遺伝子mcrは病原性大腸菌の腸内体力を向上させ、常在菌へのライフスタイルをバランスさせる

2023年1月23日 11:17

公開日：2023年1月20日
遺伝子mcrは病原性大腸菌の腸内体力を向上させ、常在菌へのライフスタイルをバランスさせる

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-022-01457-y?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Dalmasso Guillaume, Beyrouthy Racha, ...Bonnet Richard 著者一覧
マイクロバイオーム11巻、記事番号：12（2023）この記事を引用する

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1 アルトメトリック

指標詳細

概要
背景
プラスミドを介した耐性遺伝子mcr-1は、大腸菌にコリスチン耐性を付与し、汎薬剤耐性への進化をもたらすと考えられている。我々は、mcr-1をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌とmcr-1をコードしない大腸菌を用い、抗生物質非存在下での腸管コロニー形成におけるmcr-1の影響について検討した。

結果
ノトバイオティックマウスおよび従来型マウスにおいて、mcr-1は大腸菌の腸管内定着性を著しく向上させたが、致死効果は損なわれた。この腸内環境の改善には、腸の炎症マーカーの低下と腸内細菌叢の維持が関連していた。mcr-1遺伝子は、微生物叢と腸管上皮細胞（IECs）から分泌される抗菌ペプチドに対する交差耐性を仲介し、IECsへの大腸菌の接着を促進し、大腸菌とそのリポ多糖の両方の炎症活性を低下させることが示された。

結論
mcr-1は、抗生物質非存在下においても、腸内常在菌の生活様式や腸内残留性を高める因子であることが示唆された。

ビデオアブストラクト

背景
コリスチンは、多剤耐性グラム陰性菌による感染症を治療する「最後の手段」の抗生物質として、近年再導入された[1]。その広範な使用によりコリスチン耐性の蔓延が進み[2]、2015年に広範囲薬剤耐性大腸菌において初めてプラスミドを介した耐性遺伝子mcr-1が同定されました[3,4,5]。この獲得遺伝子は、リポ多糖（LPS）の電荷を修飾するホスホエタノールアミノトランスフェラーゼをコードし[6, 7]、その結果、コリスチンによる細菌溶解に対する耐性が誘導されます[8]。現在までに、10個のmcr遺伝子とそのポイントバリアントが報告されている[9]。その結果、これらのmcr遺伝子は、後天性耐性機構として報告され、薬剤耐性への進化への道を開いている。大腸菌は腸内細菌叢の病原性共生生物であり、mcr遺伝子の大きなリザーバーとなりうるため、大腸菌との関連が懸念される。したがって、mcr-1 をコードするプラスミドを保有する大腸菌が、ヒト、渡り鳥、ペット、食用動物の消化管で観察されている[6, 10, 11, 12, 13]。

しかし、いくつかの要素から、mcr遺伝子は抗生物質耐性とは関係のない機能にも関与している可能性が示唆されている。それらは、Klebsiella pneumoniaeのmgrB不活性化のような≧64 μg/mLのMIC値を与える他の耐性機構と比較して、コリスチン最小阻害濃度（MIC）の適度な増加（≦8 μg/mL）をもたらし、それによってコリスチンに対する低い特異性が示唆される。mcr-1は様々なプラスミドに存在し、抗生物質に感受性のある菌や他の耐性遺伝子を持たないプラスミドで観察される[6, 14]。一方、「最後の砦」としての抗生物質耐性機構は通常、多剤耐性プラスミドに集積する[15, 16]。また，昆虫感染モデルにおいて，実験用大腸菌の mcr-1 を過剰発現させると，菌の増殖，マクロファージの活性化，致死活性が低下することがわかった[17]．このことから，mcr-1 が大腸菌の生理に広く影響を与え，コリスチン耐性とは別の役割を担うことが示唆された．

本研究では，mcr-1 を保有する大腸菌の腸管内定着能を，gnotobiotic および conventional マウスモデルで検討した．腸管外病原性大腸菌CFT073株を空プラスミド（E. coli mcr-1-）またはmcr-1をコードする同系統の変異体（E. coli mcr-1+）で形質転換したものを使用し、mcr-1の腸管内定着能を検討した。その結果、mcr-1が宿主-細菌間の相互作用の複数の側面に影響を与え、腸内細菌叢における大腸菌の侵入を個別に促進することが明らかとなった。

研究方法
細菌株とプラスミド
大腸菌CFT073株[18]と常在大腸菌HS株をカナマイシン耐性pBK-CMV空ベクター（大腸菌mcr-株）またはmcr-1, mcr-3, -4, mcr-5, mcr-10コード配列がlacプロモーターの下流にクローニングされた変異型pBK-CMV（大腸菌mcr＋株）で形質転換し、同系統の比較を実施した。リファンピシンまたはナリジクス酸耐性菌を作製するために、大腸菌CFT073をLuria-Bertani（LB）培地で一晩培養し、リファンピシンまたはナリジクス酸（50μg/ml）を含むLB寒天プレートに撒いた。pBK-CMV空ベクターまたはpBK-CMV-mcr-1ベクターを用いて、1つの耐性クローンを形質転換した。mcr-1の存在とlac誘導剤の非存在下での発現により、臨床分離株で通常観察されるコリスチンMIC値4μg/mLが得られ[6]、37℃のLB、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Gibco, Waltham, MA, USA）またはロスウェルパーク記念研究所1640（RPMI ; Gibco）培地で12時間（および少なくとも24時間まで）培養しても細菌の増殖は影響しない（補足図1）。実験ではlacプロモーターの誘導剤は使用せず、全ての実験はLB培地で37℃、16時間培養した後に採取した菌で行った。

pBK-CMVプラスミドの安定性は、大腸菌mcr-および大腸菌mcr+において、カナマイシンを含まないLBブロス培地で37℃、10日間継代増殖することにより評価した。継代は、10mlの滅菌LB培地で1：1000に希釈して、毎日行った。連続希釈液をカナマイシンを含むまたは含まないLB寒天培地プレート上に毎日撒き、CFUの数をカウントしてプラスミドの損失を評価した。データは、空またはmcr-1をコードするpBK-CMVの損失が同様であることを示す。抗生物質なしで10日間集中的に増殖させた後でも、大腸菌集団の〜25％がプラスミドを保存していた（補足図2）。この研究を通して、CFUはカナマイシン（pBK-CMV抗生物質耐性）を添加したプレート上でカウントされ、pBK-CMVプラスミドを含む大腸菌を標的にすることができた。

菌体上清を用いた実験では、菌体を5500rpmで10分間遠心分離し、上清を回収した後、0.22μmフィルターを用いて滅菌を行った。なお、コリシンE1、E2、DをコードするpBRプラスミドおよびコリシンAをコードするpLR1プラスミドは、大腸菌C600株（Denis Duché博士、UMR7255 CNRS-Aix-Marseille Universitéから親切に提供）を宿主とした。

mcr遺伝子のクローニング
mcr-1, mcr-3, mcr-4, mcr-5, mcr-10 遺伝子を GoTaq DNA polymerase (Promega) を用いて増幅し、以下のプライマーで pBK-CMV plasmid (mcr-3, mcr-4, mcr-5, mcr-10) にクローン化した。mcr1EcoRIFor5'-GCGAATTCATGATGCAGCATACTTCTGTG-3'、mcr1XhoIRev5'-GTTCTCGAGTCAGCGGATGAATGCGGTG-3'、mcr3BamHIFor5'-CGGGATCCATGCCTTCTTATAAAAAT-3'、mcr3EcoRRIev 5'-CGGGAATTCTATTGAACATGTACACATTG-3'.の各プラマーにて、mcr3、mcr-4、mcr-5、mcr-10をクローニングした。mcr4BamHIFor 5'-GCGGATCCGTGATTTCTAGATTTAAGACG-3'、mcr4EcoRRIev 5'-GCAGAATTCCTAATACCTGCAAGGTGC-3'.がある。mcr5BamHIFor 5'-GCGATCCATGCGTTGTCTGCATTTATCAC-3'、mcr5EcoRIRev 5'-GCGAATTCTCATTGGTTGTCCTTTTCTGC-3'.。mcr10BamHIFor5'-GCGATCCATGCCCGTACTTCAGGATG-3'、mcr10EcoRIRev5'-GCGAATTCCTATCCACGACATTCGCGGAAC-3'. 空またはmcrを含むpBK-CMVプラスミドを大腸菌にエレクトロポレーションし、カナマイシン（50μg／ml）を用いて選択した。mcr遺伝子の配列は、配列決定（GATC、Konstanz、ドイツ）により二重チェックした。

Mcr-1触媒部位の不活性化
pBK-CMVから生産されたMcr-1酵素を不活性化するために、InFusion HD Cloning Kit（Takara, Kusatsu, Japan）、Platinum SuperFi II DNA Polymerase（Invitrogen, Waltham, MA, USA）、T285AFor 5'-ATACGCCGCCGATGTGCCGCACGATGTG-3' および T285ARev 5'-ACATCGCGGCGGTATTCTGTGCCGTG-3' プライマーを用いて、部位特異的変異導入によりアラニンに置き換えた。mcr遺伝子の配列は二本鎖配列決定（GATC, Konstanz, Germany）により二重確認した。

抗菌アッセイ
細菌をカナマイシン（50μg／ml）を含むLB上で37℃にて一晩培養した。10-mM リン酸緩衝液 (pH 7.2) で洗浄し、100 μl に懸濁して 0.5 MacFarland の光学密度を得た後、抗菌ペプチド (hBD1 と hBD2 は 1 μg, hBD3 と LL37 は 0.2 μg, HD-5 は 2 μg, HD-6 は 4 μg) とともに2時間インキュベーションした。その後、LB寒天培地プレートに菌体を広げ、37℃で一晩培養し、CFUを数えた。使用したペプチドはすべてペプチド研究所（日本、大阪）から入手した。

バクテリオシン耐性アッセイ
大腸菌 mcr-1+ および大腸菌 mcr-1- に対するバクテリオシンの抗菌活性を、先に述べたように、寒天培地中でアンチバイオグラム的アプローチにより調べた[20]。簡単に言えば、一晩の寒天平板培養から0.5マクファーランドの細菌懸濁液を調製し、滅菌ブロスで希釈して、約105CFU/mlの最終接種量を得た。この懸濁液をMueller-Hinton（MH）寒天培地に接種した後、10μlのコリシン産生大腸菌をMH寒天培地プレート上にスポットした。37℃で一晩培養した後，プレート上でコリシン感受性を調べたところ，重ね合わせた菌株に明確な溶血ゾーンが観察された。コリシンの阻害活性は、既報の通り、LBブロスで定量した[20]。簡単に説明すると、コリシン産生大腸菌と大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を100：1の割合で10mlのLBブロスを用いて37℃、振盪培養器で共培養をした。24時間培養後，共培養物の連続希釈液をブラッドシープ寒天培地プレート（bioMérieux, France）に広げ，（大腸菌C600とは異なり）ヘモリシン表現型を持つ大腸菌CFT073 mcr-1+および大腸菌CFT073 mcrのCFUをカウントした．

LPSの精製
LPSは既報の通り精製した[21]。簡単に言えば、細菌を、カナマイシン（50μg／ml）を含む50mlのLB中で37℃で一晩培養した。それらを遠心分離によって集め、0.15 mM CaCl2 および 0.5 mM MgCl2 を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS, Gibco）で2回洗浄し、超音波処理によって破砕した。残存する核酸およびタンパク質を除去するために、溶解物を200μg／mlプロテイナーゼKで処理し（穏やかに混合しながら65℃で1時間）、次に40μg／ml DNaseおよび80μg／ml RNaseで処理した（37℃、穏やかに混合しながら1μl／ml 20％MgSO4および4μl／mlクロロホルムの存在下で一晩）。最後に、等量の高温（68℃）90％フェノールを混合物に加え、次いで、68℃で15分間激しく振盪した。その後、懸濁液を氷上で冷却し、8500rpmで15分間遠心分離した。水相をプールし、フェノール相を10mlの蒸留水で68℃にて再抽出した。プールした水相を4℃で蒸留水に対して広範に透析し、精製LPS生成物を最終的に凍結乾燥させた。実験のために、LPSはPBSに溶解した。

細胞培養
ヒト腸管上皮細胞HT-29（ATCC® HTB-38™）とヒト単球細胞THP-1（ATCC® TIB-202™）は、ATCCが推奨する培地を用いて、5％CO2含有雰囲気、37℃で維持しました。ヒト粘液産生腸上皮 HT29-16E 細胞株 [22] は，10% (v/v) 仔牛胎児血清 (Lonza), 1% l-glutamine (Life Technologies), 200 U ペニシリン，50 mg のストレプトマイシンおよび 0.25 mg アンホテリシン B/ リッターを添加した Dulbecco' modified Eagle' medium で増殖させた．さらに、THP-1単球を20 ng/ml phorbol myristate acetate (PMA) で18時間処理することにより、マクロファージに分化させた。

細胞感染
細胞は、100（HT-29）または10（THP-1）の感染多重度（MOI）で、示された時間、感染させた。細菌付着量を測定するために、細胞を滅菌PBSで広範囲に洗浄し、連続希釈液をLB寒天培地プレート上に撒いた。37℃で一晩後、CFUの数を数えた。

免疫蛍光染色
HT29-16E細胞を滅菌ガラスカバースリップに播種した。21日間の培養後、細胞をMOI100で30分間感染させた。数回の洗浄後、細胞を固定し、ハイブリダイゼーションバッファー（20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1.25 M NaCl, 0.01% SDS, Denhardt's solution 1X）中で室温インキュベートし、DNA probe (5 ng/μL; 5'-GCA AAG GTA TTA ACT TTA CTC TCC-Cy2-3') で3時間インキュベートした。細胞をホットハイブリダイゼーションバッファーで洗浄し（48℃）、DAPI（1μg/mL）およびWGA（1μg/mL）を用いて10分間染色した。細胞を3回洗浄し、Zeiss LSM 800共焦点顕微鏡を使用して観察した。画像解析ソフトウェアImarisを用いて細菌を計数した。

酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)
細胞培養上清中に分泌された、またはマウス組織中に存在するKC、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、およびマウス糞便中に存在するリポカリン-2の量は、製造者の説明書に従ってELISA（R＆D Systems社）により決定された。

大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-およびその誘導体LPSに対するマウスの感受性の評価
6〜8週齢のC57/BL6雄マウス（Charles River, Ecully, France）に、5 mg/ml LPSまたは109 CFUの細菌を0.2 mlのPBSで腹腔内投与した。

オリゴマウス-マイクロビオタ12（OMM12）モデルを用いた大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-感染症
OMM12（C57Bl/6J）マウスは、マウスの腸から分離された12種類の細菌株の定義されたコンソーシアムを保有し、大腸菌株を含まないgnotobioticマウスである（表S1参照）[23]。これらのマウスは、stable defined moderately diverse microbiota mouse (sDMDMm2)とも呼ばれる[24]。OMM12マウス繁殖ペアは、Dr. BasicおよびProf. Bleich（Hannover Medical School, Institute for Laboratory Animal Science, Hannover, Germany）の好意により提供され、INRAeマウス施設（UMR454 MEDIS, Theix, France）の柔軟なアイソレーター内で無菌条件下で繁殖させた。マウスコロニーは、qPCRおよび培養ベースのアプローチを用いて潜在的な汚染物質について定期的にチェックされた。

OMM12 マウス実験は、個別換気および陽圧ケージシステム（IsoCage P-bioexclusion system、Tecniplast、フランス）を使用して実施した。各実験は、8週齢または18週齢の同胞を用い、12：12の明暗サイクルに従わせ、餌と水を自由に摂取できるようにした。簡単に言えば、OMM12マウスは、腸内細菌叢が安定するように、実験開始の2日前にIsoCage Pシステムに移された。さらに、50μlのPBSに再懸濁した103個／マウスを経口感染させ、感染後10日目に頸部脱臼により犠牲とした。

従来型マウスを用いた大腸菌mcr-1+および大腸菌mcr-1-感染実験
実験は、フランスのクレルモンオーヴェルニュ大学の特定の病原体フリーの動物施設に収容された野生型またはCampノックアウトの6〜8週齢のC57／BL6雄マウス（それぞれ、Charles RiverおよびThe Jackson Laboratory）を用いて行った。マウスには実験中、標準的な飼料を自由摂取させ、滅菌水を自由に飲ませ、12：12の明暗サイクルに従わせた。さらに、108CFUの大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を含む200μlの懸濁液を経口投与し、感染3日後に頸部脱臼により犠牲にした。

競合実験のために、マウスは48時間、飲料水中のストレプトマイシン（2.5 g/L）を受けた。その後、抗生物質を中止し、24時間後に、200 μlのPBS中の108 CFUの大腸菌mcr-1+（rifampicin耐性株）および108 CFUの大腸菌mcr-1-（nalidixic acid耐性株）の投与を受けた。糞便を連続希釈し，カナマイシン（50μg/ml）とリファンピシン（50μg/ml）またはナリジクス酸（50μg/ml）を含むLB寒天培地プレート上に広げ，それぞれ大腸菌mcr-1＋および大腸菌mcr-1-CFUを計数した．

マウス糞便中の大腸菌mcr-1+および大腸菌mcr-1-の定量化
糞便を所定の時間に採取し、滅菌PBSで希釈した後、カナマイシン（50μg/ml）およびリファンピシン（50μg/ml）またはナリジクス酸（50μg/ml）を含むLB寒天培地にプレートし、大腸菌mcr-1+および大腸菌mcr-1-の数を定量化した。菌の同定は発色培地または質量分析計を用いて行い、分離株におけるmcr-1の存在はPCRにより確認した。非感染マウスでは、このような耐性菌やmcr-1陽性菌は認められなかった。腸組織を縦に開き、3mlの滅菌PBSで洗浄した後、大腸菌組織関連負荷を定量するためにTissue Master 125 Homogenizer (Omni International) を用いてホモジナイズするか、分泌サイトカインを定量するために抗生物質を含む滅菌DMEMで直接インキュベーションした。

細菌16S rRNA遺伝子の定量的(q)PCR
糞便DNA抽出は、DNAをdH2Oで10ng／μlの最終濃度に希釈したことだけが異なるが、Herpら（2019）に記載されているように行った[25]。DNA濃度は，Qubit 3蛍光光度計と対応するキット（Qubit® dsDNA HS Assay kit (0.2-100 ng), Thermo Fisher Scientific）を用いて決定した。16S rRNA遺伝子の絶対定量は，Brugirouxら（2016）に記載されたものを改変して実施した[23]．さらに、QPCRアッセイは、CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）上で実行し、分析された。すべてのqPCRは、増幅効率を最適化するために54℃を用いて実施したI48株のqPCR検出を除き、最適なアニーリング温度として60℃を用いて実施された。大腸菌の検出は、最適なOMM12 qPCRプログラム（95℃ 10分、95℃ 15秒、60℃ 1分の45サイクル）を用いて評価し、E. coliのフォワード（5'-C'）とした。coliのフォワード（5'-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3'）およびリバース（5'-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3'）プライマーと、Huijsdensら［26］によって公開された対応するプローブ（Taqman FAM標識プローブ5'-TATTAACTTTACTCCCTTCCTCGCTGAA-3'）と、を使用して、評価を実施した。

細菌16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定
糞便サンプルは、排便後直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。1ヶ月以内に、以前に記載したように、International Human Microbiome Standardsのプロトコルに従って、糞便サンプルからDNAを抽出した[27]。DNAを含まない陰性対照と、細菌およびDNA陽性対照も、実験全体を通して処理した（ZymoBIOMICS®、Zymo Research）。ゲノムDNAは、以前に記載したように、インデックス・バーコードを持つ16S rRNA遺伝子の可変V3およびV4領域を標的とする融合プライマーを用いて増幅された[28]。すべてのサンプルをプールし、フランスのクレルモンフェラン大学病院において、製造元の仕様書に従ってIllumina MiSeqプラットフォーム（Illumina）で2 x 300 bpペアエンドシーケンスを実施した。リードはEuropean Nucleotide Archive (project ID: PRJEB33293) に寄託された。

微生物叢組成の解析
UPARSE [29]を用いて、ペアエンドリードのアセンブリ、quality and length filtering、OTU picking (100% sequence identity threshold)、chimera removalを実施した。品質フィルタリングとトリミングの後、各サンプルについて平均26,175の配列が取得された。SILVAデータベース（バージョン132, https://www.arb-silva.de/）を用いて、QIIME 2（https://qiime2.org/）により、アレル特異的バリアントを分類に割り当てた。配列数は、そのサンプルサイズに正規化し、さらに小さい方のサンプルのサイズ（n = 5,500）を乗じた。少なくとも15%のサンプル(n = 4)で3回以上観測されなかった配列は廃棄された。

統計解析は、R (https://www.r-project.org/) で、vegan (https://CRAN.R-project.org/package=vegan) と phyloseq パッケージを用いて行った[30]。グループ間のα多様性の差の推定にはKruskal-Wallis検定を用い、一対の比較はFDRの手順に従ってp値を補正したWilcoxon検定で実施した。ベータ多様性はJensen-Shannon指数と一般化UniFrac指数から評価し、非計量的多次元尺度法（NMDS）後に報告した。グループ間の有意差の評価にはAdonis (PERMANOVA) とPermDISP2検定が用いられた。グループ間の分類群存在度の有意差は、DEseq2アプローチとFDR手順によるp値の補正で検出された。

ペアワイズコンパラティブモデリング(PCM)
腸内細菌叢におけるmcr-1類似体を予測するために、以前に記載したようにPCMを使用した[31]。PCMは、タンパク質の機能予測の特異性を高めるために、特に潜在的なホモログと遠縁である場合に、ホモロジーモデリングを使用することに基づいている。分類学は、National Centre for Biotechnology Information (NCBI) ゲノムデータベースに対する BLASTN (minimum 70% identity and 80% coverage), IMOMI インハウスデータベースに対する BLASTN (minimum 85% identity and 90% coverage), およびメタゲノム単位の分類学から得られた結果を組み合わせて、前述のように割り当てられました [31]。

倫理的記述
動物プロトコルは、Clermont Auvergne大学のGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsの勧告に準拠し、フランス国民教育・高等教育・研究省の承認を得た（APAFIS#16354、#22507、#22770）。

統計解析
数値は平均値±SEMsで表した。統計的検定は、GraphPad Prism version 6.07 ソフトウェアを用い、D'Agostino-Pearson オムニバス正規性検定を用いて決定した正規性に応じて、両側Studentのt検定またはMann-Whitney U検定を用いて実施した。0.05未満のP値は統計的に有意であるとみなした。

結果
Mcr-1はオリゴマウス-微生物叢12モデルで腸内細菌の侵入を促進する
腸内細菌の定着におけるmcr-1の役割を調べるために、我々はOMM12モデルを用いた。このモデルでは、大腸菌などのProteobacteriaは存在せず、gnotobioticマウスは、マウス腸内の主要細菌群を代表する配列決定済みの12株の安定した微生物叢によって定着される[23]。マウスに大腸菌CFT073 mcr-1+または大腸菌mcr-1-の低菌量接種物（103 colony-forming units [CFU]）を経口感染させた。マウスは感染後10日目に死亡させた。接種した細菌は糞便中で定量され、これは腸のコロニー形成レベルを反映し、炎症状態は糞便と腸の組織で評価された。16S rRNA遺伝子のqPCRアッセイにより、オリゴマウスの微生物叢がマウス腸管に定着したことを確認した（Fig.1A）。組成分析では、OMM12分類群の侵入に成功し、大腸菌mcr-1+と大腸菌mcr-1-に感染したマウスの間で細菌の存在量に微妙な違いがあるだけだった（図1Aおよび補足図3）。大腸菌mcr-1-細胞とは異なり、大腸菌mcr-1+は糞便内容物から検出された（Fig.1B）。糞便からは、16S rRNA遺伝子qPCRアッセイと連続希釈培養により、大腸菌mcr-1+負荷が大腸菌mcr-1-負荷に比べ1000倍以上有意に増加した（Fig.1B）。大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-によるコロニー形成に対する腸の炎症状態を評価するために、CXCL1/KC（ヒトIL-8のマウスアナログ）、IL-1β、IL-6サイトカインの分泌を大腸組織で測定した（補足図4A-C）。大腸菌mcr-1+と大腸菌mcr-1-とでは腸管コロニー形成の点で大きな違いがあるが、大腸菌mcr-1+がコロニー形成したマウスでは大腸菌mcr-1-がコロニー形成したマウスと比較してサイトカイン発現に大きな違いはなかった。さらに、腸管炎症の鋭敏なマーカーである糞便中のリポカリン-2濃度は、大腸菌mcr-1+感染マウスでは大腸菌mcr-1-感染マウスに比べ低かったが、有意差はなかった（補足図4D）。以上より、mcr-1は腸内炎症状態に影響を与えることなく、OMM12モデルにおける腸管コロニー形成を促進することが示唆された。

Fig.
図1
mcr-1は、腸内細菌叢の組成に劇的な影響を与えることなく、オリゴマウス-マイクロバイオータ12（OMM12）モデルにおける腸内コロニー形成を促進する。Gnotobiotic OMM12マウスに大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1を経口感染させ、感染後10日目に腸管コロニー形成を評価した。A OMM12株の相対的存在量は、株特異的qPCRアッセイにより決定し、相対的存在量（全16S rRNA遺伝子コピー数に対する割合として表現）としてプロットした。YL44, Akkermansia muciniphila; I48, Bacteroides caecimuris; YL27, Muribaculum intestinale; YL45, Turicimonas muris; YL2, Bifidobacterium longum; KB1, Enterococcus faecalis; KB18、Acutalibacter muris、YL32、Clostridium clostridioforme、YL31、Flavonifractor plautii、YL58、Blautia coccoides、I49、Lactobacillus reuteri、I46、Clostridium innocuum、およびE. coli CFT073。データは平均値±SEMs。B 盲腸内容物および糞便中の大腸菌量は、連続希釈培養法（盲腸内容物または糞便1gあたりのCFUとして表現）および大腸菌特異的16S rRNA遺伝子qPCR法（糞便ゲノムDNA1ngあたりのコピー数として表現）により評価した。データは平均値±SEMs

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MCR-1は従来型マウスの腸内コロニー形成を促進し、微生物叢の組成を維持する
OMM12モデルを用いて得られた結果をより生理的な状況で確認するために、従来型マウスに108CFUの大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1を経口感染させた。接種前、接種後1日目、3日目に糞便を採取した。さらに、動物を犠牲にした後、大腸および回腸の組織を採取した。予想通り、接種前のマウスの糞便からは大腸菌CFT073は検出されなかった（データは示さず）。大腸菌CFT073接種後、大腸菌mcr-1+は大腸菌mcr-1-よりも高い割合で回復し、接種後3日目には腸内コロニー形成レベルの差が大きくなった（Fig. 2A）。したがって、mcr-1は大腸菌CFT073の腸管内侵入を促進し、その持続性を高めることが、共感染後のマウス糞便中に大腸菌mcr-1+が大腸菌mcr-1-より多数検出されることから、競合実験により確認できた（補足図5）。

図2
図2
mcr-1は、マウス腸管のコロニー形成を促進し、微生物叢の構成を維持し、炎症を抑制する。マウスに大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を経口投与してチャレンジした。A糞便から大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-の数を測定した。データは、平均値±SEMで表した。B 大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-接種前（Ninf）および接種後3日の糞便16S rRNA遺伝子配列決定から腸内細菌叢の組成を評価した。Jensen-Shannonおよび一般化UniFracメトリクスで測定した組成の違いを、非計量的多次元尺度法（NMDS）序列として表示した。さらに、腸内細菌叢構造の有意差を評価するためにAdonis検定を行い、サンプル群内の分散の有意差を評価するためにPermDisp2を使用した。p値はBenjamini-Hochberg（BH）法により多群間比較のために調整された。C 便中リポカリン-2濃度は、ELISA法により測定した。データは、平均値±SEMとして表される。NSは「有意ではない」を示す

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さらに、大腸菌CFT073によるコロニー形成の前後で、従来型マウスの腸内細菌叢組成を解析した。腸内細菌叢の多様性は、4つの指標で評価した（補足図6）。Shannon index、InvSimpson index、evenness indexでは、3つのマウス群間で有意な差は見られなかった。しかし、豊かさ指数から評価した多様性は、大腸菌mcr-1-を接種したマウスでは、非感染マウスおよび大腸菌mcr-1+を接種したマウスよりも有意に低かった（Kruskal-Wallis検定、p値=0.01；ペアワイズWilcoxon検定、調整p値。それぞれ0.013と0.015）。一方、非感染マウスと大腸菌mcr-1+を接種したマウスの間では、豊富さに差は見られなかった（pairwise Wilcoxon test、調整後p値=0.56）。その後、3つのマウス群間の微生物叢構造の違いをJensen-Shannon距離（JSD）と一般化UniFrac距離で評価した（図2B）。どちらの指標についても、PermDISP2検定により、マウス群内の微生物叢組成の分散は同程度であることがわかった（p値：0.641-0.910）。しかし、大腸菌mcr-1-が定着したマウスの微生物叢構造は、非感染マウスおよび大腸菌mcr-1+が定着したマウス（Adonis、調整p値：0.006-0.024）とは有意に異なり、区別できない腸内細菌群集を有していた（Adonis、調整p値：0.186-0.266）。これらの結果は、試料が同様の分散を示し、mcr-1の状態に応じて一貫して分離された非計量多次元尺度法（NMDS）順序付けと一致した（図2B）。その結果、大腸菌mcr-1を接種したマウスでは、非感染マウスや大腸菌mcr-1+を接種したマウスと比較して、10種の細菌分類が属レベルで異なって豊富に存在することが確認された（補足図7）。後者2群間では、菌量に有意差はなかった。

これらの結果から、mcr-1は大腸菌CFT073の腸内侵入による微生物叢組成の変化を防ぎ、その結果、大腸菌の目立たない侵入と定着を促進することが明らかとなった。

mcr-1は腸の炎症を防ぐ
大腸菌mcr-1+によるコロニー形成に対する腸管の炎症状態を評価するために、従来型マウスの回腸および大腸組織において、KC、IL-1β、IL-6およびTNF-αサイトカインの分泌を測定した（補足図8）。大腸菌mcr-1+でコロニー形成されたマウスでは、回腸と大腸のKCとIL-6の分泌率が、大腸菌mcr-1-でコロニー形成されたマウスに比べ有意に低いことがわかった。さらに、TNF-αおよびIL-1βの発現は、大腸では有意な変化は認められなかった（p値はそれぞれ0.65および0.48）。一方、回腸ではIL-1βの産生に有意な減少が認められた（p値：0.038）。さらに、結果を補強するために、糞便中のリポカリン-2の濃度も測定した（図2C）。予想通り、細菌接種前の動物では、分泌量に大きな差は見られなかった。しかし、大腸菌mcr-1-を接種した場合と比較して、大腸菌mcr-1+を接種すると、接種後1日および3日目にリポカリン-2の産生量が有意に減少した（p値、それぞれ0.04および0.001）。この結果は、gnotobioticマウスから得られた結果と一致し、従来のマウス腸管組織からのサイトカイン測定で得られた結果を確認することができた。

これらの結果から、mcr-1が腸管コロニー形成中の大腸菌の炎症性活性を低下させることが明らかとなった。

mcr-1はヒトおよび細菌の抗菌ペプチドに対する耐性を誘導する
mcr-1はコリスチンに対する耐性を誘導することから，腸内で産生される構造的に関連した抗菌ペプチド（AMP），すなわち腸管上皮細胞（IEC）が産生するβディフェンシン1〜3（hBD）とカテリシジンLL37，パネス細胞特異的なαディフェンシン5および6（HD）に対する耐性に果たす役割を調べた [33, 34]．AMP hDB1-3, LL37, HD-5, HD-6 は，大腸菌 mcr-1+ と比較して大腸菌 mcr-1- の増殖を有意に抑制した（図 3; p 値, 0.02～<0.0001）ことから，mcr-1 が大腸菌に対して AMP 耐性を高めることが示唆された．大腸菌のmcr-1+腸管定着に対する真核生物由来AMPの影響を調べるために，Cramp（LL-37のマウスホモログ）ノックアウトマウスに大腸菌mcr-1+と大腸菌mcr-1-を感染させたところ，真核生物由来AMPが大腸菌の腸管定着に影響を与えていることがわかった．図9に示すように、大腸菌mcr-1+は大腸菌mcr-1-に比べて腸管への定着が良好であった。以上の結果より、mcr-1遺伝子はコリスチンと腸管細胞から分泌されるAMPの交差耐性を誘導することが明らかとなった。しかし、AMP抵抗性だけがmcr-1による腸内環境の改善に関与しているわけではないと思われる。

図3.
図3
mcr-1はヒト抗菌ペプチドに対する細菌の抵抗性を増加させる。2.107E. coli mcr-1+または2.107E. coli mcr-をα-ディフェンシン（hBD1〜3）、β-ディフェンシン（HD-5および-6）およびカテリサイジン（LL-37）と2時間インキュベートした。生存菌数は、コロニー形成単位（CFU）数として報告する。データは4反復の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表値である。

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腸内細菌叢の細菌は，バクテリオシンと呼ばれるAMPを産生することもあり，コリシンE1・A（膜透過を誘導する）やコリシンE2・D（核酸を標的とする）などがある[35]．我々は、mcr-1遺伝子が、このような一般的な抗競合細菌エフェクターの効力に影響を与えるかどうかを調べた（図4）。興味深いことに、膜孔形成性コリシンE1およびAを産生する実験室大腸菌C600株は、大腸菌mcr-1-の増殖を阻害し、大腸菌mcr-1+はそれらの膜孔形成性コリシンE1およびAの阻害活性に著しく抵抗した（p値、≦0.001）。一方、mcr-1の存在は、E2およびD細菌ヌクレアーゼの活性を有意に低下させなかった（p値0.08-0.287）。

図4
図4
mcr-1はコリシン抗菌ペプチドに対する細菌の抵抗性を高める。A コリシンA、D、E1、またはE2を産生する大腸菌C600株の存在下での大腸菌mcr-1+と大腸菌mcr-1-の成長競合を観察した。LB培地で16時間共培養した後、連続希釈液を血中ヒツジ寒天培地にまき、大腸菌mcr-1+および大腸菌mcr-1-コロニーを計数した。データは、コロニー形成単位（CFU）の数として表される。データは4反復の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表である。B大腸菌mcr-1＋または大腸菌mcr-1-をMH寒天培地に広げ、コリシン産生大腸菌の10μlの菌体ペレットをスポットした。代表的な写真を示す。白矢印は生育阻害域を示す

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したがって、mcr-1は、腸管上皮細胞や微生物叢によって腸内で産生されるヒトおよび細菌のAMPに対する感受性を低下させる。

mcr-1はLPSの炎症促進活性をマスクし、細菌の病原性に影響を及ぼす
mcr-1の標的であるLPSは、自然免疫受容体によって認識され、その結果、炎症性遺伝子の発現を促進する[36]。その結果生じる炎症は敗血症性ショックの原因であるが，宿主の回復にも重要である．我々は，大腸菌 mcr-1+ と大腸菌 mcr-1- を感染させた HT-29, THP-1 細胞の炎症性反応を調べた．同様の実験を、大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-から精製した菌体培養上清およびLPSと細胞をインキュベートすることによって行った。その結果、大腸菌mcr-1+の感染により、炎症性サイトカインIL-8、IL-1β、TNF-αの分泌が有意に減少した（図5A、D；p値、0.002〜＜0.0001）。同様の結果は、大腸菌mcr-1+由来の培養上清（図5B、E）および精製LPS（図5C、F）でも確認された。次に、これらの結果を補強するために、mcr-1が大腸菌の病原性を変化させるかどうかを検討した。そこで，109 個の大腸菌 mcr-1+ または大腸菌 mcr-1- をマウスに腹腔内投与する敗血症モデルを用いた．大腸菌mcr-1-を投与したマウスは48時間後に100％死亡したが、大腸菌mcr-1+を投与したマウスはすべて生存した（p値：<0.0001、補足図10A）。精製LPSの腹腔内接種でも同様の傾向が見られた（p値：0.1、補足図10B）。

Fig.
図5
mcr-1は炎症性反応を低下させる。A HT-29細胞を大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-にMOI100で3時間感染させた。B細菌培養上清（10% vol/vol）で3時間刺激するか、C大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-から精製したLPS（10μg/ml）で3時間刺激した。D-F THP-1細胞を用いて、A-Cと同様の実験を行った。D THP-1細胞をMOI10で1時間感染させ、Eは10vol/volの菌体上清で1時間、Fは0.01μg/mlのLPSで3時間刺激した。 A-F 細胞培養上清中の分泌IL-8、IL-1β、TNF-αの量をELISAで定量化した。データは6反復の平均値±SEMであり、3つの独立した実験の代表値である。

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全体として、mcr-1は腸のコロニー形成を損なう自然免疫反応を制御するpeacekeeperの役割を担っていることが明らかとなった。

mcr-1は大腸菌の宿主細胞への接着を促進する
mcr-1を介したLPSの修飾は、細菌外膜の電荷と膜の流動性に影響を与えることができる[37]。そこで，我々はmcr-1が細菌の宿主細胞への接着に影響を与える可能性があると仮定した．HT29 IECおよびTHP-1マクロファージに対する大腸菌mcr-1+および大腸菌mcr-1-の接着を調べた（それぞれ図6AおよびB）。大腸菌mcr-1+のHT29細胞への接着は、大腸菌mcr-1-の接着に比べて10倍に増加し（p値、0.0003）、THP-1細胞でも同様の結果が得られた（p値：0.002）。腸内では、IECは粘液層を持ち、細菌-細胞間の相互作用を制限している。ムチン高産生細胞であるHT29-16E細胞に感染させたところ[22]、大腸菌mcr-1+も大腸菌mcr-1-に比べて有意に粘液に付着できることがわかった（図6C, D）。

図6
図6
mcr-1は真核生物細胞への細菌の接着を増加させる。A HT-29細胞は3時間、B THP-1細胞は1時間、大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-に感染させた。付着細菌を数え、データはコロニー形成単位（CFU）/wellの数で表した。データは6反復の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表値である。C, D HT29-16E 細胞を大腸菌 mcr-1+ または大腸菌 mcr-1- に感染させ、細菌（赤）、粘液（緑）、核（青）について染色した。C 代表的な画像を示す。D フィールドあたりのバクテリアの定量化。データは26フィールドの平均±SEMであり、2つの独立した実験の代表値である

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したがって、mcr-1の存在は、細菌の粘液や宿主腸管上皮細胞への接着を促進し、細菌の腸管コロニー形成の促進に関与する可能性のある重要な機能であることがわかった。

pBK-CMV-mcr-1で形質転換した常在大腸菌において、mcr-1によって誘導される修飾が観察された。
大腸菌CFT073は病原性細菌であるため、我々は常在菌である大腸菌HS株を用いてmcr-1遺伝子の影響を調べることを目的とした。予想通り、pBK-CMV-mcr-1 のエレクトロポレーションにより、コリスチンに対する MIC は 4 μg/mL となり、空プラスミドで形質転換した大腸菌 HS では 0.5 μg/mL となった（データなし）。 mcr-1 により PAM に対する大腸菌 HS 耐性が向上し、LPS で刺激した HT-29 細胞では炎症反応が抑制された（それぞれ図 7Aおよび B）。また、mcr-1遺伝子を保有する大腸菌は、HT-29細胞により良く接着することができた（図7C）。これらの結果から、mcr-1による修飾は株依存的ではないことが示唆された。

図7
図7
常在大腸菌HS株によるMcr-1の発現は、LL-37に対する抵抗性を誘導し、LPS炎症反応を低下させ、真核細胞への細菌接着を増加させる。大腸菌HS株を空のpBK-CMV（大腸菌mcr-1-）またはpBK-CMV-mcr-1（大腸菌mcr-1+）で形質転換させた。2.107E. coli mcr-1+または2.107E. coli mcr-を0.1μgのLL-37と共に1.30時間インキュベートした。生存菌のパーセンテージを報告した。データは4反復の平均±SEMであり、6つの独立した実験の代表である。B HT-29細胞を、大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-から精製したLPS（10μg/ml）で3時間刺激した。細胞培養上清中の分泌されたIL-8の量をELISAで定量した。データは6反復の平均±SEMであり、2つの独立した実験の代表である。C HT-29 細胞を大腸菌 mcr-1+ または大腸菌 mcr-1- で 3 時間感染させた。付着細菌を数え、データはコロニー形成単位（CFU）/ウェル数で表した。データは6反復の平均±SEMであり、2つの独立した実験の代表である。

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mcr-1によって誘導される修飾は、Mcr-1の酵素活性に依存している
Mcr-1 はホスホエタノールアミノトランスフェラーゼ活性を持ち、コリスチンに対する抵抗性の原因となっている[6]。そこで、Mcr-1の酵素活性と関連付けるために、触媒部位を変異させた。予想通り、コリスチンに対するMICは、野生型mcr-1で形質転換した大腸菌CFT073のMIC = 4 μg/mLに対し、変異型mcr-1で形質転換した大腸菌CFT073では0.5 μg/mLとなり（データなし）、Mcr-1の触媒部位が無効であることが明らかとなった。興味深いことに、この非機能性Mcr-1タンパク質の発現は、細菌のPAMに対する耐性を増加させなかった（図8A）。さらに、非機能性Mcr-1は、野生型Mcr-1を発現する大腸菌CFT073と比較して、細菌感染またはLPS刺激に対するHT-29細胞の炎症反応を有意に増大させた（図8B）。最後に、大腸菌CFT073が変異型Mcr-1を発現した場合、HT-29への細菌の付着が有意に減少した（図8C）。これらの結果から、今回検討したmcr-1の生物活性は、MCR-1の酵素部位に依存することが明らかとなった。

図8
図8
Mcr-1の機能は、（i）LL-37耐性、（ii）LPSの炎症誘発性の調節、（iii）真核細胞への細菌接着性の上昇を誘導するのに必要である。大腸菌CFT073を野生型mcr-1（WT mcr-1）または不活性化mcr-1（Inactivated mcr-1）で形質転換した。2.107E. coli WT mcr-1+ または 2.107E. coli Inactivated mcr-1- を 0.2 μg の LL-37 と共に 2 時間インキュベートした。生存している菌の割合を報告した。データは4反復の平均±SEMであり、6つの独立した実験の代表である。B, D HT-29細胞を、大腸菌WT mcr-1+または大腸菌Inactivated mcr-1-に3時間、MOI100で感染させた。C HT-29細胞を大腸菌WT mcr-1+または大腸菌Inactivated mcr-1-から精製したLPS（10 μg/ml）で3時間刺激した。B, C 細胞培養上清中の分泌されたIL-8の量は、ELISAによって定量された。データは6反復の平均±SEMであり、2つの独立した実験の代表値である。D 付着菌の数をカウントし、データはコロニー形成単位（CFU）/ウェル数として表した。データは、6つのレプリケートの平均値±SEMであり、2つの独立した実験の代表値である。

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mcr-1によって誘導される修飾は、mcrファミリーに共通する特徴である
mcrファミリーは急速に拡大しており、現在までに大腸菌などのProteobacteriaで10の主要系統が同定されており、mcr-1と30-83%のアミノ酸同一性を持つタンパク質；phophoethanolamine transferaseドメインをコードしており、Mcr-1で誘導される脂質Aの修飾は異なる酵素に共通して見られる[38]。各mcr遺伝子は，大腸菌や肺炎桿菌などの腸内細菌に広く分布する共役プラスミド上に多く存在し，緑膿菌やアシネトバクター属などの他のグラム陰性菌でも報告されている[38]．そこで，今回得られた知見が mcr-1 特有のものなのか，あるいは mcr ファミリーに共通する特徴なのかを検討した．大腸菌CFT073をmcr-3-, mcr-4-, mcr-5-, mcr-10-をコードするプラスミドで形質転換し、最も強い抗菌ペプチド（LL-37）に対する生存能力とIECへの接着能力を調べた。図11および図12に示すように、試験したすべてのmcr遺伝子は、空ベクターで形質転換した大腸菌CFT073と比較して、LL37に対する細菌の生存率およびIECsに対する細菌の接着力の両方を増加させた。さらに、mcr-3-、mcr-4-、mcr-5-、またはmcr-10-をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌CFT073から抽出したLPSは、空のプラスミドで形質転換した大腸菌CFT073から抽出したLPSよりも炎症が少なかった（補足図13）。

これらの結果から、mcr ファミリーは抗菌ペプチドを投与した際の細菌の生存率を高め、細菌の接着を促進し、LPS の炎症誘発性を低下させることが示唆された。

mcr ホモログはヒト腸内細菌叢の細菌に広く存在する
1267検体のメタゲノム解析により構築された990万遺伝子カタログ[39]を用いて、ヒト腸内細菌叢におけるmcr様遺伝子の普及度を評価した。mcr-1はこのコレクションの27サンプルに存在することがわかったが、カタログが構築された時点ではmcr-1のホモログは調べられていなかった[40]。ここでは、pairwise comparative modelling (PCM) [31]と呼ばれる3次元ベースの予測法を用いて、990万遺伝子のカタログからmcrの構造的ホモログを同定した。その結果、470の予測結果が得られ、そのうち348は高品質（PCMスコア100%、Tm AlignによるTm Score（生成された構造がmcr-1の構造とどの程度整合しているか）≧0.9）で、mcr様遺伝子とみなされるものであった。また、mcr-1との平均アミノ酸の共有率は24.2%であった。348個のmcr様遺伝子は、1267人の被験者のうち少なくとも1人に認められ、その有病率は0.08〜98.7％であった。平均相対存在量は7.9×10-5（範囲5.2×10-1.6×10-5）で、最も多い遺伝子が最も多く存在した（ピアソン相関検定 P = 2.2×10-16, 付図14）。また、348個のmcr様遺伝子のうち、門に割り当てられたのは124個（35.6%）に過ぎず、Proteobacteria (n = 64, 51.6%) とBacteroidetes (n = 35, 28.2%) 門が最も多くなっていることが示された。

これらの結果から、mcr様タンパク質は腸内細菌プロテオームで保存されたタンパク質であり、支配的な門によってコードされていることが明らかになった。したがって、腸に定着する際の生理的な利点、そしておそらく宿主にとっての利益を提供する可能性が示唆された。

考察
大腸菌は、脊椎動物に広く存在する腸内常在菌であると同時に、汎用性の高い病原体でもあるという興味深い二面性を持っている[41,42,43]。その結果、その挙動は常在性と病原性の間を行き来している。病原性因子は広く研究されているが、大腸菌の常在菌性を高める因子に着目した研究はほとんどない。その結果、mcr-1遺伝子が腸管への侵入と定着を促進し、大腸菌と腸内環境との相互作用のいくつかの側面に影響を与えるという、大腸菌による腸管コロニー形成の新たな側面を明らかにした。

我々は、mcr-1およびその類縁体が大腸菌のIECへの接着を促進し、ヒト宿主細胞および腸内細菌が産生するAMPに対する抵抗性の増加を誘導することを見出し、これらは常在菌の2つの重要な機能である[44,45,46,47,48]とした。Mcr遺伝子は、ヌクレアーゼAMPに対する抵抗性を誘導しなかったが、細菌膜を標的とする孔形成AMP、同様にLPSを標的とし細菌膜を不安定にし、結果としてその透過性を変化させるコリスチンに対する感受性を特に低下させた。つまり、McrsによるLPSの修飾は、孔形成性AMPやコリスチンと細菌膜の相互作用に影響を与えるため、Mcrによる孔形成性AMPに対する耐性も同じ論理で導かれる。

したがって、膜を標的とするAMPの将来の治療開発は、プラスミドを介したmcr耐性遺伝子の拡散によって阻害される可能性が高い。また、治療とは無関係のメカニズムでmcr遺伝子が残存している可能性もある。そのため、コリスチンへの曝露量が減少する中で、mcr遺伝子の発現量が増加していることが報告されている[49]。mcr-1に関連する他の耐性遺伝子がこのような進化を説明できるとすれば，mcr-1遺伝子による腸内体力の向上が，プラスミド保有に伴う体力コストを相殺し，その拡散に寄与している可能性もある．この持続的なメカニズムには、おそらくmcr-1を介したLPSの修飾[6, 7]が関わっており、腸内常在菌の回復力に関与するLPSホスファターゼによって引き起こされる修飾が反響している[44]と思われる。

その結果，mcr-1アナログは腸内細菌叢のプロテオームにおいて高い発現を示し，その中にはBacteroidetesのような常在のグラム陰性菌が多く含まれていることがわかった．したがって、mcr-1は常在菌のLPSの挙動を模倣した機能的特徴を促進し、大腸菌におけるその存在は、腸内生態系の選択圧の下での収斂進化の結果である可能性がある。

腸内生態系の主役である腸内細菌叢と免疫系の主な役割の1つは、常在病菌の過剰増殖や外来菌の侵入に対する抵抗力を提供することである[50,51,52,53,54]。我々は、大腸菌にmcr-1が存在すると、このバリア効果を回避し、腸内細菌叢の多様性や組成に明らかな変化を与えることなく、大腸菌の侵入を促進することを明らかにした。したがって、mcr-1を保有する大腸菌は、微生物叢の組成を変化させることで生じる免疫系の活性化や炎症性反応を防ぐことができる[55,56,57,58]。

さらに，mcr-1が大腸菌の病原性を低下させ，大腸菌のコロニー形成に対するIECやマクロファージの炎症反応をダウンレギュレートし，これら免疫系の「番人」の活性化を防ぐことも明らかにした [59, 60]．mcr-1のこのようなピースキーパー活性は、生きた細菌、細菌上清、および腸管内腔からIECの表面に拡散することができる誘導体LPSで観察されている[36]。全体として、mcr-1とその類似体は、腸管生態系への大腸菌の慎重な侵入を支持し、腸管免疫系を介して大腸菌に対する耐性を増強することが分かった。

Mcr遺伝子は、腸管に定着するための高度に特殊な因子を持つ腸管病原性大腸菌（IPEC）ではこれまで報告されておらず、通常腸に定着した後に腸管外に感染する常在菌（大腸菌群A、B1など）と腸管外病原性大腸菌（ExPEC、B2群）のみで報告されている。ExPECは、IPECとは異なり、腸管に定着し病原性を発揮するための病原因子を不均一に保有する菌株の集合体であり、明確な定義はない[61]。免疫不全の宿主における日和見的な腸管外感染症にのみ関与する常在大腸菌と、免疫不全の宿主における腸管外感染症に関与する強毒性株の間には、おそらく病原性の勾配が存在するのであろう。このことから、Mcr-1はExPECや腸内常在菌の腸管内定着を促進し、プラスミドがもたらす体力的コストを相殺すると考えられるが、おそらくその毒性および腸管外感染や障害を引き起こす能力には影響を与えるものと思われる。

結論
mcr-1遺伝子、およびおそらくそのアナログは、抗生物質非存在下での腸内定着を促進する。コリスチン耐性の付与に加え、腸内常在菌で顕著なピースキーパーやレジリエンス活性を示すことから、大腸菌の腸内常在菌としての生活様式を向上させることが示唆された。mcr-1の爆発的な出現は、コリスチンの乱用がもたらした結果であると考えられる[7]。また、抗生物質がない場合でも、大腸菌にこの遺伝子が存在し、持続していることは、腸内生態系による選択圧力の偶然の副産物である可能性もある。抗生物質非存在下で抗生物質耐性が腸管内コロニー形成を促進するというこの新しいパラダイムは、抗生物質耐性との戦い、およびグラム陰性菌による感染症における最後の手段としてのコリスチンおよび関連抗生物質の持続性においてさらなる懸念材料である。

データおよび資料の利用可能性
細菌の16S rRNA遺伝子のリードは、European Nucleotide Archive (project ID: PRJEB33293) に寄託されました。

略号
CFU:
コロニー形成単位

DMEM:
ダルベッコ改変イーグル培地

LPS:
リポポリサッカライド

MIC:
最小発育阻止濃度

MH:
ミューラーヒントン培地

MOI
感染倍率

NCBI:
全米バイオテクノロジー情報センター

OMM12 :
オリゴマウス-マイクロビオタ12株

PBS
リン酸緩衝生理食塩水

PMA:
酢酸ミリスチン酸フォルボール

sDMDMm2:
安定型中等度多様性微生物群マウス

NMDS:
非計量的多次元尺度法（Non-metric multidimensional scaling

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謝辞
Marjiana Basic博士とAndre Bleich教授（Hannover Medical School, Institute for Laboratory Animal Science, Hannover, Germany）に、グノトビオティックマウスの飼育ペアを提供していただいたことに感謝する。また、CLIC (Clermont-Ferrand Imagerie Confocale, Université Clermont Auvergne) のプラットフォームとCaroline Vachias博士に共焦点顕微鏡の協力に感謝する。また、Denis Duché博士（Laboratoire d'Ingénièrie des Systèmes Macromoléculaires, Institut de Biologie Structural et Microbiologie, CNRS）にはコリシン産生株の提供をお願いした。また、Anne-Sophie MarinelliとSandra Lebeauの技術協力に感謝する。

資金提供
本研究は，Ministère de la Recherche et de la Technologie, the Inserm (UMR 1071), the INRAe (USC-2018), フランス政府の IDEX-ISITE initiative 16-IDEX-0001 (CAP 20-25), the National Program 'Microbiote' Inserm, the National Program 'Microbiote'により支援された．欧州委員会の抗菌剤耐性に関する共同プログラミングイニシアチブ（JPIAMR）プログラムTransComp-ESC-R、および抗菌剤耐性に関する国家優先研究プログラム（PPR-AMR）からの助成金（'DYASPEO'）。

著者情報
著者名および所属
Université Clermont Auvergne, Inserm U1071, USC-INRAe 2018, Microbes, Intestin, Inflammation et Susceptibilité de l'Hôte (M2iSH), Centre de Recherche en Nutrition Humaine Auvergne, 28 place Henri Dunant, 63001, Clermont-Ferrand、France。

Dalmasso Guillaume, Beyrouthy Racha, Brugiroux Sandrine, Bonnin Virginie, Saint-Sardos Pierre, Barnich Nicolas, Delmas Julien & Bonnet Richard.

抗菌剤耐性研究センター、大学病院、58 PLACE MONTALEMBERT、63000、Clermont-Ferrand、フランス

Beyrouthy Racha、Guillouard Laurent、Bonnet Richard

パリ大学、IAME、INSERM、F-75018、パリ、フランス

Ruppé Etienne

AP-HP, Hôpital Bichat, DEBRC, F-75018, Paris, France

Ruppé Etienne

バイオインフォマティクス・バイオスタティスティック・デパートメント、パスツール研究所、USR 3756 CNRS、パリ、フランス

ゴズラン・アミン

IMOST, UMR 1240 Inserm, Université Clermont Auvergne, 58 Rue Montalembert, 63005, Clermont-Ferrand、France

Gaumet Vincent

寄稿
コンセプト立案。R.Bo.、G.D.、R.Be.、調査。G.D.、R.Be.、S.B.、P.S.-S、L.G、V.B、A.G、V.G、J.D、データ解析．G.D.、R.Be.、S.B.、A.G.、E.R.、J.D.、および R.Bo.; writing-original draft preparation: G.D.、E.R.、R.Bo.、執筆-レビューと編集。G.D.、R.Be.、E.R.、P.S.-S.、J.D.、N.B、R.Bo.、および資金獲得。G.D.，R.Be.，R.Bo.．最終原稿は著者が読み、承認した。

協力者
Dalmasso GuillaumeまたはBonnet Richardに連絡すること。

倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
動物プロトコルはフランス教育・研究・革新省（APAFIS許可番号16354，22507，22770）の承認を受け，すべての動物は動物の世話と使用に関する欧州共同体のガイドライン（86/609/CEE）に従って使用された。

論文発表の同意
該当なし

競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。

追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。

補足情報
追加ファイル1: 表S1.
本研究で使用したマウス微生物株。補足図1. mcr-1の存在は細菌の増殖に影響を与えない。103 個の細菌を 10 mL の (A) LB, (B) DMEM, または (C) RPMI で培養し、37°C で増殖させた。希釈後、細菌を数え、データはコロニー形成単位（CFU）の総数/10 mLとして表した。データは3反復の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表値である。補足図2. カナマイシン加圧なしで、pBK-CMVの損失は、空のプラスミドまたはmcr-1をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌CFT073の間で同様である。空白プラスミドまたはmcr-1をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌CFT073を抗生物質なしで10日間培養し、プラスミドを含む細菌数および含まない細菌数を測定した。データは3反復の平均値±SEMであり、3回の独立した実験の代表値である。黒線は、pBK-CMVプラスミドを保有する細菌集団の25%を示す。補足図3. 大腸菌mcr-1+（黒棒）または大腸菌mcr-1-（白棒）による腸内コロニー形成に対するオリゴマウス-マイクロビオータ12（OMM12）モデルにおける細菌株の絶対的存在量。Gnotobiotic OMM12マウスに大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を経口感染させ、感染後10日目に糞便を採取した。各菌株の絶対量は菌種特異的qPCRアッセイにより決定し、糞便ゲノムDNA 1ngあたりの16S rRNA遺伝子コピー数としてプロットした。データは平均値±SEMsで表した。I46, Clostridium innocuum; I48, Bacteroides caecimuris; I49, Lactobacillus reuteri; KB1, Enterococcus faecalis; YL27, Muribaculum intestinale; YL31, Flavonifractor plautii; YL32, Clostridium clostridioforme; YL44, Akkermansia muciniphila; YL45, Turicimonas muris, および YL58, Blautia coccoides.である。補足図4. オリゴマウス-マイクロバイオータ12（OMM12）モデルにおいて、大腸菌mcr-1+（黒棒）または大腸菌mcr-1-（白棒）による腸内コロニー形成に反応して測定したKC、IL-1β、IL-6の糞中濃度（A〜C）および糞中リポカリン-2の濃度（D）。Gnotobiotic OMM12マウスに大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を経口感染させ、感染後10日目にサイトカインおよびリポカリン2（Lp-2）産生をELISAで評価した。データは平均値±SEMsで表した。補足図5.mcr-1は、競争実験において、マウス腸管のコロニー形成を促進する。マウスに大腸菌mcr-1+と大腸菌mcr-1を経口投与してチャレンジさせた。感染後41日目から9日目の糞便から大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-の数を測定した。データは、平均値±SEMで表した。補足図6.mcr-1は微生物叢の豊かさを維持する。マウスに大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を経口投与してチャレンジした。腸内細菌叢の組成は、大腸菌接種前と接種後3日目の糞便16S rRNA遺伝子配列から評価した。アルファ多様性の違いは、Shannon (A), InvSimpson (B), Evenness (C), Richness (D) 指数で評価した。グループ間の有意差の推定にはKruskal-Wallis検定を用い、一対の比較はWilcoxon検定で行った。また、p値はFDR法により多群間比較の調整を行った。補足図7. 腸内細菌叢で存在量に有意差を示した分類群。分類群は16S rRNA遺伝子に基づくneighbor-joining treeで報告され（A）、その存在量の差はlog2 fold changeで示される（B）。存在量の有意な差はDeseq2アプローチで評価した。補足図8. mcr-1はマウスの炎症を抑制する。マウスに大腸菌mcr-1+（黒棒）または大腸菌mcr-1-（白棒）を経口投与してチャレンジさせた。大腸（A）および回腸（B）の炎症性サイトカインレベルをELISAで測定した。データは、平均値±SEMで表した。補足図9．Campの欠失は、細菌の腸内定着に影響を与えなかった。Camp欠損マウスに、大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-を経口投与してチャレンジした。感染後1日目および3日目に採取した糞便中の大腸菌mcr-1+または大腸菌mcr-1-の数を測定した。データは平均値±SEMsである。補足図10. mcr-1は細菌およびLPSの病原性を低下させる。マウスに大腸菌mcr-1+、大腸菌mcr-1-（A）、またはそれらの菌から精製したLPS（B）を腹腔内注射で接種し、生存率をモニターした。Mantel-Cox検定およびGehan Breslow-Wilcoxon検定を用いて、得られた生存曲線を比較した。補足図11. MCRはLL-37に対する細菌の耐性を増加させる。2.107 個の大腸菌 mcr-3, -4, -5, -10 または遺伝子 mcr を欠く 2.107 個の同系大腸菌を LL-37 とともに 2 時間インキュベートした。生存菌の割合を報告した。データは4つの複製の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表である。補足図12. MCRは真核細胞への細菌の付着を増加させる。HT-29 細胞を大腸菌 mcr-3, -4, -5, -10 または mcr 遺伝子を持たない同系大腸菌に 3 時間感染させた。付着した細菌を数え、データはコロニー形成単位（CFU）/ウェル数で表した。データは6反復の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表である。補足図13. MCRは、LPSによって誘導される炎症性反応を減少させる。HT-29 細胞を大腸菌 mcr-3, -4, -5, -10 または遺伝子 mcr を持たない同系大腸菌から精製した 0.01 μg/ml の LPS で 3 時間刺激し、細胞培養上清中の分泌 IL-8 量を ELISA で定量化した。データは6反復の平均±SEMであり、3つの独立した実験の代表である。補足図14．腸内細菌メタゲノムにおけるmcr-1様遺伝子の平均相対存在量は、その有病率と正の相関がある。補足図15. mcr-1様遺伝子の平均相対量はIBD群でコントロール群に比べ有意に低かった（Wilcoxon unpaired test P = 8.2×10-7）．mcr-1様遺伝子の分布は、既報のデータを用いて、炎症性腸疾患（IBD）のある被験者（n = 148）またはない被験者（n = 745）で評価された。

権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。

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Guillaume, D., Racha, B., Sandrine, B. et al. Genes mcrは病原性大腸菌の腸内体力を向上させ、その生活スタイルを常在菌にバランスさせる. Microbiome 11, 12 (2023)。https://doi.org/10.1186/s40168-022-01457-y。

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受付終了
2022年4月21日

受理済
2022年12月22日

公開日
2023年1月20日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01457-y

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