SARS-CoV-2のRNAが逆転写され、ヒトゲノムに組み込まれる
【 解説 】
新型コロナ感染者が回復後も長期間PCR検査陽性になる原因の一つが、RNAがDNAに逆転写されることで、DNAがコロナ関連タンパクを産生するためと仮設を立てた。研究者は実験で実際に新型コロナRNAがDNAにトランスフェクトすることを確認したという論文。
本文に以下のように記述されています。
「ヒトの細胞では、内因性の逆転写酵素（RT）活性が観察されており、逆転写の産物がゲノムに組み込まれることが示されている」
ヒトのDNAから作られたRNAが逆転写されても問題は起きない。しかしウイルスやワクチン由来のRNAが逆転写されれば、LongCOVIDと言われるような長期の後遺症の原因になると考えられる。
このページの最下部に、ザッカーバーグ氏が会議で、ワクチンはDNAを書き換えると発言している内部リーク動画。
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.12.422516v1.full
SARS-CoV-2のRNAが逆転写され、ヒトゲノムに組み込まれる
Liguo Zhang, Alexsia Richards, Andrew Khalil, Emile Wogram, Haiting Ma, Richard A. Young, Rudolf Jaenisch
概要
SARS-CoV-2のRNAが長期間にわたって排出され、PCR陽性反応が再発することが回復後の患者で広く報告されているが、これらの患者はほとんどの場合、非感染者である1-14。そこで我々は，SARS-CoV-2のRNAが逆転写されてヒトゲノムに統合され，統合された配列が転写されることでPCR陽性反応が生じるのではないかと考えた。この仮説を裏付けるように、SARS-CoV-2に感染した培養細胞や患者の初代細胞の公表されたデータセットの中に、ウイルスの配列と細胞の配列が融合したキメラ転写物が見つかり、ゲノムに統合されたウイルスの配列が転写されていることが確認された。ウイルスのレトロインテグレーションの可能性を実験的に裏付けるために、我々は、SARS-CoV-2のRNAがLINE-1要素からの逆転写酵素（RT）またはHIV-1 RTによってヒト細胞内で逆転写され、これらのDNA配列が細胞ゲノムに統合され、その後、転写される可能性があるという証拠を示した。ヒトの内因性LINE-1の発現は、SARS-CoV-2の感染時や培養細胞でのサイトカイン曝露により誘導されたことから、患者におけるSARS-CoV-2のレトロインテグレーションの分子メカニズムが示唆された。SARS-CoV-2感染症のこの新しい特徴は、患者が回復後もウイルスRNAを産生し続ける理由を説明し、RNAウイルス複製の新たな側面を示唆するものである。
はじめに
SARS-CoV-2のPCR検査では、初感染から回復して数週間から数カ月後に、継続的または反復的に陽性となる患者が報告されている1-14。最近、回復後のSARS-CoV-2の善意の再感染が報告されているが15、COVID-19から回復した被験者を厳格に隔離したコホートベースの研究では、「再陽性」の症例は再感染によるものではないことが示唆された16,17。さらに、これらのPCR陽性患者から複製能力のあるウイルスは分離されず、拡散もしなかった1-3,5,6,12。このように長期間にわたって繰り返しウイルスのRNAが生成される原因は不明である。SARS-CoV-2をはじめ、SARS-CoV-1やMERSなどのβ-コロナウイルスは、正鎖RNAウイルスとして、RNA依存性RNAポリメラーゼを用いてゲノムRNAを複製し、サブゲノムRNAを転写する18-20。一つの可能性として、SARS-CoV-2のRNAが逆転写されてヒトゲノムに統合され、統合されたDNAコピーの転写がPCR検査の陽性の原因となっているのではないかと考えられる。
ヒトの細胞では、内因性の逆転写酵素（RT）活性が観察されており、逆転写の産物がゲノムに組み込まれることが示されている21,22。例えば、APPの転写産物は、内因性RTによって逆転写され、その結果、APP断片が神経細胞のゲノムに組み込まれて転写されることが示されている22。自律型レトロトランスポゾンの一種であるヒトのLINE-1要素（ヒトゲノムの約17％）は、自身やAluなどの非自律型要素を逆転写することができ、内因性RTの潜在的な供給源となっている21,23。
結果
感染した培養細胞および患者由来の細胞におけるウイルスと細胞のキメラ転写産物の発現は、ウイルス配列のゲノム統合と一致する
ウイルス感染細胞へのウイルスの組み込みの可能性を調べるために、SARS-CoV-2感染細胞の公開されているRNA-Seqデータを解析し、ウイルスがゲノムに組み込まれて発現していることを示すキメラ転写産物の証拠を探した。これらのデータセット24-30（図S1a-b）を調べたところ、かなりの数の宿主とウイルスのキメラリードが検出された（図1a-c, S1c）。これらは、肺、心臓、脳、胃などの組織から採取した細胞やオルガノイド、COVID-19患者から直接採取したBALF細胞など、複数のサンプルタイプで発生した（図1c）。キメラリードの量は、サンプルの種類にかかわらず、ウイルスRNA量と正の相関がありました（図1c）。重症のCOVID19患者由来の気管支肺胞洗浄液細胞では、キメラリードの数が69.24%と最大であり、患者の血液のバフィーコート細胞ではキメラリードがほとんどなかった（SARS-CoV-2の総リード数がほとんどないことに対応）。大半のキメラ接合体は、SARS-CoV-2のヌクレオカプシド（N）配列にマッピングされた（図1d-e）。これは、ヌクレオカプシド（N）RNAが最も豊富なSARS-CoV-2サブゲノムRNA31であり、逆転写や統合の標的となる可能性が最も高いという知見と一致する。これらの解析結果は、SARS-CoV-2のRNAが感染細胞のゲノムにレトロインテグレーションし、ウイルスと細胞のキメラ転写産物を産生しているのではないかという仮説を支持するものである。
SARS-CoV-2のRNAは、逆転写酵素を過剰発現させた細胞で逆転写され、ヒトゲノムに組み込まれる可能性がある
SARS-CoV-2のRNAが逆転写され、組み込まれることを実験的に証明するために、HEK293T細胞でヒトLINE-1またはHIV-1逆転写酵素（RT）を過剰発現させ、その細胞にSARS-CoV-2を感染させた。感染から2日後に、PCRまたは蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）により、細胞のウイルス配列を調べた（図2a）。N RNAは最も豊富なSARS-CoV-2サブゲノムRNA31であり、レトロインテグレーションされる可能性が最も高いことを考慮して（図1d-e）、COVID-19試験で使用される4つのN -ターゲティングPCRプライマーセットを選択した（プライマーソースはWHO32、図2a）。精製した細胞DNAをPCRで増幅したところ、ヒトLINE-1またはHIV-1 RTを過剰発現させた細胞では陽性のゲルバンドが認められたが（図2b）、非導入細胞や非感染細胞では認められなかった。N配列のDNAコピーが細胞のゲノムに組み込まれているかどうかを調べるために、細胞のゲノムDNA（gDNA、23kb以上、図S2a）をゲル精製し、3種類のRTを発現している細胞のgDNAにN配列があることをqPCRで確認した（図2c）。CMVのプロモーターでLINE-1を強く発現させた細胞では、N配列の検出シグナルが8倍以上になったことから、LINE-1を天然のプロモーター（5'UTR）やHIV-1 RTで発現させた細胞に比べて、統合されたN配列のコピー数が多いことが示唆された（図2c）。CMV-LINE-1を過剰発現させた細胞のgDNAから完全長のN DNAをクローニングすることができ、その塩基配列をサンガーシークエンスで確認した（Fig.S2b）。5'UTR-LINE-1やHIV-1 RTをトランスフェクトした細胞のgDNAからは完全長のN配列が検出されなかったが、これはこれらの細胞ではRTの発現量が少ないためと考えられる（Fig.S2b）。さらに、感染細胞から精製したSARS-CoV-2のRNAが、LINE-1またはHIV-1 RTを発現させた細胞のライセートによってin vitroで逆転写されることを確認した（図S2c-d）。
私たちは、ウイルスのN配列が組み込まれていることを確認するために、Nを標的とした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて1分子RNA-FISH（smRNA-FISH）を行い（図2a）、核内での転写を検出した。SARS-CoV-2感染細胞は、期待通りのN RNAの細胞質FISHシグナルを示した（図S3a）。LINE-1を過剰発現させた細胞では、細胞核にN RNAのFISHシグナルが検出され（図2d、S3b）、統合されたN配列の新生転写部位を示した。同じ細胞集団において、LINE-1 ORF1pの免疫染色で示されるように、LINE-1を過剰発現している感染細胞は、LINE-1を過剰発現していない細胞（～12%）に比べて、有意に高い割合（～35%）で核内Nシグナルを示した（図2e）。LINE-1プラスミドをトランスフェクションした感染細胞（トランスフェクション効率は～80％）は、トランスフェクションしていない細胞（13％）に比べて、核N FISHの陽性シグナルを示す割合が有意に高かった（～30％）；図S3c）。感染したがトランスフェクションを受けていない細胞も、頻度は低いものの核Nシグナルを示し（～10％；図2e、S3c）、細胞内在性RT活性によるSARS-CoV-2 N RNAの統合を示唆している。
SARS-CoV-2感染やサイトカインによって誘発されるヒト内因性LINE-1の発現は、レトロインテグレーションと相関する
ヒトのLINE-1要素は、自律的なレトロトランスポゾンであり、コード化された逆転写酵素（ORF2p）とサポートタンパク質（ORF1p）は、Aluなどの細胞内RNAのような非自律的な要素のレトロトランスポゾンを助ける働きもある21。私たちは、SARS-CoV-2の感染に伴い、LINE-1要素の発現が、公開されている細胞のRNA-Seqデータで有意に上昇し、キメラリードの量と相関していることを発見した（図3a-b、S4a-d、効率的に感染したCalu3細胞と、感染に抵抗性のあるNHBE細胞を比較）。Calu3での発現量はNHBEでの発現量よりも高くはなかったが、複数のLINE-1要素が発現していた（図3a、S4b、d）。LINE-1に特異的なプライマー33,34を用いた発現解析では、SARS-CoV-2に感染したCalu3細胞ではLINE-1が約3～4倍に増加していた（図3c）。さらに、Calu3細胞のDNAをPCRで解析すると、感染後にSARS-CoV-2のN配列がレトロインテグレーションしていることがわかった（図3d-e）。これは、活性化したLINE-1の逆転写酵素によるものと思われる。
SARS-CoV-2などのコロナウイルスに感染した患者では、免疫反応に伴うサイトカインの誘導が認められ、重症の場合にはサイトカインストーム35-37が発生することから、サイトカインだけでLINE-1の活性化が誘導できるかどうかを検討した。ミエロイド細胞、ミクログリア細胞、CAR-T細胞の培養液にサイトカインを加えて細胞を処理したところ、PCR解析により内在性LINE-1の発現が約2～3倍に増加したことがわかった（図3f、S5b）。発現したLINE-1タンパク質（ORF1p）は、免疫蛍光染色でも確認された（図3g-h, S5a）。以上の結果から、ウイルス感染によるストレスやサイトカインにさらされた細胞では、LINE-1の発現が誘導されることが明らかになり、ヒト細胞におけるSARS-CoV-2のレトロインテグレーションの分子メカニズムが示唆された。
考察
本研究では、SARS-CoV-2のRNAが、活性化されたヒトLINE-1や共同感染したレトロウイルス（HIV）など、いくつかの逆転写酵素源によって逆転写され、ヒトゲノムに統合されることを示した。我々は、SARS-CoV-2の感染やサイトカインの暴露によってLINE-1の発現が誘導されることを発見し、患者におけるSARS-CoV-2のレトロインテグレーションの分子メカニズムを示唆した。さらに、統合されたSARS-CoV-2の配列は、RNA-SeqおよびsmRNA-FISHデータが示すように、転写される可能性があることが示唆された。これは、最初にウイルスに感染した後、検出可能な感染性ウイルスが存在しない場合に、後からウイルス配列が存在することを説明できる可能性を示している1-14。SRAS-CoV-2のレトロ挿入された配列は、サブゲノム断片である可能性が高い。というのも、統合ジャンクションはほとんどがN配列に集中しており（図1d-e）、感染性ウイルスの産生は考えられないからである。今回のデータは、患者が病気の症状から回復した後、PCR1,8-14で検出されるウイルス配列が再び陽性になることの説明にもなる。
今後の重要な課題は、これらの統合されたSARS-CoV-2配列がウイルス抗原を発現するかどうかである。もしそうであれば、統合されたウイルス断片から発現するウイルス抗原が、患者の免疫反応を引き起こし、病気の経過や治療に影響を与えるかどうかを評価することは、臨床的に興味深いことである。統合されたウイルス断片の臨床的影響は、ヒトゲノムへの挿入部位や、HIV患者で明らかになっているエピジェネティックな制御に依存する可能性がある38。患者のサンプルにおけるSARS-CoV-2のレトロインテグレーション部位を慎重に分析し、疾患の重症度との相関関係を調べることは、潜在的な臨床的影響を解明するのに役立つだろう。さらに、免疫反応は個人の基礎疾患に応じて変化する可能性がある。今回の結果は、デング熱、ジカ熱、インフルエンザウイルスなど、一般的な病気の原因となるRNAウイルスにもレトロインテグレーションが起こり、病気の進行に影響を与える可能性があることを示唆しています。
ヒトのLINE-1は、ヒトゲノムの約17%を占め、50万コピーのうち約100コピーが活性化している21,23。LINE-1にコードされている逆転写酵素（ORF2p）とそれをサポートするタンパク質（ORF1p）は、LINE-1の転写産物（Cis）だけでなく、Alu（SINE）や細胞内のmRNAなどの他のRNA種（Trans）も、「ターゲットサイト-プライミング逆転写」のメカニズムで逆転写することが知られている21。LINE-1タンパク質は、高いRNA結合親和性を持つ核酸シャペロンとして知られており39、したがって、外因性のウイルスRNAをレトロインテグレーションすることができても不思議ではない。進化論的には、LINE-1によるウイルスRNAのレトロインテグレーションは、抗原の発現を持続させるための宿主の適応反応であり、防御免疫を高める可能性がある。逆に、ウイルスRNAのレトロインテグレーションは有害であり、患者に「サイトカインストーム」や自己免疫反応のようなより深刻な免疫反応を引き起こす可能性がある。
今回の結果は、現在行われている抗ウイルス療法の臨床試験にも関連する可能性があります40。PCR検査では、感染性ウイルスではなく、ゲノムに安定的に組み込まれたウイルス配列からのウイルス転写物が検出される可能性があるため、ウイルス複製やウイルス量に対する治療効果を評価するためにPCR検査に依存することは、ウイルス複製を抑制する治療の効果を反映していない可能性があります。
http://www.qlifepro.com/news/20190903/line1.html
ザッカーバーグ氏が会議で、ワクチンはDNAを書き換えると発言している内部リーク動画。