Vero細胞適応株は、フリンを介した効率的なスパイク切断によりウイルス増殖の増加を示す(2024年2月)
Vero cell-adapted SARS-CoV-2 strain shows increased viral growth through furin-mediated efficient spike cleavage
Vero細胞に適応した SARS-CoV-2 株は、フリンを介した効率的なスパイク切断によりウイルス増殖の増加を示す
ABSTRACT
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、いくつかの宿主プロテアーゼを利用してスパイク (S) タンパク質を切断し、宿主細胞に侵入します。 SARS-CoV-2 S タンパク質は、SARS-CoV-2 の病原性に密接に関与するフリンによって S1 サブユニットと S2 サブユニットに切断されます。
しかし、S タンパク質の変異によるプロテアーゼ切断活性の調節がウイルスの複製や病因に及ぼす影響は依然として不明です。
ここで我々は、2つのSARS-CoV-2株をVero細胞で連続継代し、細胞に適応したSARS-CoV-2株をin vitroおよびin vivoで特徴付けました。
適応株は、野生型株と比較して、高いウイルス増殖、Sタンパク質の効果的なS1/S2切断、および低い病原性を示しました。
さらに、環状ポリメラーゼ伸長反応によって生成された組換えSARS-CoV-2株を使用したΔ68-76変異とH655Y変異の組み合わせによって、ウイルスの増殖とS1/S2切断が増強されました。
適応株の変異を含む組換え SARS-CoV-2 株は、フリン阻害剤に対する感受性の増加を示しました。 これは、適応したSARS-CoV-2株が野生型株よりも効果的にフリンを利用していることを示唆しています。
病原性は、効果的に切断された組換えSARS-CoV-2株の感染により減弱されました。 これは、S タンパク質の過剰な切断により毒性が低下することを示唆しています。
IMPORTANCE
S タンパク質切断の有効性は一般に SARS-CoV-2 変異体間で異なり、その結果、異なるウイルス特性が生じます。
変異とSARS-CoV-2の宿主細胞への侵入との関係は依然として不明です。
この研究では、高増殖性のベロ細胞に適応した SARS-CoV-2 の配列と、適応したウイルスの増殖の促進を決定する因子を分析しました。 そして、組換えSARS-CoV-2株を分析することで適応株の特徴を確認しました。
我々は、ウイルスの増殖とフリンによるSタンパク質の切断を促進する変異Δ68-76およびH655Yの同定に成功しました。
組換えウイルスを使用することで、生体内でのウイルス攻撃実験を行うことができました。
変異Δ68-76、H655Y、P812L、Q853Lが導入されたSARS-CoV-2の病原性はハムスターでは弱毒化されました。 これは、過剰に切断された SARS-CoV-2 が弱毒化される可能性を示しています。
これらの発見は、SARS-CoV-2株の感染力と病因に関する新たな洞察を提供し、ウイルス学の分野に大きく貢献します。
INTRODUCTION
2019年に中国で初めて検出された重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、重症急性呼吸器症候群やその他の症状を伴うコロナウイルス感染症2019（COVID-19）を引き起こし、世界的なパンデミックとなっている。
ウイルスは頻繁に変異し、そのウイルス学的特徴を変化させます。
したがって、このパンデミックを克服するには、ウイルス複製とワクチン開発の基礎となるメカニズムに関するさらなる研究が不可欠です。
ウイルスエンベロープの外側領域に位置するスパイク (S) タンパク質は、ウイルスの宿主細胞への侵入を仲介する際に重要な役割を果たします。
S タンパク質は抗原性の高い三量性タンパク質であり、最近の流行の際に頻繁に変異を起こしています。
S タンパク質は、SARS-CoV-2 の受容体であるアンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) に結合し、ウイルスの宿主細胞への侵入に不可欠な宿主プロテアーゼによって切断されます。
この過程で、S タンパク質は 2 つのドメイン、つまり S1 と S2 に分割されます。
S1 ドメインには、N 末端ドメイン (NTD) と受容体結合ドメイン (RBD) が含まれています。 一方、S2 には融合ペプチド (FP) と他のいくつかの機能タンパク質ドメインが含まれており、さらに宿主プロテアーゼによって S2' に切断されます。 FP をウイルス粒子の表面に露出させ、膜融合を促進します。全体として、RBD は受容体 ACE2 に結合し、S タンパク質はいくつかの宿主プロテアーゼによってプロセシングされ、膜融合を媒介します。
ウイルスゲノムは膜融合時に細胞質に放出され、その後ウイルスが複製されます。
S タンパク質の切断は、主に 3 つの宿主プロテアーゼによって媒介されます。
まず、膜貫通プロテアーゼ セリン 2 (TMPRSS2) が細胞膜に局在し、ウイルスの宿主細胞への侵入を促進します。
第二に、エンドソームに局在するカテプシン-L (CTSL) は、低 pH 条件下で S タンパク質を切断し、エンドサイトーシス中のウイルスの侵入を媒介します。
TMPRSS2 と CTSL は、S1/S2 および S2' 接合部の両方の切断部位にアプローチし、S タンパク質を切断します。
ウイルスエンベロープの融合は、存在する宿主プロテアーゼに応じて、細胞表面またはエンドソーム膜のいずれかで細胞膜と行われます。
例えば、TMPRSS2 の存在下では融合が細胞表面で起こりますが、細胞表面にプロテアーゼが存在しない場合、ウイルスは内部移行し、細胞内 CTSL を使用してその融合を活性化します。
第三に、フリンは主に小胞体-ゴルジネットワークに局在し、S1/S2切断部位で切断します。
SARS-CoV-2 は、フリンによって処理される複数の塩基性 S1/S2 切断部位を有しており、ウイルスの感染力を大幅に高めますが、感染や細胞間融合には必須ではありません。
たとえその部位が頻繁に変異していても、フリンによる切断部位は機能的に保存されており、これはフリン切断部位の重要性を示しています。
フリン切断部位を持たない組換え SARS-CoV-2 ウイルスは、生体内で毒性が弱まり感染が減少しました。 これは、ウイルス感染におけるこの切断の重要性を示しています。
S タンパク質の RBD における変異は、S タンパク質と ACE2 の間の親和性を調節することによりウイルスの感染力に影響を与えます。
同様に、NTD の変異は、S タンパク質の切断を調節することによって感染力に影響を与えます。
最近の報告では、Alpha 株 (B.1.1.7 系統) における NTD の 69-70 (Δ69-70) の欠失により、S タンパク質のフリン依存性 S1/S2 切断が増加することが示されました。
しかし、組換えSARS-CoV-2を用いた解析はまだ行われていないため、Δ69-70変異の詳細な役割は不明のままです。
Δ69-70 変異が現在最も関連性の高い変異体である Omicron 株 (B.1.1.529 系統) のいくつかの亜系統でも保存されていることを考慮すると、この欠失の機能はまだ十分に解析されていません。
さらに、NTD を標的とするいくつかの抗体は、S タンパク質の立体構造を変化させ、RBD を「アップ」状態に保つことで SARS-CoV-2 感染を増強することが示されています。
したがって、NTD は、タンパク質の受容体結合と構造変化を調節する可能性があります。
細胞株における SARS-CoV-2 の連続継代による S タンパク質に関するいくつかの研究が行われています。 これは、継代されたウイルスがおそらくウイルス複製に関与する変異を獲得するため、ウイルス複製機構を分析するための一般的なアプローチです。
SARS-CoV-2 はVero細胞内でよく増殖するため、Vero細胞における SARS-CoV-2 の適応に関する研究が報告されています； 実際、SARS-CoV-2のVeroE6細胞への適応により、多塩基性フューリン切断部位（R685）周囲のアミノ酸欠失が誘導され、Sタンパク質がフューリンによって切断不可能になります。
同様の研究では、Vero細胞におけるSARS-CoV-2のSタンパク質による組換え水疱性口内炎ウイルス（VSV）の適応が報告されています。
適合させた組換えVSVは、Sタンパク質にH655Y変異を獲得します。
H655Y は、S タンパク質の切断を増加させ、フリンによる細胞間融合活性を増加させ、生体内でのウイルス感染を促進し、CTSL 使用への依存性を高めます。
H655Y 変異の分析は行われていますが、これらの研究では組換え SARS-CoV-2 は使用されていません； したがって、本物のウイルスにおける点変異した S タンパク質の機能は不明のままです。
さらに、組換え SARS-CoV-2 および動物モデルを使用した研究は限られているため、病原性に対する点変異の影響は完全には理解されていません。
この研究では、in vitro でのウイルス増殖の増加、S1/S2 切断の強化、in vivo での毒性の低下を示すVero細胞適応型 SARS-CoV-2 株を樹立しました。
適応された株には、Δ68-76 と H655Y という 2 つの興味深い変異があります。
今回我々は、組換えSARS-CoV-2とハムスターモデルを用いて、ウイルス学的特徴と病原性の観点からこれらの変異の機能を明らかにしました。
RESULTS
Virological characterization of Vero cell-adapted SARS-CoV-2 strains
Vero 細胞に適応した SARS-CoV-2 株のウイルス学的特徴付け
私たちは、2つの株の連続継代を通じてVero細胞に適応したSARS-CoV-2を生成しました。 SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020 (Kng 株; LC528232) および 2020/BIKEN/B-1 (B-1 株; LC603286)で、 それぞれ系統 B および B.1.1 に属します。
どちらも懸念される変異株（VOC）が出現する前に分離されたプロトタイプ株です。
これら 2 つの株は、S タンパク質の D614G 変異が異なります。つまり、Kng 株の 614 番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるのに対し、B-1 変異体のアミノ酸はグリシンです。
SARS-CoV-2株に感染したVero細胞の培地を新鮮なVero細胞に接種しました。
ウイルス継代を 30 回繰り返し、継代およびクローン化された Kng および B-1 株をそれぞれ Kng P30 および B-1 P30 と命名しました。
生成されたVero細胞に適応したSARS-CoV-2株は、親株が示すものよりもVero細胞において有意に増加した増殖を示しました（図1A）。
適応株のゲノム配列は、次世代シーケンスを使用して分析されました。
Kng P30 株と B-1 P30 株では、それぞれ 12 個と 4 個の非同義変異が検出されました。
Kng P30 と Kng P0 (親株) を比較すると、次の変異が検出されました。nsp3；A54T、 nsp4；N4D および V212L、 nsp10；A32V、nsp12；K417G および K478R、S タンパク質；Δ68-76、V622F、H655Y、S735L、および F1089L、 Nタンパク質；R191L。
B-1 P30 と B-1 P0 を比較すると、Δ68-76、H655Y、P812L、および Q853L 変異が S タンパク質で検出されました (表 1、図 1B)。
興味深いことに、初期継代で導入された Kng P30 株と B-1 P30 株の間の S タンパク質に 2 つの共通の変異、Δ68-76 および H655Y が観察されました (表 1)。
クライオ EM の結果を参照すると、S1 サブユニットに位置する Δ68-76 および H655Y 変異は両方とも S タンパク質の表面にありました (図 1C)。
H655Y はフリン切断部位 (R685) に近いですが、Δ68-76 変異はそうではありません (図 1C)。
変異は互いに近接していないため、これらの変異間の直接の相互作用は考えられません。
Δ68-76 変異は自然に循環している株ではほとんど検出されませんでしたが、同様の欠失Δ69-70 が Omicron 変異株を含むさまざまな SARS-CoV-2 株で検出されました。
H655Y 変異は Omicron 変異体でも検出されています。
以前の報告では、Δ69-70 および H655Y 変異が S タンパク質の S1/S2 切断の亢進に関連していることが示唆されています。
したがって、これらの変異が S タンパク質切断に影響を与えるかどうかを調べるために、Kng P30 および B-1 P30 に感染した細胞からの溶解物を抗 S1 抗体を用いたイムノブロッティングに供しました。
予想通り、全長および切断されたSタンパク質のレベルから確認されるように、適応株では野生型株よりもS1/S2部位でのSタンパク質の切断の増加が示されました（図1DおよびE）。
ウイルス増殖の増強における変異の役割をさらに決定するために、S タンパク質で覆われた VSV ベースの偽型ウイルスを使用して、変異 S タンパク質の感染力を評価しました。
Δ68-76 変異はウイルス感染力を低下させましたが、H655Y 変異はウイルス感染力の増強を示しました（図 1F）。
Δ68-76 と H655Y の組み合わせは感染力を大幅に増強し、2 つの変異が相乗的に機能することを示しています (図 1F)。
P812L および Q853L 変異は、Δ68-76 および H655Y 変異によって誘発される感染力の増強には影響を及ぼさない可能性があります (図 1F)。
Pathogenicity of Vero cell-adapted SARS-CoV-2 strains
Vero 細胞に適応した SARS-CoV-2 株の病原性
ここでは、特に明記しない限り、その後の分析には B-1 株を使用しました。 流行しているほぼすべての SARS-CoV-2 株には D614G 変異があるため、 B-1 株はハムスターにおいて Kng 株よりも比較的毒性が強く (データは示されていません)、B-1 P30 は S タンパク質の 4 点のみで変異していました。
Vero細胞に適応した SARS-CoV-2 は、インビトロではよく増殖し、S タンパク質の切断を促進しますが、インビボでの病原性は不明のままです。
Sタンパク質の変異の病原性を明らかにするために、Vero細胞適応SARS-CoV-2（B-1 P30）をハムスターに鼻腔内接種し、その進行を観察しました。
B-1 P0 株に感染すると、B-1 P30 株に感染したハムスターの体重と比較して、感染したハムスターの体重が減少しました（図 2A）。
さらに、B-1 P30 群の肺重量/体重の比 (肺炎症指標) は、B-1 P0 群のそれよりも有意に低かった (図 2B)。
組織病理学的分析では、B-1 P0 感染肺よりも B-1 P30 感染肺で観察された炎症がより軽度であることも裏付けられましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした (図 2C および D)。
体重減少と肺炎症の観点から評価すると、B-1 P0 は B-1 P30 よりも比較的毒性が強かった； それでも、肺内のウイルス力価には有意差はありませんでした（図2E）。
これらのデータを総合すると、ハムスターモデルでは、少なくとも体重減少と肺炎症に関して、B-1 P30 の病原性が弱められていることを意味します。
Growth of recombinant SARS-CoV-2 strains bearing single or multiple mutations in their S proteins
S タンパク質に単一または複数の変異を持つ組換え SARS-CoV-2 株の増殖
われわれは、ウイルス増殖の亢進と病原性の減弱に関与するアミノ酸残基を同定し変異のウイルス学的特徴を調べるために、環状ポリメラーゼ伸長反応（CPER）によって単一または複数の点で変異した組換えSARS-CoV-2株を生成しました。
Δ68-76 および H655Y 変異を持つ組換えウイルスは、野生型株に比べて増殖レベルが大幅に増加していることが明らかになりました (図 3A)。
B-1 P30 と同じ追加の変異 P812L および Q853L を保有するウイルスもまた、顕著なレベルの増殖を示し、Δ68-76 および H655Y 変異のみを持つウイルスよりも早く増殖のピークに達するようでした (図 3A)。
単一点変異 (Δ68-76 または H655Y) を持つウイルスは、ウイルス増殖の有意な増加を示さなかった (図 3A)。
これらの結果は、S タンパク質の 2 つの変異 Δ68-76 および H655Y がウイルス増殖の促進に関連していることを示唆しています。
Degree of cleavage of the S proteins in strains bearing the combination of the Δ68-76 and H655Y mutations
Δ68-76 変異と H655Y 変異の組み合わせを有する株における S タンパク質の切断の程度
B-1 株に基づく組換えウイルスの S タンパク質の切断パターンをウェスタンブロッティングを使用して視覚化し、S タンパク質の切断に関与するアミノ酸残基を決定しました。
Sタンパク質の切断は、Δ68-76およびH655Y変異を有するウイルスに感染した細胞、およびΔ68-76またはH655Y変異のいずれかを単独で有するウイルスに感染した細胞において増強された（図3B）。
これらの結果は、偽型ウイルスを使用した報告とも一致します。
Δ68-76 と H655Y の組み合わせにより、切断が著しく強化されました。
S タンパク質切断の強化はウイルス増殖の強化と密接に関連していることが示唆されています。
Kng 株ベースの組換えウイルスを使用して、切断の強化も分析されました。抗 S2 抗体を使用して、どの部位 (S1/S2 または S2'、または両方) が切断されたかを決定しました。
その結果、Δ68-76およびH655Y変異がKng株におけるSタンパク質の効率的な切断に寄与していることが確認されました（図S1A）。
ただし、S2' サイトは検出されないままでした。 これは、S1/S2部位でのSタンパク質切断の強化を示しています（図S1B）。
次に、Vero 細胞適応 SARS-CoV-2 を他の野生型株と比較しました。
これまでに、大量の SARS-CoV-2 ゲノム データが GISAIDに寄託されてきました。
H655Y 変異の有無にかかわらず、さまざまなタイプの NTD 部分欠失 (すなわち、Δ69 ～ 70、Δ69 ～ 76、Δ66 ～ 76、および Δ64 ～ 76) を有する SARS-CoV-2 株が現在流行していることが報告されています。 このうち、H655Yを伴うΔ69-70 変異が最も一般的です。
ただし、Δ68-76 変異と H655Y 変異の組み合わせは、天然株ではまだ報告されていません。
NTD の部分欠失と H655Y の間の相互作用のウイルス学的役割を調査するために、CPER 法を使用して NTD (および H655Y) のさまざまな部分欠失を有する組換え SARS-CoV-2 を生成しました。
Δ68-76 変異を持つ S タンパク質は、組換え NTD 部分欠失 SARS-CoV-2 株の中で最も効果的に切断されました (図 3C)。
NTD の部分欠失の影響を、H655Y 変異の存在下で分析しました。
H655Y 変異は、部分的な NTD 欠失が同時に導入された場合に S タンパク質の切断を増加させました (図 3C および D)。
特に、Omicron 変異体で一般的に検出されるように、S タンパク質切断の増強は、Δ69 ～ 70 および H655Y 変異を有する株よりも、Δ68 ～ 76 および H655Y 変異を有する株の方がより効果的でした。
Dependence of the recombinant SARS-CoV-2 strains on host proteases in infecting Vero cells
感染したVero細胞における宿主プロテアーゼに対する組換え SARS-CoV-2 株の依存性
切断の促進に関与する宿主プロテアーゼを決定するために、プロテアーゼ阻害剤を使用した阻害アッセイを実施しました。
まず、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) を使用して、Vero 細胞内の宿主プロテアーゼの mRNA レベルを測定しました。CTSLは、HEK293-3P6C33およびA549細胞よりもVero細胞における発現レベルが高いことを明らかにしたが、フリンおよびTMPRSS2はVero細胞において低レベルで発現しました(図4A)。
デカノイル-Arg-Val-Lys-Arg-クロロメチルケトン (デカノイル-RVKR-CMK、フリン阻害剤)、E64d (CTSL 阻害剤)、またはナファモスタット (TMPRSS2 阻害剤) で処理した Vero 細胞を、組換えSARS-CoV-2株に対する感受性をテストするためにウイルスを感染させました。
通常、すべてのウイルスは E64d によって阻害され、ナファモスタットによって阻害されませんでした。
E64dとΔ68-76/H655Y/P812L/Q853Lを有するウイルスとの組み合わせを除いて、野生型株とSタンパク質変異を有する組換えウイルスとの間に有意差はなかった（図4BおよびC）。
しかし、何らかの変異を有する組換えウイルスは、野生型ウイルスよりもデカノイル-RVKR-CMKに対して比較的感受性が高かった。
これらの結果は、適応SARS-CoV-2のVero細胞への侵入の強化が主にSタンパク質のフリン依存性切断に関連していることを示しています。
フリンによって処理された S タンパク質の切断が、ウイルスの増殖促進の原因である可能性が最も高くなります。
私たちは、多塩基性領域「TNSPRRA」のアミノ酸配列を「SLL」に変換することにより、フリン切断部位（ΔCS）を消失させたB-1ベースの組換えSARS-CoV-2株（フリンの利用とウイルス増殖の関係を確認するための SARS-CoV 株の配列）を作製しました。
Δ68-76 および H655Y 変異によるウイルス増殖の増強は、追加の挿入変異 ΔCS によって失われ、フリンによる S タンパク質の切断がウイルス増殖の増強の原因であることが実証されました (図 4D)。
組換えSARS-CoV-2株のS1/S2部位における切断強化の消失は、ウエスタンブロッティングによって確認されました（図S2）。
まとめると、組換えウイルス株の結果は、Δ68-76 および H655Y がフリン依存的に S タンパク質を切断することによりウイルスの増殖を増加させることを示しました。
これらのデータは、フリンを介した S タンパク質の切断がVero細胞におけるウイルスの増殖と正の相関があることを示唆しています。
Pathogenicity of recombinant SARS-CoV-2 strains
組換え SARS-CoV-2 株の病原性
本研究により、Δ68-76 および H655Y 変異が in vitro での Kng P30 株および B-1 P30 株の切断促進に関与していることが明らかになりました。
しかし、これらの変異が病原性に及ぼす影響は依然として不明です。
さらに、B-1 P30 の弱毒化を引き起こす変異は依然として不明です。
ハムスターに組換えSARS-CoV-2を鼻腔内接種しました。 続いて体重と肺の状態を検査して、B-1 P30 の病原性を弱める原因となるアミノ酸を特定します。
野生型株のSタンパク質を含む組換えSARS-CoV-2は、野生型株と比較して体重にわずかな影響を与えるだけでした（図2Aおよび5A）。
以前の研究では、親ウイルスと比較して組換えウイルスの病原性と複製が弱毒化されていることが報告されており、これは我々の発見と一致しています。
逆遺伝的システムによって生成された組換えウイルスは、高度にクローン化されたウイルス集団により軽度の病原性を示す可能性があります。
B-1 P30 株の S タンパク質 (Δ68–76、H655Y、P812L、および Q853L) および二重変異 (Δ68–76 および H655Y) を含む組換え SARS-CoV-2は、 感染後 5 日 (dpi) での体重減少は、野生型ウイルスによる体重減少よりも軽度でした。
他の単一点変異組換えSARS-CoV-2株には有意な差異は示されませんでした（図5A）。
肺の炎症は、野生型グループよりも組換えB-1 P30グループの方が軽度でした（図5B）。
感染した肺の組織病理学的分析は、組換えB-1 P30および二重変異グループにおける軽度の炎症を裏付けました(図5CおよびD)。
しかしながら、二重変異グループと野生型グループの間には有意差は観察されなかったが、前者は軽度の炎症の傾向を示しました(図5B〜D)。
他の組換え株は、野生型ウイルスの病原性と同様の病原性を示しました(図5B〜E)。
変異株では体重減少と肺炎症が改善したにもかかわらず、異なる群間でウイルス力価に差はありませんでした（図5E）。
まとめると、単一の変異ではなく、S タンパク質の 2 つまたは 4 つの変異の組み合わせが、体重と肺の炎症の点で生体内での SARS-CoV-2 B-1 株の悪影響の軽減に関与している可能性があります。
Fusion activity of Vero cell-adapted SARS-CoV-2
Vero細胞に適応したSARS-CoV-2の融合活性
融合活性は病原性における重要な要素です。
変異による減弱を理解するために、B-1 P30 株の S タンパク質の融合活性に焦点を当てました。
VeroE6-TMPRSS2 細胞に、D614G などの変異 S タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトしました。
融合活性はH655Y変異によって増加しましたが、Δ68-76欠失によっては増加しませんでした（図S3）。
これら 2 つの変異を合わせると、H655Y 単独の融合活性に匹敵する融合活性が得られました。
これらの結果は、P812L および Q853L 変異が融合活性の低下と関連しており、病原性の減弱に寄与していることを示唆しています。
Evaluation of the Vero cell-adapted SARS-CoV-2 strain as an inactivated vaccine
Vero細胞適応型SARS-CoV-2株の不活化ワクチンとしての評価
樹立されたVero細胞適応SARS-CoV-2は、ワクチン製造が承認された細胞株であるVero細胞内で良好に増殖しました（図1A）。
ワクチン生産に生産性の高いウイルスを使用する主な利点は、製造コストの削減です。
さらに、適応SARS-CoV-2の病原性は野生型よりも低く（図2A～D）、これが取り扱いリスクの低下に寄与しました。
そこで、Vero 細胞に適応した SARS-CoV-2 の不活化ワクチンとしての免疫原性を評価しました。
ウイルスはβ-プロピオラクトンを使用して不活化され、2週間間隔で2回ハムスターに筋肉内接種されました。
免疫化後、ハムスターに親B-1 P0株を鼻腔内投与しました(図6A)。
不活化B-1 P0株およびB-1 P30株（それぞれiB-1 P0およびiB-1 P30）で免疫したハムスターは、5 dpiでプラセボ群よりも有意に軽減された体重減少を示しました（図6B）。
予想外なことに、肺の炎症を示すハムスターの肺重量/体重の比は、プラセボ群とiB-1群の間で有意な差はなかったが、免疫群では炎症がより軽度である傾向が示されました(図6C)。
ただし、組織病理学的分析では、免疫グループでは炎症が減少していることが示されました（図S4）。
注目すべきことに、肺における感染ウイルス力価はiB-1グループで大幅に減少し（図6D）、抗N抗体による免疫組織化学的染色によってさらに確認されました（図S4）。
iB-1 P0 株と iB-1 P30 株で免疫したグループ間には、体重、肺炎症、ウイルス力価に差はありませんでした (図 6B-D)。 これは、iB-1 P30 が iB-1 P0 と同様に有効であり、免疫原性が B-1 P0 株と B-1 P30 株の間で保存されている可能性があることを示しています。
不活化ワクチンの防御効果をさらに評価するために、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロンなどの他のウイルス株を攻撃実験に使用しました（図 6E ～ G）。
アルファ株に感染したハムスターの体重は減少しましたが、この減少は iB-1 P30 による免疫化によって防止されました。しかしながら、他の株に感染したハムスターの体重減少を制御することは困難でした（図6E）。
アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ株に感染したiB-1 P30免疫ハムスターは、肺炎症の減少を示しました(図6F)。
オミクロン株に感染したハムスターにおける肺重量/体重の比は、プラセボ群とiB-1 P30群の間で差がありませんでした(図6F)。
サンプル収集中にオミクロン株に感染したハムスターの肺に小さな限られた病変が観察されたため（データは示されていない）、その保護活性を評価することは困難である可能性があります。
注目すべきことに、どのグループでもiB-1 P30で免疫したハムスターの肺では感染性ウイルスが検出されませんでした(図6G)。
最後に、長期のワクチン接種試験が実施されました。
最後の免疫化から69日後に、免疫化ハムスターをB-1 P0株に感染させました(図7A)。
免疫化により、感染したハムスターは体重減少と肺の炎症から保護されました (図 7B および C)。
感染性 SARS-CoV-2 は肺では検出されませんでした (図 7D)。これは、免疫応答が SARS-CoV-2 の感染を防ぐのに十分な活性をまだ持っている可能性があることを示しています。
iB-1 P30 による免疫は、ワクチン接種後少なくとも 2 か月間、ハムスターを SARS-CoV-2 感染から効果的に保護しました。
DISCUSSION
この研究では、ウイルス増殖が高いベロ細胞適応型 SARS-CoV-2 株を樹立しました。
Vero細胞は、I 型インターフェロン産生が欠損しているため、さまざまなウイルスの複製をサポートします。
ウイルスに対するこの感受性は、ウイルス感染の根底にあるメカニズムの解明に役立ち、適応を通じて生産性の高いワクチン株の開発にも役立ちます。
適応のために、2 つの異なる SARS-CoV-2 株タイプ、つまり武漢株タイプとヨーロッパ株タイプを選択しました。
これら 2 つの株は、S タンパク質の D614G 変異が異なります。つまり、Wuhan/Kng 株の 614 番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるのに対し、Europe/ B-1 株のアミノ酸はグリシンです。
D614G 変異は S タンパク質の立体構造を変化させ、RBD を「アップ」状態に保ち、ウイルスの伝播と感染力を高めます。
B-1 P30株はSタンパク質をコードする遺伝子のみに変異を有するが、Kng P30株はSタンパク質をコードする遺伝子および他のウイルスタンパク質遺伝子に変異を有しました。
Kng P30 の他の遺伝子の変異はウイルス増殖の促進を裏付ける可能性があり、さらなる調査が必要です。
Kng P30 株と B-1 P30 株の S タンパク質には、Δ68-76 および H655Y という 2 つの共通の変異があり、これらは効果的な S1/S2 切断とウイルス増殖の促進に寄与しました。
具体的には、Δ68-76 変異は、以前に報告されている同様の欠失、つまりΔ69-70 によって引き起こされるものよりも、S1/S2 部位での S タンパク質切断を比較的強く増強しました。
Δ68-76 または H655Y 変異は個別に S1/S2 部位での切断を増強しましたが、組み換え SARS-CoV-2 の増殖は増強を示さなかったことから、これらの変異は個別にウイルス増殖を改善するには十分ではない可能性があります。
これら 2 つの変異は、S1/S2 部位での切断とウイルスの増殖を相乗的に強化しました。
注目すべきことに、他の部分的な NTD 欠失 (Δ69-70、Δ69-76、Δ66-76、および Δ64-76) は、単独で存在する場合には切断の強力な増強を示さなかった。 また、H655Y 変異は、Δ69-70 によって引き起こされるものを除く部分的な NTD 欠失によって引き起こされる S タンパク質切断の範囲を強化しました。
NTD の 69 ～ 76 のアミノ酸を持つタンパク質領域はループ構造を構成しており、Δ69 ～ 70 の変異により NTD 構造が内側に引っ張られると報告されています。
他の部分的な NTD 欠失 (例: Δ68 ～ 76) は、NTD 構造の立体構造の変化に関与している可能性があり、その結果、ウイルス学的特性の変化が引き起こされます。
ただし、これらの変異によって引き起こされる切断の強化と、H655Y および部分的な NTD 欠失の相乗効果の根底にあるメカニズムはまだ不明であり、さらなる研究が必要です。
Δ69-70 および H655Y 変異を持つオミクロン株 (系統 B.1.1.529) は主要な VOC であり、世界中でCOVID-19パンデミックを引き起こしています。
Δ68-76 の欠失は、Δ69-70 の欠失よりも S1/S2 部位での S タンパク質切断の効率が高いことを考慮すると、 Δ68-76 と H655Y の組み合わせを保有する SARS-CoV-2 変異株が、おそらく主要な変異株であり、パンデミックを引き起こしていると考えられます。
これまでに、Caco-2 細胞で数回継代された SARS-CoV-2 株 (系統 B.1) も、H655Y を持たない Δ68-76 を保有していました。 一方、H655Y を持たずにΔ68-76 に変異を有する野生型株は台湾とパキスタンで検出されました。
Δ68-76 および H655Y を保有する変異体の出現を監視するには、さらなる疫学研究が依然として必要です。
現在、H655Y 変異の獲得について報告されているいくつかの研究により、H655Y は重要な変異であると考えられています。
SARS-CoV-2 Sタンパク質を発現する組換えVSVをVero細胞で連続継代すると、組換えウイルスにH655Y変異が生じました。
別の研究では、抗体カクテルの存在下でVero細胞内で SARS-CoV-2 をウイルスが継代する間に、ウイルスが H655Y に変異を獲得したことが報告されています。
さらに、この変異は実験動物へのウイルス伝染によっても導入されました。
in vivoでの H655Y の役割は不明のままですが、切断の強化または細胞間融合の強化により、効果的なウイルス伝播が引き起こされる可能性があります。
私たちのデータは、以前の研究のデータと合わせて、ウイルスの適合性と適応にとって H655Y の重要性を示しています。
偽型ウイルスの H655Y 変異は、S1/S2 部位での切断と細胞間融合を促進すると報告されており、組換えウイルスを使用した我々の結果が実証されています。
注目すべきことに、H655Yを有する株の融合活性の増強は、P812LおよびQ853L変異によって抑制されました； これらのアミノ酸残基はFPの近くに位置し、細胞融合と密接に関連しています。
変異により細胞膜融合が減少する可能性があります。
さらに、H655Y を持つ組換えウイルスの複製動態が野生型ウイルスの複製動態と類似していることを示しました。 これは、細胞融合活性が、TMPRSS2が低レベルで発現されているVero細胞におけるウイルス増殖の亢進に関連していないことを示しています。
他の細胞株におけるウイルス動態の検査は興味深いものです。
一般に、野生型 SARS-CoV-2 は、CTSL 依存性のエンドサイトーシス経路を介してVero細胞に侵入します。
VeroE6 細胞に適応した SARS-CoV-2 は、他のプロテアーゼよりも比較的効率的に CTSL を利用することが報告されています。
別の報告では、偽型ウイルスのΔ69-70欠失はウイルス侵入におけるCTSLへの依存性を強化しないことが示されており、これは我々の発見と一致しています。
CTSL阻害剤に対する組換えB-1 P30株の感受性は野生型ウイルスに比べて著しく高くなっていました。これは、組換え B-1 P30 株が主に CTSL によって処理されるエンドサイトーシス経路を使用したことを示しています。
しかし、宿主細胞に侵入するための CTSL への依存性は劇的な増強を示せませんでした。
組換えB-1 P30は野生型よりもフューリン阻害剤に対して比較的感受性が高く、このことは、適応ウイルスがVero細胞への侵入には十分に利用されていないフューリンを効果的に利用するように進化したことを示しています。
この結果は、Vero細胞に適応したSARS-CoV-2株のフリン切断部位を消失させる変異に関するこれまでの発見とは逆です。
これまでの研究のほとんどは、Vero 細胞と比較してわずかに異なる特性を持つ VeroE6 細胞を使用しました。
特に、VeroE6細胞におけるTMPRSS2の発現レベルは、Vero細胞よりも低かった。
宿主プロテアーゼの発現レベルのバランスは、SARS-CoV-2 の進化にとって重要である可能性があります。
これらの相反する変異が誘導される正確な理由はまだ不明ですが、Vero 細胞の継代履歴やフリンを含む宿主プロテアーゼの発現パターンの違いがこの違いを引き起こす可能性があります。
B-1 P30 株はハムスターでは弱毒化されました。
Δ68-76 および H655Y 変異を有する組換え株も弱毒化を受けましたが、追加の変異を有する組換え株、P812L および Q853L は比較的より弱毒化されました。
以前の報告では、フリン切断部位の欠失を持つSARS-CoV-2変異体はハムスターやマウスの体重に影響を与えなかった。
フェレットモデルでは、フェレット間の伝染にはフリン切断部位が不可欠です。
フリン切断部位の上流にある QTQTN モチーフも、S1/S2 部位での効果的な切断とウイルスの弱毒化に役割を果たしています。
フリンを介した切断が失われると、ウイルスの劇的な弱毒化が引き起こされます。
しかし、我々の結果は、Sタンパク質の過剰な切断によっても病原性が低下する可能性を示唆しました。
効果的に感染させるためには、S タンパク質を適切に切断する必要があります。
弱毒化の根底にあるメカニズムを明らかにするために、我々は S タンパク質のもう 1 つの重要な役割、つまり細胞間融合を分析しました。
デルタ系統は、P681R 変異により高い融合活性を持ち、ハムスターに深刻な体重減少を引き起こします。
Δ68-76 および H655Y を持つ S タンパク質は高い融合活性を示しましたが、追加の変異を持つ S タンパク質、つまり P812L および Q853L はそうではありませんでした。
P812L および Q853L 変異による細胞間融合の減少は、細胞損傷の減少を引き起こす可能性があります。
この変異はウイルスの複製には影響を及ぼさなかったが、生体内での肺への損傷を軽減する可能性があります。
適応 SARS-CoV-2 株 (B-1 P30) にこれら 4 つの変異が共存すると、in vivo での切断活性の増加と細胞融合活性の低下による弱毒化が生じると仮説が立てられています。
弱毒化に重要な変異を特定することはできませんでしたが、これら 4 つの変異はウイルスの病原性の弱毒化に寄与しました。
これらの複雑なウイルスの特徴と宿主の免疫応答との関係については、さらなる評価が必要です。
ウイルス感染における S タンパク質の重要な役割により、S タンパク質のみを標的とするワクチン (mRNA ワクチンやウイルスベクターワクチンなど) が効果的であり、広く使用されています。
しかし、S タンパク質は中和抗体を逃れるために頻繁に変異します。
現在のワクチンによる予防接種では、新たに出現した SARS-CoV-2 変異株による感染を防ぐことができない可能性があります。
実際、Omicron 株の S タンパク質の抗原性は、プロトタイプ株の抗原性とは異なります。
プロトタイプSタンパク質を免疫原としてコードするmRNAワクチンの効果は、オミクロン株に対しては弱められます。
対照的に、不活化ワクチンはすべてのウイルス構造タンパク質を標的とします。
不活化ワクチンは、S タンパク質に対する抗体を誘導するほか、M や N などの他の抗原ウイルスタンパク質に対する抗体も誘導します。
M タンパク質と N タンパク質は異なる変異体間で比較的保存されているため、不活化ワクチンは新たに出現した SARS-CoV-2 変異体に対する免疫を誘導する可能性があります。
以前の研究では、フリン切断の影響を受けた RBD の立体構造が中和抗体を誘発しました。
Omicron 株は RBD の「ダウン」の立体構造を維持するため、中和を回避します。
適応株は、RBD の立体構造を「アップ」に保ち、強力な中和抗体を誘発する可能性があります。
我々の結果は、適応株の免疫原性が野生型株の免疫原性と同様であることを示しました。
注目すべきことに、不活化適応株によるワクチン接種はハムスターをSARS-CoV-2変異種による感染から保護した。 オミクロンも含まれており、不活化ワクチンとしての適応ウイルスの有効性が示唆されています。
さらに、適応させた SARS-CoV-2 株はVero細胞内で野生型株よりもよく増殖するため、不活化ワクチンのコストが削減されます。
免疫原性と高い生産性を考慮すると、不活化適応型 SARS-CoV-2 はワクチン開発の有望な候補です。
結論として、我々は、おそらくフリンを介したS1/S2部位での切断の促進により、高いウイルス増殖を示すVero細胞適応SARS-CoV-2株を樹立しました。
in vitroで観察された高い増殖速度とは対照的に、ハムスターモデルでは適応ウイルスの病原性が低下しました。
組換えウイルスは、Δ68-76 と H655Y という 2 つの変異の組み合わせがこれらの表現型に寄与していることを示しました。
さらに、適応したウイルスが不活化ワクチンとして使用できることを実証しました。
私たちの発見は、COVID-19を制御し、効果的で安定したワクチンを開発するための、SARS-CoV-2感染と病原性の根底にあるメカニズムの解明に貢献します。
以下省略。
この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？