ヒト腸内細菌Eggerthella lentaが異食性マウスの腸内メタボロームに影響を及ぼす

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原著論文｜オープンアクセス｜2024年1月18日
ヒト腸内細菌Eggerthella lentaが異食性マウスの腸内メタボロームに影響を及ぼす

https://www.oaepublish.com/articles/mrr.2023.65

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アリーナ・ヴィーホフ1

, ...
トーマス・クラヴェル1

Microbiome Res Rep 2024;3:14.
10.20517/mrr.2023.65 | © The Author(s) 2024.
著者情報
論文ノート
引用
要旨
腸内細菌叢とその代謝産物は、宿主の代謝の健康に影響を及ぼすことが知られている。しかし、特定の微生物の役割についてはほとんど知られていない。本研究では、最小コンソーシアムであるOligo-Mouse-Microbiota（OMM12）を用いて、コリオバクテリウムの機能をgnotobioticマウスの定義された条件下で研究した。OMM12マウスに、優勢腸内細菌Eggerthella lenta（E.レンタ）を添加したものと添加しないものを用意し、脂肪含量と主要胆汁酸を変えた飼料を与えた。E. lentaはマウスの盲腸に高い相対量（中央値：27.5%）で安定的に定着した。このことは、Akkermansia muciniphilaおよびEnterococcus faecalisの出現率の減少を伴っていたが、その結果は、食餌および個体間差によって、すべての群で統計的有意差には達しなかった。宿主パラメータ（人体計測、血糖値、コレステロール）と肝臓プロテオームの変化は、主に食事によるものであった。一方、大腸内容物のメタボロームはコロニー形成群間で有意な差がみられた。E. lentaの存在は、ラチホリシンC酸レベルの上昇と関連し、クレアチン、サルコシン、N,N-ジメチルアルギニン、N-アセチル-DL-メチオニンの減少と関連していた。結論として、E. lentaは大腸内の特定の代謝物を変化させたが、個体差が顕著であったため、試験した条件下ではマウスおよび肝臓のプロテオームには有意な影響を及ぼさなかった。

図解要旨

キーワード
腸内細菌叢、オリゴマウス-微生物叢、Eggerthella lenta、腸-肝臓軸、メタボロミクス、プロテオミクス
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はじめに
腸内細菌叢は代謝の健康に影響を与える[1,2]。例えば、腸内微生物の群集が食事と宿主の相互作用を変化させ、代謝性疾患の発症と進行に原因的な役割を果たすという十分な証拠がある[3-6]。しかし、これらのプロセスに重要な特定の微生物に関するデータはほとんどない[7-9]。これは、腸内微生物の生態系が複雑で、複数の種類の微生物と数百種類の細菌種が存在し、そのうちのかなりの割合がまだ未知であることが一因である[10]。したがって、特定の生態系メンバーの機能を研究するために、腸内細菌叢の単純化されたモデルを開発し、利用することが有用である[11,12]。

コリオバクテリウム科は、放線菌門（旧放線菌門）に属するグラム陽性菌の一群である。この科に属する種は、定期的に菌血症と関連しているが、アトポビウム属、コリンセラ属、エガテラ属、スラッキア属などのヒト腸内細菌叢の重要なメンバーでもある[13]。最近、コリオバクテリウム科はコリオバクテリウム属の中でも複数の科に分割され、その中にはエッガートヘラ科（Eggerthellaceae）［そのタイプ種であるエッガートヘラ・レンタ（Eggerthella lenta）（E.lenta）を含むエッガートヘラ属に代表される］、アトポビウム科（Atopobiaceae）、およびコリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）が含まれる[14]。E.レンタは、ヒトの腸内微生物の生態系において、支配的で一般的なメンバーである[15]。コアマイクロバイオームに属するだけでなく、この種の菌株は機能的にも多彩で、宿主由来の複数の分子（ホルモン、胆汁酸、神経伝達物質など）[16-19]や、食事性基質（ポリフェノールなど）[20,21]、薬剤（ジゴキシンなど）[22]などの経口化合物を代謝することができる。このような重要な機能資産を有するにもかかわらず、生態系におけるE. lentaの役割や、定義された条件下での宿主への影響について調査した研究はほとんどない。

アレクサンダー（Alexander）らは最近、モノコロナイズドマウスで複数のE. lenta株を用いて、Th17依存性大腸炎におけるE. lentaの原因的役割を証明し、それは細菌酵素である心筋グリコシド還元酵素2（Cgr2）に起因することを明らかにした[23]。興味深いことに、Cgr2がアルギニンを基質として感受性を示すため、アルギニンを食事に添加すると炎症の誘発が抑制される。メタボリックヘルスの観点から、ヒト糞便中のEggerthella spp.およびE. lentaのシークエンシングによる検出と、肥満や2型糖尿病（T2D）との関連を調べた記述的研究がいくつかある。Kohらは、イミダゾールプロピオン酸を産生するこの種の能力と関連して、T2D患者（n = 33）における相対的存在量の高さを報告した[24]。Qinらもまた、E. lentaとT2D（n = 170）との正の関連を報告している[25]が、これらの調査結果はメトホルミン治療によって混乱していた[26]。肥満に関しては、Yunら（n = 940）は、Eggerthellaと体格指数（BMI）との間に負の関連を報告し[27]、Fuら（n = 893）は、BMIとの有意な関連を認めなかったが、血中トリグリセリド値または高密度リポタンパク質（HDL）コレステロール値との間にそれぞれ強い正または負の関連を認めた[28]。したがって、代謝性疾患におけるEggerthella属およびE. lentaの発生に関する結果は相反しており、実験的研究は不足している。

本研究では、マウスの腸から分離された12種類の細菌からなる細菌コンソーシアムであるOligo-Mouse-Microbiota（OMM12）[29]をコロニー形成させたマウスと、E. lentaによるコロニー形成の有無を比較した。マウスには、コリオバクテリアと宿主の代謝状態との関連性から、脂肪含量を変え、胆汁酸を添加した異なる飼料を与えた。大腸のメタボロームと肝臓のプロテオームが研究された。

方法
培養と経口投与液の調製
この研究の当初の目的は、コリオバクテリウム科の主要な機能的特徴を示すコンソーシアムを使用することであった。そこで、アドレルクロイツァ・ムコシコーラDSM 19490T（旧エンテロラブドゥス・ムコシコーラ）、コリンセラ・アエロファシエンスDSM 3979T、E. レンタDSM 2243T、およびランスフィデラ・パルビュラDSM 20469T（旧アトポビウム・パルビュラム）を、ウィルキンス-チャルグレン-アネローブ培地（WCA、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）または脳心梗塞培地（BHI、オキソイド社製）で培養した。これらの培地には、還元剤として0.05g/mLのL-システイン（Sigma-Aldrich）および0.02g/mLの1,4-ジチオスレイトール（DTT；Sigma-Aldrich）、酸化還元電位指示薬として2mg/Lのフェノサフラニン（Sigma Aldrich）を添加した。L. parvulaの成長を刺激するため、培地には0.02% Tween80（Fisher Scientific）を添加した。9mLの培地を入れたハンゲートチューブ（Dunn Labortechnik GmbH）を用い、37℃の無酸素条件下（89.3% N2、6% CO2、4.7% H2）で培養した。

無菌マウスをコロニー形成させるために、OMM12 株[29]とコリオバクテ リアを含むか含まない微生物懸濁液を作製し、嫌気チャンバー（MBraun, Garching, Germany; 89.3% N2, 6% CO2, 4.7% H2）で分注し、-80℃で保存した。OMM12マウス（ドイツ、ハノーバー医科大学、Marijana Basic博士の好意により提供）の凍結カイカ3個を切り開き、内容物を40%（vol/vol）グリセロールを含む128mLの滅菌無酸素WCAブロス中で滅菌ガラスビーズ（直径2.5mm）と混合した。ボルテックスでホモジナイズした後、懸濁液を数分間静置して残渣を沈殿させ、上清を回収した。コリオバクテリウムを含まない OMM12 溶液の場合、スクリューキャップ付きチューブに分注し、-80 ℃で保存する前に、上清を同量の滅菌無酸素 WCA ブロスと混合した。コリオバクテリウムを含む OMM12 ストックについては、4 株の一晩培養液を Thoma Chamber を用いて二重にカウントし、各株の約 1×109 個/mL の細胞を含む混合液を、40%(vol/vol)のグリセロールを含む OMM12 上清と 1:1 で混合した。最終ガベージ液（0.2 mL）中のコリオバクテ リア 4 株の細胞密度は約 1 × 108 個であった。アリコートはスクリューキャップチューブに入れ、80℃で保存した。

動物実験
動物使用は地元の担当機関（Regierung von Oberbayern、承認番号55.2-1-54-2532-156-2013）の承認を得た。動物はミュンヘン工科大学ZIEL-Institute for Food & Healthのマウス施設で飼育した。

実験スキームを補足図1Aに示す。無菌雄性C57BL/6Nマウスに、前述の解凍したての微生物混合液0.2mLを、離乳直後の5週齢から1週間以内に3回経口投与した。この間、マウスはケージに割り当てられ、各コロニー化／食事群には、複数のケージに収容された異なる産仔のマウスが含まれるようにした［補足図1B］。雄マウスは食事誘発性肥満に反応しやすいため、雄マウスを使用した。8週目以降、飼料をオートクレーブ処理した標準飼料（Ssniff GmbH）から合成対照飼料（CD）に2週間変更した。その後、マウスに以下のいずれかの飼料を8週間与えた（各群n = 6-8）： CD；CD-BA：一次胆汁酸であるコール酸（CA）とチェノデオキシコール酸（CDCA）（各0.1％w/w）を添加したコントロール食；HFD：ラードベースの高脂肪食（脂肪からのエネルギー48％）；HFD-BA：CAとCDCAを添加したHFD。これらの飼料は、コリオバクテ リア/E.レンタと胆汁酸代謝および宿主の代謝健康との関連から使用された。その参考文献と主な組成の違いを補足図1Cに示す。マウスをCO2で安楽死させる前に、最低6時間絶食させ、FreeStyle Liteシステム（Abbott社製）を用いて尾から血糖値を測定した。剖検の際、中心静脈（大静脈）から全身のEDTA血漿を採取した。盲腸、結腸および肝葉の内容物はスナップ凍結した。精巣上体、腸間膜、皮下の白色脂肪組織の重量を測定し、その累積重量を白色脂肪組織（WAT）質量とした。

コレステロール分析
血漿中のコレステロール濃度は、VITROS Chemistry Products CHOL Slides（Ortho Clinical Diagnostics）とVITROS 350 Chemistry System（Ortho Clinical Diagnostics）を用いて定量した。

微生物DNAの分離
gnotobioticマウスからの糞便内容物または経口摂取に使用した細菌ストックを、7.5mgのリゾチームを含む500μLのTris-EDTA（TE）緩衝液と混合し、37℃で30分間インキュベートした。50μLの10%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、Carl Roth）と300μgのプロテイナーゼK（Carl Roth）を加えてから、50℃で1時間インキュベートした。 1 mm; Carl Roth）、250 μL 4M Guanidinethiocyanate（Sigma Aldrich）、500 μL 5% N-laurolylsarcosine（Sigma Aldrich）を入れた2 mLスクリューキャップチューブに移し、70℃で1時間、絶え間なく振盪しながらインキュベートした。その後、FastPrep®-24（3回、40秒、6.5m/s）（MP Biomedicals）を用いて機械的溶解を行った。15mgのPoly(vinylpolypyrrolidone) (PVPP, Merck)を添加した後、サンプルをボルテックスした。その後、5μLのRNase（10mg/mL、VWR）を、2回の遠心分離（15,000rcf、4℃、3分）後に得られた500μLの透明な上清に加え、サンプルを37℃で20分間、一定に振盪しながらインキュベートした。ゲノムDNAはNucleospin gDNA clean-up kit（Macherey Nagel）の説明書に従って精製し、50μLのTEバッファーで溶出した。DNA の量と質は NanoDrop（Thermo Fisher Scientific）で測定した。

ハイスループット16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング
コンビナトリアルデュアルインデキシングを含むプライマー341Fと785R[31]を用いて、16S rRNA遺伝子のV3/V4領域を増幅した（25サイクル；2段階PCR）[30]。ライブラリーは磁気ビーズ（Beckman-Coulter）を用いて精製し、製造元の説明書（Illumina）に従ってMiSeqでシングルエンドモードでシーケンスする前に等モルでプールした。UPARSEベース[32]プラットフォームIMNGS[33]を使用して、以下のパラメータで生のシーケンスリードを処理した：バーコードミスマッチ、1；予想エラー、9；クオリティトリミングスコア、20；トリミング長、10 nt；最小シーケンス長、200 nt；最大シーケンス長、300 nt。操作上の分類単位（OTU）は、97％の配列類似度でクラスタ化された。各コリオバクテリアとOMM12種の相対量は、対応する参照16S rRNA遺伝子配列に対してBLAST検索（配列同一性97％、クエリー配列長の80％、e値＜1-25）を行った後に得られた。β多様性解析はRhea[34]で行った。ネガティブコントロール（DNA抽出およびPCRブランク）はすべてコンタミネーションを示さなかった（<100リード）。

プロテオミクス
肝臓サンプルのタンパク質は、凍結したサンプルに氷冷した溶解バッファー[150 mM NaCl、10 mM Tris (pH7.2)、0.1% SDS、1% Triton X-100、1% デオキシコール酸、5 mM EDTA、pH 7.4、cOmpleteTM protease inhibitor]を800 µL加え、ビーズミリング(10 分、頻度 30)を行い、氷上で1時間インキュベートすることで抽出した。溶解液を遠心分離（12,000 rpm、15分、4℃）し、上清を回収した後、DC protein assay（BIO-RAD）を用いて、製造元の指示に従ってタンパク質濃度を測定した。

各サンプルについて、前述[35]のように、20μgのタンパク質溶解液をサンプル調製に用いた。簡単に説明すると、タンパク質はTCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]で還元し、ヨードアセトアミド(IAA)でアルキル化した。タンパク質のクリーンアップは、サンプルを酸性化することなく、70%エタノールとアセトニトリル（ACN）中で常磁性ビーズを用いて行った[35]。次に、Trypsin（Promega社製）を用いて、1：50の割合（トリプシン：タンパク質）で、37℃で16時間、タンパク質をタンパク質分解した。次に、5×タンデムマスタグ（TMT, TMT-10plex, Thermo Scientific, USA）を用いてサンプルを室温で1時間標識した後、100 mM TEAB中5%（v/v）ヒドロキシルアミン1 µLを加えて標識化をクエンチした。サンプルは7つのミックスにまとめられ、それぞれ異なる処理の1レプリケートが含まれていた。100%ACNでペプチドをクリーンアップした後、フラクション1には10mMギ酸アンモニウム（pH10、Sigma Aldrich）中87%ACNを、フラクション2には2%ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma Aldrich）を用いて、ペプチドを2つのフラクションに溶出した。

LC-MS/MS 分析は、UltiMate 3000 RSLCnano システム (Dionex, USA) を用い、チップベースのエレクトロスプレーイオン源 (TriVersa NanoMate, Advion, USA) により、Q Exactive HF 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific, USA) にオンラインで結合して行った[35,36]。まず、98%水/2%ACN/0.05%トリフルオロ酢酸（Acclaim PepMap 100 C18, 3 μm, nanoViper, 75 μm × 5 cm, Thermo Fisher Scientific, Germany）を用いて、5 μL/分のトラッピングカラムにペプチドをロードし、次に分析カラム（Acclaim PepMap 100 C18, 3 μm, nanoViper, 75 μm × 25 cm, Thermo Fisher, Germany）でペプチドを分離した。水中0.1%ギ酸から水中80%ACN/0.08%ギ酸まで、150分間の非線形グラジエントを適用した。各MSから、0.7 m/zの分離ウィンドウで上位15個のプレカーサーイオンを選択した。

MSの生データは、ProteomeDiscoverer 2.2を用いて、2021年11月16日のMus musculus UniProtKB参照プロテオームに対してカルバミドメチル化処理した。TMTは固定とし、メチオニン酸化とタンパク質N末端のアセチル化は可変修飾とした。リポーターイオン強度は製造元の指示に従って補正した。合計1,914個のタンパク質が同定された。サンプルは、各TMTミックスに含まれる全サンプルの混合物を含むプールコントロールに対して正規化した。サンプルは、条件ごとに少なくとも4つの複製で定量されたタンパク質についてフィルターにかけられ、1,710個のタンパク質が得られた。

メタボロミクス
サンプルは、Pedersenら[37]の記述に従い、Krauseら[38]の方法を用いて調製、測定、分析した。大腸全体の管腔内容物を5×ACN:H2O溶媒と4個のスチールビーズと混合し、ビーズミルで抽出した（10分、30Hz）。遠心分離（14,000rpm、2分間）後、100μLの上清を500μLのMeOH:ACN:H2O（2:3:1）に加え、5分間十分にボルテックスした。5分間の超音波処理の後、サンプルを遠心分離し（14.000 rpm、5分間）、550 µLを新しいチューブに移し、蒸発乾固した（SpeedVac、エッペンドルフ）。分析に先立ち、サンプルは100 µLの0.1% FAと1% ACNの水に再懸濁した。正イオン化モードと負イオン化モードで測定したサンプルは、さらに1:10に希釈した。

6546 UHD Accurate-Mass Q-TOF（Agilent Technologies）とオンライン結合した HPLC システムに、各抽出物 10 µL または 5 µL（それぞれ正イオン化および負イオン化）を注入して測定しました。代謝物は、プレカラム (2.1 × 50 mm、1.8 µm) を備えた Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 カラム (2.1 × 100 mm、1.8 µm) で分離しました。オートサンプラーは5℃に保ち、カラムオーブンは45℃に設定した。分離は、A（水中0.1% FA）とB（ACN中0.1% FA）の二元溶媒系を用いて達成された。グラジエントは以下の通り： 0-5.5分：1% B; 5-20分：1%-100% B; 20-22分：100% B; 22-22.5分：100%-1% B; 22.5-25分：1% B。オートサンプラーを5℃、カラムオーブンを45℃に設定し、0.3 mL/分の一定流速で代謝物を溶出した。溶出した化合物は、セントロイドモードでQTOFを操作して測定した。両方のイオン化モードで50-1,000 m/zのスキャンレンジでフルスキャンデータを作成した。サーベイスキャンのうち、電荷状態=1の最も豊富な2つのプリカーサーイオンがフラグメンテーションの対象となった。2回のスペクトル取得後の動的排除時間は0.1分に設定した。

スペクトルデータ（.dファイル）をProgenesis QIソフトウェア（Non-Linear Dynamics, Milford, MA, USA）にインポートした。2つのイオン化モードを別々に分析した。付加イオンは、ポジティブモードでは[M+H]、[M+H-H2O]、ネガティブモードでは[M-H]、[M-H2O-H]、[M+FA-H]とした。クロマトグラムの位置合わせは、データセットから自動的に選択されたリファレンスクロマトグラムを用いて行った。次のソフトウェアガイド付きピークピッキングツールにより、保持時間、質量電荷比、対応する正規化ピーク面積を含むデータマトリックスが得られた。インシリコデータベース検索には、Fecal Metabolome Databaseをリソースとして使用した。全測定化合物の結果（化合物測定と推定同定）をエクスポートした後、MS2フラグメントスペクトルで推定同定され、Progenesisスコアが40以上のピークのみを残すようにデータをさらに処理した。ピークが複数の化合物にアノテーションされている場合は、Progenesis スコアが最も高いアノテーションのみを保持しました。

統計
微生物叢のデータについては、RのRhea[34]を用いて統計量を算出するか、GraphPad Prism（Graphpad Software, Inc）を用いて本文および図を通して言及した特定の検定を行った。プロテオミクスについては、log2変換後、それぞれのコントロールに対するfold変化を算出し、Benjamini-Hochberg法を用いて調整P値を算出した。タンパク質は、調整P値≦0.05で有意に変化したとみなされた。解析はR-3.5. 0を使用した： mixOmics[39]、ggplot2[40]、qpcR[41]、corrplot[42]、PerformanceAnalytics[43]、calibrate[44]、dendsort[45]、dendextend[46]、 ComplexHeatmap[47]、limma[48]、plyr[49]、reshape2[50]、xlsx[51]、DEP[52]、ggsci[53]、ggpubr[54]、pheatmap[55]、circlize[56]。メタボロームピークの主成分分析はRで行い、グループ差の有意性はRパッケージvegan[57]のadonis2関数を使用してPERMANOVAで計算しました。アノテーションされた代謝物の差は、Benjamini-Hochberg法による多重検定の補正と、一対比較のためのpost hoc Dunnの検定によるKruskal-Wallis検定を用いてRで計算しました。

結果
OMM12マウスの腸内におけるE. lentaのコロニー形成
無菌マウスにOMM12マウスの凍結保存糞便懸濁液をコリオバクテリウムの有無にかかわらずコロニー形成させた。実験終了時（18週齢；約12週間のコロニー形成）に、盲腸内の各菌種の存在を16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価したところ、サンプルあたり13,202±4,266の高品質でキメラチェックされた塩基配列が得られた。4種のコリオバクテリアのうち、E. lentaのみが腸内に定着していた。

一般化UniFrac距離に基づくβ多様性解析の結果、微生物群集は主にE. lentaの有無によって異なることが明らかになった（P = 0.001、PERMANOVA；図1A）。全体的な系統構成に対する食餌（BAsおよびHFD）の影響は、E. lentaでコロニー形成されたマウスにおいてより顕著であり、HFDにBAを補充した場合にのみ統計的有意差に達した（E.L HFD vs. E.L HFD-BA、adj. P = 0.0482）［図1B］。BAはOMM12マウスの盲腸の微生物叢プロフィールにも影響を与えた（MM CD vs. MM CD-BA、adj. P = 0.028）。他のすべての食餌群間の一対比較は、統計的に有意ではなかった（adj. P > 0.05）。

ヒト腸内細菌<i>Eggerthella lenta</i>はノトビオティックマウスの腸内メタボロームに影響を与える。
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図1. E. lentaはOMM12マウスの盲腸に定着した。(A）一般化UniFrac距離の多次元尺度プロットとして示したコロニー形成群のベータ多様性解析（P = 0.001；PERMANOVA）；（B）パネル（A）と同じ、コロニー形成／食事群ごとに可視化（P = 0.001；PERMANOVA）；（C）gnotobioticマウスの盲腸における細菌組成（16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング）。データは個々のマウスを表す点としてプロットされ、黒棒は中央値を示す。B. animalisとA. murisは検出されなかった。統計：少なくとも1つの食餌群のマウスの50％以上で検出された菌株は、Benjamini-Hochberg調整後のMann-Whitney検定を用いて統計的に比較した。星印はコロニー形成群間の有意差を示す（*j. P < 0.05; **j. P < 0.01；各食餌群内での補正を含む；n = 11検定）。異なる文字は、各系統の対応する食餌間の有意差を示す（各系統のP値を個別に補正；n = 12検定）。この図の旧バージョンは、共著者であるTheresa Streidlの博士論文[58]に掲載されている。OMM12：オリゴマウス微生物叢；MM：マウス合成群集OMM12でコロニー形成されたマウス；E.L：OMM12とコリオバクテリアでコロニー形成されたマウス；CD：対照食；CD-BA：0.2％の一次胆汁酸を添加した対照食；HFD：ラードベースの高脂肪食；HFD-BA：0.2％の一次胆汁酸を添加したHFD。

マウスのコロニー形成に使用した経口投与液からは、4 種類のコリオバクテリアがすべて検出された： E. lenta (6.3%), L. parvula (4.8%), C. aerofaciens (3.5%), A. mucosicola (1.6%), OMM12株 (83.9%)であった。一方、マウスではE. lentaのみが検出され、その相対量の中央値は27.5%であった。個体差が顕著であったため、飼料間で有意な差は認められなかった［図1C］。小腸内容物でも同様の結果が得られた。すなわち、コリオバクテ リアは E. lenta だけが検出された（データは示さず）。

OMM12株12株のうち10株が経口摂取液からシークエンシングにより検出された［補足図2］。Bifidobacterium animalis DSM 26074 (= YL2) および Acutalibacter muris DSM 26090T (= KB18) は、過去のマウス研究で報告されているように検出されなかった[29,59]。同じ10株のOMM12がマウスの糞便内容物から検出された[図1C]。Akkermansia muciniphila DSM 26127 (= YL44)が最も優占種であり（ほとんどのマウスで相対存在量30%以上）、次いでEnterococcus faecalis DSM 32036 (= KB1)とBlautia pseudococcoides DSM 26115 (= YL58)（ともに10%以上）であった、 Clostridium innocuum DSM 26113 (= I46)、Turicimonas muris DSM 26109 (= YL45)、Bacteroides caecimuris DSM 26085 (= I48)、Enterocloster clostridioformis DSM 26114 (= YL32)(すべて4%未満)であった。Limosilactobacillus reuteri DSM 32035 (= I49)、Muribaculum intestinale DSM 28989 (= YL27)、Flavonifractor plautii DSM 26117 (= YL31)は低い相対量（1％未満）であった。E. lentaの存在はEnt. faecalisの減少に関連しており、これはBAsを含む2種類の飼料を給与した動物で統計的に有意であった。Akk.muciniphilaの相対量は、E. lentaの存在下でCDおよびHFD-BAマウスにおいて減少したが、結果は統計学的有意差には達しなかった。E.レンタによるコロニー形成は、それ以外では微生物群集に大きな変化をもたらさなかった。

E. lentaは宿主パラメータおよび肝臓プロテオームに有意な変化を与えなかった。
盲腸重量、胴体重量、肝臓重量、総WAT重量、空腹時血糖値、血漿コレステロール値は、E. lentaのコロニー形成によって有意な変化は認められなかった［図2A］。盲腸重量は、E. lentaコロニー化マウスでは食餌に有意に影響された；BA補充はより小さな盲腸と関連していた。さらに、食餌によるコロニー特異的な影響には以下のようなものがあった： (i)HFD-BAおよびHFDをそれぞれ与えたOMM12マウスでは、統計的有意差には達しなかったが、体重およびコレステロール値が最も高かった；(ii)HFD-BAを与えたE. lentaコロニーマウスでは肝臓重量が低かった。

ヒト腸内細菌<i>Eggerthella lenta</i>は異食性マウスの腸内メタボロームに影響を与える。
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図2. E. lentaによるコロニー形成は宿主に有意な影響を与えなかった。(A）盲腸、胴体、肝臓、全WATの重量、空腹時グルコースとコレステロールの血中濃度。データは個々のマウスを表す点としてプロットした。各グループ内で、異なるケージに収容されたマウスは空または塗りつぶされた円で示されている。黒棒は中央値を示す。統計： 統計：Kruskal-Wallis検定とDunn検定による多重比較。星印は食餌間の有意差を示す（*j. P < 0.05; **j. P < 0.01）；(B)コロニー形成群ごとの肝臓プロテオームのPCA（P = 0.582; PERMANOVA）；(C)パネル(B)と同じ、食餌群ごとに示す（P = 0.001; PERMANOVA）。この図のパネル(A)は、共著者であるTheresa Streidlの博士論文[58]に掲載された。WAT：白色脂肪組織；PCA：主成分分析；MM：マウス合成群集OMM12でコロニー形成したマウス；E.L：OMM12とコリオバクテリウムでコロニー形成したマウス；CD：対照食；CD-BA：0.2％の一次胆汁酸を添加した対照食；HFD：ラードベースの高脂肪食；HFD-BA：0.2％の一次胆汁酸を添加したHFD。

肝臓プロテオームの主成分分析（PCA）では、コロニー形成グループ間に有意差は認められなかった（P = 0.582、PERMANOVA）［図2B］。対照的に、食餌の違いによってプロテオームには有意差が生じた（P = 0.001、PERMANOVA）［図2C］。4つの食餌群それぞれについて、OMM12マウスとE. lentaコロニー化マウスの間で単一タンパク質の倍数変化を比較したところ、有意差のあるタンパク質は同定されなかった。対照的に、有意な影響は食餌、特に脂肪含量によって引き起こされた［補足図3］。すべての比較における個々のタンパク質と差異に関するデータは、補足表1にある。HFDを与えたマウスを、脂肪を追加しない対応する食餌を与えたマウス（すなわち、HFD対CDおよびHFD-BA対CD-BA）と比較した場合、両方のコロニー形成群で一貫した変化が観察された。脂肪酸結合タンパク質5（UniProtKB ID: Q05816）のLog2(FC)は最も高い負の値（-4.23～-4.84）を示した。細胞質アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（UniProtKB ID: P05201）、ATP-クエン酸合成酵素（UniProtKB ID: Q3V117）、および甲状腺ホルモン誘導性肝タンパク質（UniProtKB ID: Q62264）は、HFD群では一貫してダウンレギュレートタンパク質のトップ10に入っていた。コレステリルエステルヒドロラーゼ(UniProtKB ID: Q9Z0M5)は、HFD群では一貫してアップレギュレートタンパク質のトップテンの下にあった[Log2(FC) 3.28 to 4.69]。BA補給は肝臓プロテオームにも有意な変化をもたらした。CD-BA食を与えたE. lentaコロニー化マウスでは、ペルオキシソームアシルコエンザイムAオキシダーゼ1（UniProtKB ID: Q9R0H0）が最も大幅にダウンレギュレートされたタンパク質であったが、コルチコステロイド11-β-デヒドロゲナーゼアイソザイム1（UniProtKB ID: P50172）は強くアップレギュレートされた。

レンタ菌のコロニー形成が大腸のメタボロームに及ぼす影響
次に、ノンターゲットメタボロミクスを用いて、腸管遠位部におけるE. lentaコロニー形成の機能的影響を調べた。ポジティブイオンモードとネガティブイオンモードで、それぞれ381と576の代謝物ピークが同定された。これらの代謝物ピークのうち、それぞれ71代謝物および87代謝物のアノテーションが可能であった。すべての代謝物のピーク強度を補足表 2 および 3 に示します。すべてのアノテーション済み代謝物について、個々のzスコアを含むヒートマップを補足図4および5に示します。

検出された全代謝物ピークの PCA を行った結果、ポジティブイオン化モード（P = 0.001、PERMANOVA）ではコロニー形成グループ間で有意差が認められましたが、ネガティブイオン化モード（P = 0.548）では認められませんでした[Figure 3A and E]。イオン化モードとは無関係に、異なる飼料を与えたマウス間で、代謝物ランドスケープ全体に明らかな有意差（P = 0.001）が観察されました[図 3B および F]。次に、各食餌群におけるE. lentaコロニー化マウスとOMM12マウスの大腸における単一アノテーション代謝物の出現率を、Kruskal-Wallis検定と一対比較（Dunn検定）を用いて比較した[図3CおよびG]。合計で、33（ポジティブモード）および32（ネガティブモード）の注釈付き代謝物が、少なくとも1つの食餌群においてコロニー形成による有意な変化を示した。興味深いことに、2つの代謝産物（ポジティブモード）と4つの代謝産物（ネガティブモード）は、複数の食餌（≧3）にわたってマウス間で一貫した変化を示した（図3DおよびH；図3CおよびGでは灰色で表示）。OMM12マウス（CD食、HFD食、HFD-BA食）に対してE. lentaコロニー化マウスで上昇した代謝物はラチホリシンC酸のみであったが、クレアチン（両方のイオン化モードで検出）、サルコシン、N,N-ジメチルアルギニン、N-アセチル-DL-メチオニンはE. lentaコロニー化マウスで有意に減少した。

ヒト腸内細菌<i>Eggerthella lenta</i>は同胞性マウスの腸内メタボロームに影響を与える。
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図3. E. lentaによるコロニー形成は大腸のメタボロームを有意に変化させた。(A)コロニー形成、(B)食餌に従って正イオン化で検出された同定された全代謝物ピークのPCA。(C)正イオン化モードで測定された、少なくとも1つの食餌群におけるE.LマウスとMMマウスの間で有意差のある代謝物。グレーのボックス内の代謝物の個別値はパネル(D)に示す。代謝物名の後ろの記号は、2つのイオン化モードで検出され、両方で統計的に有意なもの（*）または特定のイオン化モードでのみ有意なもの（#）を示します。有意性の強さはカラーグラデーション（淡黄色から茶色）で示されています。最初の色のついた列は、多群間比較（ベンヤミニ・ホッホベルク調整によるクラスカル・ワリス）による有意性（調整P値）を示す。残りの列は、食餌ごとのE.LマウスとMMマウス間の事後比較のためのダン検定の結果を示す。灰色の矢印は、図の凡例で指定された変化の方向を示す。(D) 4食餌のうち少なくとも3食餌において、2つのコロニー形成群間で有意な一対比較を示した個々の代謝物のピーク強度。ドットは個々のマウスの値を示し、黒棒は中央値を示す。各グループ内で、異なるケージに収容されたマウスは空または塗りつぶしの円で示す。統計： **adj. P < 0.01, ****adj. P < 0.0001, Kruskal-Wallis; 各代謝物について、異なる文字は対応するグループ間の有意性を示す（Dunnの検定）; (E-H) 負イオン化モードについてはパネル(A-D)と同じ。PCA：主成分分析；E.L：OMM12およびコリオバクテリウムでコロニー形成したマウス；MM：マウス合成群集OMM12でコロニー形成したマウス；CD：対照食；CD-BA：0.2％一次胆汁酸を添加した対照食；HFD：ラードベースの高脂肪食；HFD-BA：0.2％一次胆汁酸を添加したHFD；OMM12：オリゴマウス微生物叢。

考察
本研究では、ヒトの腸内細菌の優占種であるE. lentaが微生物群集および宿主に及ぼす影響を、gnotobioticマウスを用いた制御条件下で検討した。

C.aerofaciens、L.parvula、A.mucosicolaの3種のコリオバクテリアは、アンプリコンシークエンシングでは検出されなかった。これらの菌が亜優勢集団を形成している可能性は否定できないが、E. lentaは試験された2つの腸管領域における合成群集の明らかな優勢メンバーであった。これまでの研究で、菌株の宿主由来がマウス腸内へのコロニー形成能力に影響することが浮き彫りにされた[60,61]。使用した株（タイプ株）がヒト腸管由来であることから、これはC. aerofaciensにも当てはまる可能性がある。しかし、以前の研究では、同じ株でマウスのコロニー形成に成功したことが報告されている[62,63]。さらに、同じくヒトの腸（直腸腫瘍）に由来するE. lentaのタイプ株も、我々の実験ではマウスにコロニー形成した。したがって、合成群集組成や食餌の違いなど、他の要因が種の生着に影響したと考えられる。A. mucosicolaは本研究では検出されなかったが、そのタイプ株はマウスの腸に由来し、以前には19株からなるOMMの拡張版の一部として、相対的な存在量は低かったものの、マウスにコロニー形成していた[11]。4つのコリオバクテリアのうち3つがマウス腸内に定着しなかった理由は不明である。検出にはハイスループットのアンプリコンシーケンスのみを用いたため、ショットガンシーケンスや16S rRNA遺伝子をターゲットとしたqPCRを用いれば、おそらくサブドミナント集団の一員として、他のコリオバクテリアを検出できた可能性は否定できない。それにもかかわらず、E. lentaが優勢なメンバーであったために、2つのグループのマウスが異なる合成群集プロフィールを示したことで、この種の有無が他のすべての測定値（体重測定、肝臓プロテオーム、大腸メタボローム）に及ぼす影響を調べることができた。

E. lentaは重要な代謝機能を有し、高い相対量でコロニー形成したが、そのコロニー形成は調査した宿主パラメータに強い影響を与えなかった。従って、コリオバクテリウム菌やE. lentaと宿主の代謝を関連付ける過去の観察データを実験的に確認することはできなかった。E.レンタをコロニー形成したマウスとOMM12をコロニー形成したマウスでは、異なる食餌群間で血中コレステロール値が低い傾向が観察されたが、これは統計学的に有意ではなかった。Martinezらは、ハムスターの高コレステロール血症モデルにおいて、食餌介入後のコリオバクテ リア（16S rRNA遺伝子アンプリコンのパイロシークエンシングにより測定）の発生と非HDL血漿 コレステロール値との間に高い正の相関があることを報告している[64]。しかし、基礎となる生物種は不明であった。2011年、Clausらは、8週齢の雌性生殖細胞フリーマウスを20日間再飼育した後、E. lentaの発生と肝トリグリセリド値との間に強い正の関連があることを報告した[65]。我々の研究では、肝臓プロテオミクスのデータは、E. lentaによる肝機能の大きな変化を示唆するものではなかった。対照的に、食餌中の脂肪と一次胆汁酸は肝臓プロテオームに大きな影響を与えた。例えば、アルギニン生合成経路に関与するタンパク質は、高脂肪食を与えたマウスで発現が低下した。

いくつかの食餌群ではマウス間で顕著な個体差が観察されたが、これはコロニー形成による影響を覆い隠している可能性がある。本研究では、このような潜在的な交絡因子を考慮し、マウスの複数の仔マウスを含む実験デザインを用い、各群につき2つのケージを用いた。MM/HFD群では、WAT量と体重の点で、マウスの間に明確な分裂が見られたが、例えば、E.L/HFD群におけるコレステロール、E.L/CD-BA群における空腹時グルコース、E.L/HFD-BA群におけるWAT量に関しては、このようなことはなかった。脂肪を豊富に含む2つの飼料は、すべてのマウスの肝臓のプロテオームと腸内のメタボローム、数匹のマウスの体重増加（最大+10 g）と白色脂肪組織増加（最大+5 g）、OMM12マウスの血中コレステロール増加など、複数のパラメーターを有意に変化させた。従って、飼料そのもの（例えば、組成）や給餌プロトコルの成否に関する懸念はない。観察された個体間差の背後にある理由は不明であるが、1つのケージ内での差、例えば、雄マウス間のライバル意識・ヒエラルキーによる飼料アクセスの差などが考えられる。

肝重量は、E. lentaをコロニー形成させ、HFDで一次胆汁酸を与えたマウスで有意に減少した。他の群間の差は有意ではなかった。他の実験でも、胆汁酸が肝臓重量の減少に関連する同様の効果が観察された。この効果の根底にあるメカニズムについては、さらなる調査が必要であり、本研究の範囲外である。(i)マウスは8週間だけ、脂肪からのエネルギー含量が48％（他の研究では60％）のHFDを与えられた；C57BL/6Nマウスの脂肪肝発達には通常8週間より長い時間がかかる（例えば、16週間の摂食）；(ii)マウスは合成コミュニティOMM12でコロニー形成された。これにより、制御された条件下でE. lentaの影響を具体的に研究することができたが、結果は、通常コロニー形成されたマウスにおけるHFDの既知の影響と直接比較することはできない。

ラチホリシンC酸は上昇し、クレアチン、サルコシン、N,N-ジメチルアルギニン、N-アセチル-DL-メチオニンは減少した。これらの変化は、全く異なる食餌を与えたマウスの全群で一貫していたことは注目に値する（例外はラチホリシンC酸とN-アセチル-DL-メチオニンであり、それぞれCD-BA食とHFD-BA食を与えたマウスでは有意差は認められなかった）。その他の代謝物の変化は複数観察されたが、マウスに与えた餌に依存していた。E.レンタにコロニー形成されたマウスで観察されたラチフォリシンC酸レベルの上昇は、文献と一致している。ラチフォリシンC酸はチロシン分解の代謝産物であり、E.レンタを含む複数の腸内細菌によって産生されうるからである[66,67]。大腸のクレアチンレベルが低下していることから、E. lentaがクレアチンを分解できることが示唆される。腸内細菌は、クレアチニンおよびクレアチン分解に関与する酵素を発現することが報告されている[68]。クレアチニンのクレアチンへの可逆的変換を触媒するクレアチニナーゼをコードする遺伝子が、E. lentaのゲノムから検出された（GCA_000024265.1_01172、WP_009304706.1）。クレアチンはさらに尿素に代謝され、サルコシンもグリシンに分解される[68]。サルコシンもまた、E. lentaが定着したマウスでは有意に減少していた。しかし、これらの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子は、E. lentaのゲノムには見つからなかった。N,N-ジメチルアルギニンもまた、E. lentaコロニー化マウスで有意に減少した。これはL-アルギニンのアナログで、E. lentaの基質として知られており[69]、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）によってジメチルアミンとL-シトルリンに代謝される[70]。この酵素をコードする遺伝子はE. lentaゲノムから検出された（GCA_000024265.1_02955）。N,N-ジメチルアルギニンの血漿中濃度の上昇は、高コレステロール血症[71]、糖尿病[72]、動脈硬化[73]、高血圧[74]、慢性心不全[75]、慢性腎不全[76]のヒトで観察されている。我々のデータでは、N,N-ジメチルアルギニンの大腸含量は、E. lentaコロニー化マウスで顕著に減少した。N,N-ジメチルアルギニンの潜在的産物であるシトルリンは、陽イオン化モードで検出されたが、コロニー形成群間で有意差はなかった。他の研究では、シトルリンはE. lentaによって産生され、さらに代謝されることがわかった[69,77]。

結論として、本研究により、優勢腸内細菌種であるE. lentaを合成群集に加えることで、マウス結腸内の代謝物が有意に変化することが明らかになった。特定の代謝物が宿主に及ぼす影響については、まだ明らかにされていない。提供されたオミックスデータは記述的なものであるが、この研究のgnotobiotic設定は、in vivoでの腸内におけるE. lentaの原因的役割について新たな洞察を与えてくれる。より広範なコリオバクテリア種の影響を研究するには、より洗練されたコロニー形成戦略が必要である。E.レンタに関しては、標的操作に利用可能な遺伝子ツールやファージの出現により、腸内細菌-宿主相互作用における役割の発見が加速されるであろう[78-80]。

宣言
謝辞
以下の方々に感謝する： (i)マウス血中コレステロールの測定にご協力いただいたRWTHアーヘン大学病院動物科学研究所、(ii)動物実験および16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスのサポートにご協力いただいたミュンヘン工科大学ZIELコアファシリティ・マイクロバイオーム。Amy CoatesとSusan Jennings（Functional Microbiome Research Group, Institute of Medical Microbiology, University Hospital of RWTH Aachen）の言語編集に感謝する。

著者らの貢献
研究のデザイン： 研究デザイン：Viehof A、Streidl T、Clavel T

動物実験の実施： 動物実験の実施：Streidl T

実験の実施 実験実施者：Viehof A、Streidl T、Schubert K、Engelmann B、Haange SB

データの解析とキュレーションを行った： データの解析およびキュレーション：Viehof A, Haange SB, Engelmann B, Streidl T, Schubert K, Rolle-Kampczyk U

方法とリソース： Haange SB、Schubert K、Rolle-Kampczyk U

データの解釈： データの解釈：Viehof A、Streidl T、Haange SB、Schubert K、Rolle-Kampczyk U、von Bergen M、Clavel T

材料とインフラの提供： Haller D、von Bergen M、Clavel T

資金調達：フォン・ベルゲンM、クラヴェルT

プロジェクトの監督： クラベルT

図表の作成 図の作成：Viehof A、Streidl T、Haange SB

図の校閲と修正：Viehof A, Streidl T, Haange SB Viehof A、Streidl T、Clavel T

原稿執筆： 原稿執筆：Viehof A、Clavel T

全著者が原稿を査読した。

データおよび資料の入手
16S rRNA遺伝子アンプリコン解析の生データはENAに提出した（project PRJEB67952）。質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリ[81]を通じてProteomeXchange Consortiumに寄託され、識別子PXD047016および10.6019/PXD047016を用いてアクセスできる。メタボロミクスデータはNIH Common FundのNational Metabolomics Data Repository (NMDR)のウェブサイト、Metabolomics Workbench82で入手可能であり、Study ID ST003011が割り当てられている。データはプロジェクトDOI (http://dx.doi.org/10.21228/M8GM8G)から直接アクセスできる。

財政支援およびスポンサー
von Bergen MとClavel Tは、ドイツ研究財団（DFG）のプロジェクト番号403224013 - SFB1382から資金援助を受けている。 von Bergen Mはまた、ノボ ノルディスク財団（助成金NNF21OC0066551）から資金援助を受けている。

利益相反
すべての著者は、利益相反がないことを宣言した。

倫理的承認および参加同意
本研究で実施したマウス実験は、ドイツ政府の承認を得た（Regierung von Oberbayern、承認番号55.2-1-54-2532-156-2013）。

論文発表の同意
該当なし。

著作権
© The Author(s) 2024.

補足資料
補足資料
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Viehof A, Haange SB, Streidl T, Schubert K, Engelmann B, Haller D, Rolle-Kampczyk U, von Bergen M, Clavel T. Human intestinal bacterium Eggerthella lenta influences gnotobiotic mice in gut metabolomes. Microbiome Research Reports. 2024; 3(2): 14. http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2023.65

シカゴ/トゥラビアンスタイル

Viehof, Alina, Sven-Bastiaan Haange, Theresa Streidl, Kristin Schubert, Beatrice Engelmann, Dirk Haller, Ulrike Rolle-Kampczyk, Martin von Bergen, Thomas Clavel. 2024. "ヒト腸内細菌Eggerthella lentaがgnotobioticマウスの腸内メタボロームに影響を及ぼす" Microbiome Research Reports. 3, no.2: 14. http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2023.65

ACSスタイル

Viehof, A.; Haange S.B.; Streidl T.; Schubert K.; Engelmann B.; Haller D.; Rolle-Kampczyk U.; von Bergen M.; Clavel T. ヒト腸内細菌Eggerthella lentaは、gnotobioticマウスの腸内メタボロームに影響を与える。Microbiome. 研究報告 2024, 3, 14. http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2023.65

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