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COVID-19 (および VAX) のスパイクタンパク質を「展開」して、それを消滅させる方法!

あかいひぐま

自分の考えはウイルは存在しないので、この記事をメモするか考えましたが、ウイルスではなくて実験的mRNAワクチン被害を考慮してメモしておきます。
査読付き論文なので、言い回し、用語等、何度も読みながら検索しつつ全て目を通しましたが、その辺りは必要ないのかもしれません。

基本は『2つの市販の食品サプリメント、ブロメラインとアセチルシステイン（NAC）を一緒に（別々にではなく）使用すると、スパイクタンパク質の結合がバラバラになり、無になることを示した研究結果』ということです。
前から言われていた『ブロメラインとアセチルシステイン』を調べていくと、騙されて接種してしまった人たちの役に立つのかな？と考えています。

興味のある方はこの下⇩からどうぞ😎

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WORLD HAL TURNER 16 JANUARY 2023
https://halturnerradioshow.com/index.php/en/news-page/world/tonight-how-to-unfold-the-spike-protein-of-covid-19-and-the-vax-making-it-go-away

SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を破壊する一般的な市販のサプリメントが2種類あることが、査読済みの医学研究によって明らかになった。 この記事は、専門家による研究を転載したもので、スパイク・タンパク質を除去するためにどのようなサプリメントを使用したかを説明しています。 もしかしたら、「ワクチン」を摂取した人々は、これを利用して、多くの人々を病気にし、多くの人々を殺している自分の中のスパイク・プロテインを一掃することができるのではないだろうか？

完全な開示のために、私はここで言及されたサプリメントのいずれも販売していませんし、この情報をあなたに伝えるために誰からもお金を得ていません。 私は公共サービスとしてこれを行う。

この査読付き論文は2021年3月に発表されましたが、メディアは誰もこのことを伝えようとはしませんでした。メディアがやったのは、"vax "を押し付けることだけだった。 今、多くの人がvaxのせいで死んだり、重病になったりしてる。

ワクチン中のメッセンジャーRNAは、人間の細胞にCOVIDの原因となるコロナウイルスのような「スパイク・プロテイン」を発現させるようです。 ただし、人間の細胞は「スパイク・タンパク質を発現する」と仮定されてはいない。

以下は、2つの市販の食品サプリメント、ブロメラインとアセチルシステイン（NAC）を一緒に（別々にではなく）使用すると、スパイクタンパク質の結合がバラバラになり、無になることを示した研究結果です。 結果の画像は以下の通りです。

ブロメラインとアセチルシステイン（BromAc）の併用によるSARS-CoV-2の相乗的不活性化作用について

1
セントジョージ病院外科（オーストラリア、NSW2217、シドニー
2
Mucpharm Pty Ltd., シドニー, NSW 2217, オーストラリア
3
CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Team VirPatH, Univ Lyon, Inserm, U1111, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, ENS de Lyon, F-69007 Lyon, France
4
リヨン市民病院、EMR3738（CICLY）、リヨン第1大学、F-69921リヨン、フランス
5
ニューサウスウェールズ大学セントジョージ＆サザランド臨床学校（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州シドニー市
6
ウイルス学研究所、感染症研究所、リヨン市民病院、ノール病院グループ、F-69004リヨン、フランス
*
著者への返信
†
これらの著者はこの仕事に等しく貢献した。
‡
これらの著者はこの仕事に等しく貢献した。
Viruses 2021, 13(3), 425; https://doi.org/10.3390/v13030425
Received: 2021年1月31日 / 改訂：2021年2月25日 / 受理：2021年3月1日 / 掲載：2021年3月6日 2021年3月1日 / 掲載：2021年3月6日
(本論文は「コロナウイルスに対するワクチンと治療法」特集号に属しています）

1.はじめに

最近出現した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、コロナウイルス病2019（COVID-19）の原因ウイルスであり、無症状から全身性炎症反応症候群を伴う重症・致死型まで様々な病型がある。2021年2月21日現在、1億1100万人以上の確定症例が報告されており、全死亡率は2.2％と推定されています[1]。現在、早期および後期の疾患進行の抑制に有益であることが証明されている治療薬はほとんどありません[2]。幸いにも多くのワクチン候補があるが、ワクチン接種に広く利用できるとは限らず、免疫防御の期間は限られており[3,4]、ワクチンの効果は新種のSARS-CoV-2亜種によって減少する可能性がある。したがって、効果的な治療法の継続的な探求が依然として必要である。

構造的には、SARS-CoV-2は、表面のスパイクタンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質と、RNAをパッケージする内部の核タンパク質を含んでいます。スパイクタンパク質はホモ三量体の糖タンパク質複合体で、一部はジスルフィド結合に基づく動的な構造変化により、様々な役割を果たす[5]。ヒトのアンジオテンシン変換酵素（ACE2）受容体などに結合することで標的細胞への感染を可能にし、膜貫通型プロテアーゼセリン2（TMPRSS2）、フリン、そしておそらく他のプロテアーゼによるタンパク質分解の引き金を引き、ウイルスと宿主細胞の膜融合を導く[6,7]。

ウイルスの哺乳類細胞への侵入、すなわち「ウイルス内部化」は、エンベロープウイルス感染の重要なメカニズムであり、その表面糖タンパク質の動的構造変化、すなわちジスルフィド結合還元を介した、細胞表面の酸化還元酵素とプロテアーゼによる制御に基づいている[5,8,9,10,11]。SARS-CoV-2の宿主細胞への侵入は、アロステリックな機械的変化によるスパイクタンパク質の不安定化から始まり、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）の閉鎖「下」状態から開放「上」状態への構造変化を引き起こすことが示されている [12,13]．RBDの構造変化とウイルス結合は、TMPRSS2やカテプシンLによって誘導され、融合前の状態から融合後の状態への遷移が引き起こされる[5,12,13]。ジスルフィド結合の還元によって解放されるエネルギーは、タンパク質の柔軟性を高め、還元状態が完了したときに最大となる[8]。その結果、還元前に存在する水和力の反発によって他の方法では不可能な、宿主-ウイルス膜の融合が可能になる[5]。

ブロメラインは、主にパイナップル（Ananas comosus）の茎から抽出され、複雑な炭水化物中のグリコシド結合を加水分解する能力を与える多くの酵素を含んでいます[14]。これまでの研究で、ブロメラインはセムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、マウス消化管コロナウイルス、赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、H1N1インフルエンザウイルスのスパイクおよびヘマグルチニンタンパク質を除去することが示されています[15,16]。治療用分子として、火傷の剥離に使用されています。アセチルシステインは強力な抗酸化物質であり、一般に粘液の蓄積のために気道にネブライジングされ、パラセタモールの過剰摂取における肝保護剤としても使用されている。現在の文脈で最も重要なのは、アセチルシステインがジスルフィド結合を減少させることである[17]。さらに、スパイクタンパク質とエンベロープタンパク質がそれぞれのトリプルシステインモチーフによって結合していることから、アセチルシステインの作用によってジスルフィド結合が破壊されると、ウイルスの安定性に影響を与えるという仮説が成り立ちます[18]。ブロメラインとアセチルシステイン（BromAc）の組み合わせは、相乗的な粘液溶解効果を示し、粘液性腫瘍の治療 [19,20] およびいくつかの抗癌剤の化学増感剤として使用されている [21]．これらの異なる作用は、RBDとACE2の間の高い親和性のために、BromAcが複雑な糖タンパク質の分子構造を展開し、したがって結合が起こることを可能にする能力によるものである。

そこで、本研究では、BromAcがSARS-CoV-2のスパイクタンパク質とエンベロープタンパク質の完全性を破壊することができるかどうかを明らかにし、その後、新規S1/S2切断部位を変更したスパイク変異体を含む2つのウイルス株のin vitro複製に対する不活性化の可能性を検討することを目的とするものである。

2.材料と方法

2.1. 材料

ブロメライン原末は、Mucpharm Pty Ltd (Kogarah, Australia)により滅菌粉末として製造された。アセチルシステインは、Link Pharma (Cat# AUST R 170803; Warriewood, Australia)から購入した。組換えSARS-COV-2スパイクタンパク質は、SinoBiological（Cat# 40589-V08B1；中国、北京）から入手した。組換えエンベロープタンパク質は、MyBioSource (Cat# MBS8309649; San Diego, CA, USA)から入手した。他の試薬はすべてSigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)から入手した。

2.2. リコンビナントスパイクおよびエンベロープのゲル電気泳動

スパイクタンパク質またはエンベロープタンパク質は、製造者の指示に従って滅菌蒸留水で再構成し、アリコートを-20℃で凍結した。2.5マイクログラムのスパイクまたはエンベロープタンパク質を、Milli-Q水中で50または100μg/mLのブロメライン、20mg/mLのアセチルシステイン、または両者の組み合わせとインキュベートした。コントロールは薬物を含んでいない。総反応量はそれぞれ15 µLであった。37 ℃で30分間インキュベートした後、5 µLのサンプルバッファーを各反応に加えた。各反応の合計20 µLをSDS-PAGE (Cat# 456-1095; Bio-Rad Hercules, CA, USA) 上で電気泳動した。ゲルはクマシーブルーを用いて染色した。

2.3. スパイクタンパク質とエンベロープタンパク質のジスルフィド結合のUVスペクトルによる検出

IyerとKleeによるジスルフィド結合の還元率測定法を用いて、スパイクタンパク質とエンベロープタンパク質のジスルフィド結合を検出した[22]。1 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.0）中、3.0 µg/mLの濃度の組み換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質を、0、10、20、40、50 µLのアセチルシステイン(0. 5 M）を添加し、37℃で30分間撹拌した後、Dithiothreitol (DTT) (0.5 M)を等量添加し、37℃でさらに30分間撹拌した。スパイクタンパク質は、アセチルシステインを添加せず、先ほどと同様にDTT (0.5 M) のみで並行してインキュベートし、37 °Cで30分間攪拌した。その後、310 nmで吸光度を読み取った。エンベロープタンパク質のジスルフィド結合のUVスペクトル検出は、同様の方法で行った。

2.4. BromAcによるSARS-CoV-2全ウイルスの不活化

コロナウイルス感染症に関する世界保健機関（WHO）のバイオセーフティ暫定指針を十分に尊重し、SARS-CoV-2全ウイルス不活化試験は、初期の欧州循環ウイルスを代表する野生型（WT）株（GISAIDアクセッション番号EPI_ISL_578176）を用いて実施された。また，スパイクS1/S2切断部位にまれな変異があり，実験室での培養が可能であることから，フランスのオーベルニュ＝ローヌ＝アルプ地方で定期的にゲノム調査が行われているSARS-CoV-2第2株（△Sと表記）を不活化試験に追加した（GISAID accession number EPI_ISL_578177）。

これらの試験は、105.5および104.5 TCID50/mLの2つのウイルス培養希釈液に対して、ブロメライン単独（0、25、50、100、250μg/mL）、アセチルシステイン単独（20 mg/mL）、および一定の20 mg/mL アセチルシステイン製剤と組み合わせた異なる濃度のブロメラインの交差反応により実施された。37 °Cで1時間の薬物曝露後、対照を含むすべての条件を細胞毒性を避けるために100倍に希釈し、コンフルエントなVero細胞（CCL-81; ATCC©, Manassas, VA, USA）に四重に接種し、36 °C, 5% CO2で5日間インキュベートした。細胞は、2%ペニシリン-ストレプトマイシン、1%L-グルタミン、2%不活性化ウシ胎児血清を含むイーグルの最小必須培地（EMEM）中で維持された。結果は、毎日の光学顕微鏡観察、終点細胞溶解染色アッセイ、および上清RNA抽出物の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により得られた。簡単に言うと、エンドポイント細胞溶解染色アッセイは、細胞単層にNeutral Red色素（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を加え、37℃で45分間インキュベートし、PBSで洗浄し、クエン酸エタノールを加えてから光学密度（OD）を540 nmで測定した（Labsystems Multiskan Ascent Reader, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）。ODは生細胞に正比例するので、ODが低ければ、ウイルス複製による重要な細胞溶解を意味する。さらに、ウェル上清からのRNAを半自動eMAG®ワークステーション（bioMérieux, Lyon, FR）で抽出し、SARS-CoV-2 RdRp IP2標的RdRp Institute Pasteur RT-PCRをQuantStudio™ 5 System（Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA, USA）で実施した。ウイルス複製のLog10減少値（LRV）は、条件ごとの処理ウェルとコントロールウェルの差を3.3で割って算出した（1 log10 ≒ 3.3 PCR Cycle thresholds（Ct）通り）。

2.5. リアルタイム細胞分析による複製動態

WT 株および∆S SARS-CoV-2 株の in vitro 複製能力を比較するために、xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) DP Instrument (ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA) 上でマイクロエレクトロニクスセルセンサーの電極インピーダンスを測定し複製動態を決定し た。Vero細胞をE-Plate 16 (ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA)に1ウェルあたり20,000個播種し、前述と同じ培地条件で36℃、5% CO2でインキュベートした。24時間後、SARS-CoV-2培養株を10-2の感染倍率で3回接種した。模擬感染は4重で行った。電子インピーダンスデータ（セルインデックス）を15分間隔で6日間連続的に収集した。接種時に設定した正規化セルインデックスの曲線下面積を12時間間隔で算出した。各間隔で、細胞生存率を、対応する細胞対照に対して正規化することによって決定した。各条件の比較には、GraphPad Prism (software version 9.0; San Diego, CA, USA) 上で Tukey multiple comparison test を使用した。

3.成果

3.1. SARS-CoV-2 スパイクタンパク質およびエンベロープタンパク質の変質

スパイクタンパク質をAcetylcysteine単独で処理してもタンパク質の変化は見られなかったが、Bromelainを50および100 μg/mL、BromAcを50および100 μg/20 mg/mLの濃度で処理すると、タンパク質が変化した（図1A）。エンベロープタンパク質にアセチルシステインを処理してもタンパク質は変化しなかったが、ブロメラインを50および100 µg/mL、BromAcを50および100 µg/20mg/mLで処理すると、それぞれほぼ完全および完全に断片化された（図1A）。

図1 （A）ブロメラインとアセチルシステインは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクおよびエンベロープタンパク質の不安定化に対して相乗的な効果を示す。組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質S1 + S2サブユニット（150 kDa）およびエンベロープタンパク質（25 kDa）のSDS-PAGEを実施した。タンパク質は、20 mg/mL アセチルシステイン単独、100 および 50 µg/mL ブロメライン単独、100 および 50 µg/20 mg/mL BromAc の組み合わせで処理した。 (B) アセチルシステインによる組み換え SARS-CoV-2 スパイクタンパク質のジスルフィド還元作用。スパイクタンパク質に見られるジスルフィド結合の還元について、アセチルシステイン（Ac）とジチオスレイトール（DTT）の差検定により、アセチルシステインはDTT添加前にジスルフィド結合の42％を還元することが示された。残りの結合はDTTによって還元され、310 nmで検出されるクロモジンを生成する。(C) アセチルシステインによるリコンビナントSARS-CoV-2エンベロープタンパク質のジスルフィド結合の還元。エンベロープタンパク質に見られるジスルフィド結合の還元について、アセチルシステイン（Ac）とジチオスレイトール（DTT）の差検定から、アセチルシステインはDTT添加前に40%の結合を還元することがわかる。

3.2. UVスペクトル検出によるスパイクタンパク質とエンベロープタンパク質のジスルフィド結合の変化の証明

スパイクタンパク質のジスルフィド結合の減少をDTT単独とDTT＋アセチルシステインで比較したところ、グラフの傾きから42%の差があった（図1B）[0.002599/0.006171 (100) = 42 %] 。アセチルシステインは試料中のジスルフィド結合の58%を還元することができ、その後、残ったジスルフィド結合はDTTによって還元され、スペクトルでモニターされる発色物質が生成されるのである。同様に、エンベロープタンパク質に見られるジスルフィド結合の還元に対するアセチルシステインとDTTの差分検定［0.007866/0.01293 (100) = 60%］は、アセチルシステインがDTT添加前にジスルフィド結合を40%還元することを示す（図1C）。

3.3. ブロメライン、アセチルシステインおよびBromAcのin vitro SARS-CoV-2不活性化能

試験した両SARS-CoV-2株について、105.5および104.5 TCID50/mLの未処理ウイルス対照は典型的な細胞障害作用（CPE）を示し、Vero細胞ではいずれの薬剤組み合わせも細胞毒性は観察されなかった。光学的CPEの結果は、必ずエンドポイントのNeutral Red細胞染色で確認された。全体として、ブロメラインおよびアセチルシステイン単独処理では、ウイルス抑制効果は認められず、いずれもウイルス対照ウェルと同等のCPEを示したが、BromAc組み合わせでは、濃度依存的にウイルス不活性化を示した（図2）。104.5 TCID50/mLウイルス量に対する処理（図2B、D）は、105.5 TCID50/mLウイルス量に対する処理（図2A、C）よりも、4重のCPEの一貫した阻害が得られた。

図2. 細胞溶解アッセイにより、SARS-CoV-2に対するアセチルシステインとブロメラインの組み合わせ（BromAc）のin vitroでの不活性化の可能性が示された。細胞生存率は、ニュートラルレッドによる細胞染色で測定され、光学密度（OD）は生存細胞に直接比例する。低いODは、ウイルス複製による重要な細胞溶解を意味することになる。5.5 および 4.5 log10TCID50/mL力価の野生型（WT）SARS-CoV-2株（それぞれAおよびB）は、単剤処理では、模擬処理ウイルス対照条件と比較して細胞病理効果（CPE）の抑制を示さなかった。BromAcの組み合わせは、模擬感染細胞コントロールと比較して、CPEを阻害することができた。S1/S2接合部に変異を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質変異体（∆S）を5.5および4.5 log10TCID50/mL力価で処理しても（それぞれCおよびD）、同様の結果を示した。棒グラフは、白丸で示した条件ごとの各4重奏の平均を表す。模擬処理ウイルスコントロールを対照条件として、通常の一元配置分散分析を行った（*** p < 0.0001, *** p < 0.0005, ** p < 0.003, および * p < 0.05）。

WHOが定めたウイルス不活性化ガイドラインに基づき、堅牢で信頼性の高い不活性化処理は、少なくとも4 logs［Log10減少値（LRV）＝（RT-PCR処理Ct - RT-PCR コントロール）/3.3；1 log10≒3.3 Ctとして］複製を減少できることであると考えられる。このように、ウイルス複製を直接測定するために、RNA抽出液に対してRT-PCRを行った。104.5 TCID50/mL の野生型（WT）株では、25, 50, 100, 250 µg/20 mg/mL BromAc でそれぞれ4ウェル中1ウェル、4ウェル中2ウェル、4ウェル中3ウェル、4ウェル中4ウェルで LRV > 4 の成功が認められた（図3）。注目すべきは、105.5 TCID50/mLでは、LRVは平均3.3と閾値をわずかに下回り、100および250 µg/20 mg/mL BromAc では、それぞれ4ウェル中3ウェル、4ウェル中2ウェルとなった（Table 1）。104.5 TCID50/mL のスパイクタンパク質変異体∆S では、25 µg/20 mg/mL BromAc では LRV > 4 が観察されなかったが、50、100、250 µg/20 mg/mL BromAc では4ウェル中4ウェルで観察された（図 3）。また，105.5 TCID50/mL では，LRV は平均 3.2 とわずかに閾値を下回り，50, 100, 250 µg/20 mg/mL BromAc ではそれぞれ 4 ウェル中 1, 2, 4 ウェル中 4 ウェルで認められた（表 1）。全体として、SARS-CoV-2両株の複製能力のin vitroでの不活性化は用量依存的に観察され、104.5 TCID50/mLのウイルスに対して100および250 µg/20 mg/mL BromAcで最も強く実証された。

図3. 5.5 および 4.5 log10TCID50/mL力価のWTおよび∆S SARS-CoV-2株に対するBromAc処理後96時間のin vitroウイルス複製のlog10減少値（LRV）の閾値マトリックス。LRVは以下の式で算出した。LRV = (処置のRT-PCR Ct-RT-PCR Ct virus control)/3.3; 1 log10 ≈ 3.3 Ctとして。カラーグラデーションマトリックスは、LRV > 4をもたらす条件ごとの四重奏の数を表示し、WHOに従った堅牢な不活性化に対応する。WT = 野生型; ∆S = S1/S2 スパイク変異体。

表1. WTおよび∆S SARS-CoV-2株の5.5および4.5 log10TCID50/mL力価におけるBromAc処理後96時間のin vitroウイルス複製のLog10減少値（LRV)。LRVは以下の式で算出した。LRV = (処置のRT-PCR Ct - RT-PCR Ct virus control)/3.3; 1 log10 ≈ 3.3 Ctとして。各複製を記載する。TCID50/mL＝組織培養感染量中央値；WT＝野生型；△S＝S1/S2スパイク変異体。

リアルタイム細胞分析により、WTおよび∆S SARS-CoV-2株ともに同等の複製速度が示された（図4）。細胞生存率については、どの時点でもWTと∆Sの間に有意な差は観察されなかった。感染後48時間以降、WTと∆Sの細胞生存率はモック感染と比較して有意な差があった（p < 0.05）。

図4. Real-Time Cell Analysisで測定したWTおよび∆S SARS-CoV-2の複製能力。データポイントは、12時間間隔での正規化細胞指数（接種時に確立されたRTCAの電子インピーダンス）の曲線下面積分析に対応する。その後、細胞生存率は、対応する細胞コントロールに対して正規化することによって決定された。WT = 野生型; ∆S = S1/S2 スパイク変異体。

4.考察

ブロメラインとアセチルシステイン（BromAc）の組み合わせは、Vero細胞で培養した2つのSARS-CoV-2株の感染性を相乗的に阻害した。タンパク質の確認とその分子特性は、ペプチド結合とジスルフィド橋の双方に依存する構造的・幾何学的完全性に依存する。アセチルシステインは、優れた還元剤として、ジスルフィド結合を減少させる傾向があり、その結果、ほとんどのタンパク質の分子特性を変化させる。この特性は、いくつかの治療法（慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性気道疾患、嚢胞性線維症、腹膜炎偽粘液腫など）の開発に広く利用されています[20,23,24,25,26,27]。最近では、スパイクタンパク質の完全性が感染に不可欠であるインフルエンザやCOVID-19などの呼吸器感染症に対する治療法の開発にアセチルシステインが使用されています[28,29,30] [12,13]. その作用機序として、スパイク糖タンパク質の折り畳みを解除し、ジスルフィド結合を減少させるという仮説がある。

SARS-CoV-2のスパイクタンパク質は、ウイルスが宿主細胞に結合する際の要であり、それゆえ理想的な治療ターゲットである。このスパイクタンパク質に対する直接的な機械的作用は、既存の多くの抗ウイルス剤とは異なる治療戦略であり、複製機構を標的とするのではなく、宿主細胞へのウイルスの侵入を防ぐものである。BromAcは、複雑な糖タンパク質を破壊する生化学的な薬剤として作用する。ブロメラインの多能性酵素能力は、グリコシド結合を破壊する能力に支配されており、アセチルシステインのジスルフィド結合を還元する強力な力を補完するのに有用である[17]。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質のアミノ酸配列解析により、BromAcが優先的に作用する部位として、ジスルフィド結合の多いS2'部位や、RBDの他の3つのジスルフィド結合などが特定されている[31]。これと並行して、BromAcによって除去されやすいスパイクを覆うグリコシールドの役割は、RBDのコンフォメーション遷移の安定化要素であると同時に、特定の免疫反応に対する抵抗機構としても注目されている[5,33,34]。

哺乳類細胞はその表面にジスルフィド結合を切断する還元機能を有しており、このチオール-ジスルフィドのバランスの調節がSARS-CoV-2を含む様々な種類のウイルスの内在化に影響を与えることが証明されている[8,35,36,37,38]。ACE2もスパイクタンパク質もジスルフィド結合を持っている。スパイクタンパク質のRBDジスルフィド結合をすべてチオールに還元すると、ACE2受容体とスパイクタンパク質の結合が不利になった[8]。興味深いことに、ACE2のジスルフィド結合の減少も結合の減少を誘発しました[8]。さらに，他の報告では，ブロメラインのみがジスルフィド結合への作用により，VeroE6細胞におけるSARS-CoV-2感染を抑制することが示唆されている[39,40]．このように、BromAcで前処理した後に観察されたSARS-CoV-2の感染性の喪失は、in vitroで示されたアセチルシステインによるジスルフィド結合の著しい減少を伴うスパイクおよびエンベロープタンパク質の累積アンフォールドと相関することが可能であった。

興味深いことに、BromAcはWTおよび∆S SARS-CoV-2の両方に対して同様の効果を示した。SARS-CoV-2と以前のSARS-CoVとのアミノ酸配列の主な違いは、S1ドメインとS2ドメインの間にfurin切断部位が含まれていることである[41]。スパイクタンパク質のこの明確な部位と、宿主のスピルオーバーとウイルスのフィットネスにおけるその役割は、多くの議論の的となっている[41,42,43,44]。注目すべきは、この新しいS1/S2切断部位に変異を持ち、切断モチーフを変えた∆Sは、WT株と比較して複製能力に明らかな差を示さなかったことである。したがって、∆SのBromAc処理に対する感度がわずかに上昇したのは、基礎的な複製バイアスによるものではなく、この変異がおそらくBromAcの作用機構の強化に関与している可能性がある。しかしながら、これらの結果は、ある閾値からBromAcがスパイク変異株に対して有効である可能性を示唆するものである。これは、スパイク特異的ワクチン接種の特異的な免疫学的メカニズムに対するBromAcの明確な利点となりうる[3,4]。

今日まで、さまざまな治療戦略がテストされてきたが、どの分子も明確な抗ウイルス効果を示していない。さらに、COVID-19患者の病勢が不均一であることを考慮すると、治療戦略は複数の作用機序を組み合わせ、病期に適応させる必要があります。したがって，世界中でワクチン接種が十分に行われるのを待つ一方で，治療の再利用はCOVID-19に対する理想的な戦略であることに変わりはない[45,46]．特に、患者の感染力を低下させ、重症肺炎型への進行を防止しやすい早期鼻腔指向型治療の開発は、強力な根拠によって裏付けられている。Houらは、最初の感染部位が鼻咽頭粘膜であり、吸引による肺への二次的な移動があることを示した[47]。実際、呼吸器系細胞の感染パターンは、ACE2受容体の発現に追随して、上気道から肺胞組織へと減少していた。ACE2の発現比率は、遠位気道よりも鼻の方が5倍高かった[40]。鼻腔用消毒薬としての他の再利用療法は、SARS-CoV-2に対して活性を示したポビドンヨードなど、in vitroで試験されている[48]。本研究では，BromAcのSARS-CoV-2に対するin vitroでの治療可能性を，100 µg/20 mg/mLという閾値の有効量にて明らかにした．これまでに2種の動物気道安全性モデルで毒性を示さなかったため（未発表データ）、第I相臨床試験で鼻腔内投与試験を行うことを目指す（ACTRN12620000788976）。このような治療法は、軽度の感染を軽減し、医療従事者など、定期的にウイルスと接触している人への感染を防ぐのに役立つと考えられます。

今回の結果は心強いものですが、この実証実験に関して考慮すべき点がいくつかあります。すなわち、in vitroの条件は固定されており、in vivoとは異なる可能性があることです。どのような酵素反応も環境のpHに影響され、ジスルフィド結合の還元などの酸化還元反応に関わる場合はなおさらである[9]。鼻粘膜のpHは、生理的には5.5～6.5で、鼻炎では7.2～8.3まで上昇する[49] 。SARS-CoV-2の症候性感染でしばしば遭遇する高齢者も、鼻粘膜pHの上昇を誘発する[49]。このように、ウイルス感染によって誘発される典型的な変化による変動幅は、我々の治療戦略の有効性に疑問を投げかける可能性がある。現在、さまざまなpHの条件を検証するためのさらなるin vitro実験が進行中であるが、最終的には、臨床研究のみがこの点を評価することができるだろう。我々の実験は、SARS-CoV-2感染に対して非常に寛容であることが知られているサルの腎臓細胞株を用いて導かれたものである。Sタンパク質溶解チオール-ジスルフィドバランスの崩壊という上記の仮説により、SARS-CoV-2に対するBromAcの効果は膜プロテアーゼパターンに影響されないはずである。この実験プロトコルをヒト肺上皮Calu-3細胞株（ATCC® HTB-55™）で再現すれば、気道上皮と同様にウイルス侵入がTMPRSS2依存性でpH非依存性であるのに対し、Vero細胞でのウイルス侵入はカテプシンL依存性でpH依存性なので[50]、これらの点を解決することができるだろう。

全体として、BromAcの特性およびSARS-CoV-2の特性に関する補足的な研究とともに本研究から得られた結果は、BromAcがSARS-CoV-2に対する有効な治療薬として開発できることを強く示唆するものであった。

5.結論

現在、初期SARS-CoV-2に対して、疾患の進行を防ぐことを目的とした適切な治療法は存在しない。BromAcは複雑な糖タンパク質構造を変化させることができるため、筆者らは粘液性癌を対象に臨床開発を進めている。ジスルフィド結合で安定化されたSARS-CoV-2スパイクおよびエンベロープタンパク質に対するBromAcの可能性を調べたところ、ジスルフィド安定化橋を還元することにより、組み換えスパイクおよびエンベロープタンパク質のアンフォールドを誘導することが判明した。また、BromAcは野生型およびスパイク変異型SARS-CoV-2に対して、in vitroで複製能力を不活性化させる阻害効果を示した。したがって、BromAcは変異があってもSARS-CoV-2の初期感染に対する有効な治療薬となり、さらに感染リスクの高い人への予防薬としての可能性もあるものと思われる。

執筆協力

構想、J.A., K.P., S.J.V., D.L.M.; 方法論、J.A., G.Q., K.P., S.B., A.H.M.; 検証、J.A., G.Q., K.P.., 執筆-原案作成、K.P., V.K., A.H.M., E.F., S.J.V.; 監督、D.L.M., E.F.; プロジェクト管理、S.J.V.; 資金獲得、S.J.V., D.L.M. 全著者がこの原稿の公開版について読み、合意しています。

資金提供

本研究は，Mucpharm Pty Ltd.（オーストラリア）から一部資金提供を受けた。

データの利用可能性

この原稿のプレプリントは、COVID-19の緊急事態により、www.biorxiv.org（2021年1月31日にアクセス）に保存されました。

利益相反について

David L. Morrisは、本試験の共同発明者兼ライセンスの譲受人であり、スピンオフスポンサー企業であるMucpharm Pty Ltd.の取締役である。Javed Akhter、Krishna Pillai、Ahmed MekkawyはMucpharm Pty Ltd.の従業員であり、Mucpharm Pty Ltd.の従業員です。Sarah Valleは、Mucpharmの癌開発のために一部雇用されており、オーストラリア政府研究訓練プログラム奨学金の支援を受けている。Vahan KepenekianはFoundation Nuovo Soldatiから奨学金を受け、Mucpharm Pty Ltd.から奨学金の一部スポンサーとして支援を受けている。

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