グラフェン系材料の安全性評価②生体内分布と材料への曝露経路

グラフェン系材料の生体内分布と宿命

　曝露された生物の体内におけるGBMの運命は、横方向の寸法、厚さ、C/O比／機能化などの内在的な物理化学的特性と、生体環境との接触に伴う外来的または後天的な特性の両方に支配され、その大部分はバイオコロナによって決定される。(10）さらに、体内への侵入経路も、その後の物質の運命を決定する大きな要因である。GBMの固有の特性は、その生体内分布、二次臓器への移行、蓄積、分解およびクリアランスに影響を及ぼすと予想される。しかし、これらの特性は、生体内に存在するタンパク質やその他の生体分子の吸着により変化する可能性がある。(75) また、局所的なイオン濃度が、GBMを含むナノマテリアルに影響を与える可能性がある。(これらの相互作用は、初期形状、表面電荷、厚み（ひいては流体力学的直径に影響）、またはコロイド安定性が変化するようにGBMを修正し、材料の生物学的挙動に影響を与える可能性がある(76)。(77）注目すべきは、これらの獲得された特徴が、時間の経過とともに動的に変化し、GBMがある生体区画から別の区画へ（例えば、肺から血流へ）移動する際に、局所環境の関数として進化する可能性があることである。しかしながら、内在する材料特性もまた、免疫細胞による分解（後述）や他の形態の生体内変換の結果として変化する可能性があるため（78）、可能な限り、原形だけでなくin situ（曝露中または曝露後の試験系）で材料の特性を把握することの重要性が強調される。このことを念頭に置いて、我々は生体内分布に関する研究を論じる。

グラフェン系材料への複数の曝露経路

　経口投与の影響を調べるため、Zhangらは小型および大型（いずれもナノサイズ）のrGOシートを125Iで標識し、経口摂取後60日間にわたる生体内分布を評価した（79）。(両材料とも血液、心臓、肺、肝臓、腎臓で検出され、1日目に対照と比較して腎臓で有意に多く、急速に減少したが、15日目と60日目には依然として対照より多く残っていた。これらの結果は、両材料が消化管で速やかに吸収され、全身循環を介して二次臓器に到達したことを示唆している。一方、PEG化したGBMを用いた研究では、異なる結果が報告された(80)。(80) 後者の場合、PEG化、ナノサイズのGO、大きなrGO、およびナノサイズのrGOを経口摂取した後のin vivo生体内分布が125I標識で調べられた。4時間後に胃と腸で放射能が検出されたが、他の主要な臓器では検出されなかった。24時間後にはシグナルは検出されなくなり、PEG化GOの腸内吸着がないことが示唆された。これらの知見と同様に、GO（小および大横寸法）は、完全に分化した腸管細胞様のCaco-2細胞単層を超えて浸透しないことが実証された。(81)
吸入経路は、ヒトへの曝露に重要な関連性を持っている。Li らは、125I で標識したナノサイズの GO（横方向寸法：10～800nm、1～2層）を研究し、気管内注入後の生体内分布をテストした。(82) GOシートの大部分は肺に存在し、10分後から12時間後まで徐々に減少したが、血液、肝臓、腎臓にも微量に検出された。この結果は、胃や腸でも多量に検出されたことから、肺から直接、あるいは腸管での吸着により血液に移行したものと考えられ、粘膜のクリアランス、嚥下、消化管への再分配による可能性がある。肺の黒さをマクロ的に観察したところ、物質は長期的に残存していた（最大3ヶ月間黒色領域が確認された）。しかし，1日目から90日目にかけて黒色度は明らかに減少しており，肺からのクリアランスが示唆された。同じ投与経路で、14Cで標識した数層グラフェンプレートレット（横寸法：60～590 nm、1～4 nm、4～6層、C/O比：14.8）をマウスで28日間まで追跡した(83)。(83) この物質は主に肺で見つかったが、胃や腸でもかなり少ない量で見つかったことから、粘膜クリアランス機構に続いて、吸い込まれた物質が飲み込まれることが示唆された。著者らは、調査したすべての臓器で時間依存的に減少し、肝臓と脾臓では無視できる量の物質が見つかったことから、血流への移行は非常に限定的であることを指摘した。観察されたグラフェン小板の生体内分布は、咽頭吸引後の14C標識多層カーボンナノチューブの生体内分布（マウスの脾臓に蓄積）を彷彿とさせる。(84)
PBSベースのGO懸濁液（C/O比：2.8）の皮下投与による影響を、修正Hummers法において過マンガン酸カリウムを少なくして調製した酸化の少ないGO（GO-R）（C/O比：3.1）と比較検討した。(85) 試料中に微量金属不純物は検出されなかった。GOとは異なり、3日目にはGO-Rと皮下組織との界面に単球が早期に採用され、またGO-Rマクロ構造内に単球が浸潤している証拠があった。7日目と14日目には、マクロファージと線維芽細胞によるGOマクロ構造への浸潤が見られたが、これらの細胞はGO-Rに完全に浸潤し、物質を含んだマクロファージが両条件で見られた。(85) 14日目には、GO-Rのコラーゲン沈着（線維化）の初期徴候も見られた。30日目には、GOのマクロ構造はマクロファージ、線維芽細胞、巨細胞に完全に浸潤し、典型的な異物反応として予想された。一方、GO-Rのマクロ構造は、治癒、組織修復過程、細胞外マトリックスリモデリングのより進んだ兆候を示したが線維化はなかった。著者らは、線維化の欠如は、マクロファージによる材料の取り込み、マクロ構造の端における軽度の炎症反応、および注入部位からのクリアランスの兆候の組み合わせによって説明できることを示唆した(85)。(85)
グラファイト（平均サイズ 3-4 nm）および GO（平均サイズ 8-25 nm）の粉末を界面活性剤を含まない生理食塩水に懸濁し、腹腔内に最大 2 mm の巨視的凝集体を形成することを発見した。(これらの物質は、注射部位に蓄積されたが、腹腔内全体にランダムに蓄積され、臓器や血液区画に対するクリアランスや毒性の兆候は認められなかった（86）。さらに、GOの酸化度(C/O比)がi.p.投与後の生体内分布に及ぼす影響を評価するため、GOのPBS懸濁液をGO-Rのものと比較した(85)。腹腔に動員される単球の増加は、GOでは酸化度の低いGO-Rと比較して3日目に見られ、2週間にわたって持続していた。処理した動物の腹腔から回収し、in vitroで12時間培養した細胞は、GO-Rに暴露した動物から回収した細胞に比べて、GOでは炎症性サイトカインやケモカインを分泌しやすいことがわかった。また、GO-RはGOよりも速やかにクリアーされるようであり、これらの材料の持続性／クリアー率が単球系細胞の動員や炎症誘発性に関連している可能性が示唆された。(85)
生体関連物質の i.p. 投与後の生体内分布を調べるため、GO（横寸法：300-700 nm）から異なるタイプの GBM を調製し、PEG 化した nanoGO（横寸法：10-40 nm）または rGO（横寸法：50-80 nm）および nano-rGO（ 横寸法：10-30 nm）、そしてこれらの物質を 125I で標識した (80) 1 日後に、すべての物質は曝露マウスの肝臓および 脾臓を中心に蓄積していた。しかし、7日後、ナノフォーム（nGO-PEGおよびnRGO-PEG）は肝臓でわずかに減少し、脾臓でわずかに増加したが、大きなサイズのフォーム（RGO-PEG）はこれら二つの臓器で1日から7日にかけて劇的に増加した。興味深いことに、PEG化誘導体とは異なり、非PEG化GOはi.p.投与により腹腔内で凝集体を形成した。しかし、この結果はマクロな観察に基づくものであり、著者らは非PEG化材料について放射能に基づく生体内分布解析は行っていない。また，注入後30日までの組織切片には，注入物質と思われる黒色物質が確認された。別の研究では、PEG化rGO（横寸法：約1μm、厚み：4-9nm、C/O比：3.7）をHummersの方法に従ってグラファイトフレークから調製し、i.p.投与によるマウスでの生体分布、クリアランス、毒性プロファイルを研究した。(ラマン分光法とクラスター分析により、脳、腎臓、肝臓、脾臓にPEG化した構造体が分布していることを明らかにした。i.p. 注射後、3 日後にほとんどの物質が脾臓で見つかった。しかし、脾臓では時間の経過とともに物質量が減少したのに対し、脳では7日目と14日目に増加し、21日目には減少し、肝臓では21日目には劇的に増加した。著者らは、材料が血液脳関門を通過したことを示唆したが、この考えを支持する直接的な証拠は提示されなかった。(87)

ナノセーフティと医学の架け橋。静脈内投与
ナノ材料の生物医学的応用における最も一般的な投与経路の 1 つは、静脈内（i.v.）投与である。ナノメディシンにおけるかなりの研究開発の努力により、形状、サイズ、および表面電荷が、静脈内注射後のナノ材料の生体内分布と運命を決定する最も重要な物理化学的パラメータであることが確立されている（88）。(88) i.v.注入後のGBMの生体内分布については、いくつかの研究が発表されている。Qu らは、PBS に懸濁させた GO、または 1％Tween 80-PBS に分散させた GO の i.v. 注入を研究し、GO-PBS（横寸法：300-1000 nm）では肺への高い蓄積を認めた(89)。(89) 一方、肝臓への集積は、GO-PBS-Tween 80の方がGO-PBSの場合より高かった。これらの結論は、処理後の臓器の黒さおよび組織切片における茶色／黒色物質の観察のみに基づいているにもかかわらず、この結果は、より良いコロイド安定性が、GOシートがより容易に肺毛細管を通過するのを助けるという考えを支持している。ポリ（4-スチレンスルホン酸ナトリウム）で機能化し、蛍光色素Cy7で標識したGOシートを用いて、全身ライブイメージングによる生体内分布の評価を行った(90)。(90) 24時間後に臓器を摘出したところ、肝臓と膀胱にのみ蛍光が見られた。注入後 14 日目に、肺、肝臓、脾臓に明らかな巨視的な物質の存在が認められ、PBS 処置した動物の対応する臓器と比較して、すべて黒色に見えた。180日後にもこれらの臓器に物質が存在し、組織切片に黒色物質が見られたことから明らかなように、物質はまだ存在していた。最近の研究では、非標識PEG化rGO（横寸法：約1μm、厚み：4-9nm、C/O比：3.7）をラマン分光法を用いて、i.v.注入後の生体内分布を評価した(87)。(87）ほとんどの物質は、他の研究と一致して、最も早い時点である3日目に肝臓と脾臓に認められたが、7日目と14日目に脳で一過性に増加し、21日目には減少した。酸化したFLG血小板（横寸法：150-220 nm）の生体内分布と分解を、ラマン共焦点イメージングを用いて90日間にわたり研究した。(91) 著者らは、材料（PBSに分散）が凝集し、肺、肝臓、腎臓、脾臓で0.5-10μmのマクロ構造を形成したことを報告した。この凝集体は、材料の端に劣化の兆候が見られるにもかかわらず、90日後も存在していた。

Yangらは、PEGでさらに機能化した125I標識ナノサイズGO（横寸法：5-50 nm、厚さ：1-2 nm）を用いて、静脈内投与後のGOの生体内分布の定量評価を報告した(67)。(67) 生体内分布を60日間にわたり追跡したところ、すべての時点において肝臓に比べ脾臓に高い集積を示し、これらの網状内皮系臓器における物質量は徐々に減少した。この減少は、60日間にわたり尿と糞の両方で放射能が検出され、糞に比べ尿の量が多かったことから、糸球体濾過による物質のろ過が示唆され、継続的なクリアランスによって説明される可能性がある。関連する研究において、PEG で機能化したナノサイズ GO の生体内分布が、PEG で機能化されていないナノサイズ GO の分布と比較された。(92)125Iによる標識は、2つの材料の追跡と定量に用いられた。両材料は、試験期間中（10分～6時間）、クリアランスを示すことなく肺に蓄積された。脾臓にはごく微量であったが、肝臓には広範囲に蓄積され、時間とともに減少した。PEG化GOと比較して、非PEG化GOは肝臓に2倍蓄積された。注入後3ヶ月経過しても、肺と肝臓の両方に黒色物質が認められ、コラーゲン沈着（線維化）によって証明される組織損傷とリモデリングの徴候が見られた。したがって、PEG化により血液循環が拡大し、網状内皮系臓器への蓄積が減少したが、これらの臓器へのGOの蓄積に伴う有害な結果はわずかに緩和されたに過ぎない。(92)
Sasidharanらは、放射性マーカー99Tcで共有結合標識したFLG（横寸法：100-200 nm、厚さ：0.8 nm）およびその誘導体（カルボキシル化FLG-COOHおよびPEG化FLG-PEG）を調製し、24時間の生体分布を研究している。(93) FLG-COOHは24時間の間に肺に高い集積を示したが、FLG-PEGは最初は肺に集積したが、24時間後には肝臓や脾臓に移動した。組織切片を用いてこれらの結果を確認したところ，FLGとFLG-COOHは長期間（90日まで）肺に蓄積して障害を引き起こすが，FLG-PEGは徐々に肺から退出し（90日では兆候なし），肺に悪影響を与えないことがわかった。また，3物質とも脾臓，肝臓および腎臓で90日までの期間，FLGおよびFLG-COOHで組織損傷の徴候が認められたが，FLG-PEGでは認められなかった。(93) 別の研究では、125Iで標識した小型（横寸法：148-160 nm、1-2層、C/O比：2.28）と大型（横寸法：556-780 nm、1-2層、C/O比：2.70）のGOシートを、180分間の生体分布の調査のためにマウスに静脈注射した。 (94) 大型GOに比べて小型GOで長い血液循環時間が観察された。逆に、小型のGOシートは主に肝臓に集積し（5分をピークに180分までに徐々に減少）、肺と脾臓にはごくわずかしか認められなかった（これらの臓器からは急速に消失）。一方、大きなGOシートはほとんど肺で検出され、180分間にわずかな減少しかなかった。また、肝臓にも少量の大きなGOが検出された。最後に、注入した小さなGOの量を10倍に増やすと、GOの臓器集積が明らかに肝臓から肺にシフトしたと報告し、おそらくGOシートの凝集体の形成による肺の毛細管床の混雑を示唆した。(この2つの比較（すなわち、大きなGO対小さなGO、小さなGOの低濃度対高濃度）はいずれも、大きな板状構造または小さな板状構造の凝集体が、おそらく血管の鬱血により、i.v.注入後に肺に捕捉されやすいという考えを支持するものであった。
　
最後に、ジオクチルスズジアセテート（DOTA）で機能化し、放射性標識をキレート化したGOシートを用いた一連の調査をグラフェンフラグシップで実施した（図2）。単層から数層のGOシート（横寸法：DOTAで100-400nm、厚さ：2-10nm）は、肝臓と脾臓の両方で蓄積し、1時間から24時間の間に肝臓で放射能が減少し、脾臓で増加することが分かった（95）。(さらに、この薄いGOシート（厚さ：DOTAなし1-4nm、DOTAあり1-10nm）の生体内分布を、経時変化により薄いGOシートを再積層して得た厚いGOシート（DOTAあり5-30nm）と比較検討したところ、DOTAありの方が厚いGOシートの生体内分布が大きかった。(40)厚い材料は、注入後最初の1時間で、肝臓と脾臓の両方で、薄い材料よりも大きく蓄積された。重要なことは、いずれの研究においても、早い時間帯に膀胱に大量の放射能が観察されたことである。これらの結果は、腎臓における放射性標識GOシートの一過性の存在と、TEMおよびラマン分光法によって検証された尿中のGOシートの検出によって確認されたように、i.v.注入されたGOシートの大量が腎糸球体ろ過を経たことを示唆するものであった。(40)このGOシートの広範な腎クリアランスが腎臓の生理学に与える影響について、その後の研究で調査した。(41) GOシートの血液から尿への移行にもかかわらず、腎毒性および糸球体バリア機能障害の徴候は確認されなかった。板状のGOシートが腎臓の糸球体濾過膜の内皮柵を通過するためには、一過性に異なる形状（例えば、折り曲げ、くしゃくしゃ、またはしわ）を採用する必要があると考えることができる。

図2

図2. GOの生体内分布。64Cu]-f-GO-thin, [64Cu]-f-GO-thick, および [64Cu]-EDTA のPET/CTイメージングと組織分布。(A) C57BL/6マウスに[64Cu]-f-GO-thin（上）、[64Cu]-f-GO-thick（下）を静脈内投与し、異なる時点（1、3.5、24時間）における全身PET/CT画像 (B) C57BL/6マウスに[64Cu]-f-GO-thin, [64Cu]-f-GO-thick 及びコントロール[64Cu] -EDTA を投与し主要器官の時間反応曲線. (C）対照試料[64Cu]-EDTAを静脈内注射したC57BL/6マウスの全身PET/CT画像で、3時間後にほぼ完全に排泄され、組織蓄積がないことを示している。 参考文献（40）から許可を得て転載したもの。Copyright 2016 Elsevier.

集合的に、これらの研究は、様々な投与経路後のいくつかのGBMの生体内分布および運命に光を当てている。全体として、様々なGBMが生理学的障壁を越えて、侵入点から離れた二次臓器に到達できることを示す証拠がある。しかしながら、発表されたデータが乏しく、体系的な調査が行われていないため、物理化学的特徴とGBMの生体内分布パターンとの関係に関して決定的な結論に達するにはまだ時期尚早である。さらに、蓄積部位におけるGBMの長期的な運命も重要である。しかしながら、このようなデータの作成は決して容易なことではなく、GBMが体内で変化または生分解を受ける場合であっても、長期間にわたって追跡し定量的に測定できる標識物質が必要であることは認識されている。