グラフェン系材料の安全性評価④心血管及び胃腸への影響評価

グラフェン系材料の心血管系への影響

過去20年間、大気汚染、微粒子および超微粒子の吸入、肺への影響、および心血管系疾患との間に関係性があるという説得力のある証拠が得られてきた(173,174)。(173,174) したがって、微粒子の吸入によって生じる肺系の炎症と酸化ストレスは、心血管系への副次的影響の原因として考えられるとされている。肺への曝露と心血管系疾患との間に確立された関係にもかかわらず、吸入可能なナノ材料の心血管系への影響の可能性に関する情報は依然として限られている。(175) GBMについては、これまでのところ、肺曝露後の心血管系への影響について報告した研究はほとんどない。Bengtson らは、rGO（横寸法：1～2μm、2～3層、C/O 比：8.5）と比較して、GO（横寸法：2～3μm、2～3層、C/O 比：1.4）の単回気管内注入後に、心血管疾患のリスクに関するバイオマーカーである急性期応答蛋白を測定した。(166）rGOとは異なり、GOシートは明らかに一過性の急性期反応を誘導し、これらのバイオマーカーは1日目と3日目に有意に増加し、28日目または90日目には消失した。別の研究では、グラファイト血小板を咽頭吸引した後、肝臓でSAA1をコードする急性期遺伝子の発現の増加が見られた（158）。(158）これらの限られた結果は、吸入後の心血管系に対するGBMの潜在的影響に関するさらなる調査の必要性を強調するものである。これらの研究に加え、心血管系の細胞とGBMの相互作用に関する研究もわずかしかない。たとえば、最近の研究では、心筋のH9c2細胞をGO（横寸法：380 nm、C/O比：0.82）またはrGO（横寸法：150 nm、C/O比：1.70）にさらすことが行われた。(176） 細胞毒性は 10 μg/mL 以上で用量依存的であり、rGO は GO よりも毒性が強く、GO よりも大きく内在化されることがわかった。Singhらは、GOシート（横寸法：0.2～5μm）を研究し、Srcキナーゼの活性化および細胞内貯蔵物からのカルシウムの放出を伴う血小板の強い活性化および凝集を指摘した。(177) さらに，GOの静脈内注射（250μg/kg）は，材料投与15分後にマウスに広範な肺血栓塞栓症を誘発することが判明した．比較のために、還元されたGOは、肺血管系における血小板の凝集において、著しく低い効果を示した。著者らは、表面特性の違いが、2つの材料の間で観察された違いに関与している可能性があると主張した（177）。(しかし、彼らは、GOやrGO上に形成されたバイオコロナが果たす可能性のある役割については、言及していない。(10）一方、アミン基で官能基化したGNPは、単離したヒト血小板を活性化せず、マウスに静脈内投与しても肺血栓塞栓症を誘発しない（178）。(また、これらのアミン基を有するGNPは、10μg/mLという高濃度でも単離ヒト赤血球の溶血を引き起こさなかったが、GOシートは最低濃度（2μg/mL）でも赤血球膜の破裂を引き起こした(178)。(178)
一方、グラフェンフラグシップで実施された生体内分布試験において、単層から数層のGOシート（41,95）および多層GOをマウスに静脈内投与しても、明らかな急性心血管系および血液系の有害事象は認められなかった（40）。(40) Qu らは、PBS ベースおよび PBS-1%Tween 80 ベースの GO 懸濁液は、マウスの肺に i.v. 投与しても血栓塞栓症を引き起こさないことを報告した。さらに、GNPおよび酸酸化GNPは、溶血や血小板の活性化および凝集を引き起こさなかった(131)。また、PEG-GOは、i.v.投与後、3ヶ月間、血液毒性を示さなかった(67)。最近の研究では、GOシートは溶血を引き起こすが、GOシートを脂質ベースのベシクルでコーティングすると、この効果が緩和されることが示された(67)。(179)
全体として、発表された研究間の一貫性の欠如は、生物学的効果と物理化学的特性の関連付けの必要性を強調し、血液および心臓血管系に対するGBMの潜在的影響に関するさらなる研究が必要であることを示唆している。　

グラフェン系材料の胃腸への影響

消化器系は、生物が食物を取り込み、消化して栄養素と必須元素を抽出・吸収し、残った老廃物を排泄物として排出することを可能にします。ナノ物質の経口曝露の可能性には、（i）食品中に存在する、または食品包装から放出される物質の直接摂取、および（ii）吸入された物質の間接摂取の2つの主要な原因がある（180,181）。(180,181) これは、経口摂取が職業的環境にも関連することを意味する。吸入されたナノ物質のほとんどは、呼吸器系に捕捉され、「粘膜繊毛運動器」を介して上方に運ばれ、最終的に飲み下されるか咳き込まれる。消化管に入ったナノマテリアルは、すぐに唾液にさらされます。その後、胃に運ばれ、その厳しい条件（塩酸を主成分とする胃酸のpHは1.5～3.5）にさらされ、小腸と大腸に移行し、栄養分がボーラスから再吸収される。消化酵素、pH、イオン強度、界面活性化合物、および食物摂取の種類と量などのいくつかの要因は、ナノ材料の物理化学的特性を変える可能性があり、経口曝露経路に続くナノ材料の危険性評価において考慮されなければならない。(180) 小腸は絨毛構造を持ち、粘液で保護された表面積は約2000㎡と人体で最も大きく、効率的な栄養摂取を可能にしている。腸管上皮は、主に腸管細胞、粘液産生性杯細胞、および効率的な免疫反応の誘導に重要な、いわゆる小葉細胞（M細胞）で構成されている(182)。(182) 後者の細胞は、頂膜上で粘膜免疫反応を開始し、微生物や粒子を上皮細胞層を介して腸管内腔から固有層に輸送し、そこで免疫細胞との相互作用が行われるようにする。(183) GIバリアを通過する粒子の潜在的な取り込みおよび移動経路は、傍細胞経路または経細胞経路のいずれかであると考えられる。細胞バリアに加えて、GI管の粘膜は、ナノ粒子の全身循環への取り込みおよび移動に対する重要かつ効果的な生物学的バリアを形成している(184)。(184）このクラスの物質の健康リスクを推定するためには、他の粒子と比較して、GBMがどのように消化器系と相互作用するかを解明することが重要であるが、現在までのところ研究はほとんどない。

医薬品および毒性学的研究において最も一般的に受け入れられている in vitro 腸管モデルのひとつが、ヒト結腸腺癌細胞株 Caco-2 である。この細胞株は、前腸細胞を表すサブコンフルエントな培養物として維持することができる。しかし、3 週間培養すると、腸管細胞へと完全に分化し、未分化な細胞と比較して、極性化、微絨毛構造の形成、遺伝子およびタンパク質の発現変化などの激しい形態学的および生理学的変化を起こします(185)。Caco-2細胞は、ナノ粒子が消化管に与える潜在的な影響を評価するために、数多くの研究で使用されてきた(185)。(186-188) 近年、3次元共培養、(189) ガットオルガノイドまたは「ミニガット」(190) またはガットオンチップモデルなど、より高度なin vitroモデルが開発されてきた(191)。(191）しかし、このようなモデルを用いたGBMの影響に関する研究は、あったとしてもごくわずかである。それでも、最近のいくつかの研究では、Caco-2細胞モデルを用いて、GBMの潜在的な毒性に取り組んでいる（図S5を援用）。Nguyenらは、Caco-2細胞を異なる濃度（10〜500μg／mL）のGOフレークに暴露し、高濃度では軽度の細胞毒性効果しか観察しなかった（192）。(192) 彼らは、フレークへの培地栄養分の吸着が、この観察された効果の原因かもしれないと推測している。グラフェン・フラグシップで実施された最近の研究では、GBMの取り込みが細胞の分化状態に強く依存することが示された（81）。(81）非分化型 Caco-2 細胞は、数マイクロメートルの大きさの GO および GNP 凝集体を用量依存的に取り込むことができたが、分化型 Caco-2 細胞は、密集した微絨毛の存在により GBM に対して忌避特性を示した。このことは、in vitroモデルの選択が研究の結果に重要であることを示唆している。Ruiz らは、哺乳類細胞の付着および増殖に対する GO コーティング表面の役割の試験を行った。(193）この目的のために、対照のスライドガラスとHummersの方法で製造したGOでコーティングしたスライドガラスを、大腸腺癌HT-29細胞を加えた培養皿の上に置いた。その結果、スライドグラスにコーティングされたGO膜は、この細胞の付着、成長、増殖を促進することがわかった。Kucki らは、GBM の物理化学的特性が Caco-2 の反応に及ぼす影響をさらに明らかにするために、GBM のパネル（すなわち、4 つの GO と 1 つの GNP）を調査した。(194） GOは、以下のパラメータにおいて異なっていた：（i）サイズ（横方向の寸法が数百ナノメートルから数マイクロメートル）、（ii）出発材料（グラファイト対グラファイトナノファイバー）、（iii）C/O比（GOサンプルでは約2、GNPでは24）、（iv）層の数（厚さ：1 nmから5 μm）。本研究の主な成果は、4種のGOすべてが、分化細胞よりも感受性が高いとされる非コンフルエントなCaco-2細胞に対して非細胞毒性であったことである。比較的高濃度（80μg/mLまで）でのみ反応が誘導された。消化管内の状態を模倣するために材料を酸で前処理しても、結果には影響しなかった。一方、GNP凝集体は、高濃度でも低レベルの急性毒性を示し、凝集体、層数、C/O比が、横方向の寸法だけよりも細胞生存率に顕著な影響を与えることが示された(194)。(194） 別の関連研究において、経口摂取を模擬した消化液による GO および FLG の処理は、材料の構造変化／分解を誘発せず、消化された GBM の慢性暴露は、長期暴露（1 および 5 μg/mL; 2 日ごと 2 時間、最長 9 日間）にもかかわらず、腸の Caco-2 バリアに影響を与えなかった。(195)

マイクロバイオームは、我々の「忘れられた臓器」と考えられており、腸内細菌叢は、腸、肝臓、筋肉、脳を生理的につなぐ、宿主の複数の代謝、シグナル伝達、免疫炎症経路の調節に関与している（196）。(196） 最近の in vivo 研究では、GO は、単層カーボンナノチューブ（SWCNT）および多層カーボンナノチューブ（MWCNT）と比較して、経口曝露後に穏やかな影響を及ぼすことがわかった。 197） また重要なことに、著者らは、16S rRNA 遺伝子配列決定法を用いて腸内細菌叢組成への影響を評価し、これらの炭素系ナノ材料が腸内微生物に何らかの影響を与えるかどうかを調査している。様々な分類レベルで微生物叢を分析した結果、SWCNT、MWCNT、GOの急性経口投与後に、腸内細菌叢の多様性と組成に著しい変化が見られた。16S rRNA 遺伝子配列解析の結果、SWCNT 投与マウスでは、優占する微生物群が Firmicutes から Bacteroidetes に著しくシフトしており、MWCNT 投与でも SWCNT と同様の変化が植物群および属レベルで見られた。(197） しかし、SWCNT や MWCNT の経口曝露に比べ、GO への曝露は腸内細菌叢に より顕著な影響を与えた（Figure 5）。
図 5

図5．炭素系ナノ材料と腸内細菌叢。マウスにSWCNT、MWCNT、GOを急性経口投与（2.5 mg/kg、7日間）した後の門地レベルでの細菌群集存在比の比較。円グラフは、16S rRNA 遺伝子配列決定に基づく腸内細菌叢の相対的存在度を示す。文献（197）から許可を得て転載。Copyright 2018 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.

結論として、この比較的新しい分野における最初の探索的研究は、腸管上皮細胞に対するいくつかの異なるGBMの急性細胞毒性を示さないか、または軽度であることを示している。しかしながら、この分野はまだ初期段階にあり、微生物叢への影響を含むGBMの長期的影響に関する側面は、今日でも未解決のままである。したがって、経口曝露後のさまざまなGBMの潜在的影響を理解するために、さらなる研究が必要である。