Toll様受容体4（TLR4）過剰発現による腸内細菌叢の変化とサルモネラ感染に抵抗する羊の免疫応答の改善

2023年2月21日 09:08

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Microbiol.、2023年2月15日
第2部脊椎動物の消化器官における微生物
第14巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1075164
Toll様受容体4（TLR4）過剰発現による腸内細菌叢の変化とサルモネラ感染に抵抗する羊の免疫応答の改善
Xue-Ling Xu1, Yue Zhao1, Ming-Ming Chen1, Yan Li1, Yao Li1, Su-Jun Wu1, Jin-Long Zhang2, Xiao-Sheng Zhang2, Kun Yu1* and Zheng-Xing Lian1*.
1中国農業大学動物科学技術学院農業部動物遺伝育種工学国家工学研究所動物遺伝学改良重点実験室（中国・北京市
2天津動物科学研究院畜産獣医学研究所、中国天津市
はじめに Toll-like receptor 4（TLR4）は、グラム陰性菌やその産物を識別し、侵入してきた病原体に対する宿主防御に重要な役割を担っている。腸内では、TLR4は細菌のリガンドを認識し、免疫系と相互作用しています。TLR4シグナルは自然免疫系の重要な構成要素であるが、TLR4の過剰発現が自然免疫反応に及ぼす影響や腸内細菌叢の構成に与える影響については不明である。

方法：ここでは、ヒツジ末梢血からマクロファージを入手し、マクロファージにおけるサルモネラ・チフスムリウム（S. Typhimurium）の貪食およびクリアランスを検討した。一方、TLR4トランスジェニック（TG）ヒツジと野生型（WT）ヒツジの便に生息する複合微生物叢を16SリボソームRNA（rRNA）ディープシーケンスを用いて特徴づけた。

その結果その結果、TLR4の過剰発現は、S. Typhimuriumによる刺激後、下流のシグナル伝達経路を活性化することで、より多くの初期サイトカインの分泌を促進することが示された。さらに、多様性解析により、TLR4過剰発現は微生物群集の多様性を増加させ、腸内細菌叢の組成を制御することが示された。さらに重要なことに、TLR4の過剰発現は、ファーミキューテス/バクテロイデテス、炎症および酸化ストレス産生菌（ルミノコックス科、クリステンセネル科）の比率を減らし、バクテロイデス集団およびプレボテル科などの短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌の存在量を増加させることによって腸内細菌叢構成を調整し腸の健康を維持することが明らかになりました。TLR4過剰発現により変化したこれらの優勢な細菌属は、TG羊の代謝経路と密接な相関があることが明らかとなった。

考察 TLR4 の過剰発現は、腸内細菌叢の組成を制御し、抗炎症性代謝産物を増加させることにより、ヒツジの S. Typhimurium 侵入に対抗し、腸の炎症に抵抗することができることが示唆された。

1.はじめに
Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium) は公衆衛生上の危険を引き起こす人獣共通感染症病原体で、多くの国で流行しており、ヒツジ宿主の消化管感染により大きな経済損失をもたらしている (Alvseike and Skjerve, 2002)。羊の群れで発生したS. Typhimuriumは、急速に拡大し、雌羊と子羊に深刻な死亡率をもたらすことが特徴である。羊は人獣共通感染症の潜伏病原体の宿主であり、羊肉の消費に関連してより大規模なサルモネラ感染症が報告されている（Carson and Davies, 2018）。ニュージーランドでは、羊への曝露に関連したサルモネラ症の流行が再発した（Bakerら、2007）。Toll-like receptor（TLR）は、主に自然免疫細胞に発現するパターン認識受容体の一種で、様々な病原体から病原体関連分子パターン（PAMP）を検出し、炎症反応の開始だけでなく、初期の免疫防御に不可欠です（川井・彰、2007年）。感染時には、TLR4はグラム陰性菌の主成分である内毒素リポ多糖（LPS）を特異的に認識し、マクロファージや好中球などの免疫細胞にインターロイキン（IL）-8、IL-6、IL-1β、IL-12、腫瘍壊死因子α（TNFα）など多くの炎症性サイトカインを産生させて、侵入した病原体を排除します (Ramachandran, 2014). S. Typhimurium感染に対するTLR4の抵抗性を理解することは、動物の臨床疾患を減らし、食中毒のリスクを減少させることにつながる。

重要なことは、TLRは病原体だけでなく常在菌も認識し、この相互作用が正常な生理状態における腸管上皮細胞の恒常性維持に重要であることです。腸内細菌は、哺乳類の消化管に生息する数百万個の微生物からなる非常に複雑で多様な生態系である。ファーミキューテス門（グラム陽性）とバクテロイデーテス門（グラム陰性）は、宿主の生理機能に影響を与えることができる様々な代謝物を産生する羊腸微生物の主要な門である（Zhang et al, 2022）。一方、Proteobacteria、Verrucomicrobia、またはActinobacteriaのいずれかの門に属する細菌は、通常、マイナーな構成要素である。Ruminococcaceaeは羊の腸管内の主要な微生物であり、エネルギー代謝に関連し、セルロースやデンプンの分解に重要な役割を持つ（Sun et al.、2019）。

腸内細菌は、酵素を分泌して他の難消化性物質を分解することで栄養素の吸収を促進するだけでなく、炎症、免疫系の発達、腸脳軸の調節にも関与している（Hill and Artis, 2010; Lozupone et al, 2012; Karakan et al, 2021）。マイクロバイオータの構造の崩壊は、肥満、栄養失調、自己免疫、炎症性腸疾患（IBD）、感染症などの疾患に関連している（Donskeyら、2000；Leyら、2005；Frankら、2007；Turnbaughら、2008；Wuら、2010；Elinavら、2011；Kauら、2011）。これらのうち、腸内常在菌の存在は、クローン病や潰瘍性大腸炎を含むIBDの発症に極めて重要であると考えられています。通常、これらの疾患では腸の慢性炎症が特徴的であり、細菌による免疫系の異常活性化が原因と考えられています（Farrell and LaMont, 2002; Mirsepasi-Lauridsen et al., 2019）。健康な状態では、腸粘膜バリアは腸内細菌とそれ以外の宿主を分離し、上皮細胞と粘膜恒常性に関与するタンパク質で構成されています（奥村、武田、2017）。TLRを腸管上皮細胞につなぐ細菌産物は、上皮細胞の増殖、IgAの分泌、抗菌ペプチドの発現を促進することができる（Abreu, 2010; Venkatesh et al, 2014）。IgAの存在は、宿主の腸の炎症性シグナル伝達を減少させます（Visekrunaら、2019年）。したがって、免疫系は腸内細菌組成にも影響を与える。IgA欠損マウスの腸内では、分節化糸状菌（SFB）が異常に拡大した（Suzuki et al, 2004）。マウス大腸上皮細胞におけるNLRP6の欠損は、NLRP6 KOマウスおよび野生型（WT）マウスにおける大腸炎の増加を特徴とする糞便微生物相の変化をもたらす（Elinav et al.）腸内細菌叢の組成の変化もまた、TLRシグナル伝達と関連している。例えば、TLR5を遺伝的に欠失したマウスの腸内細菌叢は、多様な系統から116の細菌系統においてWT同胞と異なっていた（Vijay-Kumarら、2010年）。MyD88欠損マウスでは遠位腸内細菌組成が変化し、糞便微生物叢ではリケネル科とポルフィロモナド科の細菌がより多く存在した（Wenら、2008年）。

免疫系が腸内細菌叢に影響を及ぼすことを踏まえ、本研究では、Salmonella S. Typhimurium（食品由来病原体）の侵入に対する防御におけるTLR4シグナルの役割と羊の腸内細菌叢組成への影響に関心を抱いた。我々は、糞便サンプルから増幅した16S rRNA遺伝子のハイスループットシーケンスを用いて、TLR4過剰発現羊とそのWTコントロールの微生物叢を解析した。本研究の目的は、TLR4過剰発現がヒツジの腸内細菌叢の組成を変化させるかどうかを明らかにすることであった。

材料と方法
2.1. 倫理に関する記述
すべてのヒツジは、国家給餌基準 NT/T815--2004 に従って飼育された。この研究のために行ったすべての手順は、National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに一致するものであった。本研究におけるすべての実験動物プロトコルは、中国農業大学の動物管理使用委員会（承認番号AW81012202-1-3）の要件に従って承認され、実施されたものである。

2.2. 動物
ovis aries TLR4（図1A）を含む線形ベクターを受精卵にマイクロインジェクションして、創始者トランスジェニック（TG）羊を得た（Dengら、2012）。創始者TGヒツジは、WTヒツジと交配して子孫を育成した。子孫において、2〜3歳の健康な雌の羊は、サザンブロッティング（Roche Diagnostics, Germany）によりWTまたはTGと同定された（Bai et al.、2015）。

図1
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図1. ヒツジにおけるTLR4過剰発現アッセイ。(A) CMV-ovis aries TLR4 過剰発現ベクターの構造図。(B) TLR4トランスジーンの存在に基づく、代表的なサザンブロットによるTGヒツジの同定。TGヒツジは内因性4,700bpのTLR4バンドと外因性2,771bpのTLR4バンドの両方を持っている。マーカー、1kbラダー。(C) 単離されたマクロファージの形態。(D）ヒツジマクロファージを末梢血から単離し、その形態をギムザ染色により強調した。(E）マクロファージにおけるTLR4のmRNA発現を、qRT-PCRによって調べた。(F）マクロファージにおけるTLR4タンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングを用いて分析した。WTマクロファージと比較して、TGマクロファージにおけるTLR4タンパク質レベルは、有意に高いことが分かった。(G)ウエスタンブロットのデータを統計的に解析した。TG、トランスジェニック；WT、野生型。エラーバーはSDを示し、N = 4; *p < 0.05, **p < 0.01.

耳組織から20μgのゲノムDNAを抽出し、HindIII（New England Biolabs、イギリス）で消化した。サザンブロッティング用プローブを設計し、PCR産物を調製した。プライマーはフォワード5′-ACTGTAAAGAACTTGAGGAGG-3′とリバース5′-CCTCACAGCATTCAACAGACC-3′を使用し、671bpのPCR産物はジゴキシゲニン（Roche Diagnostics, Germany）で標識した。その後の実験には、TGグループのOvis ariesを5匹、WTグループのOvis ariesを5匹使用した。本研究では、TLR4過剰発現羊とWT雌羊はすべて天津農業科学院動物科学獣医学研究所から提供され、同じ環境で飼育されたものである。

2.3. マクロファージの単離と培養
ヒツジの末梢血（10 mL）を頸静脈から採取し、末梢血リンパ球分離液（TBDscience、中国）を速やかに添加した。密度勾配遠心分離（2,000rpm、30分、4℃）後、末梢血単核球をPBSで洗浄した。単核細胞を10％牛胎児血清（FBS，Gibco）および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地（Gibco，米国）に再懸濁し、6ウェル培養プレートで37℃、5％CO2で培養を行った。2時間培養後、ウェルをPBSで洗浄して非接着細胞を除去したところ、単一接着単核細胞は紡錘形マクロファージに分化し、1週間後に増殖クローンを生じた（図1C）。

2.4. マクロファージの感染とコロニー形成単位数
当研究室で保存していたS. Typhimuriumを用いた。この菌はLuria broth (LB)培地で37℃、対数増殖期まで培養し、後に使用した。TGおよびWTマクロファージの貪食能を検出するために、細胞に生きたS. Typhimurium CVCV541を感染させた。菌は、10% FBSを含むRPMI-1640培地（Thermo Fisher Scientific, USA）に懸濁した。次に、付着したマクロファージを、2つの異なるレベルのMOI（5および10）でS. Typhimuriumに5、15および30分間感染させ、100μg/mlのゲンタマイシンを含むPBSで洗浄した。その後，0.25% tritonX-100で細胞を溶解して細胞内細菌を遊離させ，連続希釈後にCFUをカウントして細胞内生存細菌数を定量した．

マクロファージにおける細菌クリアランス能力を測定するために、まずマクロファージにS. Typhimurium CVCV541を30分間感染させた。マクロファージを100μg/mLゲンタマイシンを含むPBSで3回洗浄することにより、細胞外細菌を除去した。次に、10％FBSを含むRPMI-1640を30分間細胞に加え、これを時点60分として記録した。細胞を洗浄し、0.25% Triton X-100 (in PBS)で溶解させた。細菌を添加した時間から貪食時間を算出する。30分の菌数から60分の細胞内菌数を差し引くことで、クリアした菌数のデータをアクセスした。

2.5. 定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR)
S. Typhimuriumの攻撃を受けたヒツジのTG群とWT群の因子発現を比較するために、S. Typhimurium SL1344をMOI10で0、0.5、4時間処理し、関連遺伝子のmRNA発現をRT-PCRにより検出・定量化した。ヒツジマクロファージのトータルRNAは、RNA抽出キット（Aidlab, Beijing, China）を用いて、製造者の説明書に従って抽出した。RNAはDNAse Iで処理して残留DNAを除去し、NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific, Waltham, MA）を用いてRNAの量と質を評価した。抽出した1μgのRNAをPrimeScript RTキット（TaKaRa社製）を用いてcDNAに逆転写した。このcDNAをRT-qPCRにより解析した。表1に示す遺伝子プライマーは、tsingke（中国、北京）から合成した。qRT-PCRは、SYBR Premix Ex Taq IIキット（TaKaRa、日本、京都）を使用して実施した。RT定量PCRデータの取得には、Mx3000P装置（Agilent Technologies, USA）を使用した。qPCR 装置は、PCR 産物の蛍光がバックグラウンドシグナルを上回ったサイクル数を自動的に算出し、サイクル閾値（Ct）と称する。データは、3 つの複製からの Ct 値を平均して比較 Ct 法（2-ΔΔCT 法）により解析し、mRNA の発現量はハウスキーピング遺伝子 GAPDH mRNA レベルに正規化した。

表1
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表1. 定量的ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマー配列。

2.6. ウェスタンブロット
細胞タンパク質は、RIPA溶解バッファー（Beyotime, Beijing, China）を用いて抽出した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイキット（Cwbio, Jiangsu, China）により測定し、6×ローディングバッファーで95℃、8分間煮沸した。サンプルを10％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、直ちに0.22μmポリフッ化ビニリデン膜（ミリポア、米国）に移し、膜を5％脱脂乳含有トリス緩衝生理食塩水（TBST）で室温、60分ブロッキングを行った。3回洗浄した後、膜を抗TLR4（1：1，000希釈、AF7017、Affinity）と共に4℃で一晩インキュベートした。次にブロットを、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体（1：20，000希釈、Proteintech）と37℃で60分間結合させた。TBSTで再度3回洗浄した後、ピアス強化化学発光（ECL）ウェスタンブロッティングキット（Thermo Scientific）により実験結果を得て、化学発光システム（BIO-RAD、米国）により画像化した。

2.7. 糞便サンプルの採取
本研究では、10頭の雌成羊を使用した。TLR4過剰発現ヒツジ5頭を実験群(TG群)とし、WTヒツジ5頭を対照群(WT群)として2群に分けた。秋にTG群とWT群から清潔なプラスチック手袋を用いて糞便を採取した。新鮮で個体差のあるサンプルを2群の羊から採取した。サンプルはドライアイスで輸送され、その後の実験のために-80℃で保存される。

2.8. 糞便サンプルのDNA抽出
全細菌ゲノムDNAサンプルは、Fast DNA SPIN抽出キット（MP Biomedicals, USA）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって10匹のヒツジ糞便サンプルから抽出した（n = 10）。分離したDNAの量と質は、それぞれ分光光度計（NanoDrop 2000; Thermo Scientific, USA）およびアガロースゲル電気泳動で測定した（補足図S1）。抽出したサンプルDNAは、PCR増幅やシークエンスに使用するまで-20℃で保存した。

2.9. 細菌 16S rRNA ライブラリーの構築と塩基配列の決定
原核生物16S rRNA遺伝子ライブラリーは、可変V3-V4領域を用いたアンプリコンPCR（Forward, ACTCCTACGGGAGGCAGCA and Reverse, GGACTACHVGGTWTCTAAT）とイルミナ16Sサンプル調製ガイドを用いて抽出したDNAから生成された。増幅のための25 μL PCR成分の調製。増幅手順は、98℃での2分間の初期変性、98℃での15秒間の変性、55℃での30秒間のアニーリング、72℃での30秒間の伸長、72℃での5分間の最終伸長、10℃での保持からなる25サイクルで構成されています。未結合のプライマー、その他のコンタミ、プライマーダイマー断片を除去し、定量した。精製したサンプルを等モル量で回収し、IlluminaMiSeqプラットフォームでペアエンドシーケンスをShanghai Personal Biotechnology Co. (上海、中国)で行った。

2.10. 16S rRNA 遺伝子配列の解析
シーケンシングデータの品質管理を行うために、Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME）パイプラインを採用した（Bolyen et al.）具体的には、オリジナルのシーケンスリードをそれぞれのサンプルに割り当てられたバーコードと正確に照合し、有効なシーケンスであると判断した。ソフトウェアパッケージDADA2を適用した（Callahan et al.、2016）。2つのリードの間に少なくとも12bpの重複がある場合、リードはマージされ、キメラは排除される。生成物は増幅配列バリアント（ASV）表であり、従来の操作的分類単位（OTU）表よりも高解像度で合理的なアナログであった（Callahan et al.、2017）。

配列は、門レベルから種レベルまで分類された。参照データベースとしてSilvaバージョン132を使用して、配列リードを分類・同定する（Pruesse et al.）これは、DADA2パッケージの機能であるassingSpeciesとassingTaxonomyによって達成された。抽出後のサンプル、総リード数、最終リード数、分類群を補表 S1 に示す。同じ門のASVはそれぞれのグループにまとめた。関数の引数はデフォルトを適用した。

2.11. 統計情報
16S rRNA遺伝子配列の統計解析とバイオインフォマティクスによる解析。QIIME の ASV テーブルを用いて、Chao1 richness、Shannon diversity index、Simpson index などの群集内多様性（α-diversity）を検出した。ASVレベルの存在量曲線を作成し、サンプル内のASVの豊かさと均質性を比較した。群集組成の変化（β-多様性）は、主座標分析（PCoA）、重み付きおよび重みなしUniFrac NMDS分析、および重み付きUniFrac距離に基づく階層的クラスタリング分析によって行われた。これらはQIIMEとRソフトウェアによって行われた。グラム陽性/グラム陰性比は、ActinobacteriaとFirmicutesの配列数をグラム陰性菌（ここでは、従来のグラム陰性菌の概念を最もよく反映すると考えられるHsp60挿入物を含む門と定義）数で割ることによって算出した（Sutcliffe, 2010; Gupta, 2011）。また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の相対的な存在比は、各グループで見つかった配列の総数で割ることで算出した。各グループで存在量の異なる分類群を検出するために、線形判別分析（LDA）およびLDA効果量（LEfSe）法を使用した。相関分析にはスピアマン相関を用い、相関を計算する前にASV表をセンタリングし、対数変換を行った。可視化およびプロットにはggplotパッケージを使用。腸内細菌叢の機能予測は、Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt 2) (Douglas et al., 2020)で実施した。

すべての棒グラフおよび箱ひげ図は、GraphPad Prism version 8.0 (GraphPad Software, USA)を用いて作成した。すべてのデータは、平均値±SDで表した。統計解析には一元配置分散分析を用い、その後、多重比較のためにトルコ検定を用いた（*p < 0.05, **p < 0.01）。

結果
3.1. TLR4過剰発現TGヒツジの同定
TLR4 発現ベクター(図 1A)が我々の先行研究で飼育した TG ヒツジのゲノムに組み込まれていることを確認するため、TLR4 断片をサザンブロッティングで観察した。TG ヒツジと WT ヒツジのゲノムを制限酵素 Hind III を用いて解剖した。TGヒツジは共に4,700bpの内因性TLR4断片と2,771bpの外因性TLR4遺伝子を有していたが、WTヒツジは4,700bpの内因性TLR4断片のみであった（図1B）。

単球由来のマクロファージはヒツジ末梢血から取得し、ギムザ染色により同定した。分離に成功した細胞は、丸い核を持つ紡錘形で、いくつかの仮足と空胞を有していた（図1C）。そして、ギムザ染色で観察されるように、核は濃く着色されていた（図1D）。さらにTLR4の発現量を調べるために、RT-PCRとウェスタンブロッティングをそれぞれ用いて評価した。TGマクロファージにおけるTLR4のmRNAおよびタンパク質レベルは、WTマクロファージよりも明らかに高かった（図1E〜G）。

3.2. TLR4 の過剰発現は、サルモネラ・チフスムリウムの貪食とクリアランスを増加させ、複数の TLR4 を介したサイトカインの活性化を促進させた
マクロファージは、免疫担当細胞として生体防御の中心的な役割を担っている。そこで、TLR4マクロファージのS. Typhimurium CVCC541に対する貪食能について、プレートコロニーカウント法により検討したところ、S. Typhimurium CVCC541はTLR4マクロファージによって貪食された。TGおよびWTマクロファージのS. Typhimurium内在化量は、ともに感染期間とともに増加した。しかし、TLR4過剰発現マクロファージにおけるS. Typhimuriumのレベルは、MOI 5または10にかかわらず、生きたS. Typhimurium処理後の異なる時間においてWTマクロファージよりも有意に高かった（p < 0.05）（図2A）。言い換えれば、これらのTLR4マクロファージはWTマクロファージよりも強いエンファリング能力を有していた。TLR4が細菌の増殖を制御する役割をさらに確認するために、CFUsアッセイを用いて、TLR4マクロファージによるS. Typhimuriumのクリアランス能力を評価した。寒天培地プレート上に生育した生菌数を16時間後にCFUとして測定した。マクロファージにS. Typhimuriumを一定時間感染させ、感染後1時間後のTLR4過剰発現マクロファージとWTマクロファージにおけるS. Typhimuriumの除菌能力を調べた（図2B）。TLR4マクロファージにおけるS. Typhimuriumの細菌殺傷能力は、生きたS. Typhimuriumの感染後MOI 10でWT群に比べ劇的に高かった（図2B）。これらのデータは、TLR4がS. Typhimuriumの貪食能力を上昇させるだけでなく、マクロファージ内でのS. Typhimuriumの成長を効果的に制御することを実証した。

図2
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図2. TLR4 を過剰発現させると、サイトカインの活性化が促進され、S. Typhimurium の貪食能と殺傷能が上昇する。(A) S. Typhimurium の感染時間を変え（MOI = 5 または 10）、TG および WT マクロファージで細胞内 S. Typhimurium を検出した。(B）マクロファージにおけるS. TyphimuriumのクリアランスをCFU法により解析した。マクロファージをS. Typhimurium (MOI = 10)で30分間処理した。30分後、マクロファージ内で生存しているS. TyphimuriumをCFUプレーティングによりカウントした。(C) IL-6、TNFα、IL-8およびIL-1βのような炎症性サイトカインの発現レベルは、0、0.5および4時間のS. Typhimurium後のマクロファージでqRT-PCRによって測定された。TG、トランスジェニック、WT、野生型、MOI、感染倍率、CFU、コロニー形成単位。

マクロファージは、特異的な免疫応答を誘導し、生成された応答の制御に関与する可溶性サイトカインを産生するために重要である（Arango Duque and Descoteaux, 2014）。S. Typhimurium感染初期におけるマクロファージサイトカイン発現に対するTLR4過剰発現の影響を解明するために、IL-6、IL-1β、IL-8、およびTNFαの産生をRT-PCRで検出しました。その結果、S. Typhimurium刺激後0.5時間の時点で、TGマクロファージはWTマクロファージに比べてIL-6、IL-1β、TNFαの発現が著しく高かった（p < 0.05）（図2C）。そして、4時間後の時点でも、TLR4過剰発現マクロファージにおけるS. Typhimurium誘発IL-1β、およびIL-8の産生は高いままであった（図2C）。TLR4リガンドに対する反応がその受容体に特異的であることを評価するために、マクロファージをLPS（100 ng/mL）またはPam3CSK4（1 μg/mL）で処理し、サイトカイン分泌を評価した。LPSを48時間処理すると、WTマクロファージと比較してTGマクロファージではIL-6、IL-1β、IL-8の発現が著しく上昇し、TLR2リガンドで処理してもそのままであり、それによって上昇したサイトカインは他のTLRアゴニストでは代償できないことが示された（補図S2）。以上のことから、TLR4 の過剰発現は、S. Typhimurium 刺激の初期段階において炎症性サイトカインの分泌を促進することが示唆された。

3.3. TLR4 の過剰発現が腸内細菌叢の豊かさと多様性に及ぼす影響
腸内細菌叢プロファイルにおける TLR4 の機能を探るため、16S rRNA 遺伝子配列に基づく手法で羊の糞便微生物叢組成プロファイルを解析した。既報の方法に従って不適格な配列を除去した後、バイオインフォマティクス解析に使用した最終配列の平均数は、サンプルあたり59,510、標準偏差は11,534であった（表S1）。図3AのVennプロットに示すように、両グループは7,545のコア微生物群の構成において重複していた。これらの重複する系統群は、TG群とWT群のそれぞれ35.70%（7,545/21,137）および40.38%（7,545/18,687）を占めた。本研究では、微生物群集の豊かさと多様性を、それぞれ Chao1 指数と Shannon 指数を検出することで記述した。TG群とWT群では、Chao1だけでなくShannon指数にも大きな変化は見られなかった（図3B；Supplement Table S2）。また、Simpson指数も両群で顕著な差は見られなかった（図3B；Supplement Table S2）。さらに、NMDS解析、PCoA、および階層的クラスタリング解析を含む、サンプル間のβ多様性を評価することによって、グローバルな微生物群集構造の類似性を評価した。UniFrac距離によるNMDS解析によると、TGおよびWTグループの糞便微生物相は、2つの分化したクラスタを示し、TG羊における糞便微生物相組成の変化を反映していた（図3C）。また、重み付きUniFrac距離に基づくNMDS解析においても、同様の観察が可能である（図3D）。

図3
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図3. 腸内細菌叢の豊かさと多様性に対するTLR4の効果。(A）ベン図は、TGグループとWTグループの重複するコア微生物叢を表示した。(B) Chao1 index、Shannon index、Simpson indexによるα多様性解析を行った。(C)非重み付けUniFrac距離に基づくNMDS分析を行った。(D) 重み付けUniFrac距離に基づくNMDS解析。グラフの各点は個体を表し、点間の距離が短いほど、個体間の微生物群集構造が類似していることを意味する。(E) TGグループとWTグループのASVのPCoAスコアプロット。主成分（PC）1と2は、それぞれ分散の14.6％と12.3％を説明する。データ点の位置と距離は、細菌分類群の存在と相対的存在量の類似性の度合いを示している。(F) TG群とWT群におけるUPGMAによるASVの階層的クラスタリング解析。TG1-5：5頭のTLR4過剰発現ヒツジ、WT1-5：5頭のWTヒツジ。

重み付けされていないUniFrac距離に基づくPCoAを使用して、細菌群集パターンに対するTLR4過剰発現の効果を示した。図3Eに見られるように、TGとWTは異なる座標空間でクラスター化した。さらに、平均連結を用いた重み付けしないペアグループ法（UPGMA）に基づいて構築した階層的クラスタツリーも、TGグループとWTグループの間の明らかな分離を示した（図3F、WT4個体は除外した）。結論として、上記の結果は、腸内細菌組成におけるTLR4の重要な役割を示している。

なお、対照群のサンプルは、TG群よりも細菌の多様性が低いことが示された。この多様性の低さは、WTに属するサンプルがNMDSによると類似していたのに対し、TGグループの個体が互いに分散していた理由を説明することができる。

3.4. 腸内細菌叢の群集構造解析
本研究では、αの多様性はTLR4によって顕著な影響を受けないことが示されたにもかかわらず、TLR4の過剰発現は羊の腸内細菌の存在量を変化させることが示された。実際に、DESeq2パッケージの差分分析を用いて、TG対WTでTLR4の影響を受けた腸内細菌叢の構成を門レベルでさらに調査しました。ほとんどの個体で優勢であった2群に10種類の細菌門が決定された。ファーミキューテス、バクテロイデテス、スピロヘータ、プロテオバクテリア、パテシバクテリア、シアノバクテリア、フィブロバクテレス、テネリカート、放線菌、ベルコミクロビオタ（補足図S3）であった。BacteroidetesとFirmicutesの2つの門が有意に優勢で、この2門の存在量の合計が全体の約95%を占めた。TG群とWT群の微生物叢と個体間の相関をCircos解析により可視化した（図4A）。

図4
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図4. 各群の微生物叢の構成と門レベルでの変化。(A）TG群およびWT群の試料と微生物叢の相関をCircosで解析した結果、TG群およびWT群では微生物叢の相関が高いことがわかった。(B) Firmicutes門とProteobacteria門の羊に対するTLR4過剰発現の影響。Firmicutes門の存在量は、TGとWTで有意に異なっていた。(C) Spirochaetes門とBacteroidetes門の相対的な存在量。(D) 円グラフは、2つのグループにおけるグラム陽性とグラム陰性の平均存在量を示す。(E) ファーミキューテス/バクテロイデテス比(F/B)。各群5名、WT群との比較で*p < 0.05。

図4Bより、TG群ではWT群に比べFirmicutes門が減少しており（p=0.044）、TLR4過剰発現の影響が示唆された。Proteobacteria門もWT群に比べ有意ではないが、TG羊のTLR4発現により減少した(p = 0.870)。しかし興味深いことに、TLR4を過剰発現させるとSpirochaetesの数が増加した（p = 0.397）。最後の門であるBacteroidetesは、TGがWTと比較して有意な個体数の増加をもたらした門であった（p = 0.039）（図4C）。補足図S4は、他の細菌門の存在量をまとめたものである。

その後、TGおよびWTにおけるグラム陽性およびグラム陰性の割合について、より詳細な解析を行った。グラム陽性菌の存在量は、TG（図4D）、TG vs. WT（62.47 vs. 69.70）で有意に減少した（詳細な統計解析は補足図S5に示す）。また、Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) 比は、腸管免疫系の調節に重要な影響を及ぼすことが広く認められている。我々は、TLR4による腸内細菌叢（F/B）比の減少が、グラム陽性Firmicutesの数も減少させることを見出した（p < 0.05）（図4E）。

さらに、TG群とコントロール群間の分類学的組成も、ファミリーレベルおよび属レベルで具体的に行った（図5A）。ファミリーレベルでは、TLR4の過剰発現により、短鎖脂肪酸（SCFA）を代謝し、宿主の腸管バリアを強化し、抗炎症作用を発揮するPrevotellaceae（p＜0.05）の存在比が有意に改善された（図5B）。さらに、TLR4の過剰発現は、Ruminococcaceae (p < 0.05), Christensenellaceae (図5C) の存在量を減少させた。これらは、炎症や酸化ストレスを誘発するLPSを産生する。

図5
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図5. TLR4過剰発現が腸内細菌叢のファミリーレベルおよび属レベルの構成に与える影響。(A) 全サンプルにおけるファミリーレベルの糞便微生物叢の相対的存在量。(B）Prevotellaceaeの相対的な存在量。(C) RuminococcaceaeとChristensenellaceaeの相対的存在量。(D)糞便微生物群の属レベルでの相対的存在量。(E）系統樹を用いて、属レベルで微生物の進化的関係を示す。(F）属レベルでの相対的存在量の見かけの変化をボックス図にしたもの。N = 5 グループ。* WTと比較してp＜0.05。

属レベルでは、2群間で0.1%未満の存在度を示す属をろ過して除去した後、合計49の属が糞便サンプルに認められ、これらの属の2群における変動を補足表S3にまとめた。Ruminococcaceae_UCG-005, Christensellaceae_R-7_group, Rikenellaceae_RC9_gut_group, p-251-o5が主要な細菌属であった。相対存在量が5％以上の属は、図5Dに示すように、個体間の主要な微生物叢の組成構造であった。系統樹は、細菌の進化関係を属レベルで反映したものであった（図5E）。図5Fに見られるように、TG群の最も豊富な10属は、WT群と顕著に異なる属を有していた。WT群と比較して、Ruminococcaceae_UCG-010、Ruminococcaceae_UCG-013、［Eubacterium］_coprostanoligenes_group、Ruminococcaceae_NK4A214_groupの相対量はTG群で抑制されていた（p＜0.05）。また、TLR4の高発現により、Ruminococcaceae_UCG-005、Rikenellaceae_RC9_gut_group、p-251-o5、Bacteroidesの存在量が向上した（p＞0.05）（補足図S6）。その他のレベルの結果は補足図S7に記載した通りである。

3.5. TLR4過剰発現は、糞便微生物叢の主要な系統を変化させた
TGヒツジとWTヒツジの腸内細菌の主要な系統を視覚的に認識するために、LEfSe分析を適用した。LDAの結果、TG群には12の識別特徴があり（LDA > 2, p < 0.05）、Bacteroidia、Bacteroidetes、Bacteroidalesが主要な微生物相であることが示唆された。また、WT群では16種類の優占微生物が見られ、Ruminococcaceae_UGG_010、Ruminococcaceae_UGG_013、Ruminococcaceae_NK4A214_groupが主要な微生物相であった（図6A）。続いて、主な微生物叢を分類学的に同定するための進化的クラスタリング解析図が配信された（図6B）。図6Bの赤色の部分はBacteroidetes、青色の部分はFirmicutesであり、それぞれTG群、WT群であった。TLR4による羊の微生物の変化は、門や科のレベルで違いが見られ、属のレベルでもいくつかの相対的な存在量の変化が確認された。これらの結果から、TLR4の発現が羊の糞便中の腸内細菌叢の主要な系統を変化させ、特定の細菌の増殖を改善することが示された。

図6
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図6. TLR4 は、TG および WT の腸内細菌叢の主要な系統を変化させた。(A) LDAスコア。LDAスコア＞2で濃縮された分類群が棒グラフで表示されている（p＜0.05）。LDAスコアが大きいほど、より顕著な微生物叢の構成を示す。(B）羊の糞に含まれる微生物のTLR4に関するLEfSe解析。内円から外円への色のついた節点は、門から属レベルまでのすべての分類群の階層的な関係を示した。TGヒツジで濃縮された分類群は赤で報告されたのに対し、WTヒツジで濃縮された分類群は青で表示され、その後、有意差のない分類群が白で塗られた。各円の直径の大きさは、分類群の存在量を表している。N = 5個体/グループ。

3.6. 代謝経路における TLR4 の役割
図 7A に示すように、ASV レベルでネットワーク分析を適用した。腸内細菌叢の代謝機能を明らかにするために、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) パスウェイを PICRUST 2 を使用して調べた。KEGG機能アノテーション解析により、細胞プロセス、環境情報処理、遺伝情報処理、ヒト疾患、代謝、生体系パスウェイにシグナル伝達経路が濃縮されていた（図7B）。

図. 7
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図. 7. 腸内細菌叢と代謝経路の相関解析。(A)ネットワーク解析。ノード間リンクは、結合している2つのノードに関連があることを示す。(B）代謝パスウェイの相対的な存在量。(C)KEGGに濃縮されたパスウェイのヒートマップ。N = 5 個体/グループ。

さらに、30個のレベル2KEGGオーソロジーグループを解析した。その結果、WTと比較して、機能量が増加した上位3つは、TG群では、他のアミノ酸の代謝、糖鎖の生合成と代謝、エネルギー代謝であることが示された（図7B）。一方、細胞運動、転写、シグナル伝達、および内分泌系の経路は、TLR4過剰発現によって有意に減少した（p < 0.05）。KEGG機能解析では、機能量増加のトップ3は、K03088 (RNA polymerase sigma-70 factor, ECF subfamily), K02529 (LacI family transcriptional regulator), K02014 (iron complex outer membrane receptor protein)であった。一方、機能量が低下した上位3つは、KEGGオーソロジーの存在量が多い上位50位以内のK01990 (BC-2 type transport system ATP-binding protein), K06147 (ATP-binding cassette, subfamily B, bacterial), K01992 (ABC-2 type transport system permease protein)となった（図7C、補足図 S8）。

さらに、オーソロググループクラスター（COGs）解析では、微生物コミュニティの機能量が最も増加した3つの項目は、細胞壁/膜/包膜の生合成、翻訳後修飾、タンパク質回転、シャペロン、糖質輸送と代謝であり、微生物コミュニティの機能量が最も減少した3つは、転写、細胞運動、信号伝達機構でした（補図S9）。結論として、これらの発見は、TLR4が、おそらく異なる代謝経路に関与する特定の細菌種によって駆動される、腸内細菌叢とその関連する生物学的機能の変化を引き起こす可能性があることを示した。

4.考察
TLR4 は、自然免疫系で重要な役割を果たすパターン認識受容体の一種であり、上皮細胞や免疫細胞のような異なる種類の細胞に存在する。S. Typhimurium のようなグラム陰性菌の細胞膜上の特異的抗原である細菌 LPS を識別し、NF-κB の活性化やサイトカイン分泌の下流シグナルカスケードを刺激することが可能です。しかしながら、ヒツジにおけるTLR4過剰発現の病原体侵入に対する防御機構は、まだ不完全にしか解明されていません。本研究では、TGおよびWTヒツジの静脈血から分離したマクロファージを用いて、S. Typhimurium刺激下でのTLR4下流のサイトカイン発現を検討した。その結果、IL-6、IL-1β、IL-8、TNFαのような炎症性サイトカインの産生は、異なる時点で、TGグループがコントロールグループより顕著に高いことが示された。これらのデータは、S. Typhimuriumが、TLR4過剰発現TG羊においてより強い自然免疫応答を誘導することを示した。TGグループは、コントロールグループよりも高い貪食レベルを示した。言い換えれば、TLR4過剰発現TG羊では、より多くのS. Typhimuriumが貪食され得た。この結果は、他の研究（Ghoshら、2015；Tanら、2015；Liら、2021）と首尾一貫している。その結果、TLR4は、宿主防御機構の一部として、病原体の貪食と排除を調節する上で比類ない重要性を持っています。

TLRは、微生物のコロニー形成に関連している。新生反芻動物の空腸におけるTLR2、TLR4、およびTLR5の発現は、細菌の相対的存在量と有意な相関があり、受動免疫移転期の腸管防御に重要な役割を果たす（Zhuら、2021年）。相関分析により、TLR4発現はBradyrhizobiumおよびRudaeaの相対的存在量と負の相関があることが示された。ヒツジ血液中のLPSに対するゲノム応答は、ヒト血液中で観察されるものと極めて類似しており、ヒト炎症性疾患を模擬した研究およびTLRベースの免疫調節剤の研究にヒツジモデルを使用することを支持している（Enkhbaatarら、2015年）。便は主に大腸の微生物叢を反映します。我々は、ヒツジにおける遺伝子過剰発現とハイスループットシーケンス技術を活用し、TLR4シグナルが腸内細菌叢の構成に影響を与えるかどうかを確認した。ここでは、TLR4を過剰発現させたTGヒツジとWT対照ヒツジを慎重に比較した結果、TLR4の過剰発現は腸内細菌叢の豊かさに顕著な変化をもたらさないことが実証されました。また、TLR4は腸内細菌の多様性を適切に高めることができることが示唆された。さらに、PCA、NMDS分析、階層的クラスタリング分析などのβ多様性分析により、TLR4過剰発現TG羊の微生物群集構造全体がWTグループと有意に異なることが実証された。腸内細菌の多様性は、腸の安定性を維持する上で中心的な役割を担っています。S. Typhimuriumの早期感染が他の腸内微生物の生存を大きく阻害し、腸内細菌群集の多様性を低下させることが研究で強調されています（He et al.、2020）。これは、TG群が高レベルのサイトカイン分泌を誘導することでS. Typhimuriumを排除できるという我々の結果と一致し、TLR4過剰発現が腸内多様性の向上と腸内安定性の維持に有益であることを示している。

16S rRNA遺伝子配列解析により、TGヒツジとWTヒツジの間で複数の有意な分類学的差異シフトが確認された。細菌類とファーミキューテスは、宿主の腸内で最も豊富な細菌門の2つであり、宿主の炭水化物、脂質、胆汁酸代謝を制御する上で重要な役割を果たすと考えられています（Tremaroli and Bäckhed, 2012; Tuncil et al.）我々の結果は、TLR4を過剰発現させると、腸内の優勢なグラム陽性門であるFirmicutesが減少し、これはRuminococcaceae科とChristensenellaceae科の減少に起因する可能性があることを報告した。TLR4は、IL-6およびコロニー刺激因子3（CSF3）をアップレギュレートすることにより、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発の腸の損傷に対して修復効果を有していた（Shi et al.）腸内細菌叢の変化は炎症因子発現の制御に関与し、RuminococcaceaeはIL-6およびTNF-αと負の相関を示した（Wangら、2022年）。その上、TLR4の過剰発現は、免疫機能を高め、腸の健康を守ると考えられている腸内有益微生物の一種であるバクテロイデットのようなSCFA産生菌の存在量の増加ももたらしました。IBD患者では、Ruminococcus gnavusやproteobacteriaなどの炎症性微生物が増加し、Bacteroidetesなどの抗炎症性微生物の減少が認められました（Dalal and Chang, 2014; Wu et al., 2020）。大腸炎の動物モデルにおける他のBacteroidesの保護効果も以前の研究で証明されています（Delday et al.、2019）。さらに、ファミリーレベルでは、TG群でPrevotellaceaeファミリーが有意に増加しており、これは酪酸などのSCFAの産生を促進するため有益であると考えられる。SCFAは腸管細胞による抗菌ペプチド物質の産生を促し、宿主の腸内pHを低下させ、サルモネラの侵入・定着を抑え、腸内炎症の発生を抑制し、腸の健康を維持します（Fernández-Rubio et al, 2009; Kelly et al, 2015）。さらに、特定の細菌種の存在量の変化も、対応する生物学的機能と深く関連しています。属レベルでは、Ruminococcaceae_UCG-005, Rikenellaceae_RC9_gut_group, p-251-o5, Bacteroidesの相対量がWT群に比べTG群で増加することが分かりました。また、TLR4過剰発現羊では、Ruminococcaceae_UCG-010, [Eubacterium]_coprostanoligenes_group, Ruminococcaceae_NK4A214_group, Ruminococcaceae_UCG-013 の存在量が著しく減少していた。Ruminococcaceae-UCG-010 と UCG-005 は炭水化物を分解する機能を持ち、これらの群集は飼料のさらなる発酵に寄与すると考えられる（Kabel et al.2011; Kim et al.2011）。

比率F/Bは、腸内細菌叢のアンバランスや機能不全のマーカーとして測定することが考えられている（Tilahun et al, 2022）。また、肥満に関する先行研究では、高脂肪食がF/B比の上昇を誘導し、腸管免疫炎症と強く関連することが示されている（Min et al, 2019; Li et al, 2021）。16秒rDNA配列解析では、TG群でF/B比の減少が観察され、TLR4遺伝子が腸内細菌の制御に有益な効果を持つことが示唆された。微生物多様性の減少は、主に通性嫌気性菌、特にプロテオバクテリア門の現存量の増加によって示される（Shin et al.）さらに、Proteobacteriaの増加により腸内細菌の調節異常が起こり、糖尿病、炎症、がんなどと関連する（Shin et al.、2015）。TG群で観察されたProteobacteriaの相対量の減少は、TG群では抗炎症能力が高く、腸内細菌が側面から安定していることも反映しています。さらに、LEfSe分析を適用して、TGとWTの間の細菌の重要な系統を認識した。その結果、TG群の主要な微生物叢はBacteroidia, Bacteroidetes, Bacteroidalesで、WT群のRuminococcaceae_UGG_010, Ruminococcaceae_UGG_013, Ruminococcaceae_NK4A214_group とは全く異なることが明らかとなった。以上のことから、TLR4の過剰発現は羊の腸内細菌叢の構成に影響を与え、いくつかの主要な細菌種の存在量を改善することが示唆された。TLR4を介した腸内細菌の認識は、宿主を直接的な危害から守るために重要な役割を担っており、腸内細菌とTLR4の間の不均衡な相互作用は、慢性炎症とIBDなどの疾患発症を促進すると考えられる。我々は、ヒツジにおけるTLR4の過剰発現と腸内細菌の構造および組成との関連性を示す証拠を提供します。この発見は、TLR4が腸内微生物の生態を制御できることを示唆するものでした。

腸内細菌群のもうひとつの機能は、宿主の代謝を調節することです。コントロールと比較して、いくつかの代謝経路がTGで濃縮されていた。例えば、他のアミノ酸の代謝、糖鎖の生合成と代謝、およびエネルギー代謝の存在量は、TLR4の過剰発現によってTGグループで増加した。一方、TLR4 の過剰発現は、細胞運動、転写、シグナル伝達、内分泌系における機能を著しく低下させた。大腸炎の発生には、シグナル伝達、免疫細胞のトラフィッキングおよび細胞生存率に関連する複数の遺伝子の変化が関与していることが、証拠によって強調されています（Meddensら、2016；Neurath、2019）。これらの知見は、ヒツジにおけるTLR4の過剰発現が、腸管バリア機能の向上だけでなく、大腸炎の緩和にも関与している可能性を示唆している。因果関係の可能性を明らかにするためには、さらなる研究が必要です。

また、羊の腸内細菌叢は、施設や飼育環境、食餌条件によって大きく異なるため、本実験では、羊の腸内細菌叢を観察することに細心の注意を払いました。そのため、この実験では、羊の親の血統と給餌方法に細心の注意を払いました。それにもかかわらず、本研究の限界について考慮する必要がある。まず、遺伝子編集された大動物の数が少ないため、この研究のサンプルサイズは制限された。しかし、少人数のサンプルによる予備研究は、代替方法として用いることができる（Al-Mekhlafi et al.、2020）。これらの結果は、研究を拡大する価値があるかどうかの根拠となり、今後の研究においてサンプルサイズの算出に役立つ可能性すらあります。第二に、TLR4とマイクロバイオームの相互作用は、サンプリング部位に依存する可能性がある。今後の実験では、十二指腸、空腸、回腸の組織内容物に焦点を当て、腸内細菌叢の構成と腸管バリア機能におけるTLR4の役割を完全に明らかにする必要があります。

5.結論
本研究では、TLR4 を過剰発現させることで、S. Typhimurium チャレンジによる悪影響に抵抗するヒツジの免疫力が著しく向上することが報告された。また、TLR4 の過剰発現により、IL-6、TNFα、IL-1β、IL-8 の発現量が促進されることが示唆された。さらに、TLR4 の過剰発現は、微生物群集の構造と組成の調節を介してヒツジに影響を与える可能性がある。腸内細菌叢の組成を分析した結果、TLR4の過剰発現は、ファーミキューテス類とバクテロイデット類の比率およびプロテオバクテリアの数を減少させることが明らかになった。ファミリーレベルでは、TG群はWT群に比べ、Prevotellaceaeの増殖を有意に拡大し、Ruminococcaceaeの増殖を抑制した。これらの結果から、TLR4の過剰発現は、抗炎症に関連する微生物群集の相対的な存在量を改善することにより、腸のホメオスタシスを維持することができることが示された。また、TLR4の過剰発現は、羊の健康に害を及ぼす可能性のあるいくつかの特定の属の相対存在量を減少させた。このように、TLR4は羊の微生物種を大きく変化させる可能性がある。代謝機能の予測は、TLR4が細菌の代謝経路のプロファイルをかなり変更できることを示唆した。TGグループは、WTグループに比べ、他のアミノ酸の代謝、糖鎖の生合成と代謝、エネルギー代謝を促進する強い能力を示しました。さらに、TGグループは、細胞の運動性、転写、シグナル伝達、内分泌系を劇的に抑制した。以上のことから、TLR4は腸内細菌叢の種類と構造を調節することにより、宿主に有益な影響を与える可能性があることがわかった。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表したデータセットは、NCBI Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject) にアクセッション番号PRJNA891502で寄託されています。

倫理に関する声明
動物実験は、中国農業大学動物愛護使用委員会（承認番号AW81012202-1-3）の審査・承認を受けた。

著者の貢献
X-LX：原案作成。YZ, J-LZ, X-SZ: 試料採取。YL、M-MC、S-JW：編集と技術的レビュー。YL：可視化。KY、Z-XL：監修。すべての著者は、この原稿の公開版に同意している。

資金提供
本研究は、国家トランスジェニック生物育種大プロジェクト（2016zx08008-003）および中国国家重点研究開発プロジェクト（2021YFF1000704）の支援を受けて実施された。

利益相反について
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1075164/full#supplementary-material に掲載されています。

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キーワード TLR4、腸内細菌叢、16S rRNA、炎症、免疫

引用元 Xu X-L, Zhao Y, Chen M-M, Li Y, Wu S-J, Zhang J-L, Zhang X-S, Yu K and Lian Z-X (2023) Shifts in intestinal microbiota and improvement of sheep immune response to resist Salmonella infection using Toll-like receptor 4 (TLR4) overexpression. Front. Microbiol. 14:1075164.論文番号: 10.3389/fmicb.2023.1075164

Received: 2022年10月20日; 受理: 2023年1月25日;
公開：2023年2月15日

編集者

オザン・グンドゥ（ロンドン大学、イギリス
査読者

Ciara Keating, University of Glasgow, United Kingdom（グラスゴー大学、英国
Malcolm Scott Duthie, HDT Biotech Corporation, 米国
Copyright © 2023 Xu, Zhao, Chen, Li, Wu, Zhang, Zhang, Yu and Lian. これは、Creative Commons Attribution License (CC BY) の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権所有者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可するもので、学術的に認められた慣習に従っている。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*通信欄 Kun Yu, ✉ yukun@cau.edu.cn; Zheng-Xing Lian, ✉ lianzhx@cau.edu.cn

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は，あくまでも著者のものであり，必ずしも所属機関のもの，あるいは出版社，編集者，査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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