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ヒト腸内細菌反応性DP8α制御性T細胞、シグネチャーおよび関連する新たな機能

哉百名


ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Immunol.、2022年11月21日
Sec.免疫寛容と制御
https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1026994
ヒト腸内細菌反応性DP8α制御性T細胞、シグネチャーおよび関連する新たな機能
Francine Jotereau1*、Joudy Alameddine1、Raluca Teusan2、Annabelle Pédron1、Nicolas Jouand3、Frédéric Altare1および Emmanuelle Godefroy1。
1ナント大学、アンジェ大学、INSERM、CNRS、免疫学と免疫療法の新しい概念、INCIT、UMR 1302/EMR6001、フランス、ナント
2ナント大学、CHU Nantes、INSERM、CNRS、SFR Santé、Inserm UMS 016、CNRS UMS 3556、Nantes、France
3Cytocell, BioCore, Nantes Université UMS 3556, Inserm US016, CNRS UAR 3556, CHU Nantes, SFR Santé François BONAMY、Nantes、France
マウスでは、微生物によって誘導されたトレグが腸のホメオスタシスを維持し、成体における免疫病理に対する抵抗性を提供している。そのため、ヒトのTregの機能を同定することは重要な目標である。我々は、ヒトの大腸粘膜および血液中に、FoxP3陰性でIL-10を分泌するTregサブセットを発見した。このサブセットはCD4とCD8αを共発現し（それゆえDP8αと名付けられた）、Faecalibacterium prausnitziiに対するTCR反応性を示し、その誘導にこの共生細菌が重要であることが示唆された。さらに、IBD患者におけるDP8αの急激な減少や、マウスを用いた生体内での腸管炎症に対する保護作用も報告されており、腸管ホメオスタシスにおけるDP8αの役割を支持するものである。本研究では、これらの微生物によって誘導されるTregのゲノム、表現型、機能的特徴を明らかにし、その生理的役割と臨床的可能性を明らかにすることを目的とした。ヒトF. prausnitzi反応性DP8α Tregクローンは、大腸固有層と血液の両方から得た。RNA配列決定、フローサイトメトリー、機能アッセイを実施し、活性化時の反応を明らかにするとともに、ドナーおよび組織適合FoxP3+ Tregクローンと比較した。DP8αトレグは、ユニークなTr1様/細胞傷害性CD4+ T細胞プロファイルを示し、RORγtおよびMAFマスター遺伝子をマウス腸内細菌誘導FoxP3+ Tregsと共有することが判明した。我々は、その強力な細胞傷害性、走化性、IgA促進能を明らかにし、in vitroアッセイで確認した。したがって、DP8α TregはClostridium細菌によって誘導される以外にも、マウス微生物によって誘導されるTregとマスター遺伝子を共有していることが示唆された。このように、DP8α Tregの完全なシグネチャーと新規の機能特性を明らかにしたことは、病態、特に炎症性腸疾患における研究を通じて、このユニークなヒト微生物誘導型Tregの生体内での役割と治療への応用を明らかにする上で重要であると考えられる。

図解抄録
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図解抄録

はじめに
観察研究では、F. prausnitziiレベルの減少を含む腸内細菌叢の異常と一般的な代謝性および慢性炎症性疾患との強い関連が明らかにされ、腸内細菌叢の構成が人の健康に影響を及ぼすことが示唆されている。このような関連性のメカニズムはまだ解明されていませんが、マウスで確認されたメカニズムのひとつは、離乳期に微生物によって誘導される免疫刷り込みが、その後の炎症性疾患から身を守ることに関係していることです（1）。このような刷り込みは、Clostridium IVおよびXIVaによって誘導されるRORγt発現FoxP3+ Tregに一部依存しており、大腸炎を予防し、アレルギー疾患などのTh2媒介性応答を抑制することが明らかになった（1, 2）。我々は、ヒトの大腸粘膜および血液中に、マウス腸管RORγt+ Tregと共通の性質を持つFoxP3陰性IL-10分泌型Tregサブセット（CD4とCD8αの共発現に基づきDP8αと命名）を同定し、驚くべきことに、このサブセットをDP8α Tregと命名した。実際、DP8α Tregは大腸固有層に多く存在し、Clostridium IVのメンバーであるFaecalibacterium prausnitziiによって誘導される。このことは、この細菌に対する偏ったTCR反応性と、この細菌がIL-10およびIL-27を分泌する寛容樹状細胞を誘導する能力によって示されている(3)。さらに、IBD患者の大腸と血中のDP8α Tregが特異的に激減していること（3, 5, 6）、DP8α Tregを移植すると実験的大腸炎からマウスを保護できること（7）からも、その予防における役割が示唆されています。したがって、これらのユニークなヒト微生物誘導性Tregの生理的役割を明らかにすることは、非常に重要であると考えられる。

そこで我々は、DP8αトレグを詳細に解析し、その制御能を明らかにするため、健常大腸の辺縁系および血液から分離したクローンを用い、ドナーにマッチした従来のFoxP3+ Tregクローンと比較して、ゲノム規模のトランスクリプトーム、表現型、in vitro機能研究を実施した。

方法
大腸サンプルの採取と処理
6人の大腸がん患者から正常な大腸粘膜を腫瘍から約10cmの位置で外科的に切除した。サンプルは、フランス高等教育研究省（DC-2014-2206）に登録された組織バイオコレクションの一部であり、倫理委員会（CPP Ouest IV-Nantes）およびナント大学病院の機関委員会の承認を得ている。組織はヘルシンキ宣言に則って処理された。各患者はインフォームドコンセントフォームに署名した。固有層は、1mM EDTA PBS緩衝液でインキュベートした後（20分）、上皮から分離し、断片にミンチし、10μg/mlペニシリンおよび0.1mg/mlゲンタマイシン（Sigma-Aldrich）含有RPMIで洗浄した。層状固有片をコラゲナーゼIV (1mg/ml; Sigma-Aldrich)で消化し、37℃で振盪しながら、消化した。粘液と残骸を40μmセルストレーナー（BD）で濾過して除去した。フィコール勾配遠心により、生存可能な層状突起由来リンパ球（LPLs）を得た。

ヒトTregクローンの作製
F. prausnitzi反応性DP8α Tregクローンを血液から分離するため、DP8α Tregを構成する精製VPD染色CD4+ T細胞を、F. prausnitziiを負荷した精製自己CD14+単球と一晩共培養した（1：1比）。5日後、Aria IIIセルソーターを用いて、4人の健康なドナーからVPDLOW CD3+/CD4+/CD8αLOW細胞をクローニングした（図S1）。同時に、同じドナーから、CD3+/CD4+/CD8-/CD25HIGH/CD127LOWクラシックFoxP3+トレグも同様にクローン化した（図S1）。DP8αトレグおよびFoxP3+トレグも、新鮮に解離・選別された大腸LPLからクローン化した（図S1）。その後、クローンをフィーダー細胞上で増幅させた(6)。4週間後、安静にしているクローンを、F. prausnitziiを提示する自己単球に対する反応とそのFoxP3発現についてスクリーニングした。

試薬
細胞は、5％ヒト血清、2mM L-グルタミン、10μg/mlペニシリン-ストレプトマイシン添加のRPMI-1640で培養した（Gibco）。Violet Proliferation Dye 450 (VPD) (1μM, BD Bioscience), Brefeldin A (10μg/ml, Sigma-Aldrich) および4% パラホルムアルデヒド (Sigma-Aldrich) を使用した。CD39およびCD73をそれぞれ阻害するPOM-1およびAB-680（MedChemExpress）薬剤は、図の凡例に示すように使用された。

抗体
表面染色には、細胞を洗浄し、PBS/0.1%BSA中で4℃、40分間、以下の抗体で染色した：抗CD3 (clone UCHT1, Becton Dickinson), 抗CD4 (clone 13B8. 2、Beckman Coulter）、抗CD8α（クローンRPA-T8、Becton Dickinson）、抗CCR6（クローンG034E3、Biolegend）、抗CXCR6（クローンK041E5、Biolegend）、抗CXCR5（クローン51505、R＆D Systems）、抗CD39（クローンA1、Biolegend）、抗CD73（クローンAD2、Biolegend）、抗CD27（クローンO323、Biolegend）。抗CD40L（クローン24-31、Abcam）、抗CD19（クローンSJ25C1、Biolegend）、抗CD38（クローンHB-7、Biolegend）、抗CD25（クローンBC96、eBiosience）、抗CD127（クローンHIL-7R-M21、Becton Dickinson）、抗CRTAM（クローン210213、R＆D Systems）及び抗CCR5／CD195（クローン3A9、Becton Dickinson）。

細胞内染色では、細胞を4％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、洗浄後、PBS/0.1％BSA/0.1％サポニンでRTで40分間染色を行った。 1％サポニンで抗IFNγ-APC（クローンB27、Becton Dickinson）、抗CCL4／MIP-1β（クローンD21-1351、Becton Dickinson）、抗CCL5／RANTES（クローン2D5、Becton Dickinson）、抗Granzyme A（Clone CB9, Biolegend）、抗Granzyme B（Clone GB11、Becton Dickinson）、抗Granzyme K（Clone GM26E7, Biolegend）、抗IL-2（クローンMQ1-17H12、Becton Dickinson）、抗IL-4（クローン8D4-8、Biolegend）、抗IL-5（クローンTRFK5、Biolegend）、抗IL-13（クローンJES10-5A2、Biolegend）、抗IL-21（クローン eBio3A3-N2 、eBiosience）および抗パーフォリン（クローン δG9、Becton Dickinson）であった。転写因子については、Foxp3/Transcription Factor Buffer Set（eBioscience）および以下の抗体を用いて細胞を固定および透過化した：抗FoxP3（クローン259D/C7、Becton Dickinson）、抗RORγt（クローン AFKJS-9、eBioscience）、抗Eomes（クローンWD1928、eBioscience）および抗ID2（クローンILCID2、eBioscience）。

蛍光はFACS LSR IIフローサイトメーターで測定し、FlowJoおよびDivaソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて解析した。相対蛍光強度（RFI）は、特異抗体で得られた平均蛍光強度（MFI）をアイソタイプコントロールで得られたMFIで割ったものに相当する。

ELISA
T細胞を、コーティングされた抗CD3（クローンOKT3、1μg／ml、eBioscience）を用いて、37℃で24〜48時間刺激した。上清は、製造者のガイドライン（eBioscience）に従って、Ready-Set-Go ELISAを使用して、それらのIL-10およびIFNγ含有量について試験された。XCL1、総hIgAおよびhIgGは、製造業者の指示に従ってELISAキット（Invitrogen）を用いて測定した。

RNA抽出
クローンを0.5μM OKT3で4時間刺激し、広範囲に洗浄し、乾燥したペレットを-80℃で凍結した。

T細胞増殖の阻害
新鮮に選別したCD4+ T細胞（Miltenyi）を1μM VPDで染色してから、CD3/CD28マイクロビーズ（Miltenyi）ありまたはなしで、20UI/ml rhIL-2でTregクローンと共培養を行った。場合によっては、CD39またはCD73阻害剤を添加した。5日後にVPD希釈度を評価し、増殖を判定した。

統計解析
統計解析は、GraphPad Prism version 9.3.0を使用して行った。ほとんどの単一比較は、図の説明で示したように、2サイドt検定またはMann-Whitney検定を用いて行った。多重比較では、一元配置分散分析（マッチングデータの場合はFriedman検定、マッチングやペアリングがない場合はKruskal-Wallis検定のいずれか）、それに続くDunnの多重比較検定で調整したp値を用いた（図の説明で示したとおり）。p<.05は統計的に有意とみなした。

3'seq RNA プロファイリング
3'seq-RNAプロファイリング・プロトコルは、(8)に記載されているように実施した。ライブラリーは、4µl中の10ng total RNAから調製された。mRNAのpoly(A)tailは、テンプレートスイッチング逆転写酵素中にユニバーサルアダプター、ウェルスペシフィックバーコード、ユニーク分子識別子（UMI）によりタグ付けされた。複数のサンプルからのバーコード付きcDNAをプールし、増幅し、cDNAの3′末端を強調するトランスポゾンフラグメンテーションアプローチを用いてタグ付けを行った。100ngの全長cDNAをNextera DNA Sample Prep kit (Illumina)のインプットとして使用し、cDNAの3′末端をエンリッチしている。ライブラリーのサイズは、2200 Tape Station System (Agilent Technologies)で制御した。Hiseq Rapid SBS Kit v2-50サイクルとHiseq Rapid PE Cluster Kit v2を使用し、メーカーのプロトコル（Denaturing and Diluting Libraries for the HiSeq® and GAIIx, Part # 15050107 v03 protocol, Illumina）に従って350-800bp長のライブラリーをIllumina HiSeq 2500で実行しました。

バイオインフォマティクス
最初のリードの16塩基は、設計されたサンプル特異的バーコードの6塩基とユニーク分子識別子（UMI）の10塩基に対応します。2番目のリード（58塩基）は、捕捉されたポリ（A）RNA配列に対応する。バイオインフォマティクスステップはsnakemake pipeline (https://bio.tools/3SRP)を用いて実行される。これらのfastqペアのデマルチプレックスを行い、各サンプルについて1つのシングルエンドfastqを生成した。これらのfastqファイルを、UCSCダウンロードサイトから入手可能な参照mRNA refseq配列およびミトコンドリアゲノム配列にbwaでアライメントした。

遺伝子発現プロファイルは、アライメントファイル（bam）を解析し、各サンプルについて、各遺伝子に関連するUMIの数をカウントすることで作成した。複数の遺伝子にアラインメントされたリード、参照配列と3つ以上のミスマッチを含むリード、またはpolyAパターンを持つリードは破棄された。最後に、全サンプルの全遺伝子のカウントを含むマトリックスが作成された。全サンプルにおけるmRNAの絶対量に対応する発現値は、さらなる遺伝子発現解析のための準備が整ったことになる。

R パッケージ DESeq2 (9) を用いて差分解析を行った。

データは GSE197906 で入手可能である。

細胞毒性アッセイ
T細胞クローンを、CD3/CD28活性化（活性化T細胞の低死亡から無死亡を誘導するT-Cell TransAct高分子ナノマトリックス）の有無にかかわらず、37℃にて、100,000の示された標的細胞と示された比率で共培養させた。18時間後に上清を採取し、損傷細胞からのアデニル酸キナーゼの遊離を測定するために設計された生物発光、非破壊細胞溶解アッセイキット（ToxiLight™ BioAssay Kit、Lonza）を用いて細胞死を測定した。ToxiLight Lysis Control Set（Lonza社）を用いて100%溶解を判定した。溶血率は以下のように算出した。

((読み取ったLuminescence - 標的細胞単独で自然溶解したLuminescence x 100)/(Luminescence of totally lysed target cells - (Luminescence of target cells alone lysed spontaneously + Luminescence of corresponding T cells alone lysed spontaneously)) により算出した。

T/B共培養アッセイ
新鮮なCD3-/CD19+/CD27-ナイーブB細胞（20x103 cells/well）を1.1比でインキュベートした。 自己の選別したDP8α Treg (CD3+/CD4+/CD8αLOW/CCR6+/CXCR6+) と1対1の割合でインキュベートした。Tfh細胞（CD3+/CD4+/CD8-/CXCR5+）またはFoxP3+ Tregクローンを、アゴニスト抗BCR（抗IgA/IgG/IgM）抗体（Jackson ImmunoResearch）存在下、（ヒトIgとのあらゆる汚染を避けるために）10％牛胎児血清添加RPMI-1640で、CD3/CD28-刺激とともに、または刺激せずに、使用した。7日目に、全CD19+ B細胞中のCD3-/CD19INT/CD38+プラズマブラストの頻度を測定し、上清中の総IgGおよびIgAを測定した。

結果
Tregクローンの選択とキャラクタリゼーション
5人の異なるドナーの大腸固有リンパ球（LPL）から6個のDP8αと4個のFoxP3+ Tregクローンを選択し、4人の健康なドナーの血液からDP8αとFoxP3+ Tregクローンのマッチドペアを方法セクションに記載されているように選択した。

すべてのDP8αクローンはF. prausnitziiに反応し（図1A-D）、FoxP3+ Tregクローン（血液およびLPL由来クローンの平均RFI=21.19 ± 2.08 および 46.29 ± 9.80 ）と比較して、FoxP3の発現を欠いた（それぞれ、血液およびLPL由来クローンの平均RFI= 4.46± 1.27 および 6.31± 0.95 ）（ 図1E、F）。さらに、DP8αクローンは、刺激によりIFNγ（図1A、B）およびIL-10（図1C、D）を分泌した。FoxP3+Tregクローンの一部もIL-10を分泌したが、これらのクローンのいずれも有意なレベルのIFNγを分泌しなかった。IFNγはIL-10と共生産されるとTr1様Tregの特徴になる(10)。すべてのDP8αクローンはプリン体受容体CD39とCD73を発現しており（図1G、H）、これらの酵素を阻害すると、エフェクターT細胞の増殖を阻害する能力が中和された（図1I、J）。一方、一部のFoxP3+ TregクローンはCD39も発現していたが、CD73はほとんど発現しておらず（図1G、H）、CD39とCD73を阻害してもエフェクターT細胞増殖の抑制効果は変わらなかった（図1I、J）。したがって、DP8αの制御機能は、FoxP3+ Tregの機能とは異なり、プリン作動性経路に依存することがわかった。クローンデータと同様に、ex vivoで解析した循環DP8αトレグは、すべてのドナーでCD39とCD73を系統的に発現したが、血中FoxP3+トレグではCD39は2人のドナーのみ、CD73はいずれのドナーでも発現していた（図1K）。

図1
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図1 Tregクローンの選択と特徴づけ。F. prausnitzi-反応性DP8αおよびクローン生産に使用した古典的FoxP3+ Tregを選別するゲーティング戦略は、「方法」のセクションに記載し、図S1に示す。(A〜D）クローンは、F. prausnitziiまたは抗CD3刺激に対するIFNγ（A、B）およびIL-10（C、D）応答についてELISAによりスクリーニングした（クローンOKT3）。(E, F) 細胞内染色によりFoxP3発現を評価した。代表的なヒストグラムプロット例（左）および全データ（右）を示す（G、H）。表面免疫染色を用いて測定したクローンによるCD39（G）およびCD73（H）発現。(I, J)。CD3／CD28刺激VPD染色CD4＋T細胞を、CD39及びCD73阻害剤、すなわちPOM-1（30μM）及びAB-680（100nM）の存在下又は非存在下で、Tregクローン（比率1：1）と共培養し、それぞれ、示した。増殖は、VPD希釈によって評価した。代表的なヒストグラムプロットの例（I）およびすべての試験された条件（すなわち、3つの異なるドナーからのCD4+細胞と共培養した5つのDP8αクローンおよび2つのFoxP3+クローンのそれぞれ）（J）が示されている。(K）ゲーティングされたCD3+/CD4+/CD8αLOW/CCR6+/CXCR6+ DP8αおよびCD3+/CD4+/CD25HIGH/CD127LOW古典Tregによる、ex vivo PBMC間のCD39およびCD73発現が示されている。RFIは、比率に相当する。関連する抗体で得られたMFIと対応するアイソタイプコントロールのMFIとの比に相当する。1つの比較にはMann-Whitney検定が、1Jには一元配置分散分析とDunnの多重比較検定が用いられ、p<.05は統計的に有意とみなされた。

結腸固有層および血液から分離したヒトDP8αおよびFoxP3+ Tregクローンのトランスクリプトーム比較
主成分分析（PCA）で示されるように、DP8αクローンは、PBLまたはLPLに由来するかどうかにかかわらず、FoxP3+クローンとは別にクラスター化していた（図2A）。さらに、安静時の大腸由来DP8αクローンと血液由来DP8αクローンを区別する差次発現遺伝子（DEG）はなく、活性化時にはわずか63個が同定され、大腸由来と血液由来のDP8αトレグの間に強い関係があることが示された（示さず）。

図2
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図2 主成分分析およびDEG分析。4-6人の被験者の大腸固有層および血液から分離したヒトDP8αおよびFoxP3+ Tregクローンのトランスクリプトーム比較（活性化または非活性化）。(A)主成分分析。(B, C）安静時対活性化DP8αクローンで発現する遺伝子の平均発現値のLog2倍変化：大腸由来（B）血液由来（C）。(D-I）安静時および活性化された大腸由来DP8αクローン間の選択されたDEGの正規化された発現を示すヒートマップ。細胞傷害性に関与する遺伝子（D）、ケモカインをコードする遺伝子（E）、B細胞ヘルプに関与する遺伝子（F）、サイトカインをコードする遺伝子（G）、TFをコードする遺伝子（H）、Tr1シグナルの遺伝子（I）、CD4-CTLシグナルに対応する遺伝子（J）が表されている。

一方、LPL由来とPBL由来のFoxP3+クローンはPCAにより離れてクラスタ化し（図2A）、これらの細胞には部位による有意差があることが示された。それにもかかわらず、これらのクローン間のDEGの数は、安静時（n=98、上：47、下：51）、活性化後（n=230、上：99、下：131）ともに少なかった。これは、大腸FoxP3+ Tregの著しい不均一性によるものと思われ、この区画には、大腸リンパ系構造を循環する組織常在Tregと中枢記憶Tregが共存していることが一因であると考えられる。個々のFoxP3+ Tregクローンのトランスクリプトームとサイトカインプロファイルの解析により、大腸由来のFoxP3+クローンプロファイルには、特にリンパ組織関連遺伝子であるCD62L転写物（SELL）発現に関する二面性が実際に認められた（図S2）。

DP8α Tregの活性化誘導型トランスクリプトームシグネチャー
次に、活性化した大腸および血液由来のDP8αクローンに対して得られた3'SRPトランスクリプトームデータのDESeq2解析により、DP8α Tregクローンの活性化誘発反応を調査した。有意性の基準（FDR < 0.05 および log2 fold-change の絶対値 > 0.5）を適用すると、大腸および血液由来の DP8α クローンの活性化により、それぞれ 323 および 379 遺伝子が有意にアップレギュレートされ、93 および 208 遺伝子がダウンレギュレートされた（図 2B, C）。まず、活性化した大腸由来DP8αクローンで発現が上昇した102個の遺伝子に注目した。これらの遺伝子は、T細胞における役割がすでに報告されているものである。

その結果、10個の遺伝子が明らかに細胞傷害性機能を有していた。CD4+T細胞の細胞障害性活性とIFNγ産生の誘導因子として知られるクラスI制限の細胞障害性関連分子CRTAM (11)、細胞障害性細胞の分化に関わる転写因子 (TF) EOMES、PRDM1およびRUNX3、細胞障害性サイトカインまたは受容体をコードする遺伝子、FASLG、TNFS、TRNFS、RUNX3。FASLG、TNFSF10（またはTRAIL）、GZMB、LTA、そして細胞分解顆粒エキソサイトーシスを促進するSTX11 (12) とGZMB産生Tregを溶解から守ることが知られているSERPINB9 (Figure 2D and Figure S3) (13)が含まれていた。

6つの遺伝子はケモカインをコードしていた。CCL1は、CCR8を介してTh2リンパ球を誘引し、CCL3およびCCL4は、CCR1および/またはCCR5を発現する細胞（基本的にはT細胞）を誘引し（14）、XCL1は、抗原交差提示樹状細胞（15）、CXCL8 (IL-8) （図2E）は好中球（16）およびCKLF（図S4）はTh2細胞（17）などのCCR4発現ターゲットを引き寄せるケモカインであった。

CD3媒介の活性化はまた、CD40LG、IL10、IL4、IL21（18）、CD70、IL2、IL13、IL5、LTA、MAF、TNFSF14（またはLIGHT）（図2Fおよび図S5）などの、B細胞への援助を提供し、および／または抗体クラススイッチ組み換えもしくは分泌を駆動することが知られている分子、ならびに追加のサイトカインまたは成長因子（図2G）をコードする遺伝子をコードする多数の遺伝子を発現上昇させた。

特定のTFの組み合わせは、表面マーカーよりも正確に均質な細胞サブセットを特徴づけることが報告されている。興味深いことに、上記のものを含む23のTFが、DP8α Tregsの活性化によって誘導または発現上昇した（図2Hおよび図S6）。驚くべきことに、これらのTFはすべてTregの分化、恒常性、抑制機能に関与していることが報告されている。EOMESはPRDM1（またはBLIMP1）と共にIL-10の発現とTr1様細胞の分化を誘導し（19, 20）、PRDM1は微生物が誘導するマウスFoxP3+/RORγt+ Tregsにとって重要な制御因子でもある（21, 22）。AHR：腸管由来Tregをマークし促進し、IL-10とTr1の分化をポジティブに制御する(23)。CBFB：FoxP3+ Tregの誘導とその抑制機能に関わる遺伝子のマスターレギュレータである(24)。EGR2, Tr1関連TF (25); ID2, IRF4, BATF and PPARG, これらは脂肪組織Tregの発生と維持に関与する (26); IRF1, BATFと共にIL-27誘導Tr1細胞の発生に必要である (27); MAF, マウス微生物誘導腸TregsにおけるRORγt発現維持とIL-10産生の正の制御を通じて腸免疫恒常性の主要制御因子である (21, 22)．

興味深いことに、上記で詳述したDP8α TregクローンのTr1様特性と一致する、すなわち。主にFoxP3発現の欠如とIL-10およびIFNγの両方の分泌とが一致し、DP8αトレグは、ヒトまたはマウスのTr1およびTr1様シグネチャー、すなわちGZMB、CSF1、HAVCR2（またはTIM3）、EGR2、PRDM1, IRF4、MAF、EOMES、AHR、IRF1、BATF、ID2、BHLHE40、TNFRSF9（または41BB）、TNFRSF4（またはOX40）、IL-5、IL-2LOW（19、20、28〜32）（図2I）、ならびにGZMK（31、32）は、DP8α Tregクローンが活性化に伴って発現低下するものとして特定したものである（図S7）。さらに、1つを除くすべての活性化DP8α Tregクローンは、EOMES、FASLG、GZMBおよびPRDM1とともに細胞傷害性CD4+エフェクター細胞のシグネチャーを表すCRTAM（図2J）を発現していた（11）。

DP8αトレグの走化性及び溶解性の可能性をさらに裏付けるものとして、CCL5、CCR5、GZMA及びGZMKが安静時DP8αクローンによって発現し、活性化すると発現が低下するが依然として高発現していた（図S7）。

血液由来のF. prausnitzi反応性DP8α Tregクローンについては、活性化によって発現が増加した遺伝子のほとんどが、大腸由来のDP8α Tregクローンで発現が増加した遺伝子と重複していた（図2C）が、これらの変化の一部は、研究対象クローンの数が少ないためか、統計的に有意でないままであった。この結果は、血液由来と結腸由来のクローン間でDEGが認められなかったこと（図示していない）と共に、両方のコンパートメントで見られるDP8α細胞は同一で、腸に由来するという考えを強めるものである。

DP8αとFoxP3+ヒトTregを区別するコア遺伝子シグネチャーの同定
次に、DESeq2解析により、DP8αと、同じコンパートメント、すなわち血液または大腸固有層に由来する標準的なFoxP3+ Tregクローンを比較しました。重要なことは、FoxP3+クローンの数が少なく不均一であるという上述の限界にもかかわらず、結腸由来のDP8αとFoxP3+ TregクローンはPCAによって明らかに分岐し（図2A）、また静止状態と活性状態においてそれぞれ286（上：108、下：178）および506（上：199、下：307）のDEGsによって分岐した（図3A、B）ことであった。

図3
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図3 患者および健常ドナーの大腸固有層から得られたDP8αおよびFoxP3+ Tregクローンから作成した遺伝子発現プロファイル。(A, B）安静時（A）または活性化時（B）のDP8αおよびFoxP3+クローン間の平均発現値の対数2倍変化。(C, D）安静時（C）または活性化時（D）の大腸由来DP8αおよびFoxP3+ Tregクローン間の上位DEGの発現を正規化したヒートマップ。

一方、血液由来DP8αとFoxP3+クローンは、限られた数のDEGによって異なっていた（図S8）。しかし、フィルターなしの結果を調べたところ、大腸由来DP8α対FoxP3+クローンで同定されたほとんどの発現上昇DEGは、log2 fold-changes > 1で示されるように、DP8αではFoxP3+血液由来クローンと比較してより高レベルで発現していることも判明した。それにもかかわらず、これらの差のほとんどは統計的に有意でないままであった（図S8）。おそらく、両方のPBL由来Tregクローンサブセットの数が少なく、不均質であることが原因であると考えられる。

次に、大腸由来DP8αとFoxP3+ Tregの間で同定されたDEGsに注目した。安静時および活性化DP8α対FoxP3+ Tregクローンにおいて同定された上位発現DEG（log2 fold-change range from 3 to 6.6） をそれぞれ示す（図3C、図D）。上述のように、GZMK、GZMA、GZMBおよびCRTAMとともにEOMESを発現することは、細胞傷害性CD4+ T細胞の特徴であり（11、33）、一方、EOMES、GZMKおよびITGA2の共発現はTr1様細胞を標的としている（31、32）。上位DP8α Treg DEGの他の顕著な特徴は、FASLG、GZMA、GZMB、GZMK、GNLY、NKG7.などの細胞障害性プロファイルを1/定義する遺伝子がかなり多いことである。2/CCL1、CCL4、CCL4L1、CCL5、XCL1などのケモカイン、3/FoxP3+発現またはFoxP3+Treg分化を阻害することが報告されているTFをコードしている遺伝子が多い。EOMES (34)、EPAS1 (35)、NFIL3 (36) である。

これらのデータから、DP8αトレグは、エフェクターT細胞やDCとの相互作用を抑制するケモカインの分泌や、炎症組織への移動を促進するCCR1やCCR5（定常状態）などのケモカイン受容体の発現を通じた細胞毒性および走化性による主要な制御機能を示唆する高度に分化した転写産物サインを持っていることが明らかとなった。

DP8αトレグは、FoxP3+トレグとは異なり、骨髄由来の細胞を効率的に殺傷する。
DP8αトレグのトランスクリプトーム解析にはクローンを用いたので、全く同じ細胞を使って、興味のある分子の発現やそのin vitro機能を評価することができた。まず、DP8α Tregのトランスクリプトームには細胞毒性関連遺伝子が多く含まれていること、DP8α TregシグネチャーがTr1と大きく重複していることに基づいて、Tregクローンによるそのようなタンパク質の発現、およびTr1細胞の典型的な標的である骨髄由来の細胞を殺す能力を測定した（19, 37）。DEGデータに従い、DP8α Tregクローンは、FoxP3+ Tregクローンとは対照的にEOMESタンパク質を発現し（図4A）、またGZMA（図4B）、GZMB（図4C）、GZMK（図4D）、パーフォリン（図4E）もFoxP3+ Tregクローンと比較して高いレベルで発現していた。さらに、大腸由来のDP8α Tregクローンは、活性化直後（6時間）にCRTAMを有意に発現し、活性化後16時間でさらに増加したが、大腸由来のFoxP3+ Tregクローンは、期間に関係なく発現しなかった。一方、血液由来DP8αクローンでは、CRTAMの誘導は遅れて現れ、16時間後にのみ検出された。さらに、CRTAMは、2つの血液由来FoxP3+ Tregクローンでも発現していた（図4F）が、これは我々の知る限り、これまで報告されていない。同様に、PBMCでは、これらの分子はすべて、全CD4+ T細胞またはCD4+/CD25HIGH/CD127LOWクラシックFoxP3+ Tregと比較して、CCR6+/CXCR6+ DP8α Tregにより過剰発現された（図4G, H）。

図4
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図4 DP8αトレグは骨髄系細胞を殺すことができる。(A, F) EOMES (A) Granzyme A (B) Granzyme B (C) Granzyme K (D) Perforin (E) のクローン発現は、6時間の活性化後または非活性化後に細胞内ラベルで測定し、CRTAM (F) の細胞表面発現は指定時間の間、活性化後または非活性化した。クローンは、コーティングされた0.5μg/mlのOKT3で活性化された。(G, H) 3人のHDからのPBMCを6時間OKT3刺激し、EOMES、グランザイムA、B、Kおよびパーフォリンについて細胞内染色するか（G）、6時間および16時間染色し、CRTAMについて染色した（H）。これらのタンパク質の発現は、示されたT細胞サブセットについて示されている。(I-L) 示された標的細胞を、血液および結腸由来のDP8αおよびFoxP3+ Tregクローン（CD3/CD28ビーズで刺激した、または刺激しない）と、示された比率で共培養した。細胞死は、「方法」のセクションに記載されているように測定した。一対の両側t検定が単一比較に使用され、一方、一元配置分散分析に続いてダンの多重比較検定が4F-Hについて行われ、p<.05は統計的に有意であるとみなされた。

DP8αトレグが骨髄系細胞を殺す能力を評価するために、2つの細胞株、すなわち赤白血病系のK562と骨髄系細胞系のU937、および2種類の生体外初代選別細胞、CD19+ B細胞とCD14+単球をTregクローンと共培養した。通常CD8+T細胞が細胞傷害性を発揮するために必要とされる4時間後の細胞溶解は観察されなかった（図らずも）。一方、16時間後には、骨髄由来の細胞（U937および単球）に対する強力な溶解活性が、活性化DP8αトレグによって、また、より低い程度ではあるが、非刺激DP8αトレグによっても、血液由来か大腸由来かにかかわらず誘導された（図4Iおよび図J）。DP8αトレグクローンは、K562や選別されたB細胞を有意に殺さない（図4K、L）。FoxP3+Tregクローンは、有意な細胞毒性を示さなかった（図4I-L）。

したがって、DP8αトレグは、細胞傷害性活性に関連する多数の分子の発現に従って、Tr1細胞について報告されたように、骨髄系細胞に対して実際に強力な細胞傷害性機能を明確に発揮する（19、37）。

DP8αトレグはIgAを産生するB細胞への分化を促進する。
マウスでは、大腸のIL-10を分泌するFoxp3+ Tregが、微生物反応性分泌性IgAの産生を制御することにより、健全な腸内細菌叢の維持に関与していると考えられている(21)。

本研究では、DP8αトレグが活性化時に発現するB細胞ヘルプに関与する遺伝子の配列を同定したため（図5A）、血液由来のDP8αトレグ（ex vivoソートおよびクローン）が、FoxP3+ Tregクローンおよびソート濾胞ヘルパーT（Tfh）細胞の両方と比較して、実際にB細胞ヘルプを行い、in vitroでのIgA生産を誘導できるかどうかを検討した。

図5
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図5 血液由来DP8αトレグはIgA産生B細胞の分化を促進する。(A) DP8αトレグクローンによるB細胞ヘルプに関与する転写産物の発現。(B）CD40L：代表的なヒストグラムプロット例（左）および試験したすべての細胞型に対するRFI（右）。(C）DP8αクローンによるサイトカイン産生：代表的なヒストグラムプロット例（左）および全クローンのデータ（右）を示す。(D）3つのHDからのPBMCをOKT3刺激し、示されたサイトカインについて染色した。(E）T細胞およびB細胞サブセットのソーティングに使用したゲーティング戦略。(F-H) ソートされたナイーブB細胞を、自己のCD4+ T細胞サブセットまたはTregクローンと共培養した（比率1:1）。プラズマブラスト頻度は、10日後に評価した(F)。上清は、総IgA（G）およびIgG（H）含有量について試験された。単一比較には一対の両側t検定を用い、5Dには一元配置分散分析に続いてDunnの多重比較検定を行い、p<.05を統計的に有意であるとみなした。

まず、B細胞の活性化と分化に影響を与えることが知られている主要なタンパク質の発現を解析した。CD40Lは、定常状態でもDP8α Tregクローンによって強く発現し、より低い程度では、陽性対照として用いたTfh細胞と同様にex vivoで選別したDP8α Tregによって発現したが、Foxp3+ Tregクローンはほとんどしなかった(図5B)。血液由来クローンとPBMCの両方による、B細胞の発生と機能にも影響を与えることが知られているいくつかのサイトカインの産生を試験した。DP8α及びFoxP3＋Tregクローンの有意な画分は、IL-10（図1C、D）及びIFNγ（図1A、B）に加えて、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13及びIL-21（図5C）を産生していることが分かった。さらに、OKT3刺激PBMCは、DP8αトレグが古典的トレグよりも高いレベルのこれらのサイトカインを産生することを示し（図5D）、DP8αトレグがB細胞の助けを提供するのに適した状態にあることを実証した。

DP8αトレグがB細胞の活性化と分化を促進できるかどうかを直接判断するために、クローンまたはex vivoで選別したDP8α細胞を、CD3/CD28ビーズ付きまたはなしのアゴニスト抗BCR抗体の存在下でex vivo選別のナイーブB細胞と共培養させた。コントロールとして、ex vivoでソーティングしたTfh細胞とFoxp3+ Tregクローンを同じように並行培養した。これらの様々なTおよびB細胞サブセットを選別するためのゲーティング戦略を表す（図5E）。10日後、ナイーブB細胞をDP8αトレグと共培養すると、形質芽細胞（CD3-／CD4-／CD19LOW／CD38+）が検出された（図5F）。プラズマブラストは、活性化ソートされた自己DP8αトレグ及びDP8αトレグクローンと共培養した後、全CD3-／CD4-／CD19＋B細胞のそれぞれ平均19.1％±0.21及び14.1％±4.21（0.8〜56.9％の範囲）であった（図5F）。DP8αトレグクローンは異種であること、すなわち、あるものは高い割合の形質芽細胞を誘導するが、他のものは低いか全くB細胞分化を誘導しないことが注目される。この形質芽細胞誘導は、活性化Tfh細胞の存在下で得られたものと同等であったが、Foxp3+ Tregクローンを使用した場合には、はるかに低かった（全B細胞の5.2%±1.39）（図5F）。

並行して、上清を総IgAおよびIgGの含有量について検査した。血液由来のDP8α Tregは、クローン細胞と選別されたポリクローナル細胞の両方で、高レベルのIgA産生（それぞれ1177ng／ml±219.3および990ng／ml±433.4）を誘導し、自己Tfh細胞（211ng／ml±210）によって誘導されるレベルよりも明らかに上回った（図5G）。DP8αトレグも、Tfh細胞（164ng/ml±114.3）と同レベルでIgG産生（選別細胞およびクローン細胞についてそれぞれ90ng/ml±28.5および220ng/ml±71.8）を誘発した（図5H）。注目すべきは、Foxp3+ TregsはIgAおよびIgG産生を誘導しなかったことである（図5G、H）。

したがって、DP8αトレグは、B細胞の助けを提供し、IgAクラススイッチの組換えを促進する傾向があるようである。

DP8α Tregのユニークな高い走化性
次に、DP8αトレグの走化性に関して、この機能に関わる遺伝子、すなわちCCL4、CCL5、XCL1およびCCR5のタンパク質発現を測定した。その結果、3種類のケモカインが、大腸および血液由来のDP8α Tregクローンでは、同じ区画由来のFoxP3+ Tregクローンと比較して有意に高いレベルで発現しており（図6A-C）、循環および大腸残留のDP8α Tregが標的細胞を勧誘する重要な能力を有していることが示唆された。驚くべきことに、循環DP8αトレグによるCCL4およびCCL5タンパク質の細胞内発現もex vivoで検出され、これらの細胞と循環FoxP3+トレグを静止および活性化状態の両方で明確に識別することができた（図6D）。

図6
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図6 DP8α Tregの走化性。(A-C）代表的なTregクローン（左）およびすべての研究対象Tregクローン（右）による、示されたケモカインの発現。(D)3つのHDからのPBMCによるCCL4およびCCL5の発現は、示されたゲートT細胞サブセットに対して示されたものである。(E-G）代表的なTregクローン（E）、すべてのTregクローン（F）、およびPBMCsからのゲーティングされたサブセット（G）によるCCR5の発現。6A-D,Gでは、一元配置分散分析とDunnの多重比較検定を行い、p<.05を統計的に有意とみなした。

炎症部位への動員によるDP8α Treg制御能の観点からも重要であり（38）、CCR5発現レベルは、マッチしたFoxP3+クローンと比較して、安静時結腸および血液由来のDP8αクローンで高く（図6E、F）、この違いはex vivo（図6G）でも確認されている。

したがって、DP8αトレグは、特に従来のFoxP3+トレグと比較した場合、標的細胞を誘導し、適切な部位に誘導する能力が十分に備わっているようである。

DP8αトレグによるRORγtの発現
最後に、DP8αおよびFoxP3+ Treg細胞によるRORγt TFのタンパク質発現を評価した。このTFは、微生物によって誘導されたマウスTregの特徴として知られている（21, 22）。以前の研究(6)で、我々は今回調査していない少数の血液由来DP8α TregクローンによるRORγtの発現を報告していた。今回、使用した3'seq RNAプロファイリング法ではこの遺伝子は検出されなかったため、研究対象としたすべてのTregクローンおよびその循環血中の対応する遺伝子による発現を評価した。RORγtは、血中および結腸由来のDP8α Tregクローンでは静止状態および活性化状態で発現していたが、FoxP3+ Tregクローンでは発現していなかった（図7A）。さらに、驚くべきことに、このTFは、PBMCのうち循環しているDP8αトレグによっても発現されたが、他のT細胞サブセット、例えば全CD4＋、古典的CD25HIGH／CD127LOWトレグ、CD8＋、ならびにF. prausnitziiに反応しないCCR6およびCXCR6共発現を欠く二重陽性CD4＋／CD8＋T細胞では発現しなかった（図7Bおよび示さず）。

図7
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図7 DP8αトレグがRORγtを発現する。代表的なTregクローン（左）およびすべてのTregクローン（右）によるRORγtの発現（A）、ならびにPBMCからの示されたゲートサブセットによる発現（B）。7Bでは、一元配置分散分析とDunnの多重比較検定を行い、p<.05を統計的に有意とした。

したがって、RORγtは、F. prausnitzi誘導DP8αトレグに発現が限定されることが望ましい別のマーカーである。

考察
ヒトF. prausnitzii特異的DP8αトレグのシグネチャーは、Tr1様トレグ（図2I）および細胞障害性CD4 T細胞（CD4-CTL）（図4および図S3）と一部重複し、これらのトレグの独自性を明確に立証するものであった。さらに、血中および結腸由来のDP8α Tregはほぼ区別がつかず、IBD患者において両方のコンパートメントでこれらの細胞が同時に減少していることが以前に示唆されたように、その共通の起源を支持している（図2）ことが慰められた（3、6）。重要なことは、血中に存在するDP8α TregがF. prausnitzii特異的Tregの全身的な役割を担っていることをさらに支持することである。

マウスでは、RORγt+ FoxP3+ intestinal Tregsが微生物抗原に対して発現しており、Th17応答の制御を通じて、cMAF依存的に腸内細菌叢に対する耐性を維持することに特化していることが提唱されている(22)。さらに、アレルギーの予防や、離乳期の誘導不全がその後の代謝性疾患や慢性炎症性疾患の感受性を高めるなど、腸以外の免疫恒常性や健康にも関わる役割を担っている（1）。我々は、ヒトDP8αトレグが、関連するクロストリジウム菌によって誘導され、大腸LP内に優先的に位置することに加え、マウス微生物によって誘導された腸管FoxP3+トレグと、系統決定TFであるRORγt（図7）およびMAF（図2F、H、I）の発現が共通していることをここに明らかにした。このように両サブセットの発生学的類似性は、DP8αトレグがマウス腸管RORγt+/FoxP3+トレグのヒト機能的対応物であり、大腸炎を予防する可能性を示唆している。この仮説を補強するものとして、我々は最近、DP8α TregクローンとF. prausnitziiの経口投与により、Treg HLA class-II restricting alleleのヒト化NSGマウスを腸の炎症から守ることを示した(7)が、IBD患者ではこれらの細胞が劇的にかつ特異的に減少することと合わせて、結腸のホメオスタシスにおけるこれらの役割を強く支持している。驚くべきことに、RORγtの発現は微生物によって誘導されたマウスFoxP3+ Tregを特徴づけるが、FoxP3+クローン（結腸および血液由来）およびPBMC由来のCD3+/CD4+/CD25HIGH/CD127LOW T細胞ではフローサイト解析によってRORγt発現細胞を検出できなかった（図7A、B）。

驚くべきことに、マウスの大腸FoxP3+ Treg分化を促進する様々なヒト腸内細菌、特に常在菌が同定されているにもかかわらず（39-43）、我々の知る限り、ヒト大腸粘膜におけるこれらの細菌に特異的なTregの存在に関する直接的証拠は、FoxP3+またはTr1様のいずれも未だ得られていない。それにもかかわらず、小腸の循環CD4+エフェクターT細胞（44）およびCD4+/CD8α+制御性上皮内リンパ球（45）の両方において、常在菌特異的T細胞の存在が示されており、両者はヒト腸管バリアの完全性維持に重要な役割を担っている。

私たちのトランスクリプトームおよびタンパク質データは、活性化DP8αトレグが、直接的な細胞傷害性、脱顆粒および自己殺傷防止といった様々なレベルで、細胞傷害性に関与する分子の大きなパネルを発現していることも明らかにした（図2D、図S3および図4A-H）。この特性は、抗原提示細胞の死滅を介したTr1細胞の免疫抑制機構であると提唱されており、それゆえその後のT細胞のプライミング/活性化を制限する(19)。さらに、DP8α TregはXCL1を分泌し、XCR1aを発現するDCを標的として、DP8α Treg-DC間の接触とDCの殺傷を促進することも明らかになった（図6C）。

DP8αの高い輸送能力を裏付けるように、安静時DP8αクローンおよび生体外循環DP8α細胞は、炎症部位への移動をサポートするCCR5を高レベルで発現した（図5E-G）(38)。これらの細胞はまた、CCL1、CCL3、CCL4、CCL5およびXCL1などのケモカインを大量に産生した（図S4および図6A-D）。これは、CCR8、CCR1、CCR5を発現するエフェクターT細胞やバイスタンダーCCR5+ DP8α Tregなどの様々な標的細胞をリクルートするそれらの強い潜在能力を明らかにするものである（図6E-G）。CCL3とCCL4は古典的なFoxP3+トレグによって発現されることが知られており（14）、CCL5はユニークな血液由来Tregサブセットによって発現されることが知られている（46）。さらに、XCL1の分泌により、DP8αトレグは、ヒトの交差提示型DCであるBDCA3+ DCサブセットと報告されているXCR1aを発現する細胞と効率的に相互作用するはずである(15)。したがって、in vitroで示されたように、DP8αトレグがエフェクター細胞の増殖（6）とサイトカイン分泌（未発表の個人データ）を抑制する能力において、これらの相互作用が鍵となるはずである。さらに、マウスで安定であることが示されたXCL1-XCR1を介した相互作用は、DP8α Treg-DC間の相互作用を拡大し、その結果、以前に報告されたように、CTLA-4依存的にDCキリングまたはDC成熟の抑制を促進するか（3）、単にDCがTconvから抑制される可能性もあった。これらの効果はすべて、腸内細菌叢に対する局所的な耐性の確立や回復に関与している可能性がある。

DP8α細胞は、IL-10とIFNγの産生（図1A-D）およびFoxP3の安定発現の欠如（図1E、F）から、Tr1様Tregに部分的に類似していると考えられる。我々のデータでは、ITGA2 Tr1マーカーの発現や骨髄系細胞に対する細胞毒性など、DP8αトレグとこの極めて異質なTregサブセットとの間にさらなる類似性が確認された（図2Iおよび図S7）(19)。それにもかかわらず、DP8αトレグがTr1細胞とは明らかに異なるという証拠も提供された。例えば、DP8α細胞は、Tr1細胞では発現しないIL-4を産生し（図5A、C、D）、逆にTr1による抑制に不可欠と考えられるTGFβ転写とPD-1の発現を欠いていた（図示せず）(19)。さらに、DP8αトレグによるエフェクター抑制は、in vitroでのCD39およびCD73を介した代謝破壊に強く依存しており（図1I、J）、おそらくin vivoでの高い走化能にも依存している。この2つの特性は、従来のTr1細胞には記録されていないものである。最後に、Tr1およびTr1様Tregの正確な起源と安定性には疑問が残るが(32)、DP8α Tregは健康なドナーの血液および大腸リンパ球の安定した成分であり、したがって生理的に誘導された大腸由来のTregサブセットを体現していることになる。

マウスを用いた初期の報告では、Treg細胞はTfhやTfr細胞への分化やIL-10分泌の可塑性により、腸のIgA産生をサポートする役割を果たすことが示されている(21)。ここでは、ex vivoでソートしたDP8α細胞およびDP8αクローンが、循環Tfhと同様に効率的にナイーブB細胞を形質芽細胞に分化誘導し（図5F）、一見してより高いレベルのIgA産生を誘導する（図5G）ことを示し、さらに別の共有機能を腸管マウスFoxP3+ Tregsと追加することに成功した。注目すべきは、FoxP3+ TregクローンがIg産生形質芽細胞を誘導しなかったことである（図5F-H）。したがって、DP8αトレグは、B細胞の助けを提供し、特にIgAクラススイッチの組換えを促進しやすいようである。この機能は、これらの細胞がかなり多く存在する（LP CD4+T細胞全体の10%以上 (3, 5, 6)）腸において、IgA依存的に恒常性を維持する鍵となる可能性がある。DP8αトレグによるIgA誘導に関わるメカニズム、およびマウスで報告されたRORγt+腸管トレグとIgA産生の間の二重の負のフィードバックループとの適合性は、まだ解明されていない(47)。

クラスI制限関連分子（CRTAM）は、もともと細胞傷害性CD8+細胞やNK細胞の活性化により一過性に誘導される分子として報告されている。最近、MAF、GZMK、EOMESとともにCD4-CTL系譜を駆動することが報告されている(11, 33)。ここでは、DP8α Tregがこれらの分子を発現していることを示した（図4、図S3）。

DP8α Tregのエフェクターターゲットはまだ同定されていない。多くの研究が、特殊なTregサブセットがエフェクター細胞の転写プロファイルの一部を獲得することを立証しているので(48)、DP8α Tregが、Th17および細胞傷害性CD4の標準転写因子であるRORγtおよびCRTAMをそれぞれ発現することが示されたことは、これらのエフェクターをその特定のターゲットとできる可能性を示唆するものである。実際、マウス大腸のRORγtを発現する微生物誘導型Tregは、Th17が介在する炎症を抑制することが示されている(21)。さらに、CD4-CTLは二次リンパ系器官と比較して、マウス腸管粘膜に濃縮され、実験的大腸炎を促進することが報告されている(11)。まだ報告されていないが、ヒト腸管粘膜におけるCD4-CTLの存在は、その分化がヒストン脱アセチル化酵素によって抑制されており(49)、その阻害剤、例えば酪酸がこの区画に特に豊富に存在することから、考えられるようである。

しかし、この方法の限界は、健康状態や疾患におけるF. prausnitzi反応性DP8α細胞の生体内での潜在的な不均一性を完全に解明できないことである。この問題は、単一細胞のエピトープとトランスクリプトームを同時に測定する方法を用いた単一細胞のRNA-seq解析によって解決されるべきである(50)。しかしながら、クローンを用いて同定されたマーカーや機能は、生体外PBMC由来のDP8αトレグを用いて確認され、その関連性とクローンの選別や長期培養とは無関係であることが強調される必要がある。

多くのTr1様細胞の発生起源は不明であるが、DP8α細胞はその特異性からTreg細胞へ分化する可能性が高い。実際、我々はF. prausnitziiが樹状細胞の機能を利用し、TLR2/TLR6依存的にトレローゲン化することを明らかにした4。その結果、樹状細胞によって提示されたF. prausnitzii由来のエピトープは、最終的にナイーブCD4 T細胞を、DP8α Tregを含むIL-10産生CD4+ T細胞4へとプライミングすることが分かった。

結論として、本研究は、DP8αトレグのトランスクリプトームシグネチャー、表現型、機能的特性、すなわち強力な溶解活性、走化性、IgA産生を促進するユニークな能力に関する重要な新データを提示した。これらの特徴は、今回明らかになったFoxP3+トレッグだけでなく、上述のTr1様細胞とも、特異的機能や生理的関連性の点で明らかに一線を画している。むしろ、大腸炎を予防することが証明されたマウスRORγt+/FoxP3+腸管トレグに最も近いと思われる(2)。これらの知見は、これらのユニークな微生物誘導性トレグが、これまであまり認識されていなかった組織の恒常性維持に重要な役割を果たすことを強く示唆しており、健康や疾患、特にIBDの文脈におけるその役割をさらに探求することの重要性を強調している。

データの利用について
本研究で発表したデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができます。リポジトリ名とアクセッション番号は以下の通りです。NCBI Gene Expression Omnibus; GSE197906.

倫理に関する記述
ヒトを対象とした研究は、ナント大学病院のCPP Ouest IV-Nantes機関委員会の審査と承認を受けた。患者/参加者は、この研究に参加するために、書面によるインフォームドコンセントを提供した。

著者による貢献
FJはRNA配列データの解析、実験の共同企画、解釈、原稿執筆、JA はLPL由来クローンの作成とスクリーニング、RTはバイオインフォマティクス解析とトランスクリプトームデータ図示、APはT/B共培養実験の一部を実施、NJはフローサイトメトリによるソーティングとクローン化の企画と実施、FAはプロジェクトの監督、EGはほとんどの実験の企画、実施とプロジェクトの監督、EG、FA、FJは原稿編集を担当した。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
この研究は、ANR（MICITREG, ANR-15-CE17-0010）の支援を受けて行われた。

謝辞
INCIT INSERMユニット1302（Immunology and New Concepts in ImmunoTherapy）のメンバー、特にFrédéric Altareの研究室のメンバーの技術的支援と議論に感謝する。また、K562およびU937細胞株を提供してくださったNathalie Labarrière博士に感謝する。Julie Tabiascoには、CD39阻害剤POM-1を提供していただき、感謝している。BiogenouestとFrance GenomiqueのメンバーであるGenomics Core facility GenoA、BiogenouestとInstitut Français de Bioinformatique (IFB) (ANR-11-INBS-0013) のリソースと技術サポートを使用させていただいたBioinformatics Core facility BIRDに深く感謝いたします。A2-165 Faecalibacterium prausnitzii 菌を提供してくださった Harry Sokol 氏と Chantal Bridonneau 氏に感謝する。Cytocell (Flow cytometry and FACS core facility, BioCore, CNRS 3556 - Inserm US016 - Nantes Université UMS 3556, Nantes) のスタッフによるフローサイトメトリー材料および方法に関する専門的技術支援に謝意を表する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしもその関連組織のもの、あるいは出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1026994/full#supplementary-material に掲載されています。

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キーワード：ヒト腸内細菌特異的Treg、Faecalibacterium prausnitzii、腸内細菌叢、細胞傷害性CD4+T細胞、IgA、IBD

引用元 Jotereau F, Alameddine J, Teusan R, Pédron A, Jouand N, Altare F and Godefroy E (2022) Human gut microbiota-reactive DP8α regulatory T cells, signature and related emerging functions. Front. Immunol. 13:1026994.

Received: 2022年8月24日; Accepted: 2022年10月31日
公開：2022年11月21日

編集者

レイ・ファン（Lei Huang）、ニューカッスル大学、イギリス
査読者：Graham J. Britton, Icahn School, United Kingdom

Graham J. Britton, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, United States (米国)
Nagendra Singh, オーガスタ大学, 米国
Copyright © 2022 Jotereau, Alameddine, Teusan, Pédron, Jouand, Altare and Godefroy. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*通信欄 Emmanuelle Godefroy, emmanuelle.godefroy@inserm.fr; Francine Jotereau, francine.jotereau@univ-nantes.fr; Frédéric Altare, frederic.altare@inserm.fr

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