グラフェン系材料の安全性評価。①研究概要、グラフェン系材料の合成と特性評価
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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.8b04758#
Bengt Fadeel*, Cyrill Bussy, Sonia Merino, Ester Vázquez, Emmanuel Flahaut, Florence Mouchet, Lauris Evariste, Laury Gauthier, Antti J. Koivisto, Ulla Vogel, Cristina Martín, Lucia G. Delogu, Tina Buerki-Thurnherr, Peter Wick, Didier Beloin-Saint-Pierre, Roland Hischier, Marco Pelin, Fabio Candotto Carniel, Mauro Tretiach, Fabrizia Cesca, Fabio Benfenati, Denis Scaini, Laura Ballerini, Kostas Kostarelos, Maurizio Prato* 及び Alberto Bianco* （注）1.は、本論文の一部です。
これを引用する。ACSナノ2018、12、11、10582-10620
掲載日：2018年11月2日
https://doi.org/10.1021/acsnano.8b04758
著作権 © 2018 アメリカ化学会
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SUBJECTS:解剖学,材料,ナノマテリアル,毒性,二次元材料
要 旨
グラフェンおよびその誘導体は、エレクトロニクス、エネルギー貯蔵、医療など、社会のさまざまな分野で多様な応用が期待される「奇跡の材料」として期待されている。グラフェン系材料（GBM）の利用が進むにつれ、これらの材料が人体や環境に及ぼす潜在的な影響を総合的に評価することが必要になっている。
ここでは、これらの材料の生物学的効果の根底にある特性を理解することを目的として、in vitroおよびin vivoモデルシステムを用いたGBMの合成および特性評価、ならびにヒトおよび環境への危険性評価について議論する。
キーワーズ：カーボンナノ材料 グラフェン
グラフェンは、クラス初の2次元原子結晶である。(この材料は、機械的剛性、強度、弾性、および高い電気・熱伝導性など、多くの優れた特性を備えているため、発見当初から大きな注目を集め、現在、グラフェンおよびその誘導体がさまざまな用途で研究されている。グラフェンを利用した技術や製品を安全かつ持続的に開発するためには、これらの材料が人間の健康や環境に与える潜在的な影響に細心の注意を払う必要がある。(実際、安全性評価は、イノベーションのプロセスに不可欠な要素である。)(4)
材料の特性評価は、ハザード評価において重要な要素である。カーボンナノチューブの毒性評価は、その典型的な例である。10年前、カーボンナノチューブは動物モデルで「アスベスト様」の病原性を示すことが示唆された。すなわち、長くて硬いカーボンナノチューブは、短くて絡まるカーボンナノチューブとは異なり、マウス腹腔内注射により肉芽腫形成と炎症が誘発されたのである（5）。カーボンナノチューブは、いわゆる病原性繊維のパラダイムにある程度合致しており、多層カーボンナノチューブの中にはヒトに対して発がん性があると考えられるものがあることが分かってきた(6)。(6) しかし、同じ材料群の他のメンバーは無毒であることが分かっており(7,8)、分解を受けることさえあることから(9)、すべてのカーボンナノチューブがアスベスト様ではないことが示唆されている（文献 (10) に総説あり）。実際、カーボンナノチューブは、適切に精製され、表面修飾されていれば、ナノメディシン分野、例えば、薬物や遺伝子の送達やイメージングに有望な可能性を持っている。(10)
したがって、他の人工ナノ材料の研究から重要な教訓を得られることは明らかですが、あるクラスのナノ材料の研究から他のクラスのナノ材料への外挿を避けることも同様に重要です。新しい材料が新しく有用な特性を持つことを認めるならば、そのような新しい材料が新しい、または予期しないリスクをもたらす可能性があることも受け入れなければなりません。(11）これは、新規材料の生物学的または毒物学的影響が、必ずしも「新規」であると言っているのではない。実際、細胞や器官にダメージを与える最終的な共通の経路（例えば、酸化ストレス、炎症、発癌）は、異なる（ナノ）材料で保存されているかもしれないが(12)、それでも、それらの経路がどのように引き起こされるかを理解することはかなり重要である。本質的に、毒物学は、化学物質や材料の構造と活性の関係を理解することを求める。
毒性学は、化学物質や材料の構造と活性の関係を理解しようとするものであり、材料の特性を理解し、それらが生物学的効果にどのように関連しているかを理解することが、材料の有用性と安全性を両立させるために必要である(13,14)。(13,14)
グラフェン・フラッグシップ・プロジェクト（www.graphene-flagship.eu）は、ヒューマンブレイン・プロジェクトと並んで、欧州委員会の未来・先端技術（FET）フラッグシップ・プロジェクトの第一弾であり、その使命は、長期的かつ学際的な研究開発努力によって科学技術の主要課題に取り組むことである。
グラフェン・フラッグシップは2013年に開始され、10年間実施される予定です。コンソーシアムは、20カ国以上の150以上の学術・産業研究グループから構成されています。
安全性評価は、新技術の開発と切り離すことのできない必須要件です。そのため、グラフェンフラグシップでは、グラフェン系材料（GBM）が人の健康や環境に与える潜在的な影響の評価に多大な労力を費やしてきた。(2）本レビューの目的は、グラフェン・フラッグシップの前半に実施された作業を出発点として、その他の関連文献とともに、GBMのヒトおよび環境に対する危険性評価について包括的な見解を提供することである。
我々は、グラフェンの主な曝露経路と、免疫系、皮膚、肺、循環器系、消化器系、中枢神経系、生殖器系などの主要標的臓器、および様々な生態系における細菌、藻類、植物、無脊椎動物、脊椎動物などの幅広い生物に言及する。また、ナノ毒性評価には、物質自体の理解が不可欠であるため、GBMの合成と特性評価についても言及する(15,16)。(この時点では、情報は比較的乏しいが、我々は、GBMの曝露およびライフサイクル分析について簡単に説明する（4）。(4）全体として、GBMの安全性評価に関する最近の研究についてのこの調査では、「グラフェン」は単一の材料ではなく、材料のクラスであり、これらの材料の生物学的影響は、その固有の特性の関数として変化しうることは当然であるとして、材料を知ることの重要性を強調するつもりである（17）。(17）さらに、異なる試験では、試験の適用可能な領域内においてのみ、異なる問題を扱う可能性があるため、試験システムを知ることが重要である。(18）GBMの生物学的影響を理解するためには、in vitroからin vivoモデルにまたがる複数の試験系を用いた体系的な研究が必要である。さらに、これらの新規材料の社会的利益を最大化するためには、人の健康と環境の両方に細心の注意を払う必要がある(19,20)。
グラフェン系材料の合成と特性評価
グラフェン研究における重要な懸念の一つは、「グラフェン」という用語が、さまざまなGBMを表現するために汎用的に使用されていることである(17,21)。(この状況を改善する試みとして、Graphene Flagshipは、グラフェン層の数、平均横方向サイズ、および炭素-酸素（C/O）原子比という3つの重要なパラメータを考慮したGBMの分類体系を提案した(22)。(このような分類の枠組み（図1）（および参考情報も参照）を用いることで、異なる研究室で行われた研究間の比較が容易になり、特定の物理化学的特性とGBMの安全性プロファイルとの関連付けも可能になると思われる。
図1
図1. グラフェン系材料の分類の枠組み。文献(22)の許可を得て再掲載。Copyright 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, KGaA, Weinheim.
グラフェン系材料の合成
さまざまな合成方法論に関する文献が多数報告されているが(23-25)、グラフェン材料を毒性評価を含む生物学的用途に製造する場合、一定の要件を満たす必要がある。一般に、in vitro 試験では、材料は安定な水溶液として提供されなければならず、不純物の量は慎重に管理されなければならない (17)。また、無菌状態や無菌溶媒で製造されないことが多いため、合成に起因する化学的汚染に加え、微生物や微生物の一部（エンドトキシン）等の生物学的汚染も考慮する必要がある(26)。(26）以下に、生物学的応用に向けたGBMを得るための一般的なアプローチをいくつかまとめる。
グラフェン
グラフェン分散液は、超音波を用いたグラファイトの剥離によって製造することができる(27)。(水中での剥離を成功させるためには、層間に小分子や溶媒を介在させる方法が一般的である（27）。例えば、クロリン-e6（Ce6）を挿入すると、生体適合性媒体（水またはリン酸緩衝液）中でグラファイトの剥離に成功することが示された(28)。(28) また、植物抽出物を用いて、水中での超音波処理によるグラファイトの剥離も行われている(29)。(29）さらに、通常のキッチンブレンダーを用いて、異なる動物血清中のグラファイトを液相剥離し、低毒性のグラフェン懸濁液にした。Liuらは、別のアプローチで、マイクロ波照射下で過硫酸アンモニウムや過酸化水素を介在させてグラファイトを剥離することにより、高品質の多層グラフェンを大量に製造する効果的な方法を考案している(30)。(31) 照射により、酸化剤が気体酸素に分解され、剥離が生じる。また、ボールミル処理により、安定なグラフェンの水分散体を作製することもできる。特に、メラミンとの相互作用によるグラファイトの剥離は、欠陥の少ない材料を製造することを可能にする(32)。(32) その後、余分なメラミンを透析で除去することができる。さらに、この水性グラフェン懸濁液を凍結乾燥すると、水性媒体への分散が容易な数層（FLG）グラフェンの軟粉末が得られる。グラフェンフラグシップで開発されたこのプロセスは、以下の4つのステップで構成されている。(i) グラファイトへの有機分子（メラミン）のメカノケミカルインターカレーションと、それに続く水への懸濁。 (ii) 懸濁したグラフェンを洗浄し、メラミンをほとんど除去。 (iii) 安定したグラフェンシートを分離。(34)
酸化グラフェン(GO)
GOの合成法として提案されている方法の多くは、酸化試薬と酸を用いる修正Hummersプロトコルによるグラファイトの酸化をベースにしている。しかし、この方法では、酸化の度合いや不純物が異なるGOが得られる。このため、純度を上げるためには、さらに精製工程が必要である。(35）出発黒鉛材料は、一般的な収率だけでなく、得られるGOシートの構造的特性にも重要な役割を果たすことが報告されている。(36) Coleman らは、最近、水性分散液中で超音波処理を行い、異なるサイズのGOシートを作製し、超音波処理の全エネルギーとGOシートの平均サイズとの関係を調査した(37)。(37）市販の調製品で遭遇するいくつかの落とし穴を回避するため、グラフェン・フラグシップでは、グラファイトフレークからGO懸濁液を特別に製造した。この水性懸濁液は、化学的純度の高い単層から数層のGOシートのエンドトキシンフリー懸濁液を確保するために改良されたHummersの方法（35）に従って製造された(26,36)。(これらの材料は、生物学的影響に関するこれらの物理 化学的特性の役割を評価するために、様々な横方向寸法や厚 さのものが存在する（38,39）。さらに、各合成の品質、再現性、バッチ間変動の低さを確認するために、一連の特性評価技術が確立されている(40,41)。(42)
還元型グラフェン酸化物 (rGO)
rGOを得るための代表的な方法としては、GOの化学的還元、熱還元、電気・光化学還元がある。化学的還元法は、品質や効率が向上し、安定したrGOの分散液が得られることから、非化学的還元法に比べて優位にある。最も効果的な化学還元剤はヒドラジンであるが、この試薬は人体や環境に対する毒性があるため、あまり普及していない。過去10年の間に、ヒドラジンやその他の毒性のある化学物質は、「グリーン」還元剤と呼ばれる、より生体適合性が高く、環境に優しい還元剤に取って代わられた(43)。(43) その例としては、ビタミン C、(44) デンプン系材料、(29) 糖類、(45) 植物抽出物、(46) あるいは微生物などがある。(47) しかしながら、これらの還元剤でさえ、精製プロセスや大量生産の難しさといった欠点がある。(48) 最近の研究では、還元剤非存在下で、50℃の超音波照射によりGOをrGOに還元した(49)。(49) GO の還元は、大気中でも簡単な熱処理を行うだけで十分であることがよく示されている。(50) これは，高速であることと，外来元素（ヒドラジン使用時の窒素など）による材料の汚染を避けることができる点で魅力的である．保護雰囲気（真空、不活性ガス）中で加熱すると、かなり高いC/O比が得られる。(51)
上述した合成法の多くは、高品質のグラフェンを得ることができるが、これらの方法をスケールアップすることは不可能であるため、工業的な応用には限界がある。したがって、簡単かつ低コストで大量の生体適合性グラフェンを得ることは、依然として大きな課題である。グラファイトの液相剥離などの方法（52,53）、「グリーン」な還元試薬（蜂蜜など）（54）や剥離剤（スクロース、グルコース、絹タンパク質など）（55～57）、マイクロ波（58）やボールミル（59,60）などの技術は、経済的に実現可能かつ環境に優しい方法でグラフェン分散体の濃度を高めるために採用された最新のアプローチである。近年、グラファイトを電気化学的に剥離する方法が開発されている（61）。 この方法は大きな可能性を秘めているが、プロセス中に欠陥が発生するため、グラフェンの品質はまだ低い(61)。(61) GOはより容易に製造することができ、企業はすでに数百キログラムのGOを製造することができる。
グラフェン系材料の特性評価
適切なハザード評価を行うためには、標準化され検証された特性評価技術を使用して、材料を十分に特性評価する必要がある(62)。(62）利用可能なGBMの多様性を考慮すると、すべての毒性学的および薬理学的研究において、物理化学的特性の説明を提供する必要がある。(化学的特性の評価には、X線光電子分光法（XPS）、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、ラマン分光法、X線回折（XRD）、熱重量分析（TGA）および元素分析が最もよく使用される技術である（63）。透過型電子顕微鏡（TEM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、原子間力顕微鏡（AFM）により、材料の形態と寸法に関する情報を得ることができる（表1）。ナノ・バイオ材料のエンドトキシン含有量の確認には、リムルスアメーバ細胞溶解液（LAL）アッセイが一般的に用いられているが、最近の研究により、GBMがこのアッセイに干渉することが示され、マクロファージを用いた代替アッセイが提案されている(26)。(26）エンドトキシンの混入は、バイオマテリアルの生物学的効果を覆い隠したり、誤解を招いたりする可能性があり、その医療利用を阻む。(64)
表1. グラフェン系材料の特性評価
●特性評価
・技術
●横方向
・電子顕微鏡 (TEM, SEM)
・原子間力顕微鏡 (AFM)
・動的光散乱 (DLS)
●層数
・電子顕微鏡(TEM)
・原子間力顕微鏡(AFM)
・ラマン分光法
●表面電荷
・ ζ-ポテンシャル
●C/O原子比
・X線光電子分光法(XPS)
・元素分析
●化学構造・機能化
・ X線光電子分光 (XPS)
・元素分析
・ラマン分光
・熱重量分析(TGA)
・ζ-ポテンシャル
・フーリエ変換赤外分光法(FTIR)
●金属不純物
・X線電子回折(XRD)
・全反射蛍光X線分析(TXRF)
・原子吸光分光法
・誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)
●エンドトキシン含有量
・リムルスアメーバ細胞溶解液(LAL)アッセイ
・マクロファージベースのTNF発現試験（TET）
特定のグラフェン材料（GOなど）を選択的にもたらす合成手法を用いた場合でも、最終生成物は均一ではなく、異なる特性を持つ成分が広く分布していることが多いことに留意することが重要である。したがって、例えば異なる臓器における生物濃縮の観点から、一見矛盾した結果が文献に現れているが（後述）、これらの相違は、異なるグラフェンの形態の存在や、異なる生物学的モデル系の使用に起因する可能性があることを指摘することが重要である。一般に、GBMの毒性（あるいは安全性）は、サイズ、層数、表面化学などの物理化学的性質に依存する（22）（補足テキストおよび図S1）。さらに、不純物の存在や使用されるグラフェン合成手法も、毒性反応に影響を及ぼす可能性がある（65）。(65）後述するように、材料の横方向寸法は重要なパラメータの一つである。また、グラフェン層の数も、比表面積、吸収能力、曲げ剛性などを決定する上で重要である。表面積は層数に反比例するため、層数が少なくなるほど生体分子に対する吸着能（バイオコロナ形成能）（10）が高くなることが予想される。GBMは多種多様な化学的表面を有している可能性がある。したがって、原始的なグラフェンの表面は疎水性であり、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドロキシル基などの広範な酸素化機能を有するGOの表面は高い親水性を示すが、rGOは中間の特性を呈する。この酸化の度合い（C/O比）の違いが、タンパク質や他の生体分子との相互作用を決定していると考えられる。(さらに、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール、キトサン、プルロニックによる官能基化は、GBMの生体適合性を調節する(67-69)。(67-69）機能化は、材料の表面電荷に影響を与え、細胞の内在化およびその他の生物学的相互作用に影響を与える可能性がある。結論として、GBMの調製方法は、生体系への潜在的な影響にとって重要である。さらに、特定の用途においては、品質と規制基準の遵守が重要となる。このような用途では、生産された材料の不均一性（単一の生産者のバッチ間変動または異なる生産者間の変動）および国際基準や規制基準の欠如は、おそらく初期の市場投入のためではなく、より広い受容と市場浸透のために重要な問題である。さらに、GBMの臨床応用の文脈では、異なる合成バッチ間で観察される現在の中〜高度の変動性を克服しなければならない問題の1つです。GBMの承認と登録を可能にするためには、製造方法がより良いGMP（Good Manufacturing Practice）コンプライアンス（例えば、狭い多分散性、均質な機能化）へと進歩する必要があるのです。
材料特性の役割を徹底解剖
参考資料ライブラリ
生物学的影響に対する（ナノ）材料特性の役割を解明するためには、適切な参照材料ライブラリへのアクセスを検討する必要があります。2009年、Nelと共同研究者は、主要なクラスのナノ材料とナノ粒子を含む標準ナノ材料ライブラリの作成を提案した（70）。(70）著者らは、「本質的な材料特性から毒性メカニズムを解釈できるように、ライブラリ開発をナノ材料分類と関連付けることが重要である」と述べている。それ以来、そのような材料ライブラリの例がいくつか出てきている。そこで、金属酸化物の毒性を試験するためのカスタムデザインの材料ライブラリが、そのようなナノ粒子の製造と特性評価に利用できる確立された方法を考慮して開発された。(Walkey ら（72）は、105 種類の表面修飾金ナノ粒子のライブラリに形成される血清タンパク質のコロナ「フィンガープリント」を特徴づけ、それによって、そのようなナノ粒子に対する生物学的反応を予測するための定量的関係を開発するための豊富な情報源を提供している。Zhou ら（73）は、80 種類の機能化カーボンナノチューブのコンビナトリアルライブラリーを開発し、細胞毒性および免疫応答に関する構造活性相関を明らかにした。最近、細胞や生物学的に関連する生物の迅速なスクリーニングを可能にするライブラリを生成するために、計算方法とナノ材料の特性の組み合わせに依存する体系的な方法論が提案されている(74)。著者らは、化学組成によって特徴付けられるナノ材料およびナノ粒子から構成され得るライブラリの例を示している(74)。グラフェンは、カーボンナノチューブやフラーレンとともに、ナノカーボンのファミリーに含まれていた。しかし、グラフェンは、ナノチューブやフラーレンとは化学構造が著しく異なるため、化学組成だけが考慮すべきパラメータではないと考える。さらに、グラフェンは、異なる特性、すなわち異なる生物学的効果を持つ一群の物質を構成している。(最近、特定の明確なパラメータに従ってGBMを分類する試み（21,22）が行われたが、これは、グラフェンおよびその誘導体を含む参照ライブラリーの開発に向けた重要な第一歩であり、構造活性相関を詳細に解析して生物効果を評価することが可能となる。例えば、欧州委員会の共同研究センター（JRC）のナノマテリアルリポジトリには、まだ GBM が含まれていない。これは、国際標準化機構（ISO）がグラフェンおよび関連材料の定義と材料仕様についてまだ審議中であることと関係がありそうだ。グラフェンを代表的な工業用ナノ材料として前述のリポジトリに含め、十分に特性評価されたGBMの特定の参照ライブラリを作成することは、基礎研究や規制研究においてベンチマークを目的とした基礎的なものとなるだろう。しかし、現時点では、主に文献に報告されている個々のGBMの物理化学的特性に依存する必要がある
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