微生物叢に対するリンパ組織の反応

微生物叢に対するリンパ組織の反応。
Heinz Bauer, m.d.; Richard e. Horowitz, m.d.; Stanley m. levenson, m.d, マウントサイナイ病院病理学教室およびコロンビア大学内科医外科医学校（ニューヨーク）より。
無菌マウスおよび従来のマウスにおけるリンパ節および脾臓の質的および量的形態学的パターンを組織学的、組織化学的、免疫細胞化学的手法により調査した。
特に、無菌マウスと通常マウスで異なり、したがって微生物叢の影響を反映している要素に注意が払われた。環境との関係における生理的反応のこれらの形態学的徴候の定義が、この研究の具体的な目的であった。無菌状態のリンパ節組織と脾臓に関する初期の研究において、GlimstedtIはモルモットでこれらが未発達であることを観察している。
発育不足は微生物叢と密接な関係にある器官で最も顕著であった。宮川、飯島、小林、田島2 は、反応中心がなく、髄質のリンパ球、小胞体細胞および「ピロニン陽性」細胞の数が減少し、わずかに形質細胞が散在していることを見いだした。Sprinzとその仲間たち3は、これらの観察を確認した。
一方、Abrams と Bishop4 は、無菌のモルモットのリンパ節に明瞭な反応中心を認め、その発生は必ずしも微生物叢と関係なく、栄養的な要因を反映している可能性があることを示唆している。Gustafsson5 は、モルモットよりもリンパ組織の少ない無菌ラットに反応中心を見いだせなかった。しかし、Thorbecke6とGordon7は、無菌ラットとニワトリのリンパ節と脾臓に反応中心と少量の形質細胞を観察している。ここで報告する研究は、上記の観察を無菌マウスに拡張し、リンパ節系における2つの主要な要素、すなわち食作用細胞および免疫学的に有能な細胞を調べるのに役立つものである。
特に、微生物叢の存在に起因する形態学的変化について考察している。材料および方法 生後3〜6ヵ月、体重26〜48 gの無菌マウス45匹と従来のSwiss Websterマウス52匹を使用した。マウスは2系統あり、いずれもUniversity of Notre Dame, South Bend, Indianaに由来するものである。無菌マウスと従来のマウスは、Trexlerタイプのプラスチック製アイソレーターで同一の条件下で出生・飼育された。8.9 無菌タンクの操作および微生物学的測定の技術的詳細は、以前に記述されている10'1' 予備調査により、対側のリンパ節が組織学的に類似していることが示されていた。顎下リンパ節と腸間膜リンパ節は、消化管と呼吸器系を流れるすべてのリンパ節の代表であり、腋窩リンパ節と膝窩リンパ節は、他の部位、特に四肢を流れるリンパ節の代表であった。
したがって、以下の代表的な節が研究のために選択された：両方の腋窩下節、腋窩と膝窩の節、および最大の腸間膜節である。動物をエーテルで殺し、顎下リンパ節、腋窩リンパ節、膝窩リンパ節の1個、交互に採取した腸間膜リンパ節および脾臓の半分をヘリー液で固定した。
残りのリンパ節と脾臓の一部は、組織免疫細胞化学のために準備した。各リンパ節のパラフィン切片は、切片の平面が丘陵、髄質および十分な量の皮質を示すと認められるまで顕微鏡的にチェックされた。5uの切片をヘマトキシリン・エオジン、ギムザ、過ヨウ素酸シッフ（PAS）、鉄のゴモリ染色、スダンブラックで染色した。12 免疫細胞化学のためのマウス血清は、Swiss Webster pathogen-free マウス（ワシントン D.C. の Walter Reed Army Institute of Research の獣医学部門の好意により入手）を失血死させることによって入手した。ガンマグロブリン画分を電気泳動で分離し、フロイントアジュバントでセミミクロプレシピチン価が少なくともI :5I2.13 になるまでウサギに注射し、抗血清の特異性は二重寒天拡散法および免疫電気泳動法で決定した15。
抗血清のガンマグロブリン画分を分離し、フルオレセインイソチオシアネートと結合させ、透析とセルロースカラムでの溶出により精製した' 6.17 ゼラチンに埋め込まれたリンパ節と脾臓は、ドライアイスイソペンタンで凍結した18。アセトン固定したクリオスタット切片を蛍光標識ウサギ抗マウスガンマグロブリン血清で処理した。19 免疫学的特異性は、非蛍光標識ウサギ抗マウスガンマグロブリン血清で連続切片を処理し、次に蛍光標識ウサギ抗マウスガンマグロブリン血清で処理し、ランダム切片を蛍光標識ウサギ抗ヒトガンマグロブリン血清で処理して制御した。
リンパ節は、以下の特徴について0から4までの任意の等級に分けられた：辺縁洞と髄質洞のマクロファージ集団、鉄含有マクロファージの数、髄質コードの細胞数、分裂像の数、ラッセル体、好酸球、免疫学的に有能な細胞（プラズマ細胞と前駆細胞）。結果 脾臓およびリンパ節において、基本的に3種類の細胞が評価された。(a) マクロファージ（網状内皮細胞、副鼻腔網状細胞）。細胞質はかさ高く、時に細かくまたは粗く空胞化した好酸性または好酸性で、非糖原性のPAS陽性顆粒、4月、I963 GERMFREE MICE 473顆粒、時に脂肪滴、自家蛍光性のリポフスチンおよび鉄を含んでいる。(b) γグロブリンの存在によって特徴づけられ、Vazquez20の基準に従って形態学的に細分化された免疫学的有能細胞（ICC）；これらは好塩基性細胞質を示し、小さく偏った車軸核と核周囲のハローがあった。通常の顕微鏡によるICCの集計では、Marschalko形質細胞のみがカウントされた。(c) リンパ球（リンパ球-小、中、大）：上記の組織化学的、免疫学的特徴のいずれも含まない、乏しい細胞質によって特徴づけられる。リンパ節の形状、色、硬さは、無菌マウスと従来のマウスで同様であったが、前者ではリンパ節がわずかに小さかった。顕微鏡で見ると、すべてのリンパ節は基本的な構造において類似しており、皮質と髄質に分かれていた（図1および図2）。顎下リンパ節と腸間膜リンパ節は広範な髄洞系を示したが、腋窩と膝窩はそうではなかった（図3、図4）。無菌動物と通常動物のリンパ節では、周辺部には小さなリンパ球が密集した結節があり、その中には反応中心や分裂像が見られた21)。 22 中間帯は、すべての節で皮質組織の主要部分を形成していたが、特に無菌マウスのものでは、一般に細胞数が少なく、小リンパ球が優勢な細胞型であった。無菌マウスおよび従来型マウスの腸間膜リンパ節では、中間帯はしばしば白血球の破壊、特に好酸球と好中球の破壊、それに伴うマクロファージの活性が顕著な部位であった。顎下および腋窩リンパ節では、このような変性細胞はわずかしか見られず、中間帯にはマクロファージもまれにしか見られなかった。すべての結節には、血管周囲の髄質索があり、その種類と数は、結節の解剖学的位置と微生物の状態によって異なっていた。従来型動物の結節は、大小さまざまなリンパ球、好酸球、マクロファージ、形質細胞からなる、より大きく、より細胞性の髄膜索を示した。無菌動物の髄膜索は細く、主に中小のリンパ球から構成されていた（Fig.5）。分裂像は、従来動物の腸間膜リンパ節の髄質索に最も多く認められ、比較対照の無胚葉節ではまれであった。RingertzとAdamson28、およびConwayによって定義された反応中心は、従来の状態で、最も一般的に腸間膜結節に見られた（Fig.ro）。反応中心はすべての無菌マウスに認められ、腋窩リンパ節および膝窩リンパ節にはほとんど認められなかった。24474 BAUER, HOROWITZ, LEVENSON AND POPPER Vol.42, No.4 脾臓の肉眼的および顕微鏡的特徴の違いは、無菌マウスと従来のマウスでは詳細な定量には適さないものであった。マクロファージ 所見は表Iにまとめられている。発生率と活性は、リンパ節の解剖学的位置によってのみ変化し、微生物の状態には関係なかった。中咽頭と腸を流れる顎下リンパ節と腸間膜リンパ節ではマクロファージの数が最も多く（図9）、腋窩リンパ節と膝窩リンパ節ではこれらの細胞の数が少なかった。マクロファージの組織学的および組織化学的特性は、無菌者と従来の被験者とで区別がつかなかった（Fig.8）。TABLE I MACROPHAGES IN LYMPH NODES No.of medullary No.of mice Lymph nodes Mesenteric Submaxillary Axillary Popliteal Germfree Conv.t I8 20 x8 I8 I5 20 I9 14 sinus macrophages * Germfree 2.0 ± 0.2 Conv. 1.9 ± 0.2 p=0.5' 1.8±o.I.8 ＋ 0.2 p=0.99 I.6 O.+O .6 ± 0.2 p>0.99 I.1 + 0.1 I.7 ± 0.2 p =0.I 末端洞マクロファージ数 * Germfree 2.4 0.1 Conv. 2.4 0.1 p>0.99 2.4 ± 0.2 2.8 ± o.I p=0.2 2.3 0.1 2.4 P=°-5 1.5 ± 0.2 1.7 ± O.I P =0.3 tion of the Mean.,（tconv=従来）。確率はχ'分布による。 図は、oから4の尺度で評価した平均頻度と標準偏差を示す。縁辺部および隣接する髄質の洞の内腔には、両群のマウスでほぼ同数のマクロファージが含まれていた。この位置のリンパ球は、すべての解剖学的位置において無菌動物でより多かった。すべてのリンパ節の辺縁と隣接する髄洞には、さまざまな数のマスト細胞があった。それらは腸間膜リンパ節ではまれで、腋窩と顎下領域でより頻繁で、膝窩リンパ節で最も一般的であった。肥満細胞は，その顆粒がいずれの血清とも非特異的に結合するため，蛍光標識した抗マウスまたは抗ヒトγグロブリンで染色するとよく見えた。宿主の微生物的状態は、これらの細胞の数や外観に影響を与えなかった。脾臓には多くの含鉄マクロファージと赤色パルプのヘモシデリンの細胞外凝集体があった。脾臓のマクロファージの数および組織化学的性質には，無菌マウスと従来型マウスとで差はなかった．0.2April, I963 ___ ______ ._ GERMFREE MICE :> 400 U o r >, 0 C's4 _ u la_u_ C. Oq 0 eiHA Hif) 9 9^ 0 . .0 , 6 o Q .Q) Ut 0 P4 0 a0 Z.uCJ E o 00 " a z z H i Q :4 * 0 Cz EC。)。0 6 +1 o 0 u CL) +1 oq 6 V 04 6 +1 +1 oA 6 V oo +1 o +1 o~ 6 11 +1 1 +1 o~ .= Cd E 0 o +f) +o 0 z 1' H O.H OH H 0 V eq0 6 V1 H0p4 6 I1 H A 6 11 H04 Cd . o 44. 6 00 6O if 0n 0 a-) 1 a HI 0 H Ca CC-.). C O eq eq eqm H H1 H U ef)f o eH o H 0 04 0 475 H 0 H o Q 00 u 0% H 00 4O H E Vl >4 S. z Cd 44 0Cd 4)~~~~c476 BAUER, HOROWITZ, LEVENSON AND POPPER Immunologically Competent Cells (ICC) 表Ⅱに所見をまとめた．ICCは無菌群よりも従来型動物のリンパ節でより多く見られた。その差は、口咽頭と腸から排出されるリンパ節の比較で最も顕著であった。
従来の被験者の顎下および腸間膜リンパ節はICCに富み，皮質と髄質の境界，髄質索，肺胞，ときには胚中心にも見られた．無菌マウスでは、ICCはまれであった（Fig.6、7）。VazquezのAおよびB型に相当する20。VazquezのC型に特徴的な、広い細胞質、小さな偏心核、核周囲のハローを持つ蛍光細胞はごく少数で、これらはMarschalk6型の形質細胞に相当する。しかし，従来の染色では，好塩基性細胞の中でMarschalk6型細胞が優勢であった。これは，これらの細胞の一部だけが，実証的なγグロブリンを含んでいることを示している。PAS陽性の形質細胞およびラッセル小体は、最近Welsh25がヒトで報告したものと類似しており、無菌マウスおよび従来のマウスの両方のリンパ節で観察され、部位や微生物の状態によって大きな違いはなかった。脾臓では，ICCはリンパ節と同じタイプで，従来型マウスに多く，赤色果肉全体，特にペニシリン動脈に沿って，時には白色果肉内やその縁，また時には被膜の近くにクラスターを形成していた．無菌マウスの脾臓は同じ場所にガンマグロブリンを含む細胞を示したが、その数は少なかった。通常の染色では、Marschalko形質細胞はすべての脾臓でまれであり、その未熟な前駆体は、赤色パルプに豊富に存在する造血芽細胞と区別することができなかった。PAS陽性形質細胞とラッセル小体は大部分の脾臓に存在した。上記の基準はすべて、両系統のマウスのリンパ節と脾臓の分析に別々に適用された。その結果、系統の差は見られなかったので、まとめて評価し、集計した。動物の年齢と性別も、リンパ組織の特徴に影響を与えることはできなかった。結論 無菌状態と従来の状態におけるリンパ節と脾臓の間の主要な形態学的差異は、免疫学的反応を反映した構造的および細胞学的現象に関連するものであった。これらは、抗原刺激に対する反応がおそらく始まる反応中心、ICCが集まることが知られている髄質索、そしてガンマグロブリンを含む細胞として定義されるかマルシャルコ型プラズマ細胞として定義されるかにかかわらず、ICCの総数にも関係していた2627。反応中心は少なく、活性も低い。髄質の索は、形質細胞が少ないので細胞数が少なく、ICCはまれであった。これらの現象に系統の違いは関係ない。従来のマウスでは、抗原刺激に対する反応の形態的証拠は、脾臓と、微生物汚染の激しい領域、すなわち上部および下部消化管から排出されるリンパ節で最も顕著であった。逆に、これらの部位が微生物の影響を受けていない無菌動物では、ICCの反応はごくわずかであった。しかし、病理学的過程に由来する組織変化生成物が無菌動物に顕著な反応を引き起こす可能性があることは、無菌の自己炎症性慢性病変を有する少人数の無菌マウスにおける最近の観察から示唆されている。29 無菌マウスのリンパ節および脾臓において、通常顕微鏡および蛍光顕微鏡で認識できる免疫学的現象がほとんど見られないことは、無菌のニワトリ、ラットおよびモルモットにおける組織学的所見を裏付けるものであったS.7。30-33 無菌マウスと従来型マウスの免疫学的反応の違いとは対照的に、リンパ節および脾臓全体のマクロファージの発生率、分布および活性は、微生物の状態によって変化することはなかった。これらの網状内皮要素はすべて酸性フォスファターゼで強く染色され、鉄とリポフスチンを貯蔵する能力が同等であることが示された。このことは、マクロファージが従来のマウスと無菌マウスで形態的だけでなく機能的にも類似していることを示し、無菌動物と従来の動物が血液から物質を除去する能力が同等であることを示すin vivoの研究を確認した36'37。Meneghelli38も、ヒトの腸間膜リンパ節に顕著な洞系を見出し、腋窩リンパ節には洞が少ないことを発見した478 BAUER, HOROWITZ, LEVENSON AND POPPER 42巻4号 無菌マウスのリンパ節および脾臓は、したがって、顕著な食作用に従事しながら免疫学的には休止状態のようであった。したがって、貪食は必ずしも物質を抗原化させるものではない。傷害や他の抗原に挑戦していないマウスでは、微生物叢が反応中心形成、形質細胞成熟、ガンマグロブリン産生の主な刺激となっている。要旨 2系統の無菌マウス45匹と従来のSwiss-Websterマウス52匹のリンパ節と脾臓を、組織学的、組織化学的および免疫細胞化学的手法で調べた。リンパ節および脾臓におけるマクロファージの数、分布、組織学的および組織化学的特性は、無菌動物と従来の動物で差がなかった。リンパ節では、マクロファージは排出される部位にのみ関係し、四肢に関係する節よりも中咽頭および腸に関係する節でより顕著であることが判明した。しかし、反応中心や免疫学的に有能な細胞は、通常の顕微鏡検査でマルスカルコ形質細胞として同定されるか、免疫細胞化学でガンマグロブリン含有細胞として同定されるかにかかわらず、無菌動物のリンパ節や脾臓ではまれで、通常のマウスの同等の組織では豊富であった。このことは、微生物叢の存在が、リンパ節と脾臓の貪食機能ではなく、免疫学的機能に影響を及ぼすことを示している。参考文献 i. 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