装されている、並べ替え多変量分散分析を使って行った[59]。ベータダイバーシティは、One Codexから取得した種レベルの相対存在量ベクトルを用いて、ペアワイズBray-Curtis非類似度として計算された。すべての二次解析は、One Codexプラットフォーム（One Codex）上のJupyter Notebookで行われた。箱ひげ図は，GraphPad Prismソフトウェアパッケージversion 8.3 (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA) [60]を利用して作成した。WDとn-6HFDに関連する差は、体重とCOX-2発現について1元配置ANOVAによって分析された。血漿脂肪酸プロファイルについては、10週齢と16週齢の時点におけるWDとn-6HFDの相互関係を考慮し、グループサイズの差で補正した2元配置分散分析混合モデルを使用した。有意差（p＜0.05）は、Tukey's HSD検定を用いて判定した。統計解析は、Prism（Graph-Pad Software）を用いて行った。

  1. 5.結論
    ここ数十年、アメリカ人や欧米人への推奨事項の1つはPUFAの摂取量を増やすことであり、その結果、n-3脂肪酸よりもn-6脂肪酸の摂取量が多くなっている[61]。我々の発見は、典型的なアメリカ人WDによって通常消費されるものよりもn-6LAの高い消費は、病理学的プロファイルに向かって不利に腸内細菌叢をシフトさせることを示唆している。今後、女性の前臨床モデルおよびヒトを対象としたn-6HFDの効果を検証する研究が必要である。また、異なる脂肪酸（すなわち、SFA、MUFA、n-6対n-3 PUFA）および食事性炭水化物の種類と量との相互作用が大腸炎症およびマイクロバイオームプロファイルに与える影響も重要な研究領域である。

謝辞
動物コロニーの世話をしたGenetically Engineered Mouse Models Core、動物の手術および組織採取を支援したExperimental Mouse Shared Resources Core、血漿サンプルの処理を支援したAnalytical Chemistry Coreの協力に謝意を表したい。

略号
CA コール酸
CD クロノ病
COX-2 シクロオキシゲナーゼ-2
FXR ファルネソイドX受容体
HFD 高脂肪食
IBD 炎症性腸疾患
LFD 低脂肪食
LA リノール酸
MUFA 一価不飽和脂肪酸
NGS 次世代シーケンサー
n-6HFD n-6系高脂肪食
NSP 非デンプン性多糖類
PC主成分
E パーセントエネルギー
PUFA 多価不飽和脂肪酸
SFA 飽和脂肪酸
TβMCAタウリン共役β-ムリコール酸
UC 潰瘍性大腸炎
WD 欧米食
補足資料
以下は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22136919/s1 でオンライン公開されています。

追加データファイルはこちら(82K, zip)
著者による貢献
O.I.S.とA.J.P.は、原稿に等しく貢献した。O.I.S.、S.N.W.、M.G.D.は動物実験とデータ解析を行い、A.J.P.とS.H.はマイクロバイオームの次世代シーケンサーを担当、C.SとN.Gはマイクロバイオームのシーケンスデータを解析、T.C.Dはマウスコロニー維持の監督と指示、実験デザインとデータ解釈に寄与、S.H-H.CとJ.M.Sはプラズマ脂質の分析指導と実行を担当しました。A.J.S.は、リピドミクス解析、データ解釈、コンセプト作りに貢献した。D.F.R.とO.I.S.は、資金獲得、研究の構想と計画、データ解析とレビューに貢献した。原稿の執筆と編集には全著者が貢献した。すべての著者は、本原稿を読み、同意した。

資金提供
この研究は、USDA-NIFA, GRANT12445471; USDA-NIFA Multistate ARZT-1370460-R23-155; The University of Arizona Cancer Center Support Grant P30CA23074; and the Cancer Biology Training Grant T32CA009213 からの助成金によって行われました。

インスティテューショナルレビューボード声明
すべての動物処置は、アリゾナ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeプログラムによって承認された（PHS Animal Welfare Assurance Number D16-00159, A3248-01, effective 08-08-2019 ）。

データの利用可能性に関する声明
本研究で生成および/または解析されたデータセットは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。

利益相反
著者は、利益相反を宣言していない。

脚注
出版社からのコメント：MDPIは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場をとっています。

記事情報
Int J Mol Sci. 2021 Jul; 22(13): 6919.
オンライン公開 2021 Jun 28. doi: 10.3390/ijms22136919
PMCID: PMC8269411
PMID: 34203196
オルネラ I. Selmin,1,2 Andreas J. Papoutsis,3 Sabine Hazan,3 Christopher Smith,4 Nick Greenfield,4 Micah G. Donovan,5 Spencer N. Wren,1 Thomas C. Doetschman,6 Justin M. Snider,1 Ashley J. Snider,1 Sherry H.-H. Chow,2,7 and Donato F. Romagnolo1,2,5,*.
Giovanna Bermano 学術担当編集者
1アリゾナ大学栄養科学部、ツーソン、AZ 85721、米国； ude.anozira@nimles (O.I.S.); ude.anozira@nerwrecneps (S.N.W.); ude.anozira@redinsnitsuj (J.M.S.); ude.anozira@redinsyelhsa (A.J.S.)
2アリゾナ大学がんセンター、ツーソン、AZ 85724、米国；ude.anozira@wohcs
3ProgenomaBiome, Ventura, CA 93003, USA; moc.emoibanegorp@sistuopap (A.J.P.); moc.emoibanegorp@nazahrd (S.H.)
4One Codex, San Francisco, CA 94110, USA; moc.xedoceno@rehpotsirhc (C.S.); moc.xedoceno@kcin (N.G.)。
5アリゾナ大学がん生物学大学院学際プログラム、ツーソン、アリゾナ州、85724、米国； ude.anozira@321onodm
6アリゾナ大学分子細胞医学部、アリゾナ州ツーソン、85724、アメリカ；ude.anozira@steodt
7アリゾナ大学医学部、アリゾナ州ツーソン、85724、米国
*Correspondence: ude.anozira@otanod
Received 2021 Apr 10; Accepted 2021 Jun 15.
Copyright © 2021 by the authors.
ライセンシー：MDPI, Basel, Switzerland. この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件に基づいて配布されるオープンアクセス記事です。
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