論文：デルタ変異株の複製と免疫回避

2021年10月23日 06:49

（論文タイトル）
SARS-CoV-2 B.1.617.2 Delta variant replication and immune evasion
SARS-CoV-2 B.1.617.2デルタバリアントの複製と免疫回避
By Petra Mlcochova(University College London | UCL · Division of Infection and Immunity), Steven A. Kemp, [...]Ravindra K. Gupta

【解説】
この論文ではウイルスをB.XXXと表現しているので、どの変異株を意味しているか書いておきます。アルファ株（B.1.1.7系統）、カッパー株（B.1.617.1系統）、デルタ株（B.1.617.2系統）
また、最初に武漢で見つかったウイルスを Wuhan-1 としています。
ファイザー、モデルナ共に、このWuhan-1の遺伝子配列を元にｍRNAを開発しています。
ChAdOx1ワクチンとはアストラゼネカのワクチンのことです。

武漢株に対して作られたワクチンは、武漢株と比較してデルタ株に対する中和抗体の感受性が1/6、ワクチン誘発抗体に対する感受性が1/8しかない。

デルタ株は、中和抗体を持つワクチン接種者であっても、気道での細胞融合を誘発し、より高い病原性を示す可能性がある。

デルタ株は、現在のワクチンの免疫をすり抜ける能力が高い。そのため、ワクチンを接種しても十分な感染防止、発病防止が出来ないことが実験で確かめられた。

結論として、変異株に対するワクチン反応を高める戦略が必要としている。
つまり、今のワクチンは、変異株に対して有効性は十分でないということ。

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03944-y

概要

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のB.1.617.2（Delta）変異体は、2020年末にマハラシュトラ州で初めて確認され、B.1.617.1（Kappa）やB.1.1.7（Alpha）1などの既存の系統を凌駕してインド全土に広がった。In vitroにおいて、B.1.617.2は、D614Gを持つ野生型のWuhan-1と比較して、回復者の血清中和抗体に対する感受性が6倍、ワクチン誘発抗体に対する感受性が8倍低い。B.1.617.2に対する血清中和力は、ChAdOx1ワクチン接種者の方がBNT162b2ワクチン接種者よりも低かった。B.1.617.2スパイクのシュードタイプウイルスは，受容体結合ドメインとアミノ末端ドメインに対するモノクローナル抗体に対する感度が低下していた．B.1.617.2はB.1.1.7よりも高い複製効率を示したが，これはB.1.617.2スパイクがB.1.1.7スパイクに比べて優位に切断された状態にあることと関連している。B.1.617.2スパイクタンパク質は、野生型スパイクと比較して、中和抗体による阻害の影響を受けにくい高効率なシンシチウム形成を媒介することができた。また、B.1.617.2はB.1.617.1に比べて複製能力やスパイクを介した侵入能力が高く、B.1.617.2の優位性を説明できる可能性があることもわかった。系統が混在していた時期にインドの3つの施設でSARS-CoV-2に感染した130人以上の医療従事者を対象とした解析では、B.1.617.2に対するChAdOx1ワクチンの効果が、非B.1.617.2と比較して低下していることが確認されたが、交絡が残っている可能性もある。高い適合性と免疫回避性を持つB.1.617.2 Delta変異体に対するワクチン効果の低下は、ワクチン接種後の感染対策を継続する必要がある。

主な内容

2020年半ばにインドで発生したSARS-CoV-2感染の第一波は比較的軽度であり、全国的なロックダウンによって抑制された。制限の緩和後、インドでは2021年3月以降、コロナウイルス感染症2019の症例が拡大し、死亡者が続出し、死者数は40万人を超えています。2020年後半に英国からの渡航によって導入されたB.1.1.7アルファ亜種の症例がインド北部で拡大し、ワクチン誘発性中和抗体に対する感受性を維持しながら、D614Gスパイク置換を有する過去のバージョンのウイルスよりも感染力が高いことが知られています2,3。B.1.617亜型は、20204年末にマハラシュトラ州で初めて確認され、インド全土および少なくとも90カ国に広がっています。

最初に検出されたサブ系統はB.1.617.1であり（参考文献1）、続いてB.1.617.2が検出されたが、いずれもB.1.427/B.1.429でも観察されたスパイクの受容体結合モチーフ（RBM）のL452Rの置換を有していた（参考文献1,5）。この変異は、感染力を高め、中和抗体に対する感受性をわずかに低下させることが報告されている6,7。その後、B.1.617.2のDelta変異体が、B.1.617.1（Kappa変異体）やB.1.1.7を含む他の系統よりも優勢になっているが、その理由はまだ明らかになっていない。

Deltaバリアントと中和抗体

まず、2021年に入ってからインドで発生したSARS-CoV-2の新規症例におけるバリアントの相対的な割合をプロットした。B.1.617.1が先に出現したものの、デルタバリアントのB.1.617.2がより優勢になっている（図1a）。我々は、B.1.617.2は、過去のSARS-CoV-2感染によって生じた抗体反応に対する免疫回避を示すのではないかという仮説を立てた。そこで，2020年半ばに英国で発生した第1波で感染した12人の血清を用いた．これらの血清について、B.1.617.2ウイルス単離株を中和する能力を、B.1.1.7変種単離株およびスパイクにD614Gを有する野生型（WT）Wuhan-1ウイルスと比較して検証した。Delta変異体には、スパイクにいくつかの変化があり、それらは構造内の機能を変化させると予測される位置に配置されている（図1b）。その結果、B.1.1.7株はWT株に比べて血清に対する感受性が2.3倍低く、B.1.617.2株は5.7倍低いことがわかった（図1c）。また、同じアッセイにおいて、南アフリカで初めて同定されたB.1.351β変異体は、WTに比べて中和感受性が8.2倍低下していたことも重要である。

b, SARS-CoV-2のB.1.671.2スパイク三量体の表面表現(PDB: 6ZGE)。赤はL19R、緑はdel157/158、青はL452R、黄はT478K。白の点線枠はD950Nの置換の位置（オレンジ）を示す。 c, 2020年半ばの回復期のヒト血清によるDeltaバリアントの中和。B.1.17（Alpha）、B.1.351（Beta）、B.1617.2（Delta）変異体の100TCID50のWTに対する血清中和のフォールドチェンジ（IC19）；n＝12。d, ワクチン接種者（n = 10 ChAdOx1またはn = 10 BNT12b2）の血清によるB.1617.2生ウイルスの中和、B.1.1.7およびWuhan-1 WTとの比較。e, ワクチン血清（n = 33 ChAdOx1またはn = 32 BNT162b2）によるB.1.617スパイクPVおよびWT（Wuhan-1 D614G）の中和。データは2つの独立した実験の代表であり、それぞれ2つのテクニカルレプリケートを持つ。*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (Wilcoxon matched-pairs signed rank test); NS, not significant.

同じB.1.617.2生ウイルスを用いて、ChAdOx1またはBNT162b2を2回接種した後の個人を対象に、ワクチンによって誘発される血清中和抗体の感受性を調べた。この実験では、D614Gを持つWT Wuhan-1と比較して、B.1.617.2に対する感受性が、両方のワクチン血清セットで約8倍低下し、B.1.1.7に対しては統計的有意性に至らない低下が見られた（図1d）。さらに、シュードタイプ・ウイルス（PV）システムを用いて、65人のワクチン接種を受けた血清の中和力を調べたところ、今回はB.1.617.1およびB.1.617.2のスパイクとWuhan-1 D614Gのスパイクを比較することができました（図1e）。ワクチン接種者の人口統計学的データを比較すると、同様の特徴が見られました（拡張データ表1）。DeltaバリアントスパイクPVに対する平均幾何平均力価（GMT）は、ChAdOx1の方がBNT162b2よりも低かった（GMT 654対3,372、P < 0001、Extended Data Table 1）。

B.1.617.2スパイクのエスケープメカニズムとしての役割を、33種類のスパイク特異的モノクローナル抗体を、膜貫通型プロテアーゼセリン2（TMPRSS2）を発現するVero E6標的細胞と、Wuhan-1 D614G SARS-CoV-2スパイクまたはB.1.617.2スパイクを用いたin vitro PV中和アッセイで検証した（拡張データ図1、拡張データ表2）。その結果、3つのアミノ末端ドメインモノクローナル抗体（100％）と9つの非RBMモノクローナル抗体のうち4つ（44％）が、B.1.617.2に対する中和活性を完全に失っていた。RBM結合群では、26個のモノクローナル抗体のうち16個（61.5％）が、B.1.617.2に対する中和活性の著しい低下（2～35倍の減少）または完全な消失（40倍以上の減少）を示した（拡張データ図1）。臨床段階にある5つのRBMモノクローナル抗体のうち、bamlanivimabはB.1.617.2を中和しませんでした。また，REGN-COV2治療用デュアル抗体カクテル8に含まれるイムデビマブは，中和活性が低下していた（拡張データ図1）．
SARS-CoV-2デルタバリアントの複製

まず、肺の上皮細胞株であるCalu-3に感染させ、B.1.1.7とB.1.617.2を比較した（図2a-d）。その結果、B.1.617.2が複製に有利であることが確認され（図2a、b）、また、細胞から放出されるビリオンが増加した（図2c、d）。次に、B.1.1.7とB.1.617.2の2つの分離株をヒト気道上皮モデル（HAE）で比較しました9。この実験でも、B.1.617.2はB.1.1.7よりも複製能力が高いことが確認された（図2e、f）。最後に、初代三次元気道オルガノイド10にB.1.617.2とB.1.1.7のウイルス分離株を感染させたところ（図2g）、B.1.617.2がB.1.1.7よりも有意に複製能力が高いことがわかった。これらのデータは、B.1.617.2がB.1.1.7よりも複製率が高く、その結果、伝達性が高いことを明確に裏付けている。

a-d, B.1.1.7とB.1.617.2を比較したライブウイルス複製。Calu-3細胞に亜種をMOI 0.1で感染させた。a, 細胞ライセート中のqPCRで測定したウイルス量。b, 細胞ライセート中のウイルスタンパク質レベル。c, d, 感染したCalu-3細胞の上清から産生された生ウイルスを回収し、許容性のあるVero E6 ACE2/TMPRSS2細胞に感染させ、ウイルス量（c）またはTCID50 ml-1（d）を測定した。 e, f, HAEシステムにおけるウイルス複製動態。 g, 気道上皮オルガノイド培養における生ウイルス複製。気道上皮オルガノイドにSARS-CoV-2亜種B.1.1.7およびB.1.617.2をMOI1で感染させ，細胞を溶解してtotal RNAを単離した．qPCRを用いて細胞内の核蛋白質遺伝子のコピー数を測定し，Vero E6 ACE2/TMPRSS2細胞への感染により無細胞ウイルスの感染力を測定した．データは2つの独立した実験の代表値である。dpi, days post-infection. h, i, レンチウイルスベクターとSARS-CoV-2 S B.1を発現するプラスミドでトランスフェクションした後の293Tプロデューサー細胞のPVビリオン（h）と細胞ライセート（i）のウェスタンブロット。 .617.1およびデルタバリアントB.1.617.2対WT（D614Gを有するWuhan-1）、HIV-1 p24およびSARS-CoV-2 S2に対する抗体でプローブした。 j, スパイクB.1.617.2およびB.1.617.1対WT D614Gの親プラスミドPVによるCalu-3細胞の侵入。k, B.1.617.1およびB.1.617.2亜種の増殖速度。B.1.617.1およびB.1.617.2のウイルス単離株をCalu-3細胞に接種し、培養上清中のウイルスRNAをリアルタイムRT-PCRで定量した。上澄み液中の放出ウイルスのTCID50を経時的に測定した。アッセイは4重に行った。NS, not significant; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. データは2回の独立した実験の代表である。感染していない細胞はマイナスの記号で表した。NP, ヌクレオカプシドタンパク。

前述の実験では、細胞内のB.1.617.2スパイクは、B.1.1.7と比べて切断された状態の割合が高いことがわかった（図2b）。次に、精製したビリオンを用いてスパイクS2と核タンパク質のウエスタンブロットを行ったところ、B.1.617.2のスパイクは、B.1やB.1.1.7とは異なり、主に切断された状態であることがわかった（拡張データ図2a、b）。

B.1.617.2スパイクを介した細胞融合

細胞膜への侵入経路、および動物モデルにおける実際の感染性は、S1とS2の間の多塩基性切断部位（参考文献9,11,12）と、生産者細胞からビリオンが放出される前のスパイクの切断に決定的に依存している。多塩基性切断部位のP681の変化は、複数のSARS-CoV-2系統で観察されており、特にB.1.1.7α変異体で顕著である13。我々は以前、P681Hを持つB.1.1.7スパイクが、D614GのWuhan-1ウイルスよりも有意に高い融合能を持つことを示した13。ここでは、B.1.617.1スパイクとB.1.617.2スパイクについて、細胞と細胞の融合をモニターするためにスプリットGFPシステムを用いて実験を行った（拡張データ図2c-g）。その結果、B.1.617.1およびB.1.617.2 spikeタンパク質は、WTよりも高い融合活性とシンシチウム形成を媒介したが、これはP681Rが関与していると考えられる（拡張データ図2f、g）。次に、ChAdOx1ワクチン接種者の血清を測定したところ、PV感染細胞に対する中和活性と同様に、細胞間融合が実際に抑制されることが示された（拡張データ図2h）。したがって，B.1.617.2は，中和抗体を持つワクチン接種者であっても，気道での細胞融合を誘発し，より高い病原性を示す可能性があると考えられる。

B.1.617.2スパイクを介した細胞侵入

B.1.617.1およびB.1.617.2スパイク（図2h，iおよび拡張データ図3a，b）のシングルラウンドウイルスエントリーをPVシステムを用いて検証した。内因性レベルのアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）およびTMPRSS2を発現しているCalu-3肺細胞（図2j）、ACE2およびTMPRSS2を導入または一過性にトランスフェクトした他の細胞（拡張データ図3b）に感染させた。B.1.617スパイクタンパク質は、WTとは対照的に、主に切断された形で存在していた（図2h、iおよび拡張データ図3c）。B.1.617.1とB.1.617.2は、WTに比べて侵入効率が1対数増加していることが確認された（Extended Data Fig.3b）。

インドではB.1.617.2よりもB.1.617.1の方が先に検出されており、B.1.617.2がB.1.617.1を凌駕している理由は不明である。B.1.617.2はB.1.617.1よりも内因性受容体を持つCalu-3細胞への侵入が有利であった（Fig.2j）。B.1.617.2はB.1.617.1と比較して、内因性受容体を持つCalu-3細胞への侵入に優位性があり（図2j）、B.1.617.2はCalu-3細胞から分離した生ウイルスを用いて感染力が高いことを確認した（図2k）。

B.1.617.2ワクチンの突破口となる感染症

我々は，B.1.617.2に対するワクチンの有効性が，他の変異体に対するワクチンの有効性に比べて損なわれるという仮説を立てた．2021年初頭に医療従事者（HCW）へのChAdOx1ワクチン（Covishield社）の接種を開始しました。3月から4月にかけて感染者が続出した際、デリーの3次医療機関1施設では、3,800人の従業員のうち、ワクチンを接種した30人のスタッフに症候性SARS-CoV-2が確認された。インドとデリーのゲノムデータから、B.1.1.7が優勢であることが示唆され（図1aおよび拡張データ図4a）、2021年3月中にB.1.617が増加した。HCWのアウトブレイクで発生した症状のある非致死性感染症のショートリードシーケンス14により、大部分がB.1.617.2であり、その他のB系統のウイルスも含まれていることが明らかになった（図3a）。系統解析では、1日から2日以内に採取された、関連性の高い（場合によっては遺伝的に区別されない）配列のグループが示された（図3aおよび拡張データ図4b）。次に、罹患者のワクチン接種歴を詳細に調べました。ほとんどの人が、少なくとも21日前に2回の接種を受けていた。デリーにある他の2つの医療施設（HCWスタッフがそれぞれ1,100人と4,000人）でも、ワクチンによるブレイクスルー感染について同様のデータが得られました（図3b、cおよび拡張データ図4c、d）。病院2では、4週間の間に職員の10％以上に相当する118の配列があった。フィルタリング後、高品質な全ゲノムカバー率95％以上の66件を用いて系統樹を再構築しました。病院3では、70名の有症者が感染しており、フィルタリング後の系統樹の推定には52名の高品質ゲノムを用いました。

a-c, 3つのセンターでワクチン接種を受けたHCWにおけるワクチン突破型SARS-CoV-2配列の最尤系統図。系統樹はIQTREE2を用いて1,000回のブートストラップ複製を行って推定した。SNPs, 一塩基多型。

3つのセンター全体で、B.1.617.2に感染した人とB.1.617.2以外に感染した人の年齢と感染期間の中央値はほぼ同じであり（拡張データ表3）、B.1.617.2が入院のリスクを高めているという証拠はないことがわかりました（拡張データ表3）。次に，B.1.617.2がHCWの症候性感染に対するワクチン効果に与える影響を，他の系統と比較して評価した。多変量ロジスティック回帰法を用いて、年齢、性別、病院を調整した上で、ワクチン接種者と未接種者のB.1.617.2と非B.1.617.2の陽性反応のオッズ比を推定しました15。B.1.617.2の非B.1.617.2に対する調整済みオッズ比は、ワクチン2回接種の場合、5.45（95％信頼区間1.39-21.4、P = 0.018）でした（拡張データ表4）。
考察

SARS-CoV-2 B.1.617.2は、成人のワクチン接種率が高く、既往感染率が高いにもかかわらず、B.1.1.7やB.1.617.1などの他の系統と比較して、複製適合性が高く、中和抗体に対する感受性が低いことが、近年の急速な増加に寄与していることを、in vitroの実験と分子疫学を組み合わせて提案した16。これらのデータは、デリーにおけるデルタの増加の要因として、免疫回避と高い感染力の組み合わせを支持するモデリング分析と一致している17。

本研究では、B.1.617.2生ウイルスによる中和抗体の回避を、回復期患者の血清および2種類のワクチン（アデノウイルスベクターを用いたもの（ChAdOx1）とmRNAを用いたもの（BNT162b2））を接種した人の血清を用いて実証した。今回示されたB.1.617.2に対するイメデビマブの有効性の低下は、B.1.617.2による免疫力低下や慢性的なSARS-CoV-2感染がある場合、臨床効果の低下やエスケープバリアントの選択の可能性を示唆しています（参考文献18）。

また、粘膜表面での感染力の増加や、細胞と細胞の融合・拡散19も、抗体からの「回避」を促進する可能性があることを考慮することも重要である20。実際、我々の研究では、HAEや三次元気道オルガノイド10など、無細胞感染と細胞感染が同時に起こる可能性が高い生理学的に関連した系において、B.1.617.2はB.1.1.7と比較して体力的に優位であることも示されている。これらのデータは、B.1.617.2の感染力が高いという考えを支持している。これは、ウイルス負荷が高いか、粒子の感染力が高いかのいずれかによるものであり、その結果、人から人への感染確率が高くなると考えられる。我々は、B.1.617.2の生ウイルス粒子はB.1.1.7よりも切断されたスパイクの割合が高いことに着目し、これが感染力増加のメカニズムに関与していると仮定した。この仮説は、B.1.617.2のスパイクを持つPV粒子が、さまざまな標的細胞への侵入を著しく促進するという観察結果によって裏付けられた。

最後に、デリーの3つの病院のHCWにおけるChAdOx1ワクチンのブレイクスルー感染を報告し、B.1.617.2に対するワクチンの効果が低下していることを示した。したがって、亜種に対するワクチン反応を高める戦略が必要であり、ワクチン接種後の時代には感染制御手順に注意を払う必要がある。

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方法

血清サンプルおよび倫理的承認

ワクチン接種者の血清中のワクチン誘発抗体の研究については、East of England - Cambridge Central Research Ethics Committee Cambridge（REC ref. 17/EE/0025）から倫理的承認を得た。療養者の血清の使用は、South Central - Berkshire B Research Ethics Committee（REC ref. 20/SC/0206; IRAS 283805）から倫理的承認を得た。HCWを対象とした研究（呼吸器系サンプルの検査および配列決定を含む）は、国立疾病対策センター（NCDC）およびCSIR-IGIBのThe Institutional Human Ethics Committee（NCDC/2020/NERC/14およびCSIR-IGIB/IHEC/2020-21/01）による審査および承認を受けた。参加者はインフォームドコンセントを得た。
シーケンスの品質管理と系統樹解析

インドのデリーにある3つの病院から、3セットのfastaコンセンサス配列を入手した。まず、すべての配列をmulti-fastaファイルに連結した後、mafft v4.487（参考文献21）を用いて、--keeplengthおよび--addfragmentsオプションを用いて参照株MN908947.3（Wuhan-Hu-1）にアラインした。続いて、すべての配列をNextclade v0.15（https://clades.nextstrain.org/）に通して、ギャップ領域の数を決定しました。これを記録し、Pangolin v3.1.5（参考文献22）とpangoLEARN（2021年6月15日付）を用いて全ての配列に系統を割り当てました。系統を割り当てることができなかった配列は破棄しました。系統を割り当てた後、N領域が5％以上ある配列もすべて除外した。

系統はIQTREE v2.1.4 (ref. 23)の最尤法を用いて、GTR + R6モデルで1,000回のラピッドブートストラップを行って推定した。推定された系統樹は、R v4.1.0でgtree v3.0.2（参考文献24）を用いてアノテーションを行い、SARS-CoV-2参照配列（MN908947.3）をルートとした。ノードは降順に並べられ、系統は、各患者が受けたChAdOx1ワクチンの接種回数を示すヒートマップとともに、色付きのチップとして系統図に注記されました。

構造解析

PyMOL Molecular Graphics System v.2.4.0 (https://github.com/schrodinger/pymol-open-source/releases)を用いて、Delta系統(B.1.617.2)を定義する変異の位置を、閉構造のスパイクタンパク質(PDB: 6ZGE)にマッピングした25。
統計解析
HCWにおけるワクチンによる画期的な感染症

人口統計学的データおよび臨床データの記述的分析は、連続的な場合は中央値と四分位範囲、平均値と標準偏差（s.d.）で、カテゴリー的な場合は頻度と割合（%）で示した。連続データとカテゴリーデータの差は、それぞれWilcoxonの順位和検定またはt検定、カイ二乗検定を用いて検定した。Ct値とSARS-CoV-2のバリアントとの関連性は、線形回帰を用いて調べた。従属変数としてのバリアントは、2つのグループに分類した。B.1.617.2 変異体と非 B.1.617.2 変異体に分類した。交絡の有無にかかわらず、年齢、性別、病院、症状が出てから鼻腔ぬぐい液のPCR検査を行うまでの間隔などの共変量をモデルに含めた。

ワクチンの有効性

B.1.617.2変異体のワクチン効果を非B.1.617.2変異体と比較して推定するために、最近発表された方法を採用しました15。この方法は、B.1.617.2亜種と非B.1.617.2亜種に対してワクチンが同等の効果を持つ場合、ワクチン接種を受けた症例と受けていない症例の両方で、それぞれの亜種を持つ症例が同程度の割合で発生することが予想されるという前提に基づいています。この方法では、一方の変異体のバックグラウンドでの有病率が他方の変異体よりも高いという問題が解決されます。ワクチン接種の有無別に、B.1.617.2のバリアントを持つ人の割合を、他のすべての流通しているバリアントと比較して求めました。次に、ロジスティック回帰法を用いて、ワクチン接種を受けた人と受けていない人のB.1.617.2陽性反応のオッズ比を推定しました。最終的な回帰モデルでは、連続変数として年齢を、カテゴリー変数として性別と病院を調整した。これらの共変量の組み込みに対するモデルの感度と頑健性は，最終的なモデルが構築されるまで，共変量をモデルに順次追加し，奇数比と信頼区間への影響を調べるという反復的なプロセスによって検証した（拡張データ表4）．McFadden26が提案したR2指標は、同じモデル回帰の異なる仕様の適合性を検証するために使用された。これは、最終モデルが構築されるまで、年齢、性別、病院などを調整した変数を順次追加していくことで行った。さらに、ベイズ情報基準の絶対差を推定した。最終モデルの適合性を示すMcFadden R2は0.11であり、モデルの適合性は妥当であることがわかった。最終的な回帰モデルに年齢、性別、病院を加えることで、測定された適合度は向上した。しかし、ベイズ情報基準の絶対値の差は、完全モデルと調整変数を除いたモデルの間で13.34であり、解析的モデルを強く支持する結果となった。それにもかかわらず，感度分析（Extended Data Table 4）で共変量の追加に対する頑健性が示されたため，完全調整モデルを最終モデルとして用いた。

中和力価の解析

BNT162b2ワクチンまたはChadOx1ワクチンを2回接種した後のワクチン誘発抗体による中和は、以下に述べるように、血清の連続希釈液の存在下での感染によって決定した。各群のID50をGMTとしてまとめ、群間の統計的比較をMann-Whitney検定またはWilcoxon順位符号検定で行った。統計解析は、Stata v13およびPrism v9を用いて行った。

PV実験

細胞

HEK 293T CRL-3216, HeLa-ACE2 (James Vossより寄贈)およびVero CCL-81細胞を、10%の子牛胎児血清(FCS)、100 U ml-1のペニシリンおよび100 mg ml-1のストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で維持した。すべての細胞は定期的に検査され、マイコプラズマを含まないことが確認されています。H1299細胞はSimon Cookからの寄贈品です。Calu-3細胞はPaul Lehner氏からの寄贈品です。A549 ACE2/TMPRSS2(参考文献27)細胞はMassimo Palmeriniからの寄贈品です。Vero E6 ACE2/TMPRSS2細胞はEmma Thomsonからの寄贈品です。
ワクチン誘発抗体と細胞侵入に対する試験のためのPV準備

SARS-CoV-2 D614のスパイクタンパク質をコードするプラスミドで、カルボキシ末端の19アミノ酸をD614Gで欠失させたものを使用した。変異は、QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis kit（Agilent）を用いて、製造者の指示に従って導入した。B.1.1.7 S発現プラスミドの調製については前述の通りであるが、簡単に言えば、ステップワイズ変異誘発により生成した。ウィルスベクターは、Fugene HDトランスフェクション試薬（Promega）を用いて293T細胞をトランスフェクションすることにより調製した。293T細胞を、11μlのFugene HD、1μgのpCDNAΔ19スパイクHA、1μgのp8.91ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）gag-pol発現ベクター、および1.5μgのpCSFLW（HIV-1パッケージングシグナルを持つホタルのルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現）の混合物でトランスフェクトした。トランスフェクション後48時間および72時間にウイルス上清を回収し，0.45μmのフィルターでろ過した後，前述の方法で-80℃で保存した。TMPRSS2およびACE2をトランスフェクトした標的293T細胞、Vero E6 ACE2/TMPRSS2、Calu-3、A549 ACE2/TMPRSS2、H1299およびHeLa-ACE2細胞におけるルシフェラーゼ検出により、感染力を測定した。
SYBR Greenベースの産物増強PCRアッセイによるウイルス投入量の標準化

ウイルス調製物の逆転写酵素（RT）活性は，以前に説明したように，SYBR Greenベースの生成物増強PCRアッセイを用いた定量的PCR（qPCR）によって決定した28．ウイルス上清の10倍希釈液を、2×溶解液（40％グリセロール（v/v）、0.25％Triton X-100（v/v）、100mM KCl、RNase阻害剤0.8U ml-1、Tris HCl 100mM、pH7.4に緩衝）に1：1の割合で溶解し、室温で10分間放置した。

各サンプルのライセート12μlを13μlのSYBR Greenマスターミックス（0.5μM MS2-RNAフォワードおよびリバースプライマー、3.5pmol ml-1 MS2-RNA、0.125 Uμl-1 Ribolock RNAse inhibitorを含む）に加え、QuantStudioでサイクルした。RT活性の相対量はバクテリオファージMS2 RNAの転写速度として決定し，RT活性の絶対量はRT活性が既知のRT標準物質と比較して算出した。

B.1.617.1とB.1.617.2のウイルス単離の比較

細胞培養

Vero E6 TMPRSS2細胞（アフリカミドリザル（Chlorocebus sabaeus）の腎臓細胞株；JCRB1819）29は、10％FCS、G418（1mgml-1；Nacalai Tesque、カタログ番号G8168-10ML）および1％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン（P/S））を含むDMEM（低グルコース）（Wako、カタログ番号041-29775）で維持した。

Calu-3細胞（ヒト肺上皮細胞株；ATCC HTB-55）は、10％FCSおよび1％PSを含む最小必須培地Eagle（Sigma-Aldrich社、カタログ番号M4655-500ML）で維持した。

SARS-CoV-2 B.1.617.1とB.1.617.2の比較実験

B.1.617系統に属する2つのウイルス、B.1.617.1（GISAID ID: EPI_ISL_2378733）およびB.1.617.2（GISAID: EPI_ISL_2378732）を、日本のSARS-CoV-2陽性者から分離した。バイオセーフティレベル3の実験室で，SARS-CoV-2陽性者から採取した鼻咽頭ぬぐい液100μlをVero E6 TMPRSS2細胞に接種した。37℃で15分間培養した後，維持培地（2％FCS，1％PSを含むEagle's minimum essential medium（富士フイルム和光純薬株式会社，カタログ番号056-08385））を加え，5％CO2下，37℃で培養した。倒立顕微鏡（Nikon）を用いてサイトパシック効果（CPE）を確認し，CPEが観察された培養上清のウイルス量を逆転写を伴うリアルタイムPCR（RT-PCR）で確認した。ウイルスのゲノム配列を決定するために，QIAamp viral RNA mini kit（Qiagen，カタログ番号52906）を用いて培養上清からRNAを抽出した。NEB Next Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolab，カタログ番号E7530）を用いてcDNAライブラリーを調製し，Miseq装置（Illumina）を用いて全ゲノム配列を決定した。

作業用ウイルスを調製するために、100μlのシードウイルスをVero E6 TMPRSS2細胞に接種した（T-75フラスコに5,000,000細胞）。感染後1時間で、培養液を2％FBSおよび1％PSを含むDMEM（低グルコース）（和光、カタログ番号041-29775）に交換し、感染後2〜3日で培養液を回収して遠心分離し、上清を作業用ウイルスとして回収した。

調製したワーキングウイルスの力価を50%組織培養感染量(TCID50)として測定した。感染の1日前に、Vero E6 TMPRSS2細胞（1ウェルあたり10,000個）を96ウェルプレートに播種した。血清で希釈したウイルスストックを細胞に接種し、37℃で3日間培養した。顕微鏡で細胞を観察し、CPEの出現を判定した。TCID50 ml-1値は，Reed-Muench法30で算出した．

感染の1日前に、20,000個のCalu-3細胞を96ウェルプレートに播種した。SARS-CoV-2（200TCID50）を接種し、37℃で1時間培養した。感染した細胞を洗浄し、180μlの培養液を加えた。培養上清（10µl）を指示された時点で回収し，リアルタイムRT-PCRでウイルスRNAコピー数を定量した。
リアルタイムRT-PCR

リアルタイムRT-PCRは、既述の31,32と同様に行った。培養上清5μlを2×RNA lysis buffer（2% Triton X-100, 50 mM KCl, 100 mM Tris HCl (pH 7.4), 40% Glycerol, 0.8 U μl-1 recombinant RNase inhibitor (Takara, catalog no. 2313B)）5μlと混合し，室温で10分間インキュベートした。RNase-free水（90μl）を加え、希釈したサンプル（2.5μl）をテンプレートとして、One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCRキット（Takara社、カタログ番号：RR096A）を用いて、メーカーのプロトコルに従ってリアルタイムRT-PCRを行った。鋳型として，One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCRキット（Takara，カタログ番号：RR096A）と以下のプライマーを用いて，メーカーのプロトコールに従ってリアルタイムRT-PCRを行った：フォワードN，5′-AGCCTCTTCGTTCCTCATC AC-3′；およびリバースN，5′-CCGCCATTGCCAGCCATT C-3′。ウイルスRNAのコピー数は，SARS-CoV-2直接検出RT-qPCRキット（Takara，カタログ番号RC300A）を用いて標準化した。QuantStudio 3 Real-Time PCRシステム（Thermo Fisher Scientific社）、CFX Connect Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社）を用いて蛍光シグナルを取得した。

HAE細胞におけるウイルス増殖動態

気液界面の初代鼻腔HAE細胞はEpithelix社から購入し、HAE細胞を維持するために2〜3日ごとに基礎培地MucilAir（Epithelix社）を交換した。ウイルスの希釈、洗浄ステップおよび回収ステップはすべて、2×GlutaMAX（Gibco社）を含むOptiPRO無血清培地（SFM；Life Technologies社）を用いて行った。洗浄と回収の手順はすべて、200μlのSFMをアピカル面に加え、37℃で10分間インキュベートした後、SFMを除去することで行った。細胞に感染させるために、基礎培地を交換し、HAE細胞の頂部表面をSFMで1回洗浄して粘液を除去してから、ウイルスを3つのウェルに添加した。E遺伝子のqRT-PCRに基づいて、1細胞あたり1×104ゲノムコピーのウイルスを感染多量（MOI）で細胞に感染させた。細胞は、接種物とともに37℃で1時間インキュベートした後、頂部表面を2回洗浄し、2回目の洗浄液を0 hpiのサンプルとして保持した。24時間、48時間、71時間の各時点では、1回の頂面洗浄を行ってウイルスを回収した。使用した単離株は、B.1.617.2の単離株No. 60 hCoV-19/England/SHEF-10E8F3B/2021（EPI_ISL_1731019）、B.1.617.2分離株NO.285 hCoV-19/England/PHEC-3098A2/2021（EPI_ISL_2741645）、B.1.1.7分離株NO. 7540 SMH2008017540（B.1.1.7の社内で確認されたが、GISAIDではまだ利用できない）。
HAE感染症からの出力の滴定

QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini Kitを用いてRNAを抽出し、AgPath RT-PCR (Life Technologies)キットを用いてQuantStudio(TM) 7 Flex Systemで、以前に使用したSARS-CoV-2 E遺伝子のプライマーを用いてqRT-PCRを実施した33。また、コピー数が既知のウイルスRNAの希釈液を用いて標準曲線を作成し、Ct値からサンプル中のE遺伝子コピーを定量化した。その後、元のウイルス上清1mlあたりのE遺伝子コピーを算出した。

HAE細胞から採取したサンプル中の感染性ウイルスを測定するために、プラークアッセイを実施した。DMEM、1% NEAAおよび1% P/Sで上清を連続対数希釈し、PBSで洗浄したVero細胞に接種し、37℃で1時間インキュベートした後、接種物を除去し、1×MEM、0. 2% (w/v) BSA, 0.16% (w/v) NaHCO3, 10 mM HEPES, 2 mM l-glutamine, 1× P/S, 0.6% (w/v) agarose. プレートを37℃で3日間インキュベートした後、オーバーレイを取り除き、クリスタルバイオレット溶液で細胞を室温で1時間染色した。
複製能力のあるSARS-CoV-2単離株による肺オルガノイドの感染

気道上皮オルガノイドは，既報10の方法で作製した。ウイルス感染は、初代オルガノイドを継代し、懸濁液中のSARS-CoV-2をMOI 1で2時間インキュベートして行った。洗浄したオルガノイドを20μlのマトリゲルドームにプレーティングし、オルガノイド培地で培養し、異なる時点で回収した。

感染後24時間および48時間後に細胞を溶解し、全RNAを分離した。cDNAを合成し、qPCRを用いてサンプル中の核タンパク遺伝子のコピーを定量した。SARS-CoV-2 Positive Controlプラスミドを用いて標準曲線を作成し，オルガノイド試料中のN遺伝子のコピーを定量した。サンプル間のばらつきを正規化するため、ハウスキーピング遺伝子として18SリボソームRNAを用いた。
ウェスタンブロッティング

トランスフェクションから48時間後に細胞を溶解し、上清を回収した。上清を回収し、0.45μmのフィルターに通すことで、精製したビリオンを調製した。その後，清澄化した上清を8.4% OptiPrep密度勾配培地（Sigma-Aldrich）の薄層に載せ，TLA55ローター（Beckman Coulter）で20,000r.p.m.で2時間超遠心分離を行った。細胞を細胞溶解バッファー（Cell Signaling社）で溶解し、Benzonase nuclease（70664 Millipore社）で処理し、5分間煮沸した。その後、サンプルを4-12% Bis Trisゲルで実行し、iBlotまたはsemidryシステム（Life TechnologiesおよびBio-Rad、それぞれ）を用いてニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン膜に転写した。

膜は、PBS+0.1% Tween-20（PBST）中の5%脱脂乳で1時間ブロックした。 1% Tween-20 (PBST)で室温で撹拌しながら1時間ブロックし、SARS-CoV-2 SのS2サブユニットを検出する一次抗体（抗SARS-CoV-2スパイク）（Invitrogen, PA1-41165）でインキュベートした。抗GAPDH（Proteintech）または抗p24（NIBSC））をPBSTで5％無脂肪乳で希釈したものを、撹拌しながら4℃で2時間培養し、PBSTで4回洗浄し、撹拌しながら室温で5分間培養した後、二次抗体の抗ウサギHRP（1: 10,000, Invitrogen 31462)および5%脱脂乳で希釈した抗β-アクチンHRP(1:5,000, sc-47778)をPBSTに入れて、室温で1時間攪拌しながらインキュベートした。膜をPBSTで4回、室温で5分間洗浄し、ChemiDoc MPイメージングシステム（Bio-Rad）を用いて直接画像化した。

ビリオンのウェスタンブロッティングのためのウイルス感染

Vero E6 ACE2/TMPRSS2細胞をMOI1で感染させ、48時間培養した。上清を300gで5分間回転させて除去した後、10% PEG6000で沈殿させた（室温で4時間）。ペレットを1mMジチオスレイトールを含むLaemmli緩衝液に直接再懸濁し、Benzonase nuclease（70664 Millipore）で処理し、ゲル電気泳動のためにロードする前に超音波処理した
血清偽型中和アッセイ

ルシフェラーゼを発現するSARS-CoV-2スパイクPVを用いて、ACE2およびTMPRSS2を一過性にトランスフェクトした293T細胞でウイルス中和アッセイを行った35。PVは、熱不活化ヒト血清サンプルまたは回復期血漿の連続希釈液と二重に37℃で1時間インキュベートした。ウイルスと細胞のみのコントロールも含まれていた。次に、新鮮なトリプシン処理した293T ACE2/TMPRSS2発現細胞を各ウェルに加えた。37℃の5％CO2環境下で48時間インキュベートした後、Steady-Glo Luciferase assay system（Promega社）を用いて発光を測定した。
療養中の血漿の中和アッセイ

PCRでSARS-CoV-2感染が確認されてから21日以上経過したセントメリーズ病院のHCWの回復期血清サンプルを、REACT2研究の一環として2020年5月に採取した。

療養中のヒト血清サンプルを56℃で30分間不活化し，複製した連続2倍希釈液（n = 12）を同量のSARS-CoV-2（100 TCID50，総量100 µl）と37℃で1時間混合した。その後，Vero E6 ACE2/TMPRSS2細胞に各サンプルの連続1倍希釈液を37℃で3日間感染させた。ウイルスの中和をクリスタルバイオレット染色で定量し、CPEをスコアリングした。なお，各滴定において，ウイルスによるCPEを確認するために，ウイルス非存在下での各被験試料の1：5希釈を行った。SARS-CoV-2感染性の逆滴定は、各ウェルで約100TCID50の感染を実証するために行った。

ワクチン血清中和、生ウイルスアッセイ

Vero E6 ACE2/TMPRSS2細胞を、感染の24時間前に96ウェルプレートに1ウェルあたり2×104の細胞密度で播種した。血清を最終的に1:10希釈から滴定し、WT（SARS-CoV-2/human/Liverpool/REMRQ0001/2020）、B.1.1.7またはB.1.617.2ウイルス分離株をMOI 0.01で添加した。この混合物は、細胞に添加する前に1時間インキュベートした。感染後72時間後に8％PFAでプレートを固定し、クーマシーブルーで20分間染色した。プレートを水で洗浄し、2時間乾燥させた後、1％SDS溶液をウェルに加え、FLUOstar Omega（BMG Labtech社）を用いて染色強度を測定した。染色強度を非感染ウェルのものと比較することで、細胞生存率を求めた。非線形シグモイド4PLモデル（Graphpad Prism 9.1.2）を用いて，各血清のID50を求めた。

モノクローナル抗体アッセイのための水胞性口内炎ウイルスシュードウイルスの作製

SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現させたレプリケーション不全のVesicular Stomatitis Virus（VSV）シュードウイルスを、以前に説明した方法に若干の修正を加えて作製した36。Lenti-X 293T細胞（Takara, 632180）を10cm2ディッシュに5×106個/ディッシュの密度で播種し、翌日、メーカーの指示に従ってWTまたはB.1.617.2スパイク発現プラスミド10μgをTransIT-Lenti（Mirus, 6600）でトランスフェクションした。トランスフェクション後1日目に、細胞をVSV-luc（VSV G）にMOI3で1時間感染させ、Ca2+/Mg2+を含むPBSで3回洗浄した後、完全な培地で37℃でさらに24時間培養した。遠心分離により細胞上清を清澄化し、濾過（0.45μm）し、分注して-80℃で凍結した。

モノクローナル抗体のPV中和アッセイ

TMPRSS2を発現しているか否かにかかわらず、TMPRSS2を発現しているVero E6細胞を、10%FBSを添加したDMEMで培養し、白色の96ウェルプレート（PerkinElmer, 6005688）に1ウェルあたり20,000個の密度で播種した。翌日、モノクローナル抗体をあらかじめ温めておいた完全培地で連続的に希釈し、WTまたはB.1.617.2の疑似ウイルスと混合し、丸底ポリプロピレンプレートで37℃で1時間インキュベートした。細胞からの培地を吸引し、50μlのウイルス-モノクローナル抗体複合体を細胞に添加した後、37℃で1時間インキュベートした。条件は各プレートの2つのウェルでテストし、各プレートの少なくとも6つのウェルには、未処理の感染細胞（中和の0％、MAX相対光単位（RLU）値を定義する）と、S2E12およびS2X259をそれぞれ25μg ml-1存在させた感染細胞（中和の100％、MIN RLU値を定義する）が含まれていた。次いで、ウイルス-モノクローナル抗体複合体を含む培地を細胞から吸引し、Ca2+およびMg2+を含むPBS中のSteadyLite Plus（Perkin Elmer，6046759）の1：2希釈液50μlを細胞に添加した。プレートを室温で15分間インキュベートした後、Synergy-H1（Biotek社）で分析した。未処理の感染ウェルの平均RLU値（MAX RLUave）を平均MIN RLU（MIN RLUave）値で差し引き、以下の式に従って、実験データの個々のRLU値の中和率を正規化するために使用した。(1 - (RLUx - MIN RLUave)/(MAX RLUave - MIN RLUave)) × 100. データはPrism (Version 9.1.0)を用いて分析し、可視化した。IC50値は，log[inhibitor]対応答からの補間値から，上限制約を≦100，下限制約を0とした可変スロープ（4パラメータ）非線形回帰を用いて算出した。各中和アッセイは，2つの独立した実験（すなわち，生物学的複製）で実施し，各生物学的複製には技術的複製が含まれていた。各生物学的複製におけるIC50値は，算術平均±s.d.で示した。スパイクバリアントの中和力の損失または獲得は，各生物学的複製においてバリアントのIC50をWTのIC50で割ることで計算し，算術平均±s.d.で表示した。

細胞間融合を測定するためのスプリットGFPシステム用プラスミド

pQCXIP-BSR-GFP11およびpQCXIP-GFP1-10は、Yutaka Hata37（Addgene plasmid no.68716; http://n2t.net/addgene:68716; RRID:Addgene_68716およびAddgene plasmid no.68715; http://n2t.net/addgene:68715; RRID:Addgene_68715）から入手した。

GFP1-10またはGFP11レンチウイルス粒子の生成

Vero細胞にpQCXIP-BSR-GFP11またはpQCXIP-GFP1-10を共トランスフェクションすることにより、既述38のようにレンチウイルス粒子を生成した。48時間後および72時間後にウイルス粒子を含む上清を回収し、0.45μmのフィルターでろ過した後、293T細胞またはVero細胞に感染させて安定した細胞株を作製した。293T細胞およびVero細胞は、それぞれGFP1-10またはGFP11を安定的に発現するように導入し、2μg ml-1のピューロマイシンで選択した。

細胞-細胞融合アッセイ

細胞-細胞融合アッセイは、既述の38,39と同様に行ったが、スプリットGFPシステムを使用した。簡単に言うと、前日にVero GFP1-10およびVero-GFP11細胞を24ウェルプレートに1:1の比率で80%コンフルエントに播種した。細胞は、製造者の指示（Promega）に従い、Fugene 6を用いて、pCDNA3に0.5μgのスパイク発現プラスミドを共導入した。細胞と細胞の融合は、Incucyteを用いて測定し、全位相領域に対する緑色領域の割合として決定した。その後、Incucyteソフトウェアを用いてデータを解析した。グラフはPrism 8ソフトウェアを用いて作成した。

報告書の概要

研究デザインに関する詳しい情報は、本論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryをご覧ください。

以上