細胞モデルと両生類モデルを用いた多層グラフェンの影響の検証
2016年3月16日
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Laura Muzi1,2、Florence Mouchet3,4、Stéphanie Cadarsi3,4、Izabela Janowska5、Julie Russier1,
Cécilia Ménard-Moyon1、Gianfranco Risuleo2、Brigitte Soula6、Anne-Marie Galibert6、Emmanuel Flahaut 6,7, Eric Pinelli3,4, Laury Gauthier3,4 および Alberto Bianco1
1 CNRS、分子細胞生物学研究所、免疫病理学・治療学研究室、フランス、ストラスブール
2 ローマ・サピエンツァ大学生物学・生物工学部（イタリア
3 トゥールーズ大学、INP、UPS、エコラボ（Laboratoire Ecologie Fonctionnelle et Environnement）、ENSAT、F-31326 Castanet Tolosan,
フランス
4 CNRS, EcoLab (Laboratoire d'écologie fonctionnelle et environnement), F-31326 Castanet-Tolosan、France
5 エネルギー・環境・衛生化学研究所（ICPEES）、F-67087 ストラスブール、フランス
6 トゥールーズ大学、INP、UPS、カルノ研究所 CIRIMAT (Centre Inter-universitaire de Recherche et d'Ingénierie des Matériaux)。
UMR CNRS 5085, F-31062 Toulouse cedex 9, フランス
7 CNRS、Institut Carnot CIRIMAT、F-31062 Toulouse、France
電子メール： florence.mouchet@ensat.fr および a.bianco@ibmc-cnrs.unistra.fr
キーワード：数層グラフェン、細胞毒性、マクロファージ、Xenopus 幼虫、死亡率、遺伝毒性
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要 旨
ここ数年、グラフェンは産業応用において驚異的な広がりを見せている革命的な材料と定義されている。エネルギー技術やエレクトロニクスから食品技術や農業技術に至るまで、さまざまな場面でグラフェンが応用されている。グラフェンは、バイオメディカル分野でも有望視されている。診断、薬物送達、組織再生、光熱によるがん切除などの分野で、すでに期待できる結果が得られている。グラフェン技術の大きな発展を考えると、健康や環境に与える影響について慎重に評価することが求められる。グラフェンの毒性を調べることが、医療目的という文脈でいかに基本的な重要性を持っているかは明らかである。
一方、環境中に存在するナノ材料は、産業のライフサイクルに沿って生成される可能性が高く、生物に有害な影響を与える可能性がある。
本研究では、多層グラフェン（MLG）が健康や環境に与える影響について、多角的なアプローチにより重要な貢献を行う。第一の目的として、2つの哺乳類細胞モデルに対する材料の影響を評価しました。細胞生存率や炎症反応の誘導など、主要な細胞毒性パラメータが検討された。これは、in vivoおよび環境モデル生物として使用されるXenopus laevisに対するMLGの毒性評価と組み合わされた。
2D Mater. 3 (2016) 025009 doi:10.1088/2053-1583/3/2/025009
はじめに
グラフェンは、sp-結合を持つ炭素原子が蜂の巣状の結晶格子に密に詰まった、厚さ1atomの平面シートである[1]。
結合した炭素原子がハニカム結晶格子の中に高密度に配置された、1原子厚の平面シートである[1]。グラフェンにはさまざまな形態があり、従来はいわゆるグラフェンファミリー材料 (GFM) と呼ばれる材料でまとめられていた。GFM には、数層グラフェン（FLG）、多層グラフェン（MLG）、酸化グラフェン（GO）、還元酸化グラフェン（rGO）、グラフェンナノシート、極細グラファイト、グラフェンリボンおよびグラフェンドットなどが含まれる。FLGは2～5層のグラフェン層で構成されているが、GOとrGOは通常1層で構成されている[2]。
カーボンナノチューブやフラーレンなど、他の炭素同素体の基本的な構造要素であるにもかかわらず、グラフェンの歴史はごく最近のものである。実際、Geim と Novoselov の研究グループが、グラファイトから単層グラフェンを単離する方法を初めて報告したのは2004年のことである[3]。グラフェンは、その発見以来、産業界で大きな関心を集めている。このような成功は、以下のようなその卓越した物理化学的特性によるものである。
電子的、光学的、熱的、機械的特性は、バルクの同じ材料とは異なります。このような特性は、特定の種類のグラフェンを選択することで調整することができる[4]。グラフェンの特殊な性質を利用することで、グラフェンをベースとしたナノテクノロジーは、現在、科学研究の分野と産業応用の分野で本格的に発展している[5, 6]。実際、グラフェンは材料科学の分野で最初に利用され、最近ではグラフェンをベースにしたエレクトロニクス、フォトニクス、複合材料、エネルギー生成、エネルギー貯蔵、センサーなどの開発にも適していることが示されている[5-9]。すべてのグラフェンの中で、FLGは高収率で容易に製造できる[10-13]。また、エレクトロニクスやオプトエレクトロニクス用途の大面積FLG膜を低コストで作製する方法についても報告されている[14]。
このようにグラフェンの生産と応用が急速に拡大していることは、グラフェンが環境、特にあらゆる種類の汚染物質が濃縮されている水域に放出される可能性を示唆している[15]。例えば、グラフェンの放出は、この材料を含む市販製品の使用、使用中の分解、およびそのような製品の廃棄物から発生する可能性がある。グラフェンによって引き起こされる可能性のあるエコシステムのリスクについては、Hu and Zhu が説明している [15]。グラフェンを水生環境に導入した場合、どのような環境影響が予想されるのだろうか。グラフェンは、まず、水中に自然に存在する有機物やその他の分子（無機・有機高分子、潮汐粒子など）といった非生物的化合物、さらには生物と相互作用する。生態系の重要な構成要素である水生生物のグラフェンに対する反応は、エコセーフティにとって特に重要である[15]。しかし、水生生物に対するGFMの潜在的な毒性に関する既存の知見は、まだ乏しい。最近のレビューでは，水生環境に対する GFMs の毒性について既知のものが紹介されている [16]。これらの研究の多くは，GOとrGOの異なる水生生物（バクテリア，甲殻類，水生昆虫，魚類）に対する毒性を扱っている．単一物質やMLGの毒性評価に関する研究は、ごくわずかである。一般的な結論としては、水生生物に対するグラフェンの影響は、フラーレンやカーボンナノチューブなどのカーボンナノ材料ほど高くはないだろうというものである[16]。
一方、グラファイトを機械的に繰り返し剥離することでグラフェンフレークを単離することができるため、純度の高い材料としてバイオメディカル分野への応用も期待できる[17]。さらに、表面積が大きいため、DNA、タンパク質、ペプチド、低分子薬剤などの生物活性分子とのコンジュゲーションが可能である[17]。Sin-gle-およびFLGは，薬物/遺伝子送達，バイオセンシングおよびイメージング，抗菌活性および組織工学の分野でその可能性を実証している[18-21]。このような応用がいかにグラフェンの生体適合性に厳密に依存しているかは明らかである。実際、治療目的での使用には、グラフェンによる生体適合性がないことを証明することが必要である。
グラフェンが誘発する組織損傷や炎症反応がないことを実証する必要がある。
グラフェンのin vitroおよびin vivoにおける毒性に関する知見を報告した文献は数多く存在する[22]。にもかかわらず、記載された結果は時に対照的である。
実際、生物学的反応は、グラフェンの層数、横方向の大きさ、剛性、疎水性、投与量、材料の純度などによって異なる。また、多様な細胞モデルの使用も、逆説的な知見の原因となっている可能性がある[22]。このため、GFMの毒性学的プロファイルはほとんど理解されておらず、ヒトの健康に対する予期せぬ有害作用を回避するためには、特定のグラフェンのタイプに関するさらなる研究が必要である。
本研究は、主に2～20層からなるグラフェン（MLG）が健康や環境に与える影響をより明らかにすることを目的としている。MLGとグラファイトナノプレートの境界は明確ではないため、層数が10層以上であってもMLGとみなすことにした（グラフェンの異なる形態を説明する命名法の提案については[2]を参照のこと）。この目的のために、2つの異なるマンマリア細胞株（ヒト上皮細胞またはマウスマクロファージ）を用い、MLGに曝露した際の細胞生存率や炎症反応の誘導などの主要な急性毒性パラメーターを調べた。また、吸着した溶媒からMLGを精製することの重要性も考慮されました。In vitro の予備的研究を組み合わせて，水生両生類のモデル生物である Xenopus laevis に対する MLG の毒性を in vivo で評価した。幼生死亡率，成長阻害，遺伝毒性を評価するために，規格化された暴露条件[23]を使用した。また、両生類の幼生は、ナノ粒子の生態毒性を研究する上で重要な水生生物の環境モデルである[24-27]。
材料と方法
材料
MLG は、シンプルで迅速かつ低コストな製造プロトコルで生成し、高い収率を達成した[10]。フレークは、異なる横方向サイズを持つシートで構成されています。この特殊な構造は、いくつかの用途（触媒、電池、スーパーキャパシタなど、金属粒子の安定化が重要な分野）で有用であり、調製プロセスにも関連しています[28]。この方法で得られたMLGは、主に2～20枚のシートで構成されており、場合によっては50枚になることもあります（補足図S1参照）。その後、トルエン中で沈殿させることにより、厚いフレークを試料から分離した。高純度サンプル（MLG1）は、グラフェン層間に吸着した可能性のあるトルエンを除去するために熱処理された（MLG2）[29]。MLGシートの横方向のサイズは1.2～5.4μmであり、平均は2.3μmであった（図S2参照）。MLG 分散液は、各細胞曝露の前に、細胞を超音波処理して新鮮に調製した。ウシ胎児血清10%含有培養液
透過型電子顕微鏡による観察
MLGフレークの形態と数は、加速電圧200kV、点間分解能0.17nmで作動するTopcon 002B-UHR顕微鏡で高解像度透過電子顕微鏡によって調べられた。分析に先立ち、試料をエタノール中に5分間超音波分散させ、その懸濁液を銅グリッドで覆われた穴あき炭素膜上に一滴滴下した。
(Clone GL1, BD Pharmingen 553692)。リポポリ...
-1
をFlowJoソフトウェアで解析した。
フローサイトメトリーの結果は、少なくとも5回の別々の実験から得られたデータの要約である。
各細胞株について少なくとも5回、3回に分けて実施した実験のデータをまとめたものである。データは±SEMで表示されている。統計解析は、二元配置分散分析検定とボンフェローニの事後検定を用いて行った。すべてのp値<0.05は有意であるとみなされた。
ELISA
RAW264.7細胞上清中のインターロイキン6（IL6）および腫瘍壊死因子α（TNFα）の濃度を、ダブルサンドイッチELISAによって調べた。LPS（1μg ml-1）とIFN γ（1ng ml-1）を組み合わせて陽性対照とした。ポリビニルマイクロタイタープレート（Falcon）に、0.05M炭酸緩衝液、pH9.6で希釈した精製Rat Anti-Mouse IL6（BD Pharmingen 554400）または精製 Hamster Anti-Mouse/Rat TNF α（BD Pharmingen 557516）抗体をウェル当たり50μl、4℃で一晩コートした。非特異的部位は、10% FBSを含むPBSで1ウェルあたり100μlを37℃で1時間かけて飽和させた。培養上清またはPBS-10% FBSで希釈したRecombinant Mouse IL6 (BD Pharmingen 554582) またはRecombinant Mouse TNF (BD Pharmingen 554589) を1ウェルあたり50μl、37℃で2時間添加した。PBS-10% FBS で希釈した Biotin Rat Anti-Mouse IL6 (BD Pharmin- gen 554402) または Biotin Rabbit Anti-Rat/Mouse TNF (BD Pharmingen 557432) を 1 well あたり 50μl 添加、37℃で 1 時間静置した。10%FBSで希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを1ウェルあたり50μl添加した。各ステップの後、0.05% tween20を含むPBS(PBS-T)でプレートを洗浄した。37℃で30分間インキュベートした後、プレートを広範囲に洗浄し、H2O2の存在下で0.1Mクエン酸緩衝液（pH5）で希釈した3，3′，5，5′-テトラメチルベンジジンをウェル当たり75μl添加し、酵素反応を可視化した。得られた吸光度は、1Nの塩酸25μl/ウェルで反応を停止した後、450nmで測定した。統計解析は、フローサイトメトリーのセクションに記載した既述の方法で行った。
Xenopusの飼育と維持
卵は、エコラボの研究所で、2匹のゼノパス成魚を交配させ、雄にはPMSG 500 (Pregnant Mare's Serum Gonadotrophin, Intervet, France) 50 IU、雌にはHCG (Human Chorionic Gonadotropin, Organon, France) 750 IUのホルモン注射をして得られたものである。活性炭で濾過した水道水を入れた水槽で、生存卵を維持した。
-1
は、使用前に適切な濃度に希釈した。
(FBS)を100μg mlの濃度で使用した。
) をインターフェロンγ (IFN γ, 1 ng ml-1) と組み合わせてポジティブコントロールとして使用した。マクロファージ関連 CD86 の蛍光強度は、Gallios フローサイトメーターで少なくとも 50,000 イベントを取得し、ライブセルゲート集団のデータを解析することによって決定した。
細胞培養
HeLa 細胞（ヒト腫瘍由来上皮細胞）および RAW 264.7 細胞（マウス形質転換マクロファージ）は ATCC（VA, USA）から購入した。両細胞株は、10%熱不活性化FBSおよび100 U ml-1ゲンタマイシンを添加したRPMI 1640培地で培養した（RAW 264.7 マクロファージには50 μMβ-メルカプトエタノールおよび20 mM HEPESを添加した）。細胞は、5% CO2を含む加湿空気中、37℃で維持した。培地とサプリメントはLonza社から購入した。コンフルエントが70-80%に達した時点で、HeLa細胞またはRAW 264.7細胞をリン酸緩衝液（PBS）で洗浄し、それぞれトリプシンまたはSEバッファ（2 mM EDTAおよび2% FBS含有PBS）で剥離し、2-3dごとに再培養を行った。MLG暴露前に、細胞を剥離し、計数し、適切なウェルサイズと密度で再播種し（詳細については、各実験を参照）、一晩接着させた。
フローサイトメトリー
細胞生存率実験のために、HeLa細胞またはRAW 264.7細胞を96ウェル培養プレートに1(×)105個/ウェルの密度で播種し、一晩付着させた。細胞は、異なる濃度（1〜100μg ml-1）のMLG1またはMLG2に24時間暴露された。インキュベーション後、RAW 264.7上清をさらなる調査のために収集し、一方、細胞を収穫し、カルシウム含有緩衝液中でFITC-Annexin V (AnnV; BD Pharmingen 556419) とヨウ化プロピジウム (PI, 0.2 μg ml-1; Sigma- Aldrich) を用いて染色した。生細胞（AnnV陰性およびPI陰性）、初期アポトーシス細胞（AnnV陽性およびPI陰性）および後期アポトーシス／壊死細胞（AnnV陽性およびPI陽性＋AnnV陰性およびPI陽性）の割合は、ガリオフローサイトメーター（Beckman Coulter, Villepinte, France）を用いて少なくとも50 000イベントを取得し、FlowJoソフトウェアでデータを解析して決定された。
細胞の活性化を解析するために、MLG1またはMLG2とインキュベートした後、RAW 264.7細胞を採取し、PE-Rat抗マウスCD86抗体で染色した。
. サンプル
糖質（LPS, 1 μg ml
実験に適した発育段階に達するまで、20 ℃～22 ℃で飼育した。幼生には毎日、脱水した水族館用魚の餌（Tetra- phyll®, Zolux, France）を与えた。
Xenopusの暴露条件
国際規格 21427-1 [23]に従い、50 期幼虫の半静止暴露条件下で暴露を行った [30]。幼虫は、個体間のばらつきを抑えるため、同じ産卵場所から採取した。それらは、20匹のグループで、再構成された水（RW、すなわち、。ISO 21427-1に記載されている栄養塩を添加した無塩素水（294 mg l-1 CaCl2(-(2H2O, 123.25 mg l-1 MgSO4(-(7H2O, 64.75 mg l-1 NaHCO3, 5.75 mg l-1 KCl, pH 7) ）または対照媒体、すなわちMLGなしのRW（陰性対照: NC および陽性対照: PC）のいずれかを入れた結晶化ディッシュ。PCは、両生類幼生の反応性を確認するために、RWにシクロホスファミド（CP 6055-19-2、Sigma、フランス）を20 mg l-1で添加したものを使用した。必要量の乾燥MLG粉末を必要量の脱イオン水中で超音波処理することにより、1および10 g l-1の2つのストック懸濁液を調製した。10 g l-1（それぞれ1 g l-1）ストック懸濁液の場合、1.5 g（それぞれ0.155 g）の乾燥粉末を秤量し、200 mlのガラスフラスコに導入した。150 ml（それぞれ155 ml）の超純水を加え、混合物を30分間チップソニケーションした（Vibra Cell 75042, 20 kHz, 500 W, 30 % amplitude with 5 s on/5 s off pulses）。ガラスフラスコは、このステップの間の過熱を防ぐために、チップソニケーションの間、氷冷した水を含む結晶化皿に置かれた。超純水 20 ml 中に 100 mg または 20 mg を含む 12 本のガラス管を、10 g l-1 (1469 mg/146.9 ml) のストック懸濁液から、10 分間の超音波処理 (Bioblock T570, 35 kHz, 160 W) 後にそれぞれ 10 ml または 2 ml サンプリングして別々に調製した。20 mlの超純水中に2 mgまたは0.2 mgを含む他の12本のチューブは、1 g l-1 (40 mg/40 ml)の第二ストックサスペンションから、10分間の超音波処理後にそれぞれ2 mlまたは0.2 mlをサンプリングして別々に調製された。チューブ内容物を毎日5分間超音波処理し、適切な結晶化皿に移した後、単にRWで2lに体積を調整した。幼虫はその後、適切なディッシュに戻し、餌を与える（Tetra- phyll®, Zolux, France）。幼虫は12日間の暴露中、22.0(±0.5℃)の自然な明暗サイクルに供された。
Xenopusの毒性評価
MLGに曝露した幼虫の死亡率は，標準的な勧告[23]に従って12日間目視で調べた。20匹の幼虫のうち4匹が死亡したことを意味する20%死亡を有意水準とした。
これは，20頭中4頭が死亡したことに相当し，培地交換時に人為的に死亡させた可能性を排除する。
成長阻害は、Mesurim画像解析ソフトウェア[31]を用いて、曝露開始時（t0）および曝露終了時（t12）の各幼虫（n（=（20））の大きさを測定することによって評価された。統計解析は、先行研究[24]に記載されているノンパラメトリック検定（Kruskal-Wallisに続くDunnの検定、およびMann-Whitney検定）に従い、SigmaStat 3.1 で実施した。これらの先行研究に記載されているように、計算された成長率に基づいて、グラフィックの表現が提案されている。
小核試験（MNT）については，曝露終了時に，各麻酔幼虫から血液サンプルを採取した（MS222，Sandoz，France）．技術的な手順は、標準化された勧告によく記載されている[23]。幼虫1匹につき1000個の赤血球を採取し、小核を1個以上含む赤血球（小核化赤血球、MNE）の数を測定した（MNE ‰）。中央値と四分位値[32]に基づき、1000個あたりの小核化赤血球数MNE ‰は、中央値±1.57（×（IQR四分位範囲（上位四分位-下位四分位）/√n）で表される95％信頼限界とともに提示される。試験群の理論中央値と陰性対照群の理論中央値との差は、重複がなければ95%信頼区間内で有意である。
血液穿刺後、MLGに曝露した幼虫の一般的な様相を、双眼下でNC群と目視で比較した。また、各群の幼虫の一部を解剖した後、その内臓を双眼鏡下（倍率15倍）で観察し、MLGの有無を観察した。
結果および考察
細胞モデルでの毒性
ナノ材料の生体適合性を適切に評価するためには、in vitro 細胞モデルでのナノ材料急性毒性を調べることが重要な第一歩となる。この目的のために、2つのMLGサンプルの細胞毒性を試験するための有効なヒトモデルとして、腫瘍由来上皮細胞（HeLa）が選択された。この細胞タイプは、非食細胞性モデルであることが重要である。試験は、マクロファージ細胞株（RAW 264.7）でも実施された。後者は、2つの細胞株に対するMLGの効果を比較し、MLGによって引き起こされる可能性のある炎症性反応をさらに調べるために、重要な免疫細胞モデルとして選択されたものである。実のところ、マクロファージは、感染性臓器や外部物質に対する一次免疫反応における主要な作用因子の一つであり、そのような物質を貪食して二次免疫反応を誘発することができる[33]。細胞毒性に対するMLGの精製の重要性も考慮されました。この目的のために 2つの異なるMLGサンプルがテストされた。
図1. 100 μg ml-1 の MLG1 または MLG2 に 16 時間曝露した後の HeLa または RAW 264.7 細胞の光学顕微鏡画像 (B). スケールバー：20μm。
図2. 異なる濃度のMLG1およびMLG2に24時間暴露したHeLa（A）およびRAW 264.7（B）の細胞生存率のフローサイトメトリー解析。二元配置分散分析に続いてボンフェローニの事後検定を行い、対照細胞に対する統計的差異と異なるグラフェン試料間の比較を行った（*p（<（0.05）、 **p（<（0.01）） ***p（<（0.001））.
MLG1：出発MLGバッチ、MLG2：グラフェン層間に吸着・内包された残留トルエン分子を除去するために熱処理されたMLG1からなる。
細胞生存率は、最初に解析したパラメータである。どちらの細胞モデルも、濃度の高いMLG1またはMLG2に24時間暴露された。ここで重要なのは、両MLGサンプルの細胞培養液への分散が最適ではなかったという点である。処理した細胞の光学顕微鏡画像を約16時間後に撮影したところ、MLGの凝集の程度が非常に高いことがすぐに明らかになった。
MLGの凝集の度合いが非常に高いことがすぐにわかりました（図1）。一方、MLGの黒い斑点はしばしば細胞と共焦点になっており、細胞膜との相互作用を示唆していることも観察された。しかし、一般的な細胞の形態は、対照細胞と同等であった。培養終了後、フローサイトメトリーによりAnnV/PI染色を行い、細胞生存率を測定した。データは、細胞生存率の低下が観察されなかったことから、HeLa細胞はどちらのMLGサンプルにも非常によく耐えることを示している（図2（A））。それどころか、コントロールのDMSOでは劇的に影響を受けた。同様の状況は RAW 264.7細胞の場合である。
図 3. 異なる濃度のMLG1およびMLG2に24時間暴露したRAW264.7細胞におけるCD86発現（A）およびサイトカイン産生（IL6パネル（B）、TNF αパネル（C））のフローサイトメトリー解析 GFI（=（geomean fluorescence intensity. 二元配置分散分析に続いてボンフェローニの事後検定を行い、対照細胞に対する統計的差異を決定し、2つのグラフェン試料を互いに比較した（*p(<(0.05); **p(<(0.01); ***p(<(0.001))．
実際、MLG1およびMLG2は、マクロファージ細胞株において、わずかではあるが、有意ではない細胞生存率の低下（約5％）を誘導した（図2（B））。2つのMLGサンプルの間に差は見られなかった。
新しい材料の免疫安全性を調査することは、生物医学的な応用の文脈でも基本的に重要である。実際、生体の免疫細胞は、外部分子によって活性化され、有害な炎症反応を引き起こす可能性があります[34]。この第二の重要なパラメータを評価するために、RAW 264.7 マクロファージは、先に記述したように、増加する濃度の MLG1 または MLG2 と共にインキュベートされ、マクロファージ活性化マーカー CD86 の発現がフローサイトメトリによって解析された。また、培養上清を採取して、2つの炎症性サイトカイン、（IL6およびTNFα）のレベルをELISA法で評価した。その結果、CD86とサイトカインのレベルはコントロール細胞と同等であり、我々のMLGサンプルはRAW 264.7
マクロファージに炎症反応を起こさせないことがわかった（図3）。
逆に、細胞の活性化およびサイトカインレベルは
マクロファージ（図3）。一方、LPS/IFNγで処理すると、細胞の活性化とサイトカインレベルが上昇し、この試験の有効性が確認された。
細胞生存率および細胞活性化に関する我々のデータは、MLGがいかなる細胞毒性も引き起こさないことを示唆している。しかし、この結果はいくつかの先行研究とは対照的である [22, 35]。いくつかの例を挙げると、初期の研究では、原始的なグラフェン（主に3～5層で構成）に暴露した神経系ラット細胞において、高い酸化ストレスとカスパーゼ3の活性化（アポトーシス進行を示す）が誘発されたことが報告されている[36]。別のグループは、3～4層のGOが骨芽細胞およびマクロファージ細胞モデルにおいて、細胞周期変化、アポトーシス、および酸化ストレスを誘発することを示した[37]。しかし、グラフェンの細胞毒性は、グラフェンのタイプ（機能性、積層数、横方向サイズなど）、グラフェン不純物、試験した細胞の種類など、いくつかの要因に依存することが、さまざまなレビューで報告されている [22, 35]。とはいえ、グラフェンの細胞毒性に関する文献データとの不一致を説明する仮説を立てることは可能である。MLGのサンプルは数枚のグラフェンシート（2～20）から構成されているが、大半の研究では単層またはFLG（原型または酸化処理済み）が使用されている。研究の中心は、層数よりもグラフェンシートの横方向のサイズである[38, 39]。グラフェン層の数は、比表面積と曲げ剛性を決定するため、考慮すべき非常に重要なパラメータである[40]。特に、比表面積はグラフェン層の数に反比例する。そのため、生体内で起こる分子の物理的吸着や触媒的化学反応などの表面現象は、このケースでは減少する。このような現象は、有害な生物学的反応の原因となる可能性があるため[40]、我々のシステムで観察された細胞毒性がないことの説明となる可能性がある。さらに、我々の条件では、凝集体が強く存在することから明らかなように、MLGの分散は最適ではなく（図1）、したがって、現象はさらに減少することになる。もう一つの仮説は、材料の内部化に関するものです。私たちは、MLGサンプルの硬度が標準的に高いと仮定しています[40]。マクロファージは貪食細胞であるにもかかわらず、このような硬さの材料、さらには大きなMLG凝集体を内包することができず、その結果、細胞の生存率や活性化に対する影響が無視できる程度であることを説明することができるかもしれません。細胞膜を介した物質の受動的拡散は、以前から報告されているが[39, 41]、MLGの高い剛性によってマイナスの影響を受けるかもしれない。しかし、4～25層からなるマイクロサイズのグラフェン（横方向のサイズは0.5～25μm）は、マクロファージに取り込まれることが報告されている[41]。著者らは、グラフェン・マイクロシートの疎水性基底面と、細胞膜の内側疎水性領域との相互作用によって、細胞への取り込みが促進されたと仮定している。今回のMLGは横方向のサイズが小さいものの、凝集状態が良好であることから、細胞内への取り込みが行われなかったという仮説を支持するのに十分であると考えられる。また、同じ研究では、グラフェンマイクロシートがマクロファージに内在化されると、損傷関連分子パターンとして認識され、自然免疫反応を非特異的に活性化する可能性も提案されている[42]。私たちの場合、MLG の疎水性表面積（平均横方向サイズ 2.3 μm、層数 2～20）は小さく、このことは、RAW 264.7 マクロファージに炎症反応が見られないことを説明するもう一つの可能性を示している。マクロファージの炎症反応における材料の形状とサイズの重要性は、我々と他のグループによって報告された[38, 39]。別の先行研究では、異なる横方向サイズを有するGOシートの細胞への影響に焦点が当てられていた。著者らは、約2μmのシートを有するGOサンプルのみが、約300nmのシートとは対照的に、強い一次マクロファージ活性化を誘発することを示した[38]。それとは逆に、我々は以前に、ヒトおよびマウスの初代マクロファージにおいて、GOの横方向サイズが小さいほど、物質内包率が高く、炎症促進効果が高いことを示した[39]。横方向サイズが大きいGO（平均1.32μm）の細胞取り込みは、横方向サイズが平均0.27μmおよび0.13μmのシートと比較して、効率が悪かった。また、大きなGOサンプルは、マクロファージに対する細胞毒性もナノスケールレンジの2つのGOより低かった。これらの以前の結果は、我々のMLGの平均横方向サイズが2.3μmであることから、本研究で得られたデータと完全に一致する。
これらの観察結果から、いくつかのパラメータがグラフェンの毒性に影響を及ぼすことがさらに明らかになった。MLG の細胞毒性に対する各パラメータの相対的な寄与を正確に評価することはできなかったが、MLG の層数および横方向のサイズが比較的多いことと、ある程度の凝集が相乗効果となって、我々の細胞モデルで毒性がないことを決定しているのではないかと推測することができ る。これは、材料が悪いためと思われる。
Xenopus幼虫に対する毒性
高純度MLGサンプルは、さらにX. laevisでテストされました。この研究では、両生類を2つの目的のために使用しました。第一に、MLGの生体内影響をさらに評価するための有効なモデルであり、材料の全体的な毒性についてより深い知見を得ることができます。第二に、X. laevisはナノ粒子の生態毒性を研究するのに適した水生生物の環境モデルであるため、in vivoの結果はMLGの生態毒性に関する情報をも与えます[24-27]。
その結果，MLG は幼虫の死亡を伴わないことが確認された．その結果、MLG の存在下で曝露された幼虫は、どのような濃度であっても死亡しないことがわかった。
第二の要因として、慢性毒性の指標となる幼虫の大きさのMLGに対する変化を解析した。その結果、10 mg l-1 と 50 mg l-1 の物質で曝露した幼虫は、NC と比較して有意にサイズが小さくなった。しかし、0.1および1 mg l-1では、有意なサイズの減少は観察されなかった（図4）。
また、MLG が DNA 変異や染色体異常など、生体の遺伝物質に損傷を与えるかどうかの評価も非常に重要である。小核の誘発は、薬剤の遺伝毒性を測定するために用いられる有効な細胞遺伝学的バイオマーカーである。図 5 は、PC に曝露した幼虫は NC 群と比較して有意に高い MNE ‰を示し（17(±4.56) 対 2(±1.82) ）、MNT の結果が有効であることを示している。における小核誘発を介した遺伝毒性は認められなかった。
図4. 0.1, 1, 10, 50 mg l-1のMLGに曝露した幼虫の成長阻害という観点からの慢性毒性結果。成長率は、陰性対照（NC）幼虫と比較したパーセンテージで表した。統計的結論は、12日間の曝露後、陰性対照幼虫のサイズと比較して、有意に異なるサイズ（平均値、n（=（各条件につき20匹の幼虫））に対応する黒色で示される。
図5. 0.1, 1, 10, 50 mg l-1のMLGに曝露した幼虫の遺伝毒性結果（赤血球における小核アッセイ）。遺伝毒性は中央値（1000個あたりの小核化赤血球数，MNE‰）とその95％信頼限界の値で表した。NC：ネガティブコントロール，PC：ポジティブコントロール，MNE‰：赤血球1000個に対する小核化赤血球数．NC に対して有意な遺伝毒性がある場合は黒色で示した。
図6. 0.1, 1, 10, 50 mg l-1のMLGに暴露したXenopus幼虫のマクロ観察で、NC幼虫と比較した。赤い矢印は、エラと腸にMLGが存在する疑いがあることを示す。
図7. 肛門（50 mg l-1）による媒体曝露のMLGsの疑いのある幼虫の排泄物。赤矢印は肛門部、凝集したMLGが排泄物中に排泄された様子を示す。
X. larvaeの赤血球は、MLGの濃度にかかわらず、観察された。
の赤血球への排泄は，MLGの濃度に関わらず観察された。実際、MNE ‰の中央値は
MNE ‰の中央値は，2(±(0.81), 1(±(0.61), 2(±(1.01) および
-1
MLGの濃度が高くなると、エラや腸でMLGがますます観察されるようになった。また、図7のように、50mgl-1のMLGに暴露した幼虫の排泄物には、MLGが凝集していることが容易に観察される。
X. larvaeの結果は、MLGがこの水生種に対して実質的に毒性がないことを示している。このようなデータは、グラフェンの生態毒性に関する現在の文献に見られるものと一致する。Zanni らは、グラファイトナノプレートがバクテリアである緑膿菌に酸化ストレスを与えないことを示したが、250 mg l-1 の材料に 5 時間暴露すると、細菌の生存率が 70% 失われた [43]。また、線虫Caenorhabditis ele- gans を 250 mg l-1 のナノプレートに曝露しても、線虫の体に沿って物質が分布することが観察されたが、寿命に差は見られなかった。別の研究では、細菌Vibrio fischeriを単層グラフェンおよびグラフェンナノパウダーに30分間暴露した後の半値最大有効濃度（EC50）値を、それぞれ1.92および1.42 mg l-1と算出した [44]-[5] 。また、藻類の Dunaliella tertiolecta を単層グラフェンおよびグラフェンナノパウダーに 72 時間暴露した後の EC50 は、それぞれ 1.14 および 2.25 mg l-1 と算出された。甲殻類のArtemia salinaに対しては、腸内へのグラフェンの凝集が認められたものの、急性毒性は検出されなかった[44]。Guo と共同研究者は、250 μg l-1 の物質に 24 時間暴露した後、甲殻類の Daphnia magna の体内で 14C 標識グラフェンの含有量（生物の乾燥質量の 1%） を示した [45]。別の研究では、100 mg l-1 の多機能グラフェンが魚類 Danio rerio の胚の頭部から尾部に分布したことが報告されている。しかし，この材料は生物に異常を誘発しなかった[46]．
また，X. 幼虫の成長速度にのみ，本材料の影響があるように思われた．その結果，MLGの最高濃度（50 mg l-1）暴露時にのみ，幼虫のサイズが約40%減少した。このプロファイルは、同じ条件でカーボンナノチューブに暴露したX. larvaeで通常観察される[24, 25]。この現象を説明するために、すでにいくつかの仮説が提案されている。例えば、炭素系ナノ物質の取り込みにより、消化器（腸）および呼吸器（エラ）が閉塞し、交換ガス の機能不全が引き起こされる可能性がある。A
2(±(1.22)) をそれぞれ 0.1, 1, 10, 50 mg l
X. larvaeをRWで12日間MLGに暴露したところ、NC larvaeと比較して特別な視覚的様相を呈した（図6）。黒色の凝集体は、栄養塩と炭素系ナノ材料との間の競合が別の説明となる可能性がある。炭素系ナノ材料は、曝露中に餌や排泄物とともに実験皿の底の水柱に素早く沈降し、凝集体を形成する。幼虫が実験皿の底でブラウジングする際に、幼虫がこの凝集体を大量に取り込み、呼吸器や腸の詰まりにつながる。
一方、MLGはどの濃度でも幼虫の死亡や遺伝毒性を引き起こさなかった。この結果は、ヒト上皮細胞（HeLa）およびマウスマクロファージ（RAW 264.7）で得られた結果を支持するものである。MLG凝集体は、両生類に対する遺伝的毒性を引き起こすことなく、排泄される可能性があります。生体内でも、私たちのMLGは遭遇した細胞に取り込まれないと推測することができます。そのような細胞は、主に呼吸器や消化管の上皮細胞に代表されるもので、私たちのケースでは、これらが主な侵入経路となります。その結果、MLG は血流など他の体内区画に到達できない可能性があり、赤血球に対する遺伝毒性がないこと も説明できる。実際、トランスミッション電子顕微鏡、ラマン分光法、組織学を用いた我々の既往研究では、Xenopus の腸管内壁を介したカーボンナノチューブの移動は明確に証明できなかった [24, 47]。
結論として、この多面的な研究において、2-20 層のグラフェンからなる MLG を、2 つの哺乳類細胞モデルおよび重要な in vivo・環境モデル生物である X. laevis で試験した。MLGは、細胞モデルおよびX. larvaeに対して実質的に毒性がないことが示された。我々は、in vitro と in vivo の両モデルに有害な影響がないのは、異なる要因によるものであると仮定している。第一の理由は、MLGの細胞内への侵入がうまくいかなかったことである。これは、我々の材料の特殊なサイズと関連した特性（40）、および水性媒体への分散性の低さに起因する。エンドサイトーシスやファゴサイトーシスによって凝集した物質を細胞内に取り込むことがより困難になり、その結果、毒性がないことを説明することができると考えられる。一方、我々の MLG は、単層あるいは FLG ベースの材料と比較して、比表面積が小さく、周囲の生物学的環境 にさらされることが少ない[40]。そのため、マクロファージに疎水性損傷関連分子パターンとして認識されず、自然免疫応答を活性化できない可能性がある[42]。また、生体内で起こる分子の物理的吸着や触媒的化学反応などの表面現象は、本ケースでは減少している。このような現象は、有害な生物学的反応の原因となる可能性があるため[40]、我々のシステムで観察された細胞毒性がないことの説明にもなり得る。
この研究は、MLG が健康や環境に与える影響について重要な貢献をするとともに
グラフェンのサイズ、形状、分散性が生物学的影響に及ぼす影響、および毒性作用の引き金となる異なるパラメータの相乗効果に及ぼす影響の重要性をさらに証明するものである。
謝辞
この研究は、国立科学研究センター（CNRS）、フランス国立科学研究機構（ANR）：LabEx プロジェクト「複雑系化学」（ANR-10-LABX-0026_CSC）、および国際化学フロンティア研究センター（icFRC）から支援を受けて実施した。
EU FP7-ICT-2013-FET-F GRAPHENE Flagship project (no. 604391) および CNRS Program 'Défi G3N' 2012 からの資金援助に感謝する.
参考文献
元記事参照
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