クロマトグラフィー分離技法

クロマトグラフィー（Chromatography）は、分子構造と性質に応じて、混合物の物質を分離する手法です。クロマトグラフィーを介して分離は固定相（stationary phase）と移動相（mobile phase）を利用するが、移動相（mobile phase）は、クロマトグラフィーカラム（Chromatography column）内固定相を通過して流れ、この時、他の二つの性質の物質を分離します。いくつかの種類のクロマトグラフィー分離技法があり、これは分離しようとするサンプルの特性に依存します。今回は、代表的なクロマトグラフィー分離技法について説明します。

クロマトグラフィー分離技法
分離しようとするサンプルの大きさに応じて適用するクロマトグラフィ技法が異なることがあり、分子量5000を基準として使用することができるクロマトグラフィー手法は以下の通りです。

Normal Phase Chromatography
順相クロマトグラフィー（Normal phase chromatography）で移動相は、非極性であり、固定相は極性です。物質の極性の違いを介してサンプルを分離し、最も伝統的なクロマトグラフィー技法の一つです。一般的に、クロマトグラフィーカラムは、極性のシリカで満たされているので、分子が極性である場合、シリカカラムに結合し、非極性分子は固定相を迅速に通過します。

Reverse Phase Chromatography
逆相クロマトグラフィー（Reverse phase chromatography）で移動相は極性であり、固定相は、非極性です。最も広く使用されている手法であり、カラム内のシリカは、8または18個の炭素を追加することにより、非極性処理が施されます。分子が非極性である場合、シリカカラムに結合し、極性分子は固定相を迅速に通過します。 酸化または脱アミドなどの変性したタンパク質の分析に活用されます。

Ion Exchange Chromatography
イオン交換クロマトグラフィー（Ion exchange chromatography）はイオン化物質の分離と測定のために使用される重要な分析技術です。イオンクロマトグラフィー分離は、イオンと極性分析物質、溶離液に存在するイオンとクロマトグラフィ支持体に固定されたイオン能保持期間内のイオン相互作用に基づいています。イオンクロマトグラフィーによる分離では、イオンの引力が競合することによるイオン交換と、似た電荷を持つ分析対象のイオンとクロマトグラフィー担体に固定化されたイオンとの間の反発によるイオン排除が重要な役割を果たします。

Size Exclusion Chromatography
サイズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィ（size exclusion chromatography）は分子をサイズに応じて分離する手法であり、ゲルは、特定のサイズの細孔を含む球状ビーズで構成されます。サイズにより分子がマトリックス内孔に留まれるか、排除かつ分離が起こります。小分子は細孔内に拡散し、カラム内の小分子の流れを遅らせるが、大分子は細孔に入らず、カラムの細孔容積から溶出します。その結果、分子はカラムを通過する際にその大きさに応じて分離し、分子量の大きい順に溶出します。この手法は主にタンパク質の凝集や分解を確認するために用いられます。

Hydrophilic Interaction Chromatography
親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）は親水性固定相と親水性水性極性有機移動相での滞留（retention）を基準に高い親水性と極性化合物を分離するために使用される液体クロマトグラフィー技法です。 HILICは、最も親水性の高い物質が早く溶出されることです。これは、一般的な逆相クロマトグラフィーで見ることができる順序とは対照的です。 HILICは逆相LCで保持力の低い親水性化合物を効果的に保持し、保持力がないために分析が困難なサンプルに適用されます。

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