論文：COVIDワクチン接種はスパイクタンパク質のエクソソーム放出を誘導する
BNT162b2（Pfizer-BioNTech）ワクチン接種により、COVIDスパイクタンパク質を持つ循環型エクソソームが抗体産生前に誘導される。mRNAワクチンによる新たな免疫活性化メカニズム
キーポイント
BNT162b2は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つエクソソームの放出を誘導する。
SARS-CoV-2に対するAbsは、循環エクソソームが検出された後に発現する。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含むエクソソームは、マウスで免疫原性を示す。
概要
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）は、重症急性呼吸器症候群を引き起こす。 SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を標的としたmRNAワクチンにより、Absと防御免疫の発現が確認された。そのメカニズムを明らかにするために、健常者のワクチン接種後のSARS-CoV-2スパイクタンパク質とAbsの循環エクソソームへの誘導の動態を解析した。その結果、ワクチン接種後14日目にspike proteinを発現する循環エクソソームが誘導され、2回目の接種から14日後にAbsが誘導されることが示された。また，SARS-CoV-2スパイク蛋白を含むエクソソーム，SARS-CoV-2スパイクに対するAbs，IFN-γやTNF-αを分泌するT細胞はブースター投与後に増加した．エキソソームの透過型電子顕微鏡観察では、エキソソーム表面にスパイクタンパク質のAgが確認された。スパイクタンパク質とAbsを持つエクソソームは、4カ月後に並行して減少した。これらの結果は、mRNAベースのワクチン接種後の効果的な免疫のために、スパイクタンパク質を有する循環エクソソームの重要な役割を実証している。このことは、スパイクタンパク質を有するエクソソームを免疫したマウスにおいて、体液性および細胞性の免疫応答が誘導されることによっても証明された。
＊＊＊＊＊＊序章および材料と方法 の項目は省略しました。＊＊＊＊
結果および考察
エクソソームの分離
本研究で使用した粒子の平均サイズは200nm未満であり、国際細胞外小胞学会が記載するエクソソームサイズと一致した。エクソソームの代表的な画像を（図1A）に示す。個人差によるエクソソームの数に有意な差は見られなかった。
図1.
(A) ワクチン接種者由来のエクソソームの代表的なNanoSight画像と平均サイズおよび中央値（グラフ中の黒い細線は同一サンプルの3回の測定値、赤線は3回の平均値）。(B）コントロールとワクチン接種者のエクソソーム上のSARS-CoV-2スパイクAgの透過型電子顕微鏡像。矢印はSARS-CoV-2スパイク陽性のエクソソームを示す。右側、3枚目はワクチン接種者由来の陽性エクソソームの拡大画像（原倍率×50,000）。陰性コントロールとして抗コロナウイルスFIPV3-70 Abを両サンプルに使用した。
透過型電子顕微鏡により、ワクチン接種者由来の単離エクソソームにおけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質の表面発現を証明した
SARS-CoV-2スパイクに特異的なAbsを用いて透過型電子顕微鏡観察を行い、コントロールと健常者ワクチン接種者のエキソソームの表面にSARS-CoV-2 Agが存在することを証明した。ワクチン接種者由来のエクソソームは、SARS-CoV-2 Agに対して陽性である（図1B）。また、陰性対照としてコロナウイルスFIPV3-70 Abで両方のエクソソームを染色したが、エクソソームには陽性反応は観察されなかった（図1B）。
ワクチン接種者におけるSARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsの発現速度
SARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsは，ワクチン2回目接種14日目以降に健常者全員に検出され（平均濃度，2401.25 ± 773.45 ng/ml），ワクチン非接種およびワクチン初回接種14日目に比べてp値＜0.0001であった．ワクチン接種4カ月後のAb濃度は1107.38±681.63ng/mlに減少していた．この減少は、ワクチン2回目接種後14日目に発現したAbsと比較して有意に低い（p＝0.0313）（図2A）
図2.
(A）ワクチン初回接種後0日目、7日目、14日目（14-1）、ワクチン2回目接種後14日目（14-2）、ワクチン2回目接種後4ヶ月目におけるワクチン接種を受けた健常者におけるSARS-CoV-2スパイクAbのレベル。(B）ワクチン2回目投与後0日目、7日目、14-1日目、14-2日目、4ヶ月目のエクソソーム蛋白質SARS-CoV-2スパイク蛋白質S2のウェスタンブロッティング。(C) ウェスタンブロットのデンシトメトリーと統計解析。(D）ワクチン接種後14-1日目、14-2日目、および2回目のワクチン接種後4ヶ月における、ワクチン接種を受けた健常者のSARS-CoV-2スパイクAbのレベルの前後線図（E）ワクチン接種後14-1日目、14-2日目、および2回目のワクチン接種後4ヶ月におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するウェスタンブロットの濃度測定の前後線図（F）ワクチン接種後4ヶ月における、ワクチン接種を受けた健常者のSARS-CoV-2スパイクタンパク質の濃縮度の前後線図。(F）健常者におけるワクチン2回目投与後14日以内のエクソソーム中のSARS-CoV-2スパイクタンパク質S2のウェスタンブロットである。(G) ウェスタンブロットのデンシトメトリーと統計解析。(H）ワクチン2回目投与後14日目のワクチン接種された健常者におけるSARS-CoV-2スパイクAbのレベル。(I）SARS-CoV-2スパイクタンパク質に反応するサイトカイン発現（TNF-αおよびIFN-γ）についてのELISPOT。全てのグラフは、平均値およびSD（縦棒線）を有する散布点プロットとして表される。CD9は、すべてのブロットを正規化するために使用される。ウェスタンブロットとAbの開発実験は、独立して少なくとも3回行った。
ワクチン接種者から分離した循環エクソソームには、SARS-CoV-2スパイクタンパク質Ag S2が含まれていた。
ワクチン初回投与後0、7、14日目と2回目投与後14日目の健常者の血漿を分析し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つエクソソームの存在を確認した（図2B、2C）。その結果、投与1回目の14日目にSARS-CoV-2スパイクAg S2がエクソソーム上に存在することが確認された。投与2日目の14日目にスパイクタンパク質の濃度が有意に増加し、p値は0.0299であった。両ワクチン投与4mo後のエクソソーム中のSARS-CoV-2スパイクタンパク質の量は、2回目投与後14日目と比較して有意に減少しており、p値は0.0078であった。各健常者の異なる時点（1回目と2回目の投与後14日目、2回目の投与後4ヶ月目）におけるスパイクタンパク質とスパイクタンパク質を含むエクソソームに対するAb発現のキネティクスを（図2D）に示している。Ab発現の動態とSARS-CoV-2スパイクタンパクエキソソームの量は、ともに14日目の2回目のブースター投与後に増加しており、互いに一致している（Fig. 2E）。2回目のブースター投与14日目から4ヶ月目にかけて、各健常者のSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するAbレベルおよびエクソソーム中のSARS-CoV-2スパイクタンパク質の量の減少が見られる（図2D、図2E）。このサブセットに関する各個人のデータは、補足図1および補足図2として示されている。
健康なワクチン接種者から分離した循環エクソソームにはSARS-CoV-2スパイクタンパク質Ag S2が含まれていた
2回目のワクチン接種後14日目の健常者のエクソソームを解析した。その結果、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含むエクソソームの濃度が有意に上昇することが示された（図2F、図2G）。また、SARS-CoV-2スパイク蛋白質に対するAbsの濃度も、健常者と比較して有意に増加していた（図2H）。
健康なワクチン接種者のサイトカインIFN-γとTNF-αのレベルは、コントロールと比較して高い
健康なワクチン接種者のSARS-CoV-2スパイクタンパク質Agに対するT細胞応答をELISPOTで解析した。サイトカインIFN-γおよびTNF-α産生細胞は、SARS-CoV-2スパイクAgに応答して、健常対照者と比較してワクチン接種した健常者で有意に高かった（p = 0.0078） (Fig. 2I)．ヌクレオカプシドAgに反応して、いずれかのサイトカインを産生するT細胞は増加しなかった。
スパイクタンパク質を接種した個体のエキソソームをマウスに免疫すると、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するAbsがより高いレベルで誘導された。
C57BL/6マウスに、完全なワクチン接種を受けた個体および対照から分離したエキソソームを免疫した。しかし、完全なワクチン接種を受けた個体からのエクソソームで免疫したマウスは、15日目にコントロールよりも有意に高いSARS-CoV-2スパイクAgに対するAbs（181.49 ± 37.02 対 64.44 ± 1.7; p < 0.0449） 21日目に（352.82 ± 128.82 対 20.84 ± 2.24; p < 0.0001） そして30日目に（372.34 ± 56.08 対 25.17 ± 1.08 p < 0.0001) 発達していた（図 3A ）。SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫したC57BL/6動物も、SARS-CoV-2スパイクAbのレベルの増加を示している(図3A)。
図3.
(A）15日目、21日目および30日目に対照者およびワクチン接種された個体からのエキソソームでマウスを免疫化した後の血清SARS-CoV-2スパイクのELISA法。(B）30日目にコントロール及びワクチン接種された個体からのエキソソームでマウスを免疫した後のSARS-CoV-2スパイクAgに応答する脾臓細胞におけるサイトカイン発現（IL-10、IL-17、TNF-α及びIFN-γ）に対するELISPOTである。グラフは、平均値とSD（縦棒線）で棒グラフで表した。マウス実験は独立して少なくとも3回行い、各群にn＝3またはn＝5の動物が存在した。
ワクチン接種者のエクソソームで免疫したマウスの脾臓リンパ球でサイトカイン（IFN-γ、TNF-α）のレベルが高いこと。
ワクチン接種者のエクソソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球は、対照と比較してサイトカイン分泌細胞数の増加を示した。IFN-γ (853.77 ± 517.84 vs 340.36 ± 38.78) およびTNF-α (568.25 ± 327.72 vs 102.14 ± 19.06) spots per millionを示したが、その差は統計的に有意でなかった。同様の結果は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を免疫したマウスでも観察された（図3B）。SARS-CoV-2スパイクタンパク質を免疫したマウスのグループでも、IFN-γおよびTNF-αのレベルの増加が見られた（図3B）。今回の研究では、Pfizer-BioNTech社が開発したmRNAベースのワクチンを個体に投与した。その結果、SARS-CoV-2に対するスパイクタンパク質を持つエクソソームが、ワクチン初回投与後14日までに誘導され、その後ブースター免疫の14日目までにスパイクタンパク質特異的Ab反応が発現することが明確に示された。ワクチン接種4カ月後、血漿中のAb濃度は減少した。この傾向は、スパイクタンパク質を含む循環エクソソームでも観察された。これらの結果は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つ循環エクソソームの誘導が、mRNAベースのワクチン投与の結果として有効な免疫のために潜在的に必須であるという結論を支持するものである。我々は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つこれらのエクソソームがAPCに取り込まれ、免疫活性化をもたらすと仮定している。呼吸器系ウイルス感染症におけるエクソソームの免疫原性の可能性は、既に我々や他の研究者によって報告されている(11-13)。
私たちも、ワクチン接種者から分離したスパイクタンパク質を持つ循環エクソソームをC57BL/6動物に免疫し、このエクソソームが免疫原性を持つことを証明した。免疫後、これらの動物は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するAbsとSARS-CoV-2スパイクタンパク質に特異的な細胞性免疫反応の両方を発現した。私たちの以前の研究により、肺の自己抗原を持つヒトエキソソームをマウスに免疫すると、肺の自己抗原に対するAbsが生じることが証明された。これは、ヒトエキソソームがマウスのAPCに結合し、マウスの免疫反応を引き起こした後に生じたものである。したがって、マウスを免疫した後に免疫反応が発現するメカニズムには、エキソソームとマウスAPCが結合し、スパイクタンパク質に対する体液性および細胞性の免疫反応が発現することが必要であることが示唆された。また、このような免疫戦略により、抗原刺激後にIFN-γやTNF-αを分泌する脾臓リンパ球の頻度が増加することも興味あることである。これらのマウスモデルでの結果に基づき、健康な個体へのmRNAベースのワクチン接種は、Ab反応だけでなく、細胞性免疫ももたらすと推測される。結論として、SARS-CoV-2に対するスパイクタンパク質を持つエクソソームが初回接種後14日目に誘導され検出可能であり、ブースター投与後の後期にはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に特異的なAbsが検出可能であった。健常者へのmRNAベースのワクチン接種後，SARS-CoV-2スパイクタンパク質Agが循環エクソソームに誘導されることが効果的な免疫に必要であることが示唆された．また，ワクチン接種者のエクソソームには免疫原性があり，SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するAbsおよびスパイクタンパク質Agに対するT細胞応答を誘導することが示され，SARS-CoV-2スパイクタンパク質Agを含むmRNAベースのワクチン接種によるエクソソームが，液性免疫のみならず細胞性免疫応答も誘導することが示唆された．