二量体IgAによる細胞内オンコプロテインの標的化は、細胞質からの排出と上皮性がんの免疫介在性制御を促進する

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二量体IgAによる細胞内オンコプロテインの標的化は、細胞質からの排出と上皮性がんの免疫介在性制御を促進する

https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(23)00418-1

スビール・ビスワス 14
グンジャン・マンダル 14
カルメン・M・アナドン 14
シャオチン・ユー
パウロ・C・ロドリゲス
ホセ・R・コネホ＝ガルシア 15
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脚注を表示オープンアクセス掲載:2023年10月30日DOI:https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.09.013

ハイライト

二量体IgAはPIGR+癌細胞を介して善意のトランスサイトーシスを受ける

二量体IgAは腫瘍細胞内の変異した癌遺伝子を特異的に中和する

癌ドライバーはエンドソーム輸送の変化により腫瘍細胞外に排出される。

変異特異的二量体IgAはin vivoで腫瘍の増殖を特異的に阻害する。
概要
二量体IgA（dIgA）は、主に粘膜上皮に発現するIgA/IgM高分子免疫グロブリン受容体（PIGR）を介して細胞内を移動することができる。ここで我々は、一般的に変異した細胞質腫瘍ドライバーを標的とするdIgAの能力を研究した。IgGではなく変異特異的なdIgAは、卵巣癌細胞内でKRASG12Dを中和し、腫瘍細胞からこのオンコドライバーを排出した。dIgA結合は、KRASG12Dのエンドソーム輸送を、リサイクリングエンドソームでの蓄積から、dIgAがトランスサイトーシスする初期／後期エンドソームでの凝集へと変化させた。KRASG12DのdIgA標的化は、細胞培養アッセイにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害した。インビボでは、KRASG12D特異的dIgA1は、CD8+T細胞に依存する方法で、KRASG12D変異卵巣癌および肺癌の増殖を制限した。IDH1R132H特異的dIgAは、結腸癌の増殖を抑制し、表面レセプターに関連しない細胞質オンコドライバーの効果的な標的化を実証した。KRASG12Dを標的としたdIgAは、低分子のKRASG12D阻害剤よりも効果的に腫瘍の増殖を抑制し、ヒト癌の治療におけるこのアプローチの可能性を支持した。
図解抄録
図サムネイルfx1
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キーワード
細胞内ターゲティング
免疫療法
上皮性悪性腫瘍
変異特異的抗体
二量体IgA
IgAトランスサイトーシス
PIGR
治療用抗体
KRAS
IDH1
はじめに
抗体ベースの免疫療法の開発は、そのサイズが大きく、細胞質に浸透することができないと考えられていることから、膜貫通型または細胞外型のターゲットに焦点が当てられてきた。しかし、腫瘍を促進する経路を支えるがんドライバーのほとんどは、従来の治療用抗体ではアクセスできない細胞内タンパク質である。従って、酵素活性を阻害したり、アロステリックモジュレーターとして機能することにより、これらの細胞内経路を標的とする低分子の開発に多大な努力が払われてきた。
KRAS変異は、ヒトの癌を進行させる最も一般的な変異型癌遺伝子と考えられている1。KRAS変異は、膵臓癌、大腸癌、非小細胞肺癌、子宮内膜癌で特に頻度が高く、その総数は年間50,000例を超える2。KRAS変異は、主にコドン12（80％）、13、61の一塩基ミスセンス変異から構成されている1。KRAS変異を標的とする40年にわたる探求の結果、特異的なKRASG12C低分子阻害剤であるソトラシブ4が2021年に食品医薬品局（FDA）により承認された。現在、膵臓がんや大腸がんでより一般的な変異であるKRASG12Dに対する薬理学的阻害剤が試験中である5。オンコドライバーを標的とする低分子阻害剤は大きな治療効果をもたらし、腫瘍学に大きなインパクトを与えている。しかし、多くの低分子の半減期は約6時間4であり、標的との相互作用に制限がある。これとは対照的に、最適化された抗体の血清中半減期は20日を超える6。さらに、ソトラシブ7を含む低分子阻害剤には後天性耐性がつきものである。このようなメカニズムには、KRASをグアノシン三リン酸（GTP）結合型（活性化型）にロックすること7も含まれ、低分子阻害剤には反応しないが、抗体には特異的に認識される可能性がある。さらに、抗腫瘍抗体応答は、前臨床モデル8とヒトの癌の両方において、腫瘍特異的T細胞応答と本質的に関連していることがますます明らかになってきている9,10,11,12,13。
二量体IgA（dIgA）は、粘膜上皮の基底側面に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるIgA/IgM高分子免疫グロブリン受容体（PIGR）に結合する14。高分子IgA（およびIgM）がPIGRに認識されると、PIGR：抗体複合体が上皮細胞内を基底側から頂膜側へと移動し、粘膜液中に分泌されるトランスサイトーシスと呼ばれる過程が引き起こされる。しかし、IgAトランスサイトーシスが婦人科以外の腫瘍でも起こるかどうかは不明である。さらに、IgAはエンドソームを介してトランスサイトーシスするため18、腫瘍細胞内の特異的抗原との直接接触が妨げられる可能性がある。トランスサイトーシスIgAがエンドソームによって "遮蔽 "されないとしても、標的とする抗原が腫瘍細胞内で共局在化することはあり得ない。第一に、低分子阻害剤19の投与後に必ず起こる抵抗性のメカニズムが、抗体を介した中和に対して依然として敏感である可能性がある。第二に、修飾されていないIgAの半減期は約6日であるが、安定性を高めるためにさらに最適化することができる20。例えば、長い半減期とT細胞上のプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）分子の占有率は、免疫チェックポイント阻害抗体の有効性を決定する重要な要素であるように思われる6。 第3に、dIgAは粘膜表面に特に多く存在することから、外因性のdIgAをがん患者に安全に投与できる可能性が示唆される21。例えば、経口IgA-IgG治療薬やIgAを20％以上含む抗体製剤は、患者に安全に投与されている。本研究の結果は、ヒトの癌やその他の疾患において、様々な細胞内抗原を中和するdIgAベースの治療薬を開発する根拠を提供するものである。
研究結果
変異特異的dIgAは細胞内のKRASG12Dを中和し、腫瘍細胞外に排出するが、KRASWT細胞には影響を及ぼさない
PIGRが介在するdIgAトランスサイトーシスの影響を受けやすいヒト悪性腫瘍のスペクトルを調べるため、まずThe Cancer Genome Atlas（TCGA）データセットの腫瘍におけるPIGR発現を解析した。その結果、PIGR mRNAの発現量が比較的高い上皮性悪性腫瘍やB細胞リンパ腫と、PIGR mRNAの発現量が低いメラノーマや神経膠芽腫などの非上皮性腫瘍との間に明確な二分化があることがわかった（図S1A）。抗原特異的dIgAが、非特異的dIgA（図S1BおよびS1C；データS1）ではなく、様々な癌腫の細胞質中の特異的分子を標的化できるかどうかを調べるために、我々はまず、ヒト癌腫の4％以上に存在し、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮内膜癌に頻繁に見られる変異ホットスポットであるKRASG12Dを標的とすることに焦点を当てた2,24。GppNHp結合型KRASG12D（発がん性のGTP結合型25に相当）に対する組換え抗体は、抗PD-1免疫チェックポイント阻害剤と同様に、同一の可変重および可変軽配列を用いて、dIgAまたは単量体IgG4バックボーン上で作製した（図S2A

S2C；データS1およびS2）。GppNHp-KRASG12D特異的Absが、他の変異によって駆動されるGTP結合コンフォーメーションを認識する可能性は否定できないが25、ウェスタンブロット解析では、dIgAとIgG Absの両方が異所性または内因性の変異KRASG12Dを特異的に認識し、他のKRAS変異は認識しなかった（図1AとS2D）。注目すべきことに、IgGではなく変異特異的dIgAのみがKRASG12D変異肺がん細胞に浸透し（図1B、左）、変異特異的dIgAではなくコントロールdIgAはKRASを標的とした（図1B、右）。同様に、KRASG12D特異的dIgAは、光活性化（PA）mCherry蛍光タンパク質26を融合したKRASWTまたはKRASG12Dを形質導入したOVCAR3（卵巣がん）細胞に浸透したが、細胞内KRASG12Dの細胞質局在と分布のみを破壊した（図1C）。注目すべきことに、変異型KRASは腫瘍細胞内で中和されただけでなく、KRASG12D特異的dIgAで処理すると、KRASG12D-PAmCherryで形質転換したOVCAR3細胞の上清中に分泌型IgAとKRASG12Dが共存することから明らかなように（図1D）、トランスサイトーシスにより細胞外に排出され、細胞内のKRASG12Dは減少した（図1EおよびS2E）。さらに、KRASG12Dと融合したPamCherry断片は、3つの独立した実験において、KRASG12D特異的dIgAで処理した腫瘍細胞の上清中にのみ認められた（図1F、左）。対照的に、KRASG12Dは、KRASG12D特異的IgG4、二量体を含む無関係なIgA9、またはビヒクルで処理した上清には認められなかった（図1Dおよび1F、左）。予想通り、PIGR は抗原特異的 dIgA またはコントロール dIgA で処理した卵巣がん細胞の上清中に同定された（図 1F、右）。これらの結果を総合すると、腫瘍細胞透過性dIgAは、腫瘍（例えば卵巣がん）細胞内のKRASの特異的変異を実際に標的とし、細胞内レベルの低下をもたらし、腫瘍細胞外にオンコドライバーを排出することができるが、KRAS変異のない上皮細胞には明らかな影響がないことが示される。
図サムネイルgr1
図1KRASG12D変異特異的dIgA1（IgG4は含まない）は腫瘍細胞内のKRASG12Dを中和し、腫瘍細胞外にオンコドライバーを排出する。
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KRASG12Dと変異特異的dIgAは、トランスサイトーシス時に同じエンドソームコンパートメントに存在する。
真に一方向のトランスサイトーシスを確認するために、卵巣腫瘍細胞または肺腫瘍細胞が、PIGR+腫瘍細胞を介してトランスサイトーシスしない限り、上側のチャンバーに送られたdIgAが基底チャンバーに入るのを妨げる、古典的なトランスウェルシステムを使用した27。図 1G および S2F に示すように、KRASG12D 変異体卵巣がん細胞および肺がん細胞を抗原特異的 dIgA で処理すると、基底室に KRASG12D 抗原が蓄積することがわかったが、野生型卵巣腫瘍細胞および PIGR 切除では認められなかった。しかし、他の変異を持つ腫瘍細胞の基底室では、汎 KRAS 抗体を用いて KRAS シグナルが弱く検出されたことから、GTP 結合型癌遺伝子25 の認識が弱いことが示唆された（図示していない）。重要なことは、dIgAが添加され、同程度の量が検出された上室では、抗原の痕跡のみが認められたことであり、KRASG12D特異的dIgAがPIGR+卵巣がん細胞および肺がん細胞を通して「真の」トランスサイトーシスを受けることを裏付けている。従って、高解像度共焦点顕微鏡により、KRASG12D特異的dIgAの凝集体が卵巣腫瘍細胞内でKRASG12D-PamCherryと共局在していることが示された。一方、IgG4バックボーン上の同じ抗体は卵巣がん細胞に浸透することができず、細胞表面上の変異型KRASの優先的な位置を変化させることもできなかった（図2A）。
図2KRASG12D
図2KRASG12D特異的dIgA1は、IgG4バックボーン上の同じ抗体とは異なり、輸送中に変異型KRASを捕捉する。
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KRASG12Dトランスフェクト卵巣腫瘍細胞内での抗原特異的dIgAと変異型KRASの相互作用の動態を理解するために、KRASG12D特異的dIgAまたはIgGで処理したKRASG12Dトランスフェクト卵巣癌細胞において、初期（RAB5A+）、後期（RAB7A+）、およびリサイクリング（RAB8A+/RAB11A+）エンドソームを免疫沈降させた28,29。予想されたように、腫瘍細胞への浸透がないことから、KRASG12D特異的IgGはどのエンドソームでも検出されなかったが、dIgAは初期および後期エンドソームを通過した（図2B）。プロテアソーム分解を防ぐ既知のリサイクリング経路30と一致して、卵巣腫瘍細胞をビヒクルまたは抗原特異的IgGで処理した場合、変異型KRASは主にRAB8A+/RAB11A+リサイクリングエンドソームで検出された（図2B）。対照的に、KRASG12D特異的dIgAで処理すると、dIgAが腫瘍細胞内を輸送するのと同じエンドソーム上に変異型KRASが集中した（図2B）。このことは、トランスサイトーシスするdIgAが細胞膜上で抗原に遭遇し、エンドソーム内でそれを運搬し、最終的に分泌型IgAを通じて標的を排出することを示唆している。dIgAはエンドソームを通って輸送されるが、dIgAは細胞内抗原、少なくとも細胞膜付近に位置する抗原を特異的に標的化する能力を保持している。
KRASG12Dの捕捉と細胞外への排出と一致して、KRASG12Dを導入した卵巣がん細胞を変異特異的dIgAで処理すると腫瘍細胞の増殖が阻害されたが、KRASWTを導入した同じ細胞や未導入の卵巣がん細胞には影響がなかった（図3A-3C）。内因性に変異したKRASG12D肺がん細胞を変異特異的dIgAで処理すると、腫瘍細胞の増殖も阻害されたが（図3D）、抗原特異的dIgAもコントロールdIgAも、非悪性HEK293T細胞の増殖には影響を与えなかった（図3E）。注目すべきは、抗原特異的 dIgA はアポトーシスを引き起こすことなく、KRASG12D を導入した卵巣がん細胞の増殖を抑制することである（図 3F）。したがって、抗原特異的dIgAは、エンドソームリサイクルを阻害することによって腫瘍（卵巣がんなど）細胞外にオンコドライバーを排出し、その結果、KRASG12DはdIgAが輸送するのと同じエンドソームコンパートメントに蓄積する。
図3KRASG12D
図3KRASG12D特異的dIgA処理により、KRASG12D変異がん細胞はアポトーシスを起こさずに増殖を抑えるが、KRASWTがん細胞はアポトーシスを起こさない。
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KRASG12D特異的dIgAはin vivoで変異腫瘍の進行を特異的に阻害する
KRASG12D特異的dIgAの有効性をin vivoで証明するために、まずKRASG12Dを導入したOVCAR3（卵巣がん）-Rag1-/-マウスに異なる治療法の腫瘍内注入を行った。非特異的dIgAは、細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）1/2を脱リン酸化する二重特異性リン酸化酵素（DUSP）の発現を増加させることによってRAS経路を減弱させる一方、インターフェロン（IFN）や腫瘍壊死因子（TNF）シグナル伝達に関連する炎症経路、およびERストレスに関連するプロアポトーシス経路を活性化する9,12。したがって、非特異的dIgAは、確立した卵巣腫瘍の増殖を遅延させた。しかし、KRASG12D特異的dIgAの抗腫瘍効果はより大きく（図4Aおよび4B）、どのマウスにも明らかな毒性の徴候は見られなかった。IgG4バックボーン上の同じ可変重鎖および軽鎖は、腫瘍細胞に浸透できないことと同様に、卵巣がんを有意に減少させなかったが、これは細胞外小胞の中和に起因する可能性がある（図4B、S3AおよびS4B）。この介入の特異性を裏付けるように、KRASWTで形質導入された腫瘍細胞では、IgAトランスサイトーシスの非抗原特異的効果を超えて、腫瘍増殖に対する効果は認められなかった（図4C、S3A、S3C）。報告されているように5、現在前臨床開発中のKRASG12D選択的阻害剤MRTX1133も、毎日腹腔内投与（20回）が必要であったが、卵巣癌の増殖に有意な遅延をもたらした（図S3A-S3C）。
図4KRASG12D
図4KRASG12D特異的dIgA1は、IgG4バックボーン上の同じ抗体ではなく、in vivoでKRASG12D腫瘍の増殖を阻害する
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抗原特異的dIgAの選択的有効性は、KRASG12D腫瘍を有するNOD scid gamma（NSG）マウスに抗体を腹腔内投与した場合にも再現された（図4D、S4A、S4B）。再び、20回（毎日）のMRTX1133の腹腔内投与または5回のKRASG12D特異的dIgAの注射は、いずれも無関係なIgAの効果を超えて腫瘍の進行を遅延させた（図4DおよびS4B）。これに対応して、ヒトIgAが切除腫瘍で同定され（図4E）、抗原特異的dIgAの腫瘍床への輸送が確認された。これらの実験は、腫瘍細胞透過性dIgAがin vivoで癌細胞内の変異したオンコドライバーを特異的に標的とする可能性を支持するものである。
肺腫瘍は準普遍的にPIGRを発現し、変異型オンコドライバー中和dIgAに高い感受性を示す
異所性KRAS発現とは対照的に、KRASG12Dによって自発的に駆動されるヒト腫瘍を標的とするdIgAの能力を証明するために、我々はまず、KRASG12Dを含む変異型KRASによって頻繁に駆動される非小細胞肺癌（NSCLC）に注目した。扁平上皮癌と腺癌を含む30個のヒト肺癌組織を分析した結果、全ての腫瘍でPIGRの発現が認められ、腫瘍上皮組織と間質に結合した腫瘍床でのIgAとIgGの自発的産生も認められた（図5A）。注目すべきことに、PIGRと腫瘍結合IgAの密度、腫瘍細胞のIgGコーティング、またはPIGR：IgAの相互作用はすべて、より高いT細胞蓄積と関連していた（図5B）。そこで我々は、KRASG12Dによって内因的に駆動される肺がんに対する変異特異的dIgAの有効性を実証することを目的とした。図5Cおよび5Dに示すように、KRASG12D特異的dIgAの5回の腹腔内注射、または高用量（200μg）のMRTX1133の1日20回の投与5により、樹立されたA427 NSCLCの進行が効果的に抑制されたのに対し、IgG4バックボーン上の同じ抗体では効果はごくわずかであった（図5C、5D、S5BおよびS5C）。従って、KRASG12D特異的dIgAとMRTX1133の両方を投与すると、A427細胞のERK1/2リン酸化が時間依存的に低下した（図5E）。抗腫瘍効果はこの肺癌モデルに限定されるものではなく、樹立されたKRASG12D変異SK-LU-1肺癌も、MRTX1133に対してより抵抗性であったが、KRASG12D特異的dIgAに同等の有効性を示した（図5C、5F、S5B、およびS5D）。樹立された肺腫瘍は完全には消失しなかったが、異なるモデルでは腫瘍増殖が有意に減少した。これらの実験は、dIgAを介したKRASG12Dの細胞内ターゲティングが、変異特異的な方法で、変異していない上皮細胞におけるオフターゲット効果なしに、自然変異NSCLCの進行を阻害する可能性を支持するものである。
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図5KRASG12D特異的dIgA1は、低分子KRASG12D阻害剤よりもKRASG12D NSCLCの進行を抑制する効果が高い。
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dIgAトランスサイトーシスは、T細胞を介した殺傷に対して腫瘍細胞を感作する9。KRASG12D特異的dIgA処理によるこのメカニズムの寄与を明らかにするために、誘導性変異を有するC57BL/6マウスから肺癌細胞をクローニングし、鼻腔内アデノウイルスCreを用いて活性化し、さらにレンチウイルス導入によりMSH2を回復させることにより作製した、同系遺伝子免疫原性KRASG12D変異KPMSH2KIN肺腫瘍を利用した。 KRASG12Dを標的とするdIgAは腫瘍の増殖を大幅に遅延させた（図5G）。この免疫原システムにおける抗腫瘍効果はCD8+ T細胞に依存しており（図5G）、協調的な適応免疫応答の複雑さを強調している。同族抗原に対するdIgAの特異性をさらに裏付けるように、異なる変異（IDH1R132H）を標的とするdIgAを投与しても、同様の抗腫瘍効果は観察されなかった（図5G）。対応する効果は、別の同系KRASG12D乳癌モデル（Brpkp11031；図S5E）でも観察された。
dIgAは、PIGR依存的に、腫瘍細胞の細胞質のより深部に位置する変異に対して有効である
腫瘍細胞の細胞質のより深部に位置する、さらなる細胞内抗原を標的とすることの実現可能性を示すために、また卵巣癌や肺癌とは異なる他の上皮癌を標的とするためにdIgAを使用する可能性を示すために、我々はdIgA1またはdIgA2を作製した、 これは神経膠腫34によく見られるホットスポットであり、胃食道癌、結腸直腸癌36、肺癌37にも散発的に見られる（図6AおよびS2A-S2C； データS2）。PIGRの発現量がdIgAの効果に果たす役割をさらに評価するために、PIGRの発現量が低い同種のIDH1WTおよびIDH1+/R132H HCT116結腸癌細胞を入手し、これらをPIGRで形質転換したところ、複数の癌細胞株で見られるのと同等の発現が得られた（図6A）。低いPIGR発現は、無関係なIgAを脇腹の結腸癌担癌マウスに腹腔内投与した場合の非特異的抗腫瘍効果を消失させた（図6B-6D）。対照的に、KRASG12D標的化と同様に、IDH1R132H特異的dIgAは変異型脇腹結腸腫瘍の腫瘍増殖を遅延させたが、IDH1R132H変異がない場合は効果がなかった（図6Cおよび6D）。注目すべきことに、抗腫瘍効果は結腸癌細胞におけるPIGR発現に依存していた。というのも、IDH1R132H特異的dIgAを投与すると、PIGRを導入したIDH1R132H HCT116結腸癌細胞ではビヒクルと比較して脇腹腫瘍の増殖が3.7倍減少したのに対し、PIGR発現の低い親IDH1R132H HCT116結腸腫瘍では1.8倍減少したからである（図6B、6C、および6E）。重要なことは、IDH1WT腫瘍を持つマウスを無関係なIgAまたはIDH1R132H特異的dIgAで処置した場合、結腸癌の増殖において同等の減少が観察されたため、抗腫瘍効果は再び変異特異的であった（図6F）。同じIDH1R132H特異的IgAの単量体バージョンは有意な抗腫瘍効果を示さなかったので、変異特異的IgAの二量体化も必要である（図6G）。KRAS変異肺腫瘍を標的としたデータと合わせて、これらの結果は、抗原特異的dIgAを用いて、複数の組織学的起源と異なる変異型オンコドライバーのがんを標的とする可能性を支持するものである。また、PIGRの発現が低いにもかかわらず腫瘍を標的とすることが可能であることも、効果は低下する可能性はあるものの、支持するものである。
図サムネイルgr6
図6IDH1R132H特異的dIgA1は、PIGR発現依存的にin vivoでIDH1変異結腸癌の増殖を抑制する
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考察
我々は、PIGRを介したdIgAのトランスサイトーシスが、肺癌や大腸癌を含む非婦人科癌9で起こることを発見した。PIGRはほとんどの上皮性悪性腫瘍で発現しているが、非上皮性癌では低レベルであることから38、このメカニズムはほとんどのヒト上皮性癌に関連する可能性がある。膵臓癌や小細胞肺癌のような難治性腫瘍も含まれるはずで、我々のデータでは準普遍的にPIGRを発現している。PIGRが介在するdIgAのトランスサイトーシスはエンドソーム輸送を介して進行するが、その輸送経路は悪性細胞では非悪性細胞とはわずかに異なる可能性がある18。エンドソームを介して輸送されるにもかかわらず、dIgAは細胞内抗原を特異的に標的化する能力を保持している。我々の結果は、dIgAのトランスサイトーシスにより、がん原性KRASを持つリサイクリングエンドソームが消失し、抗原と抗体が初期エンドソームと後期エンドソームで共局在化することを示している。これは、dIgAを内在化する初期エンドソームと、KRASを細胞表面に戻すリサイクリングエンドソームとの異型融合と一致する。しかしこの活性は、KRASのように細胞膜付近に位置する変異型がんドライバーだけでなく、IDH1のように細胞質深部に位置する変異型がん遺伝子にも限定される。今後の研究では、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）やAKT（Ak strain transforming）のような他の一般的に変異したがん遺伝子、あるいはインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO）のような免疫抑制性の細胞内経路が、低分子阻害剤よりもdIgAを用いた方がより効果的に標的化できるかどうかを検討すべきである。
dIgAを介したターゲティングは、低分子化合物とともに、あるいは低分子化合物と併用することで、低分子化合物と比較して大きな利点がある。第二に、IgAの半減期（霊長類では約6日、マウスでは15時間以上）39,40はIgGの半減期39,40よりも短く、PIGRに結合するdIgAと、PIGRには結合しないが腫瘍微小環境に到達する可能性のある単量体との利用可能性に重要な違いがある可能性があるが、それでも持続性は低分子阻害剤よりも長い。従って、抗腫瘍効果は、抗体が腫瘍細胞を標的としてより長い期間利用可能であるため、より持続的となる可能性がある。第三に、dIgAは変異した癌遺伝子を腫瘍細胞外に排出するので、一時的な中和に比べて明らかに有利である。とはいえ、われわれのデータは、dIgAを用いたがんドライバーの細胞内ターゲティングの有効性は、腫瘍細胞におけるPIGRの発現レベルに依存することも示している。従って、dIgAに対する耐性は腫瘍細胞によるPIGRの消失から生じると考えられる。しかしながら、PIGRはほとんどの上皮性がんで準普遍的に発現しており、腫瘍細胞に生存の利点を与えていることが示唆される。KRAS変異を標的とするdIgAの使用は、既存および新規の低分子阻害剤を補完するものである。抗体はこのような場合に有効な治療法であり、低分子阻害剤はdIgA標的化後にPIGRが消失した場合に使用できる。最後に、経口分泌型IgA治療42が期待されることから、消化管の腫瘍に対して理想的な治療法となる可能性がある。したがって我々は、細胞内オンコドライバーを標的とする免疫療法の一形態としてdIgAを使用する理論的根拠を提案する。
われわれのdIgA治療は異種移植腫瘍を完全には除去しなかったが、われわれは5回の注射を行い、確立された（すなわち、触知可能な）腫瘍のみを治療した。より早期の介入、より持続的な抗体投与、あるいはより高用量のdIgA投与が完全な腫瘍拒絶反応をもたらした可能性がある。また、ヒトIgAの染色が斑状であったことから、dIgAの用量が最適でなかったこと、また異なる腫瘍領域や突然変異の不均一性に対して異なるトランスサイトーシスのタイミングを反映した可能性がある。さらに、免疫不全マウスにおける免疫原性肺腫瘍の治療は、CD8+T細胞の枯渇が治療効果を消失させたことから、T細胞に依存していることが判明した。このことは、dIgAトランスサイトーシスが卵巣がん細胞を抗原特異的T細胞介在性殺傷に対して感作するという我々の以前の報告と一致している9。したがって、免疫チェックポイント阻害剤との併用が、dIgAを用いた変異した細胞内オンコドライバーの標的と相乗的に作用するか、あるいは我々の観察した効果が免疫不全患者において最大化される可能性がある。例えば、卵巣がんにおけるわれわれの報告は、より良好な転帰を予測する因子として、自然に協調する体液性免疫応答と細胞性適応免疫応答の重要性を支持している9。
同系遺伝子免疫原性癌を有する免疫不全マウスにおいて治療効果を示した我々のデータは、ヒトdIgAとマウスpIgRの相互作用が、抗体と競合しうるPIGR+健常上皮細胞の存在下での抗原特異的dIgAの生体内利用能を反映するという概念をさらに支持するものである。さらに、ヒト、ラット、ハムスターとは異なり、マウスはCD89を発現していない。CD89はIgAとも結合するため、霊長類におけるIgAの持続性がマウスに比べて大きいことの一因である可能性がある40。
最後に、dIgAの将来的な応用可能性に関する重要な問題は、潜在的な毒性である。さらに、変異特異的dIgAは野生型細胞には影響を与えなかったが、dIgAは粘膜分泌物では優勢なIgである21。したがって、IgA投与が標的上で腫瘍外毒性を引き起こす可能性は低い。さらに、FDAが承認したKRASG12C低分子阻害剤では、すでに患者の11％以上にグレード3-4の毒性が認められている。これらの問題は新たな研究で評価されるべきであるが、今回の結果は、ヒト癌患者において細胞内抗原を特異的に標的とするdIgAベースの治療薬を開発する根拠を提供するものである。
研究の限界
我々の研究は、KRASG12D特異的dIgAトランスサイトーシスが変異型KRASのエンドソーム輸送を変化させることを示している。しかしながら、このメカニズムの複雑さはまだ不明である。もっともらしいシナリオの一つは、dIgAを内在化する初期エンドソームと、変異型KRASを細胞膜に戻すリサイクリングエンドソームとの異型融合である。しかし、これではdIgAがIDH1のような細胞質深部のがん遺伝子をどのように標的とするのか完全には説明できない。
今後の研究では、既存の低分子阻害剤（例えばソトラシブ）に耐性を示すようになった変異腫瘍が、PIGRを介した介入に依然として感受性を示すかどうかも調べる必要がある。様々な変異によって惹起されるKRASの構成的活性（GTP結合）構造を認識するようにデザインされた抗体は、このような状況において特に有効であろう。逆に、PIGRの欠損は腫瘍をdIgAに対して抵抗性にする一方で、薬剤阻害剤に対しては感受性を維持する可能性がある。
同様に、今後の研究では、CD8+T細胞が癌遺伝子特異的dIgAの効果に関与する機序を解明する必要があるが、これは各疾患の免疫原性に依存する可能性がある（例えば、腫瘍負担の違いによる）。
最後に、組換えdIgAの作製はIgGの作製よりも困難であり、半減期も長い。持続性を確保するためにFcRnへの結合を維持しつつ、PIGRを介したトランスサイトーシスを引き起こすためのIgGのFcドメインの改変は、最も頻度が高く侵攻性のヒト癌に対する新規免疫療法の道を開くために研究される必要がある。
STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
非特異的ヒトIgA Abcam Abcam Cat#ab91025
抗β-アクチン抗体 Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology Cat# 5125, RRID:AB_1903890
抗ホスホ-p44/42 MAPK(ERK1/2) 抗体 Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology Cat# 4370, RRID:AB_2315112
抗 p44/42 MAPK(ERK1/2) 抗体 Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology Cat# 9102, RRID:AB_330744
抗 RAS (G12D 変異体特異的) (D8H7) 抗体 Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology Cat# 14429, RRID:AB_2728748
抗 mCherry 抗体 Rockland ロックランド Cat# 600-401-P16, RRID:AB_2614470
ヤギ抗ヒト IgG (H+L) 二次抗体, HRP Thermo Fisher Scientifi Thermo Fisher Scientific Cat# A18805, RRID:AB_2535582
ヤギ抗ヒト IgA 二次抗体, HRP Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Cat# A18781, RRID:AB_2535558
抗ヒト Ig カッパ軽鎖抗体 R&D Systems R&D Systems Cat# MAB10050
抗 J 鎖抗体 Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Cat# MA1-80527, RRID:AB_934333
抗 PIGR 抗体 Abcam Abcam, ab96196, RRID:AB_10677612
InVivoMAb 抗マウス CD8β (Lyt 3.2) Bio X Cell Bio X Cell Cat# BE0223, RRID:AB_2687706
InVivoPlus ラット IgG1 アイソタイプコントロール（抗HRP） Bio X Cell Bio X Cell Cat# BE0088, RRID:AB_1107775
抗保存成分抗体 Abcam Abcam Cat# ab3924, RRID:AB_2261963
抗 IgA 抗体 Abcam Abcam Cat# ab124716, RRID:AB_10976507
抗 IgG 抗体 Abcam Abcam Cat# ab109489, RRID:AB_10863040
マウス抗ヒト CD3 抗体 ThemoFisher Scientific Thermo Fisher Scientific;Cat# MA5-14524, Clone SP7; RRID:AB_10982026
マウス抗ヒト PCK 抗体 DAKO Agilent Cat# M3515, Clone AE1/AE3; RRID: AB_2132885
抗 RAB8A 抗体 Proteintech Proteintech Cat# 55296-1-AP, RRID:AB_10858398
抗RAB5A抗体 Proteintech Proteintech Cat# 11947-1-AP, RRID:AB_2269388
抗-RAB11A抗体 Proteintech Proteintech Cat# 20229-1-AP, RRID:AB_10666202
抗RAB7A抗体 Proteintech Proteintech Cat# 55469-1-AP, RRID:AB_11182831
細菌およびウイルス株
One Shot™ TOP10 化学的コンピテント大腸菌 ThermoFisher Scientific Cat# C404010
生物学的サンプル
肺腫瘍組織マイクロアレイ（TMA） US BioMax, Inc. LC953
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
RPMI 1640 培地 Gibco™ Cat# 11875093
ペニシリン／ストレプトマイシン Lonza Cat# 17602E
L-グルタミン Genesee Scientific Cat# 25509
ピルビン酸ナトリウム ThermoFisher Scientific Cat# 11360070
0.25% トリプシン-EDTA Gibco™ Cat# 25200056
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 1X VWR Life Science Cat# 0201190500
DMEM 培地 サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# 11965092
POLYBRENE, 10MG/ML AQUEOUS SOLUTION サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# AB01643-00001
Lipofectamine™ 3000 トランスフェクション試薬 Invitrogen Cat# L3000015
DAPI Sigma Cat# 8417
RIPA 溶解および抽出バッファー Thermo Fisher Scientific Cat#89900
プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（100X） Cell Signaling Cat#5872
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド、MTT Millipore Sigma Cat#M2128
Hoechst 33342 溶液 Thermo Fisher Scientific Cat#62249
MRTX1133 MedChemExpress Cat#HY-134813
Tris-Glycine Native サンプルバッファー Invitrogen Cat#LC2673
Novex™ウェッジウェル™ 12% トリス-グリシンゲル Invitrogen Cat# XP00120BOX
Invitrogen™ コロイダルブルー染色キット Invitrogen Cat#LC6025
ECL™ Prime ウェスタンブロッティングシステム Millipore Sigma GERPN2232
Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin T1 Invitrogen Cat#65601
InVivoPure pH 7.0 希釈バッファー BioXCell Cat#IP0070
重要な市販アッセイ
Biotinylation Kit / Biotin Conjugation Kit (Fast, Type B) - Lightning-Link® abcam Cat#ab201796
Alexa Fluor® 488 Conjugation Kit (Fast) - Lightning-Link® abcam Cat#ab236553
Pierce™ BCA タンパク質アッセイキット Thermo Fisher Scientific Cat#23225
Pierce™ 共同免疫沈降キット Thermo Fisher Scientific Cat#26149
APC アネキシン V、100 テスト Biolegend Cat#640920
LigaTrap® ヒト IgG 精製キット 製品説明書 LigaTrap Technologies Cat#LT-095KIT
LigaTrap® ヒト IgA 精製キット、10 x 0.10 mL LigaTrap Technologies Cat#LT-146KIT
寄託データ
質量分析プロテオミクスデータ 本論文 PRIDE:XXX
実験モデル 細胞株
ovcar3 atcc (rrid:cvcl_0465)
a427 atcc (rrid:cvcl_1055)
SK-LU-1 atcc (RID:CVCL_0629)
HEK293TCCC(RID:CVCL_0063)。
NCI-H23 ATCC (RID:CVCL_1547)
NCI-H647 ATCC (RID:CVCL_1574)
IDH1+/+ HCT116 ホライズンディスカバリー（RRID:CVCL_0291）
IDH1R132H/+ HCT116 ホライズンディスカバリー（RRID:CVCL_0291）
Brpkp110 PMID:27803104 N/A
KPMSH2KIN 本原稿 N/A
PIGR 切除 OVCAR3 PMID:33536615 N/A
KRASG12D-PamCherryOVCAR3 この原稿 N/A
KRASwt-PamCherryOVCAR3 本原稿 N/A
実験モデル 生物／株
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:002216
C57BL/6J マウス ジャクソン研究所 RRID:IMSR_JAX:000664
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ ジャクソン研究所 RRID:IMSR_JAX:005557
組み換えDNA
pLVX-IRES-Zs GreenTakara Bio Cat# 632187
pLenti-TO/CMV-PAmCherry1-KRASWT PMID: 26080442 N/A
pLenti-TO/CMV-PAmCherry1-KRASG12D PMID:26080442 N/A
pMD2.G Addgene Cat# 12259; RRID: Addgene_12259
psPAX2 Addgene Cat# 12260; RRID: Addgene_12260
J 鎖をコードする pcDNA3.0 ベクター Addgene RRID:Addgene_145146
PBMN-I-GFPをコードする抗IDH1R132HVH-IgA1 Genscript N/A
PBMN-I-GFP をコードする抗 IDH1R132HVH-IgG4 Genscript N/A
pVitro1をコードする抗IDH1R132HVL-Kappa Genscript N/A
PBMN-I-GFPをコードする抗KRASG12DVH-IgA1 Genscript N/A
PBMN-I-GFPをコードする抗KRASG12DVH-IgG4 Genscript N/A
pVitro1 をコードする抗 KRASG12DVL-Kappa Genscript N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
FlowJo v10.7.2 FlowJoLLC N/A
GraphPad Prism v9 GraphPad Software Inc. N/A
Adobe Photoshop 2022 Adobe N/A
Adobe Illustrator 2022 Adobe N/A
新しいタブで表を開く
リソースの有無
代表連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、Jose R. Conejo-Garcia（Jose.Conejo-Garcia@Duke.edu）までご連絡ください。
入手可能な材料
本研究で作製された抗体産生プラスミドは、Materials Transfer Agreement (MTA)に記入された合理的な要請があった場合のみ、その都度、他の研究グループと共有される。
実験モデルおよび研究参加者の詳細
ヒトサンプル
扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌、気管支肺胞癌を含む合計30症例の肺癌組織マイクロアレイと、それに適合する転移癌および癌隣接組織、病理学的悪性度、生存データが入手可能なものをUS Biomax社から入手した。
細胞株
OVCAR3（RRID:CVCL_0465）、A427（RRID:CVCL_1055）、SK-LU-1（RRID:CVCL_0629）、HEK293T（RRID:CVCL_0063）、NCI-H23（RRID:CVCL_1547）、NCI-H647（RRID:CVCL_1574）細胞株はATCC（Manassas, VA）から購入した。IDH1+/+およびIDH1R132H/+ HCT116（RRID:CVCL_0291）細胞株はHorizon discoveryから購入した。Brpkp110は当研究室で樹立され18、KPMSH2KINは同じく当研究室で開発された新しい肺癌モデルで、ヒトG12D変異KRASで認識されるエピトープと同じエピトープを持つ。細胞株は、R10（RPMI-1640、10％FBS、ペニシリン（100 IU ml-1）、ストレプトマイシン（100 μg ml-1）、L-グルタミン（2 mM）、ピルビン酸ナトリウム（0.5 mM））培地（Thermo社製）で定常培養した。HEK293T細胞株は、D10（DMEM、10％FBS、ペニシリン（100 IU ml-1）、ストレプトマイシン（100 μg ml-1）、L-グルタミン（2 mM）、ピルビン酸ナトリウム（0.5 mM））培地（Thermo社製）でルーチンに培養した。
動物モデル
モデルマウスには3種類の系統を用いた。雌、4-6週齢のRag1欠損（Rag1-/-）マウス（RRID:IMSR_JAX:002216）および雌、7週齢のC57BL/6Jマウス（RRID:IMSR_JAX:000664）をThe Jackson Laboratoryから購入した。NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウス（RRID:IMSR_JAX:005557）は、もともとThe Jackson Laboratoryから調達したもので、Moffitt Cancer Centerの動物施設によって維持された。すべての動物はMoffitt Cancer CenterおよびDuke School of Medicineの動物施設によって維持され、温度制御（18～23℃）、湿度40～60％、12時間明暗サイクルの施設内で、1ケージあたり最大5匹のマウスをケージに収容した。動物実験は、南フロリダ大学Research Integrity and Compliance部のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUCプロトコル#IS00006655および#IS00009457）およびデューク大学Division of Laboratory Animal Resources（IACUCプロトコル#A011-23-01）に従って行われた。
方法の詳細
構築物および導入
ヒトPIGRコード配列をpLVX-IRES-ZsGreen1レンチウイルスベクター（Genscript）にクローニングした12。PAmCherry1と融合した野生型またはG12D変異KRASをコードする構築物（pLenti-TO/CMV-PAmCherry1-KRAS、G12DまたはWT）26は、オレゴン健康科学大学のXiaolin Nan研究室から調達した。すべての構築物の配列の完全性と正確性は、GeneWiz社の配列決定サービスによって評価・確認された。
ウイルスの産生と導入
レンチウイルス粒子は、HEK 293T/17（ATCC）にpLVX-IRES-PIGR-ZsGreen、またはpLenti-TO/CMV-PAmCherry1-KRAS（G12D変異KRASまたはWT）とパッケージング/エンベロープベクターpMD2. G（RRID:Addgene_12259）およびpsPAX2（RRID:Addgene_12260）をLipofectamine-3000（Invitrogen）を用いて導入し、48時間後にウイルス上清を採取した。5×105個のHCT116細胞またはOVCAR3細胞を6ウェルプレートに播種し、対応する0.45μ濾過ウイルス上清3mLに10μg/mLポリブレン(Millipore)を添加した。プレートを32℃、1200gで90分間回転させた。導入12時間後に培地をR10に変え、48時間後に標的遺伝子の発現を、KRAS導入については顕微鏡下で確認し、ZsGreen発現についてはFACSで選別した（PIGR）。
腫瘍モデル
脇腹腫瘍は、1×107個のKRASWTまたはG12Dが導入されたOVCAR3またはA427；または5×106個のIDH1WTまたはMut HCT116細胞または5×105個のBrpkp110細胞；または1×106個のKPMSH2KIN細胞をPBS中に注射することにより開始した。SK-LU-1腫瘍は、1:1のマトリゲルと混和したPBS中の1×107細胞を脇腹に注射することにより開始した。
腫瘍体積は次のように計算した： 0.5×（L×W2）、ここでLは長さ、Wは幅である。OVACR3、A427、HCT116、Brpkp110およびKPMSH2KIN腫瘍では7日目から、SK-LU-1腫瘍では腫瘍チャレンジ後20日目から、100μg/20gの用量で3-4日間隔で複数回、腫瘍内または腫瘍周囲注射、および抗体の腹腔内注射を行った。MRTX1133（MedChemExpress社、#HY-134813）を、OVACR3およびA427については7日目から、SK-LU-1腫瘍については20日目から、200μg/20gの用量で毎日または3-4日の間隔で複数回注射した。CD8 T細胞の枯渇は、αCD8抗体（BioXCell）を用い、200μg/20gの用量で、注射抗体と同じ頻度で注射した。
組み換え抗体作製
抗KRASG12D、抗IDH1R132H抗体の可変ヘビー（VH）および可変ライト（VL）配列は、それぞれ特許US10844136B2およびCN106957367Aから入手した。VH配列に続き、ヒトIgA1またはIgG4重鎖定常領域配列をフレーム内でPBMN-I-GFPベクター(RRID:Addgene_1736)にクローニングした。VL配列は、ヒトκ軽鎖定数領域配列と共にpVITRO1（Genscript）にクローニングした。すべてのVHおよびVLをコードするベクターはGenscript社により製造された。J鎖をコードするpcDNA3.0ベクターはAddgene社から入手した(RRID:Addgene_145146)。
組換え二量体および単量体KRASG12D-IgA1およびKRASG12D-IgG4抗体産生のために、HEK293T細胞をPBMN-I-GFPベクターをコードする抗体重鎖でレトロウイルス導入し、生存GFP+細胞を選別した。重鎖＋軽鎖＋J鎖発現HEK293T細胞をFree-Style 293発現培地（Thermo）で5-7日間懸濁培養し、二量体KRASG12D-IgA抗体を作製した。同様に、単量体KRASG12D-IgA1またはKRASG12D-IgG4については、軽鎖およびそれぞれの重鎖のみを発現するHEK293T細胞を使用した。上清を100 kDaメンブレンで濃縮し、未集合のJ鎖、重鎖、軽鎖のコンタミの可能性を排除し、IgAまたはIgG精製カラム（Ligatrap）を用いて抗体を精製した。IgA抗体の二量体化は、質量分析により溶出液中のJ鎖を検出することで確認した。全てのトランスフェクションはLipofectamine 3000（Thermo社製）を用いて行った。細胞株は、マイコプラズマ汚染が陰性であることを定期的に検査した。二量体および単量体IDH1R132H-IgA1、および単量体IDH1R132H-IgG4抗体、および追加量のKRASG12D-IgG4抗体はGenScript社から調達した。
蛍光活性化セルソーティング（FACS）
抗体重鎖導入HEK293T細胞（GFP発現）のソーティングは、DAPI（Thermo Scientific社製）バイアビリティ色素で染色し、DAPI-GFP+細胞をゲーティングすることにより行った。同様に、PIGRを導入したHCT116細胞は、DAPI-GFP+細胞をゲーティングして選別した。サンプルはその後、BD FACS ARIAを用いて蛍光活性化細胞選別（FACS）された。
KRASG12Dを導入したOVCAR3細胞10万個を6ウェルプレートに入れた。12時間後にウェルを洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を抗ヒトKRASG12D-IgA1もしくはKRASG12D-IgG4、または非特異的ヒトIgA（Abcam、ab91025）で最終濃度0.5μg/ml、またはビヒクル（PBS）で処理し、37℃のインキュベーターで16時間培養した。全アポトーシス細胞（アネキシンV+ヨウ化プロピジウム+/-）をフローサイトメトリーで解析した。
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド（MTT）アッセイ
5,000個のOVCAR3（野生型またはG12D変異KRAS導入または未導入）細胞またはSK-LU-1細胞、あるいは500個のHEK293T細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播種した。12時間後、細胞をPBSで洗浄し、新鮮な培地を加え、最終濃度0.5μg/mlの抗ヒトKRASG12D-IgA1または非特異的ヒトIgA（Abcam、ab91025）またはビヒクル（PBS）で処理し、37℃のインキュベーターで16時間培養後、培地を交換して処理を除去した。増殖は3、5または7日目に測定した。MTT試薬溶液（5mg/mlを10ul）を培養細胞の培地に加え、3時間培養した。培地を除去した後、沈殿をDMSOに溶解し、570nmの吸光度を測定した。Fold変化は、それぞれのビヒクル処理細胞株のレプリカの平均吸光度で割って計算した。
免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法
抗ヒトKRASG12D-IgA1抗体またはKRASG12D-IgG4抗体は、Alexa Fluor 488コンジュゲーションキット（Thermo社製）を用いてコンジュゲートした。5万個のOVCAR3（野生型またはG12D変異KRASを導入し、PAmCherryと融合した）細胞を6ウェルプレート内のカバースリップに置き、12時間後に異なる時間ポイントについて結合抗体で処理した。PAmCherryは、Leica TCS SP8 DAPIバンドパスフィルターキューブ（励起BP 450-490 nm）を用いて、最も広いアパーチャーで光活性化した。露光時間は実験日に依存し、20～30秒の間で変化させ、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用して最適化した。すべての処理に同じ露光時間を使用した。Hoechstチャンネルのゲインは、PAmCherryの光活性化に必要な露光時間による光退色を補正するように調整した。画像は、共焦点顕微鏡（Leica SP8）の40X/1.3NA対物レンズで、LAS X（v.3.5.5.19976） ソフトウェアを用いて取得した。Hoechst、Alexa fluor 488、PAmCherryは、それぞれ405 nm、488 nm、552 nmのレーザー光で励起した。発光は、それぞれ415-480 nm、500-525 nm、592-651 nmのバンドパス設定で捉えた。最高解像度の画像については、同じパラメーターを使用したが、ピクセル解像度を2048 x 2048に上げ、speed=400、z=0.5umで撮影した。
KRASG12DのエキソサイトーシスとLC-MS/MS
50万個のOVCAR3（野生型またはG12D変異KRASを導入、PAmCherryと融合）細胞を100mm×20mmの細胞培養プレートに置き、低血清培地中で、抗ヒトKRASG12D-IgA1もしくはKRASG12D-IgG4、または非特異的ヒトIgA（Abcam、ab91025）を最終濃度0.5μg/mlで、またはビヒクル（PBS）で処理した。12時間後、コンディショニング培地を回収し、夾雑物を除去するために濾過した。コンディショニングメディウムからタンパク質を抽出し、DTTで還元し、トリプシンで消化し、Moffitt Cancer Center Proteomics Facilityによる質量分析に供した。MaxQuant（バージョン1.5.2.8）を用いて、データの解析、タンパク質の同定、定量を行った43。
ウェスタンブロット、ネイティブゲル電気泳動、共免疫沈降（Co-IP）。
細胞は、プロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤カクテル（CST、#5872S）入りのRIPAバッファー（Thermo社製）で溶解し、遠心分離で清澄化した。タンパク質はBCAアッセイ（Thermo）で定量した。膜を、組換え産生された抗KRASG12D-IgA1もしくは抗KRASG12D-IgG4、または抗IDH1R132H-IgA1もしくは抗IDH1R132H-IgG4抗体；または市販の抗mCherry Rockland、#600-401-P16、RRID:AB_2614470）、抗ヒト免疫グロブリン重α鎖（Thermo Fisher Scientific、#A18781、RRID： AB_2535558）、または抗ヒト免疫グロブリンヘビーガンマ（プラスライト）鎖（Thermo Fisher Scientific, #A18805 , RRID:AB_2535582）、または抗ヒト免疫グロブリンカッパ鎖（R&D Systems, #MAB10050 ）、または抗ヒトJ鎖（Thermo Fisher Scientific, Mc19-9, #MA1 -80527, RRID： AB_934333）、または抗ヒトRab5A（Proteintech、#11947-1-AP、RRID:AB_2269388）、または抗ヒトRab7A（Proteintech、#55469-1-AP、RRID:AB_11182831）、または抗ヒトRab8A（Proteintech、#55296-1-AP、RRID:AB_10858398）、または抗ヒトRab11A（Proteintech、#20229-1-AP、RRID： AB_10666202）、または抗ヒトPIGR（Abcam, #ab96196 , RRID:AB_10677612）、または抗ヒトKRASG12D（CST, #14429 , D8H7, RRID:AB_2728748）、または抗ヒトβ-アクチン（CST, #5125 , 13E5, RRID:AB_1903890）、抗体。KRASG12D特異的IgAまたはMRTX1133で異なる時点処理したA427細胞の溶解物を、総ERK1/2（CST、#9102、RRID:AB_330744）およびリン酸化ERK1/2（CST、D13.14.4E、#9102、RRID:AB_330744）に対する抗体でプローブした。次に、一次抗体がHRP標識でない限り、適切なウマ大根ペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体でブロットをプローブし（室温、1-2時間）、Enhanced Chemiluminescence（ECL）基質（GE HealthCare）を用いて免疫反応性バンドを現像した。
ネイティブゲル電気泳動では、5μgの二量体KRASG12D-IgA1、二量体IDHR132H-IgA1、単量体IDHR132H-IgA1およびirrIgAをTris-Glycine Native Sample Buffer（ThermoFisher、#LC2673）を用いて希釈し、ネイティブゲル、12% Tris-Glycine Gel（Invitrogen、#XP00120BOX）を用いて220Vで1時間泳動した。ゲルをInvitrogen™ Colloidal Blue Staining Kit（Invitrogen、#LC6025）で一晩振盪して染色した。その後、染色液を脱イオン水に交換し、ゲルの背景が透明になるまで一晩振盪した。ゲルをCanon TR4700シリーズHTTPでスキャンした。
共免疫沈降では、共免疫沈降（co-IP）キット（Pierce、Cat#26149）に付属の非還元非変性溶解試薬を用いて細胞を溶解した。抗ヒトPIGR分泌成分（Abcam, SC-05, #ab3924 , RRID:AB_2261963）、または抗ヒトRab5A、または抗ヒトRab7A、または抗ヒトRab8A、または抗ヒトRab11A、または抗ヒトIgA（Abcam, EPR5367-76, #ab124716 , RRID:AB_10976507）を用いてタンパク質を免疫沈降させた。抗ヒトKRASG12D-IgA1もしくはKRASG12D-IgG4、または非特異的ヒトIgAもしくはビヒクル処理OVCAR3細胞からの濃縮調整培地からのタンパク質を、抗ヒトPIGR分泌成分を用いて免疫沈降させた。溶出液をウェスタンブロッティングした。抗体処理に伴う細胞内KRASG12Dタンパク質レベルの変化を解析するために、4時間ごとに合計12時間処理したKRASG12D導入OVCAR3細胞またはA427細胞の溶解液をウェスタンブロッティングに用いた。
KRASG12Dの排出に関するトランスウェルおよびトランスサイトーシスアッセイ
KRASG12D OVCAR3細胞（2×105）をトランスウェルシステム（Corning® 3413 Transwell® 6.5mm Polycarbonate, membrane Inserts Pre-Loaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4μm）の上部チャンバーに200uLで播種した。さらに、新鮮培地1mLを基底チャンバーに加えた。37℃、5% CO2のインキュベーターで3日間培養し、単層細胞を作製した。KRASG12D IgA1またはKRASG12D IgG4、あるいは非特異的ヒトIgA抗体を、Biotinylation Kit（Fast, Type B）を用いて、製造元のプロトコールに従ってビオチン化した。次に、それぞれのビオチン化抗体1μgを上清に添加した。一晩インキュベートした後、上部チャンバーと基底チャンバーからの上清を別々の微量遠心チューブに集め、Dynabeads MyOne streptavidin T1を用いてストレプトアビジンプルダウンに供した。簡単に説明すると、各サンプルあたり10μlのビーズを製造元の推奨に従って洗浄し、各サンプルに添加した後、4℃で一晩、頭上回転させながらインキュベートした。ビーズを磁気分離で5分間回収し、0.1%BSAを含むPBSで3回洗浄した。最後に、ビーズを100uLのPBSに再懸濁し、ドットブロットを行うために使用した。
ドットブロットでは、10μLのビーズをニトロセルロース膜にブロットし、室温で1-2時間乾燥させた。その後、TBS-T中5％BSAを用い、室温で1時間穏やかに攪拌しながら膜をブロッキングした。適切な一次抗体（αhuman-IgA-HRP、αhuman-IgG-HRP、αKRASG12D）を直ちに加え、穏やかに回転させながら室温で1時間インキュベートした。3回の洗浄後、HRP結合抗体α-human-IgA/IgG抗体でプローブしたブロットを直接化学発光現像するか、あるいはまず二次抗体でインキュベートして現像した。
マルチプレックス免疫組織化学
FFPE組織マイクロアレイは、PerkinElmer OPAL TM Automation IHC kit（マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、BOND RX autostainer（Leica Biosystems, Vista, CA）で免疫染色し、以下の抗ヒト抗体を用いた： IgA（Abcam、EPR5367-76、ab124716、RRID:AB_10976507；1:1000）、IgG（Abcam、EPR4421、ab109489、RRID:AB_10863040；1:500）、PIGR（Abcam、ab96196、RRID:AB_10677612；1： 100）、CD3（Thermo Fisher Scientific; Cat# MA5-14524, Clone SP7; RRID: AB_10982026, 1:100）、汎サイトケラチン（PCK, Dako, AE1/AE3, M3515, 1:200）。核はDAPIで染色した。正確には、組織を65℃で2時間焼成した後、BOND RX（Leica Biosystems）に移し、自動脱パラフィン、OPAL IHC手順（PerkinElmer）による抗原回収を行った。OPAL蛍光剤を除いた一次抗体と二次抗体を用いた自家蛍光スライド（陰性コントロール）も含まれる。スライドはPerkinElmer Vectra®3 Automated Quantitative Pathology Imaging Systemでスキャンし、画像化した。InForm（PerkinElmer 社）から多層 TIFF 画像をエクスポートし、HALO（Indica Labs 社、ニューメキシコ州）にロードして定量画像解析を行った。各蛍光色素は色素色に割り当てられ、陽性の閾値は、公表されている核または細胞質の染色パターンに基づいてマーカーごとに決定された。腫瘍膵島と間質はPCK染色により区別した。
がんゲノムアトラス（TCGA）データ解析
TCGA, Firehose LegacyからのPIGR mRNA発現の分子データ（RNA Seq V2 RSEM）をいくつかのヒトがん種について解析し、cBio Cancer Genomics Portal (http://www.cbioportal.org/)からグラフィカルにエクスポートした。
定量化と統計解析
特に断りのない限り、すべてのデータは平均値±SEMで示した。両側t検定（対になっていないもの、対になっているもの）は2群間で、一元配置分散分析（one-way ANOVA）は2群以上の比較のために、特に指示がない限り実施した。P値には有意閾値0.05を用いた。解析にはGraph Pad Prism（v.9.0）を用いた。
データおよびコードの利用可能性
質量分析プロテオミクスデータは、PXD042914およびPXD044426のデータセット識別子で、PRIDEパートナーリポジトリを通じてProteomeXchange Consortiumに寄託された。本論文ではオリジナルコードは報告していない。今回の研究で作成されたデータセットは、合理的な要求があれば、リードコンタクトから入手可能である。本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
米国H. Lee Moffitt Cancer Center & Research InstituteのCancer Center Support Grants (CCSG)CA076292およびDuke Cancer InstituteのCA014236より、共有リソースの支援を受けた。米国H. Lee Moffitt Cancer Center & Research InstituteのChemical Biology、Analytic Microscopy、Advanced CLIA Tissue Imaging、Proteomics、Flow Cytometry Shared Resourcesに感謝する。本研究は、米国国立衛生研究所R01CA157664、R01CA278907、R01CA124515、R01CA178687、R01CA278907、およびU01CA232758からJ． G.にはK99CA266947、S.B.にはK99CA266947、P.C.R.にはR01CA184185、B.A.P.にはK08CA231454、J.R.C.-G.にはがん研究所からCLIP賞が授与された。S.B.は米国H.Lee Moffitt Cancer Center & Research InstituteよりJunior Scientist Research Partnership Grant、インド政府バイオテクノロジー局よりDBT-Ramalingaswami Re-entry Fellowship (BT/RLF/Re-entry/48/2021)の支援を受けた。P.I.はOvarian Cancer Research AllianceのMentored Investigator Grantの支援を受けた。
著者貢献
S.B.とJ.R.C.-G.が研究の構想を練った。S.B.、G.M.、C.M.A.、J.R.C.-G.は方法論を開発し、ほとんどの実験を実施・分析し、原稿の原案を共同執筆した。R.A.C.、L.U.L.-B.、M.Z.N.、J.A.M.、K.H.、K.B.S.、P.I.、C.M.H.、J.J.P.、M.E.は、in vivo実験の一部を実施し、臨床検体の処理と保存を行い、進行中の結果と解釈、原稿と査読者への回答を批評的に検討した。J.J.は共焦点イメージングとその解釈に貢献した。B.F.は、液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析（LC-MS/MS）の実施と分析を行った。X.N.は、KRAS-PamCherry融合コンストラクトとその使用法の指導を行った。P.C.R.は動物モデルを提供し、研究の全段階を通じて結果の解釈に参加した。R.L.、B.A.P.、T.J.C.、P.C.R.は、査読者に対応するため、原稿の執筆と実験デザインにも貢献した。最終原稿は著者全員が査読・編集した。J.R.C.-G.は本研究を監督した。
利益申告
J.R.C.-G.はCompass Therapeutics社、Anixa Biosciences社、Alloy Therapeutics社のストックオプションを保有しており、Anixa Biosciences社とスポンサー契約を結んでおり、Alloy Therapeutics社から謝礼を受け取っている。J.R.C.-G.とS.B.はdIgAを用いたオンコドライバーの細胞内標的化に関する特許を出願した。B.A.P.はアストラゼネカのアドバイザリーボードを完了し、BMSから研究支援を受けている。R.L.：臨床試験プロトコール委員会（CGオンコロジー）、科学顧問／コンサルタント（BMS、フェリング、ファージン、アーカー・ダイアグノスティックス）。
インクルージョンと多様性
C.M.A.、R.A.C.、L.U.L.-B.、B.A.P.、T.J.C.、P.C.R.、およびJ.R.C.-G.は、少数民族（すべてヒスパニック）の一員であると自認している。
補足情報
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資料S1. 図S1-S5
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データS1. 図1に関連する、ネイティブヒトIgA、単量体および二量体KRASG12D特異的IgA1のLC-MS/MS解析
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データS2. 組換えKRASG12D特異的IgA1/IgG4およびIDH1R132H特異的IgA1/IgG4抗体作製に使用した重鎖、軽鎖、J鎖のアミノ酸配列、図1、2、3、4、5、6関連
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データS3. 図3、4、5、6、S3-S5に関連する統計的手法の詳細と関連するp値
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Crossref
グーグル・スカラー
ファン・テテリングG.
エバースM.
チャン C.
スティップ M.
ロイセン J.
IgA抗体を治療薬として発展させるためのFcエンジニアリング戦略。
抗体（バーゼル）。2020; 9
https://doi.org/10.3390/antib9040070
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スコープ (21)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
マイヤー S.
ネデレンドM.
ヤンセンJ.H.
ライディング K.R.
ヤコビーノ S.R.
ミールダイク J．
ボベンシェン N．
ウーラー M.
ヴァレリウス T.
ユビンクR.
他
FcRnターゲティングによる半減期延長と血清曝露促進を通じたIgA-Her2抗体のin vivo抗腫瘍効果の向上。
mAbs. 2016; 8: 87-98
https://doi.org/10.1080/19420862.2015.1106658
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スコープス (36)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
リチャーズ A.
バラノバ D.
マンティスN.J.
腸内細菌感染予防のための経口投与モノクローナル分泌性IgA（SIgA）抗体の展望。
Hum. Vaccin. Immunother. 2022; 18: 1964317
https://doi.org/10.1080/21645515.2021.1964317
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スコープス (4)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
コックス J.
マン M.
MaxQuantは、高いペプチド同定率、個別化されたp.p.b.範囲の質量精度、プロテオーム全体のタンパク質定量を可能にする。
Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1367-1372
https://doi.org/10.1038/nbt.1511
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日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2023年10月30日
受理 受理：2023年9月27日
改訂版受理 2023年6月5日
受理：2023年6月5日 2022年10月19日受理
出版段階
インプレス、修正校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.09.013

著作権
© 2023 The Author(s). 発行：エルゼビア社
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クリエイティブ・コモンズ 表示 - 非営利 - 改変禁止 (CC BY-NC-ND 4.0) | 情報アイコンの再利用方法
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図
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図1IgG4ではなく、KRASG12D変異特異的dIgA1が腫瘍細胞内のKRASG12Dを中和し、腫瘍細胞外のオンコドライバーを排出する。
図サムネイルgr2
図2KRASG12Dに特異的なdIgA1は、IgG4バックボーン上の同じ抗体ではなく、輸送中の変異型KRASを捕捉する。
図サムネイルgr3
図3KRASG12D特異的dIgA処理は、KRASWTではなくKRASG12D変異がん細胞のアポトーシスを引き起こすことなく増殖を抑制する。
図のサムネイルgr4
図4KRASG12D特異的dIgA1は、IgG4バックボーン上の同じ抗体ではなく、in vivoでKRASG12D腫瘍の増殖を抑制する。
サムネイルgr5
図5KRASG12D特異的dIgA1は、低分子KRASG12D阻害剤よりもKRASG12D NSCLCの進行を抑制する効果が高い。
図のサムネイルgr6
図6IDH1R132H特異的dIgA1は、PIGR発現依存的にin vivoでのIDH1変異結腸がんの増殖を抑制する
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