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リアルタイムPCR（SYBR Green Iまたは59ヌクレアーゼ）とドットブロットハイブリダイゼーション（rDNA標的化オリゴヌクレオチドプローブ）の比較
通信
テストした両方の化学物質は、集団サンプルに存在する総細菌ゲノムの推定数から0?01%のサブ集団を検出し、定量することができました。増幅の線形範囲は、特定の標的ゲノムについては3～5倍の大きさであったが、個々のPCRアッセイにおける増幅の有効性は88.3～104％であった。この結果は、リアルタイムPCRが糞便マイクロフローラの解析に大きな可能性を秘めていることを示唆しています。
導入
培養法で得られる情報には偏りがあるため、GI微生物の生態や影響をよりよく理解するためには、核酸の解析が必要である。利用可能な微生物学的手法は、糞便微生物組成に関する貴重な情報を提供している。しかし、それらは、定量的な変化、特にサブドミナント微生物種またはグループの変化をモニタリングするのに最適ではない。リアルタイムPCRはPCR中の蛍光の変化の連続的なモニタリングに基づいており、従来の終点検出PCRとは対照的に、量子化は増幅の指数関数的な段階で発生します。したがって、PCRテンプレート対産物比（Suzuki & Giovannoni, 1996）でしばしば観察されるバイアスは回避されます。TaqManアッセイは、Taq DNAポリメラーゼの59ヌクレアーゼ活性が、増幅領域内に結合するように設計された二重標識蛍光ハイブリダイゼーションプローブをプライマー伸長中に切断する際に、PCR中に放出される蛍光を測定することに基づいています(Heid et al., 1996)。SYBR Green Iは、蛍光シグナルが特定のプローブから得られるTaqManアッセイのような特異性を欠いています。しかし、SYBR Green Iは、あらゆる増幅反応の蛍光モニタリングに適用することができ、リアルタイムPCRの柔軟性を向上させます。
方法　実験で書くような条件だらだら
DNA濃度はVersafluorometer（Bio-Rad）を用いて測定した。この方法は、二本鎖DNAに結合すると蛍光を発するHoechst 33258色素（ビスベンズイミドH 33258）の強度の量子化に基づくもので、励起波長は360nm、発光波長は460nmである。Hoechst 33258は高感度であるため、濃度測定に必要なDNA量が少なくて済み、20 ngから10 mgの範囲で二本鎖DNAの線形量子化が得られます。
IMAGING SCREEN BIおよびQUANTITY ONEソフトウェア（Bio-Rad）を備えたMulti-Imagerを使用して、ドットを量子化した。
プライマーのスペックは、非標的試験細菌に対して確認した。そうでなければ、原核生物のDNAデータベースに対する配列検索の結果に依存した。PCR産物は電気泳動によりアガロースゲル上で分析した。
SYBR Green I化学については、PCR産物形成に対するポリメラーゼタイプの効果を、標準ポリメラーゼであるDynazyme II（Finnzymes）、およびホットスタートポリメラーゼAmpliTaqGoldDNAPolymerase（AppliedBiosystems）、BlueTaq（Euroclone）、およびFastStart Taq DNA Polymerase（Roche）を用いて試験した。混合DNAサンプル中の標的細菌DNAの量子化 0, 10, 30, 90, 270, 810 ngの標的菌株ゲノムDNAを用いてハイブリダイゼーションを行い，500 ngと1000 ngの糞便DNAに同量の標的DNAを混合したものを用いて，ドットブロットハイブリダイゼーションプローブの特異性と感度を調べた．非標的菌のゲノムDNAのプールされたDNAサンプル（1350 ng）をネガティブコントロールとして使用した。DNAを添加していない糞便DNAサンプル（500および1000 ng）を、糞便中に存在する標的細菌の量子化のために使用した。
結果
16S rDNAプライマーと標的細菌のためのプローブの特性評価
糞便細菌の分析のためのリアルタイムPCRとドットブロットハイブリダイゼーションを比較するために、インターネット上で利用可能な配列データベースや解析ツールを用いて、16S rDNAの検出を目的としたPCRプライマーとハイブリダイゼーションプローブを6つの細菌群または種について設計した。
SYBR Green I ケミストリーについては、正しい増幅産物の形成を検出するためにメルトカーブ分析を使用した。SYBR Green I の感度を向上させるために、市販のホットスタートポリメラーゼを用いて、プライマーダイマーの形成を抑制する能力を試験した。試験したホットスタートポリメラーゼはすべて、プライマー二量体の形成量を減少させましたが（データは示されていません）、BlueTaqはプライマー二量体化反応の発生を効率的に防止することが示されました
考察
多様な細菌種の集団からなる消化管マイクロフローラを研究するためには、細菌の核酸レベルでの直接検出が必要である。1gの糞便中には約1011～1012個の細菌細胞が存在しており、分子レベルでの解析は困難を極めています。本研究では、ドットブロットハイブリダイゼーション法と混合DNAサンプルや糞便中の標的rDNAの検出と量子化のための2つのリアルタイムPCRアプリケーションを開発しました。この目的のために、オリゴヌクレオチドプライマーとプローブは、糞便マイクロフローラの代表的なものや乳業で使用される細菌のために設計されました。16S rDNAクローンライブラリーの塩基配列解析により、これまで知られていなかった微生物種が糞便マイクロフローラに豊富に存在することが明らかになった(Suauetal.1999;Lesseretal.2002)。未培養生物からの配列データの蓄積により、消化管マイクロフローラについての理解は深まってきたが、本研究で使用したプライマーやプローブのように、プライマーやプローブのスペックを正確に決定することは、対象とする生態系の多様性のために事実上不可能であると考えられている。
リアルタイムPCR法は、様々な環境に存在する全細菌(Suzuki et al., 2000; Bach et al., 2002; Nadkarni et al., 2002)や古細菌(Suzuki et al., 2000)の量子化のために、また病原性細菌の高感度かつ正確な検出や量子化のために記述されています(Nogva et al., 2000; Hein et al., 2001; Ge et al., 2001)。我々の知る限りでは、正常な胃腸管マイクロフローラのメンバーを研究するためのリアルタイムPCRアッセイは記載されていませんでした。本研究で使用したリアルタイムPCR法の感度レベルは、純培養または混合DNAサンプル中の標的菌のゲノムサイズに応じて、200～400個の間であった（図4、5）。様々な量（109～105細胞g21）の標的菌を用いて糞便をスパイクした結果（図6a,b）、リアルタイムPCRは実試料の分析に適しており、高感度であることが示された。
ここで使用されたSYBR Green IおよびTaqManアッセイは、両方とも、標的細菌の量子化のための感度の高い特定の方法であることが示された。Heinら（2001）は、SYBR Green Iベースのアッセイでプライマー二量体形成を防ぐためにホットスタート酵素を使用しており、これらのアッセイの感度のその後の改善につながりましたが、同じホットスタートポリメラーゼを使用したTaqManベースのアッセイでは、さらに良い結果が報告されました。ここでは、両方のケミストリーの感度は同じであるが、ホットスタートポリメラーゼをSYBR Green Iアッセイに使用し、費用対効果の高い標準ポリメラーゼをTaqManアッセイに使用していることがわかった。TaqManベースのアッセイでは、これはおそらくホットスタート酵素を使用して達成された結果よりも感度の低い結果をもたらしましたが、得られた感度レベルは、DNAサンプル中の0.01%の亜集団の量子化のための手段を提供し、消化管の生態を研究するのに十分なものと考えられました。集団サンプルからDNAを単離するために使用されるプロセスや、その後のサンプル中に存在する鋳型DNAの濃度測定によって結果に不正確さがもたらされる可能性があることを考慮すると、in vitroのDNA混合物または標的細胞を添加した糞便サンプル中に存在する標的ゲノムの量子化におけるリアルタイムPCRの観察された精度レベルは満足のいくものでした。
図4、5、6）。ゲノムサイズおよびrRNA遺伝子コピー数もまた、異なる標的細菌の増幅に寄与する可能性がある。
rDNAを標的としたドットブロットハイブリダイゼーションと比較すると、リアルタイムPCRは優れた感度を持ち、また、選択された細菌集団の量子化のためのより便利で安価な方法であることが証明された。標準的な非ホットスタートポリメラーゼを使用したTaqManケミストリーを使用して、妥当なレベルの感度がここで得られましたが、SYBR Green Iベースのアッセイによる任意の二本鎖DNA分子の非選択的検出も有用であると考えられる。