ヒト幹細胞におけるグラフェンナノプレイトのサイズ依存的な遺伝毒性

第33巻 第32号 2012年11月 8017-8025ページ
https://www.sciencedirect.com/journal/biomaterials

元記事はこちら。

Size-dependent genotoxicity of graphene nanoplatelets in human stem cells

OmidAkhavanabAlirezaAkhavana
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.07.040

概要

還元型酸化グラフェンナノプレートレット（rGONP）は、共有結合でPEG化したGOシートを超音波処理し、ヒドラジンとウシ血清アルブミンを用いた化学還元によって合成された。
組織工学の基本因子であるヒト間葉系幹細胞を臍帯血から分離し、rGONPのサイズに依存した細胞毒性および遺伝毒性を初めて検討した。

その結果、平均横寸法（ALD）が11±4 nmのrGONPsは1.0 μg/mLで有意に細胞を破壊したが、ALDが3.8 ± 0.4 μmのrGOシートは1時間の曝露で100 μg/mLの高濃度の細胞毒性作用を示すことがわかった。
酸化ストレスと細胞壁膜損傷がrGOシートの細胞毒性に関与する主なメカニズムとして決定されたが、そのどちらも、特に1.0μg/mLの濃度でrGONPによって引き起こされる細胞破壊を完全に説明することができない。
また、rGONPは0.1μg/mLという低濃度であっても、DNA断片化や染色体異常といった幹細胞への遺伝毒性を示した。
この結果は、グラフェンシート、特にナノプレートレットを、薬物輸送体や足場材など、今後のナノテクノロジーを用いた組織工学において、より効率的かつ無害に応用するために不可欠な知見を提供するものである。

はじめに

グラフェンは、2次元ハニカム格子構造を持つsp2結合炭素原子の単原子厚シートであり、基礎研究やナノテクノロジー応用への期待から、近年ますます注目されてきている。
グラフェンのユニークな物理化学的特性（高表面積 [1]、並外れた電気伝導性 [2]および熱伝導性 [3]、強い機械強度、バイオ機能化能力、大量生産 [4]など）は、科学界の注目を集め、たとえば、以下のような用途への多数の潜在的応用が考えられてきた。
バイオセンシング[4,5]、疾病診断[6]、細菌抑制[7], [8], [9], [10], [11], 抗ウイルス材料[12]、がん標的治療[13, 14] と光熱療法[15], [16], [17], ドラッグデリバリー [18], [19], [20], 細胞電気刺激 [21] と組織工学 [22], [23], [24] などバイオテクノロジーにおける数多くの応用のために、科学界の注目を集めています。

つまり、グラフェンが人体に及ぼす可能性のある悪影響（細胞毒性、特に遺伝毒性など）については、ほぼ完全に未知の効果として、同時に詳細な調査が強く求められているのである。
しかし、グラフェンのバクテリアおよび哺乳類細胞に対する細胞毒性（遺伝毒性は含まない）については、ほとんど研究が行われていないのが現状である。

例えば、Liao ら [25] は、ヒト赤血球および皮膚線維芽細胞における酸化グラフェンおよびグラフェンの濃度依存的な毒性を報告している。
神経褐色細胞腫由来のPC12 [26] およびA549 [27] 細胞における高濃度（～100μg/mL）のグラフェンの細胞毒性については、グラフェンによって生成される活性酸素種（ROS）の関与が主要メカニズムの一つとして提案されているが、前者の細胞アポトーシスに関する証拠も報告されている。
また、グラフェンナノウォールの極めて鋭いエッジが細胞膜に直接接触することも、グラフェンシートの細胞毒性に効果的に関与するメカニズムの1つとして知られている[7,28]。
また、凝集した還元グラフェンシート内に微生物を捕捉することも、グラフェンシートの細胞毒性、特に懸濁液中での細胞毒性を説明する別のメカニズムとして示唆されている[29]。

近年、さまざまな横方向寸法（ナノスケールまで）のグラフェンシートが、細胞の接着・増殖・分化をサポートする足場として組織工学に応用されたり[22], [23], [24], 優れた近赤外線吸収性ナノ材料として光熱癌治療に応用されたり[14,15], 機能化が容易なトランスポーターとしてドラッグデリバリーに応用されている[18], [19], [20] [20]。
例えば、グラフェン膜はPC12細胞の神経細胞新生を促進し[23]、マウス海馬細胞の神経突起発芽および成長を促進することができる[24]。PEG化グラフェンナノプレート（横方向寸法がナノスケールのシート）は、超低出力レーザーによるがん治療において高い近赤外線吸収剤として使用され [15]、水に溶けない抗がん剤の送達用ビークルとして使用された [19]。
しかし、このようにグラフェンはナノテクノロジーに基づく健康・医療への応用が期待されているにもかかわらず、グラフェンナノプレートレットのヒト細胞（特にヒト幹細胞）に対する遺伝毒性に関する検討はまだ報告されていない。

本研究では、グラフェンシートおよびナノプレートレットの濃度およびサイズに依存した細胞毒性および遺伝子毒性を評価するために、脂肪、筋肉、特に骨髄を含む様々な組織に存在する前組織で多能性細胞であるヒト間葉系幹細胞（hMSC）を標的細胞タイプとして選択した [30]．
実際、hMSCsは、骨、軟骨、脂肪組織などの異なる結合組織系に分化する能力を持つ組織工学の必須因子として知られており、筋骨格系組織の再生に最も成功した候補である[31]。また、他の初代細胞とは異なり、活発に増殖を繰り返している。ここでは、最近提案された若いhMSCsを得るための代替的かつ信頼性の高いソースとして、臍帯血（UCB）を利用しました[32]。
一方、還元型酸化グラフェンナノプレート（rGONP）は、共有結合でPEG化したGOシートを超音波処理し、その後、化学的に脱酸素化することで合成したものである。細胞毒性および遺伝毒性は、細胞生存率、RNA流出、DNA損傷および染色体異常アッセイを用いて検討された。
さらに、rGO シートおよびナノプレートレットの細胞毒性および遺伝子毒性における酸化ストレスの誘発を検討した。また、rGOシートの細胞毒性および遺伝毒性発現のサイズ依存的な閾値濃度を決定した。

セクションの抜粋

GONPの合成
グラムスケールの酸化グラフェン粉末は、我々の以前のプロトコルに従って、粒子径≦20μm（Fluka Inc.）の天然グラファイト粉末を出発材料として、修正Hummers法を通じて合成した[33]。
次に、20 mL の GO を濃度約 3 mg/mL で、周波数 40 kHz、電力 150 watt で約 20 分間超音波処理し、透明な溶液を得た（超音波処理した GO 懸濁液）。GO懸濁液に水酸化ナトリウム（0.1 g/mL）を加え、40 ℃で加熱し、以下の処理を行った。

結果および考察

図 1 に示すように、AFM を用いて、グラフェンシートの表面形態、横方向寸法、および高さ分布を解析した。図1aには、平均横方向寸法（ALD）が3.8±0.4μmの調製済みGOシートが示されている。このシートの最小平均厚さは約0.7 nmであり、単層GOシートの典型的な厚さ（約0.8 nm）と同程度である[38]。調製した GO シートを超音波処理すると、シートが部分的に破砕され、その結果、シートが小さくなった。

結論

酸化グラフェンシートおよびナノプレートレットの細胞毒性および遺伝子毒性を、サイズおよび濃度依存的に検討したのは初めてである。
ALDs 11±4 nm の rGONP は 1.0 μg/mL の閾値で細胞破壊の可能性を示し、ALDs 3.8±0.4 μm の rGO シートは 100 μg/mL の高濃度で 1 時間後に細胞毒性が出現した。

謝辞

O. Akhavan は，Sharif University of Technology の Research Council および Iran Nanotechnology Initiative Council による本研究の財政支援に感謝したい。

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