ウイルス進化中に変化するRBDにおける突然変異の制約シフト(2022年7月)

元→Shifting mutational constraints in the SARS-CoV-2 receptor-binding domain during viral evolution | Science

Shifting mutational constraints in the SARS-CoV-2 receptor-binding domain during viral evolution

ウイルス進化中に変化するSARS-CoV-2受容体結合ドメインの突然変異の制約シフト

Abstract

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 受容体に対する親和性と抗体による認識に影響を与えるスパイク受容体結合ドメイン (RBD) の置換を伴う変異体を進化させました。
これらの置換は、他の部位での突然変異の影響を調節すること（エピスタシスと呼ばれる現象）により、将来の進化を形作る可能性もあります。
この可能性を調査するために、我々は深層変異スキャンを実行し、Wuhan-Hu-1、Alpha、Beta、Delta、および Eta バリアント RBD のすべての単一アミノ酸変異の ACE2 結合に対する影響を測定しました。
いくつかの置換、最も顕著な Asn501→Tyr (N501Y) は、他の部位での変異の影響にエピスタティックなシフトを引き起こします。
これらのエピスタティックな変化は、その後の進化的変化を形成します。たとえば、Omicron RBD における多くの抗体回避置換が可能になります。
これらのエピスタティックシフトは、全体的な RBD 構造が高度に保存されているにもかかわらず発生します。
私たちのデータは、RBD 配列と機能の関係を明らかにし、進行中の SARS-CoV-2 の進化の解釈を容易にします。

TEXT

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) のスパイク受容体結合ドメイン (RBD) は、ウイルスの出現以来急速に進化しました。
私たちは以前、深部変異スキャンを使用して、祖先武漢-Hu-1 RBDのアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）結合親和性に対するすべての単一アミノ酸変異の影響を実験的に測定しました。
これらの測定値は、SARS-CoV-2 の進化の監視に情報を提供するのに役立ちました。
例えば、我々は、N501Y 変異が、アルファ株に結果として生じる変異が出現する前に、ACE2 結合親和性を高めるものであることを特定しました。

(アミノ酸残基の一文字略称は以下の通り。 A＝Ala、C＝Cys、D＝Asp、E＝ Glu、F＝Phe、G,＝Gly、H＝His、I＝Ile、K＝Lys、L＝Leu、M＝Met、N＝Asn、P,＝Pro、 Q＝Gln、R＝Arg、 S＝Ser、T＝Thr、V＝Val、W＝Trp、Y＝ Tyr。変異体では、特定の位置で他のアミノ酸が置換されていました；たとえば、N501Y は、501 位のアスパラギンがチロシンに置き換えられたことを示します。)

ただし、タンパク質が進化するにつれて、個々のアミノ酸変異の影響が変化する可能性があり、これはエピスタシスとして知られる現象です。
たとえば、SARS-CoV-2のACE2への結合を強化する同じN501Y変異は、SARS-CoV-1や他の多様なサルベコウイルスによるACE2の結合を著しく損なう。
さらに、N501Y は、SARS-CoV-2 オミクロン株に出現した他の親和性を高める変異をエピスタティックに可能にしました。

エピスタシスが変異の影響をどのように変化させるかをより系統的に理解するために、我々は詳細な変異スキャンを実行して、SARS-CoV-2変異型RBDにおけるすべての個々のアミノ酸変異の影響を測定しました。
私たちは、祖先武漢-Hu-1 RBD (201 残基) および 4 つの変異体からの RBD における包括的な部位飽和変異誘発ライブラリーを構築しました： アルファ (N501Y)、ベータ (K417N+E484K+N501Y)、デルタ (L452R+T478K)、イータ (E484K)。
私たちはこれらの変異ライブラリを酵母表面ディスプレイプラットフォームにクローニングし、蛍光活性化セルソーティング（FACS）とハイスループットシークエンシングを用いて、ACE2結合親和性と酵母表面発現レベルに対するすべてのアミノ酸変異の影響を決定しました。 (図 S1 と S2 およびデータ S1)。
ACE2 結合に対する各変異の影響を図 1 に示します。この図のインタラクティブなバージョンは、URL から入手できます。

単量体 ACE2 細胞外ドメインを使用して 1:1 結合親和性を測定しました。これにより、一部の突然変異効果が結合力によってマスクされる天然二量体 ACE2 リガンドを使用した以前の測定と比較して、親和性増強効果を明らかにする粒度が向上しました (図 S1F)。
酵母表示された RBD における ACE2 結合およびタンパク質発現に対する変異体の影響は、哺乳動物細胞上に表示された完全なスパイク三量体の状況における ACE2 結合およびタンパク質発現と密接に相関することが示されています。
RBD変異体間で変異の影響が異なる部位を特定しました（図2、図S3およびS4）。 RBD 全体で SARS-CoV-2 変異体とその他の変異を区別する置換間のエピスタシスを反映しています。

ACE2 結合に対する変異の影響におけるこれらのエピスタティックな変化は、主に N501Y 変異に起因します：デルタ (L452R+T478K) およびイータ (E484K) RBD における変異の影響は、祖先の武漢-Hu-1 RBD におけるものと類似しています。 ベータ (K417N+E484K+N501Y) RBD の相違点は、N501Y のみを含むアルファ RBD の相違点をほぼ再現しています。 (図 2、A および B)。
1 つの例外は、K417N 変異によってアスパラギンが存在する場合、N 結合型グリコシル化モチーフを導入する、ベータ RBD の部位 419 におけるセリンまたはスレオニンへの変異の影響における明確なエピスタティックなシフトです（図S3D）。
N501Y により顕著なエピスタティックシフトを示す RBD 部位は、3 つの構造グループに分類されます (図 2B)。

突然変異効果の最大の変化は、N501 と直接接触する残基 Q498 です (図 2C)。

ACE2接触表面の中央β鎖を構成する部位491から496でのさらなるエピスタティックシフトを伴います（図2Bおよび図S3A）。
N501Yの存在下でエピスタティックシフトを示す部位の2番目のクラスターには446、447、および449が含まれ、これらはN501に直接接触しませんが、残基498に空間的に隣接しています（図2、BおよびC、および図S3B）。N501Yのためにエピスタティックにシフトする部位の3番目のグループには、部位501を部位403に構造的に連結するいくつかの残基（505、506、および406）とともに残基R403（図2C）が含まれます（図S3C）。

これらのエピスタティックシフトの一部は、SARS-CoV-2 の進化中に明らかに関連しています。
最も強力なエピスタティックシフトの 1 つは、N501Y による Q498R の増強です (図 2C および 3A)。

Q498R 単独では武漢-Hu-1 RBD における ACE2 親和性は弱く低下しますが、N501Y と併用すると親和性が 25 倍向上します (それ自体が武漢-Hu-1 での結合を 15 倍改善します)。 したがって、二重変異体の結合親和性は 387 倍増加します。
Q498R+N501Yの二重変異は、指向性進化研究で初めて発見されました。Omicron BA.1 および BA.2 バリアントの RBD に存在します。
これら 2 つの変異間のエピスタシスは、多数の変異があるにもかかわらず、Omicron RBD が高い親和性で ACE2 に結合できるようにするために重要です。

具体的には、Omicron RBD の一連の変異は、Wuhan-Hu-1 における単一変異効果の合計に基づいて、ACE2 親和性を強く損なうと予測されます (図 3B、左)。しかし、ベータバックグラウンド（N501Y を含む）におけるそれらの単一変異効果の合計はほぼゼロであり（図 3B、右）、これは ACE2 に対する Omicron RBD の実際の親和性と一致しています。
したがって、エピスタティックなQ498R + N501Yペアによって与えられる親和性バッファーにより、オミクロンスパイクは、ACE2結合を減少させる（図3Bおよび図S5A）が、抗体回避に寄与する他の変異を許容できるようになります（図S5、BおよびC）。

これらの親和性測定と一致して、R498Q および Y501N 復帰を Omicron BA.1 スパイクに導入すると、スパイク偽型レンチウイルス粒子による細胞侵入が減少します。 これは、Q498R+N501Yによる緩衝がなければ、残りのOmicron RBD変異が有害であることを示唆しています（図3Cおよび図S6、AおよびB）。

また、N501Y のエピスタシスと、重要なクラスのヒト抗体のエピトープを構成する 446 ～ 449 ループ上の変異との進化的関連性もあります。

武漢-Hu-1 RBDではG446への変異はこのクラスの抗体を回避しているが、これらの変異はN501Yバックグラウンドにおいてより強力なACE2結合欠損を引き起こします（図S3BおよびS5D）。

逆に、Y449 への変異は、武漢-Hu-1 RBD における ACE2 結合親和性を大きく低下させますが、N501Y を伴う場合には忍容性が高くなります (図 2C および 3D)。

Y449 への変異はモノクローナル抗体を回避し (図 S6、C ～ E)、ポリクローナル血清による中和を減少させることができ、C.1.2、A.29、および B.1.640 系統を含む N501Y も含むいくつかの変異体で報告されています。

N501Yによって引き起こされるエピスタティックシフトがSARS-CoV-2進化中の配列変動パターンにどのような影響を与えるかをより体系的に調べるために、我々は世界的なSARS-CoV-2系統発生における置換の発生を数えました。
置換は、ACE2親和性に関してより有利なエピスタシスを有する部位501のアミノ酸を含むバックグラウンドでより頻繁に発生した(図3E)。

したがって、N501Yによって引き起こされるエピスタティックシフトは、以前のSARS-CoV-2進化における突然変異蓄積パターンに直接影響を及ぼしました。 そして私たちのデータは、N501Y 変異体が引き続き優勢である場合、進化的関連性が高まる可能性がある部位 Y449 の変異の特定を可能にします。
Q498R は、Omicron 系統で優勢になるまで、Y501 ゲノム上で不均衡に発生することはありませんでした。
Q498R+N501Y二重変異体（図3A）によって引き起こされる強力な親和性の増加は、それ自体が直接的に有利ではなく、むしろ上記のように他の有益な抗体エスケープ変異を緩衝できるため、Omicronでは有利になると仮説を立てています。

他の一般的な変異の組み合わせは、特定のエピスタティック相互作用には関与しません。

たとえば、部位 417、484、および 501 での置換は、ベータおよびガンマ バリアントで同時に発生しました。
初期の研究では、ACE2結合に関してこれらの変異間にエピスタシスがあるかどうかについては意見が一致していませんが、我々のデータは厳密な相加性を示しています（図S3EおよびS5E）。
SARS-CoV-2変異体におけるこれら3つの部位での変異の同時発生は、代わりにE484およびK417変異体（異なるクラスの中和抗体を回避する）の抗原選択を反映している可能性がある。一方、N501Y は K417 変異による親和性低下の影響を全体的に補う可能性があります。
これらの例は、N501Y が特定のエピスタティック調節 (Y449 変異など) および非特異的な親和性緩衝作用 (K417N など) を通じてウイルスの進化をどのように可能にするかを示しています。

突然変異の影響におけるエピスタティックなシフトの構造的基盤を調べるために、武漢-Hu-1 およびベータ RBD の ACE2 結合 RBD 結晶構造を調べました。 これには、2.45 Åの分解能で新たに決定されたACE2結合ベータRBD（プラス抗体S304およびS309）の結晶構造が含まれます（表S1）。

これらの比較では、武漢-Hu-1 RBD とベータ RBD の間のエピスタティックなシフトを説明する明確な構造的摂動は明らかにされていません。バックグラウンド間で大きなエピスタティックシフトを持つ残基は、武漢-Hu-1またはベータ自体の複製構造内でこれらの残基が示すものと同様に、武漢-Hu-1とベータの構造の間で変動の範囲を示します（図S7）。

より広範には、Wuhan-Hu-1 とベータ RBD バックボーンの間には最小限の変化があります (図 4A および図 S8A)。 そして、変異型RBD構造における主鎖または側鎖原子の構造的変位と突然変異効果のエピスタティックシフトとの間に相関関係は検出されませんでした（図4Bおよび図S8、BからE）。

これらの観察は、全体的な静的な RBD 構造が保存されているにもかかわらず、突然変異効果のエピスタティックなシフトが発生することを示しています。

Q498R と N501Y 間のエピスタシスの原因を調査するために (図 3A)、ACE2に結合したWuhan-Hu-1 (Q498-N501)、Beta (Q498-Y501)、およびOmicron (R498-Y501) RBDの分子動力学シミュレーションを実行しました。さらにWuhan-Hu-1+Q498RおよびOmicron+Y501Nのインシリコ変異複合体に加えます（図4Cおよび図S9）。

Wuhan-Hu-1 構造は、ACE2 残基 D38 および K353 と RBD 残基 Q498 の間の安定した極性接触ネットワークを特徴としています。
ベータに存在する親和性を高める N501Y 置換は、D38ACE2 塩橋を強化するが、すべての Q498 接触を破壊する方向に K353ACE2 を再配置します。

対照的に、親和性低下 Q498R 変異単独では、残基 498 と D38ACE2 の間の調整は改善されますが、K353ACE2 は不完全に満たされたままになります。

Omicronでは、Q498RとN501Yの組み合わせにより、K353ACE2が安定な回転異性体となり、D38ACE2塩橋を維持し、アポACE2構造に存在するE37ACE2塩橋を蘇生させながら（図S9B）、R498とD38ACE2の間に新たなマイナー塩橋接触を追加します。

極性接触ネットワークのこの複雑なエピスタティックな再構成は、RBD:ACE2 相互作用の動的な基盤がどのようにして動的な進化の変動性につながるかを示しています。

全体的に見て、SARS-CoV-2 はヒトでの進化の過程で多様な一連の変異を調査してきました。
私たちの結果は、この進行中の進化自体が、受容体結合親和性に対する重要な変異の影響を変えることによって、潜在的な将来の変化経路をどのように形成しているかを示しています。
他のヒトコロナウイルスは、高い受容体親和性を維持しながら受容体結合ドメインのアミノ酸配列の大規模な進化的再構築を受けることができるため、抗体免疫から逃れることに熟達していることが証明されています。

私たちの研究は、同様のプロセスが SARS-CoV-2 でどのように展開されるかを理解するのに役立つ大規模な配列関数マップを提供します。

以下省略。