納豆キナーゼは、スパイク・タンパクを分解する。 ワクチン後遺症治療の最善策
（論文タイトル）
Degradative Effect of Nattokinase on Spike Protein of SARS-CoV-2
SARS-CoV-2のスパイクタンパクに対するナットウキナーゼの分解効果
Takashi Tanikawa,1,*† Yuka Kiba,2,† James Yu,3 Kate Hsu,3 Shinder Chen,3 Ayako Ishii,4 Takami Yokogawa,2 Ryuichiro Suzuki,5 Yutaka Inoue,1 and Masashi Kitamura2,*
【解説】
論文の執筆者は、城西大学 谷川尚（たにかわ たかし）准教授。
この論文では、ナットキナーゼが新型コロナウイルスのスパイクタンパクを分解することで感染能力を低下させることを実験で確認したと報告しています。
ワクチンについては触れられていませんが、ワクチンの設計通りなら、ｍRNAは全長のスパイクタンパクを発現させるので、ウイルスのSタンパク同様、ワクチン由来のSタンパクも分解すると考えられます。
もともと、ナットウキナーゼにはタンパク質を分解する能力が有り、納豆が柔らかいのも、ナットウキナーゼが大豆たんぱくを分解した結果です。
論文によると、ナットウキナーゼはSタンパクのRBD部分を分解し、ACE２に結合できなくするということです。
また、ナットウキナーゼは、最も高い血栓溶解力をもっていることが知られています。mRNAワクチン接種後に微小血栓ができて毛細血管を詰まらせてしまう問題にも非常に有効です。
下のツイートでは、ロバートマローン博士がナットウキナーゼを自身のワクチン後遺症の治療に用いていると述べています。
🇺🇸ロバート・マローン博士
— タマホイ🎶🍃🗻🧷 (@Tamama0306) March 31, 2023
「まだ希望はある」
自身も負ったコロナワクチンによる後遺症をFLCCCのプロコトルとナットウキナーゼで治した話と打ったロット番号
医師たちが真のリスクを知らないため患者が適切な検査・治療を受けられず死を迎える
若者やスポーツ選手に多発している心筋炎、突然死
他 pic.twitter.com/R2JR9hdIdn
FLCCCが今年３月に改定したワクチン後遺症の治療プロトコル
「I-RECOVER」では、治療の第一選択薬に「ナットウキナーゼ」が追加されています。
以下のPDFをダウンロードして読んで下さい。
詳しい治療手順が書かれています。
以下、記事の翻訳です。
概要
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス感染症2019（COVID-19）がパンデミックとして出現し、世界各国の国民生活や経済に甚大な被害を与えている。しかし、SARS-CoV-2に対する治療薬は未だ不明である。SARS-CoV-2はスパイク蛋白（S蛋白）を持ち、S蛋白の切断はウイルス侵入に必須である。ナットウキナーゼはBacillus subtilis var. nattoによって生産され、人間の健康に有益である。本研究では、SARS-CoV-2のSタンパク質に対するナットウキナーゼの影響を検討した。Sタンパク質を導入した細胞溶解液をナットウキナーゼとインキュベートしたところ、Sタンパク質は用量および時間依存的に分解された。また、免疫蛍光分析により、ナットウキナーゼを培養液に添加すると、細胞表面のSタンパク質が分解されることが確認された。このことから、ナットウキナーゼはSタンパク質の分解を介してSARS-CoV-2の感染を抑制する可能性があることが示唆された。
1. はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス病2019（COVID-19）が世界的に蔓延しています。COVID-19のパンデミックは、4億3700万人以上が感染し、630万人以上が死亡しています（https://covid19.who.int/, accessed on 4 July 2022）。
SARS-CoV-2の宿主細胞への侵入は、ウイルスエンベロープから伸びるホモトリマーを形成する膜貫通型のスパイクタンパク質（Sタンパク質）によって媒介されます。Sタンパク質は、膜貫通型セリンプロテイン2（TMPRSS2）、カテプシン、フリンなどの細胞内プロテアーゼによって処理され活性化される。
SARS-CoV-2のS1サブユニットは、宿主細胞の受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）と相互作用してウイルス受容体との結合を開始し、S2サブユニットはウイルスと標的細胞の融合に関与してウイルスが侵入できるようにします[1]。
S1サブユニットの受容体結合ドメイン（RBD）は、ACE2との結合に関与している。Sタンパク質の切断は、S1サブユニットとS2サブユニットの境界で行われる。
現在、多くの国でSARS-CoV-2感染を防ぐワクチンの開発が進められており、SARS-CoV-2感染者数は減少しています。しかし、SARS-CoV-2には、ワクチン標的エピトープが変異した株など、数多くの変異体が報告されています[2,3]。ワクチン接種後にCOVID-19を発症する患者が増加していることから、ワクチン接種によってSARS-CoV-2感染を完全に防ぐことができない可能性があります。したがって、SARS-CoV-2感染に対する新規治療法を開発することが重要である。
納豆は、大豆をBacillus subtilis var.nattoで発酵させた人気のある日本の伝統食品です。ナットウキナーゼは納豆に含まれており[4]、B. subtilis var. nattoが生産する最も重要な細胞外酵素の1つである[5]。ナットウキナーゼは275個のアミノ酸からなり、約28kDaである[6,7]。
ナットウキナーゼはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1を不活性化し、線溶を増加させます[8]。また、フィブリノゲン、第VII因子、サイトカイン、第VIII因子の血漿中濃度を低下させます[9]。
ナットウキナーゼは、天然に知られている抗凝固剤の中で最も高い血栓溶解力を有しています [10]。
臨床試験では、ナットウキナーゼの経口摂取はいかなる副作用も伴わないことが実証されました[11]。このように、ナットウキナーゼは現在、効率的で安全かつ経済的な酵素と考えられており、血栓溶解薬の研究において中心的な注目を集めている[12,13]。
さらに、ナットウキナーゼはいくつかの「腫瘍の治療」にも使用されています[14,15]。
最近の研究では、納豆エキスが牛ヘルペスウイルス1（BHV-1）およびSARS-CoV-2感染を阻害することが明らかになりました[16]。これらの結果は、納豆エキスのプロテアーゼがSARS-CoV-2感染に対して有効である可能性を示している。本研究では、納豆エキスによるSARS-CoV-2感染抑制が、B. subtilis var. natto由来のナットウキナーゼによるものかどうかを検討することを目的としました。
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2. 結果および考察
2.1. SARS-CoV-2 のスパイクタンパクに対するナットウキナーゼの分解効果 In Vitro
まず、納豆エキス中のナットウキナーゼがSARS-CoV-2のSタンパク質を分解できるかどうかを検討した。SARS-CoV-2のSタンパク質は、感染初期に宿主細胞のACE2受容体として重要な役割を果たす[17]。Sタンパク質発現細胞溶解液とナットウキナーゼの4倍希釈系列（32 µg/mL, 8 µg/mL, 2 µg/mL, 500 ng/mL, 125 ng/mL, 31.25 ng/mL, 7.8125 ng/mL）を混合した後、ウエスタンブロット法を実施しました。ナットウキナーゼ濃度500 ng/mL, 125 ng/mL, 31.25 ng/mL, 7.8125 ng/mLでSタンパク質発現細胞溶解液をD-PBSでインキュベートすると、Sタンパク質（S1およびS2サブユニット）およびS2サブユニットの全長がバンドとして出現した（図1A）。次に、ナットウキナーゼが時間依存的にSタンパク質を分解するかどうかを検討した。次に、溶解液を1 µg/mLのナットウキナーゼと10-180分間インキュベートした。SARS-CoV-2のSタンパク質は、60-180分のインキュベーション後にナットウキナーゼによって分解されたが、10分および30分のインキュベーション後には分解されなかった（図1B）。このように、ナットウキナーゼは用量および時間依存的にSタンパク質を分解した。
ナットウキナーゼの分解効果が酵素活性によるものかどうかを確認するため、ナットウキナーゼを加熱またはプロテアーゼインヒビターカクテルで処理した。ナットウキナーゼを100℃で5分間加熱すると、ナットウキナーゼの分解効果は失われた（図1C、レーン6）。さらに、プロテアーゼ阻害剤を添加すると、ナットウキナーゼによるSタンパク質バンドの消失はブロックされた（図1C、レーン4および5）。タンパク質阻害剤カクテルIと比較して、AEBSF HCl（4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩）、不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン、システインプロテアーゼであるロイペプチンからなるタンパク質カクテル IIIは明らかにナットウキナーゼ活性を阻害した。ナットウキナーゼは、セリンプロテアーゼのサブチリシンファミリーのメンバーであるSer-His-Asp (Asp32, His64, Ser221) という同じ保存アミノ酸を持つ [6,18]. ナットウキナーゼの結晶構造は、B. subtilis DB104 由来のサブチリシン E の結晶構造とほぼ同じである [19]．この結果は、ナットウキナーゼがセリンプロテアーゼであるとの既報と一致する。また、RBDとACE2を発現する細胞ライセートを用いて、ナットウキナーゼの分解作用を評価した。7.5μg/mLのナットウキナーゼと細胞溶解液をインキュベートしたところ、RBDとACE2のバンドは消失した（図1D）。
2.2. トランスフェクトされた細胞表面上のSARS-CoV-2のスパイクタンパク質に対するナットウキナーゼの分解効果
次に、ナットウキナーゼがトランスフェクトされた細胞表面のSタンパク質を分解するかどうかを検討した。Sタンパク質は、HEK293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をナットウキナーゼと9時間インキュベートした。
細胞表面のSタンパク質は、細胞を透過させずに抗Sタンパク質抗体を用いて検出された（図2A）。Sタンパク質は、トランスフェクションした細胞で検出された。トランスフェクトした細胞をナットウキナーゼで処理した場合、細胞表面のSタンパク質は減少した。細胞を25μg/mLおよび2.5μg/mLのナットウキナーゼで処理すると、Sタンパク質陽性領域と核陽性領域の比率は、それぞれ約0.3および0.7減少した（図2B）。
ナットウキナーゼの分解効果は、細胞毒性がない場合に観察された（図2C）。ウェスタンブロッティング解析の結果、総Sタンパク質量はナットウキナーゼ処理とコントロール処理の間で変化しなかった（補足図；図S1）。これらの結果は、ナットウキナーゼが非毒性濃度範囲でSARS-CoV-2のSタンパク質を分解することを示す。
本研究では、ナットウキナーゼのプロテアーゼ活性がSタンパク質の分解に寄与していることを明らかにした。ナットウキナーゼは宿主細胞においてSタンパク質だけでなくACE2も分解する作用がある。ナットウキナーゼを細胞溶解液と混合したin-vitro評価では、ハウスキーピングタンパク質であるGAPDHも同時に分解されたことから、ナットウキナーゼのプロテアーゼ特異性は低いと考えられる（補足図；図S2）。
一方、細胞に添加した場合は、細胞生存率への影響は見られず、細胞表面での保護剤として働くことが期待される。タンパク質分解効果を理解するためには、ナットウキナーゼの分解産物を質量分析でさらに解析することが必要である。
ナットウキナーゼは、SARS-CoV-2のSタンパク質に対する強力な分解活性を有し、また、抗動脈硬化、脂質低下、降圧、抗血栓、線溶、神経保護、抗血小板、抗凝固の効果を発揮することが示されている [20].
高血圧や心血管系の合併症を持つ患者は、COVID-19によって容易に重症化する可能性があります[21]。ワクチン標的エピトープが変異した株を含むSARS-CoV-2の多数の変異体が出現しているため、ワクチン接種だけではSARS-CoV-2感染から完全に保護できない場合があります。ナットウキナーゼと納豆エキスは、COVID-19の予防と治療のための新世代の薬剤として開発される可能性があります。
3. 材料と方法
3.1. 材料
Nattokinase は Contek Life Science Co. (台湾、台北市)から入手した。ナットウキナーゼ活性は60,000FU/g（FU, fibrinolysis unit）であった。プロテアーゼインヒビターカクテルセットIおよびIIIは、富士フイルム和光純薬株式会社（日本、大阪）から購入した。発現プラスミド（C末端にタグを有するpcDNA3.1-SARS2-Spike C9、pcDNA3.1-hACE2、およびpcDNA3-SARS-CoV-2-RBD-sfGFP）はAddgene（アメリカ、MA、ウォータータウン）より購入された。HEK293 (JCRB9068) 細胞は、JCRB Cell Bank (Osaka, Japan) から入手した。
3.2. 細胞培養およびウェスタンブロッティング
HEK293細胞は、10%FBS、L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM中で3.5×105細胞/mの密度で一晩培養された。各プラスミド（pcDNA3.1-SARS2-Spike, pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP, または pcDNA3.1-hACE2 ）でトランスフェクトし22時間培養後、培養細胞を掻き取り、氷冷したDulbeccoのリン酸緩衝生理液（ D-PBS ）で洗浄しました。細胞計数を行い、xTractor buffer（タカラバイオ株式会社、滋賀県）を加えて細胞沈殿を得た。細胞溶解液を1300×gで10分間、4℃で遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。タンパク質濃度は、BCAアッセイキット（タカラ）を用いたビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイにより測定した。ナットウキナーゼ10μLと細胞溶解液10μL（1μμg/mL）を37℃で1時間インキュベートした。プロテアーゼ阻害剤の効果を利用する場合、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIおよびIIIをD-PBSで10倍に希釈し、10μLプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液をナットウキナーゼと細胞溶解液の混合物に添加した。等量の反応混合物を負荷し、ウェスタンブロッティングを行った。一次抗体には、抗ロドプシン（C9）マウスモノクローナル抗体（1D4）（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA）、抗GAPDHマウスモノクローナル抗体（FUJIFILM Wako）、抗GFPタグマウスモノクローナル抗体（Proteintech, Rosemont, IL, USA）、抗ACE2抗体（Proteintech）を使用。二次抗体には、HRP標識ヤギ抗マウス抗体（Proteintech）が含まれる。
3.3. 免疫蛍光アッセイ
HEK293細胞は、10%FBS、L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを補充したDMEM中、8ウェルチャンバーで3.5×105細胞/mLの密度で培養されました。細胞をpcDNA3.1-SARS2-Spikeでトランスフェクトし、9時間インキュベートした後、試料で処理し、13時間インキュベートし、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。SARS-CoV/SARS-CoV-2 spike monoclonal antibody (1A9) (GeneTex, CA, USA) と1時間インキュベートした後、Cy3コンジュゲートヤギ抗マウス抗体と1時間インキュベートし、スライドをDAPI Fluoromount-G で染色し蛍光顕微鏡（BZ-X710、キーエンス、大阪、日本）で観察しました。Sタンパク質陽性領域および核陽性領域は、BZ-X710付属の解析ソフト（BZ-X Analyzer）を用いて算出した。細胞生存率は、3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）アッセイを使用して評価した。細胞は24ウェル培養プレートで培養した。37℃で24時間インキュベートした後、各ウェルにサンプルを加え、さらに13時間インキュベートした。 細胞は、500μg/mL MTTを含む500μLのDMEMに懸濁した。37℃で3時間インキュベートした後、4mM HClを含む500μLのイソプロパノールを加え、MTTホルマザンを溶解させた。吸光度は、マイクロプレートリーダーを用いて570 nmで測定した。
4. 結論
本研究では、セリンプロテアーゼであるナットウキナーゼがSARS-CoV-2のSタンパク質を分解することを明らかにした。
納豆エキスに含まれるナットウキナーゼがSARS-CoV-2感染を抑制できるかどうかを調べるため、Sタンパク質発現細胞溶解液とナットウキナーゼを用量および時間依存的に混合してSタンパク質分解を解析した。
Sタンパク質のRBDは、ACE2タンパク質の膜遠位部に結合している。納豆エキスは、RBD分解を介してVero E6細胞におけるSARS-CoV-2感染を阻害することが報告されている[16]。
我々は、ナットウキナーゼによるSタンパク質の分解が、熱やタンパク質阻害剤処理によってブロックされることを実証した。このデータは、ナットウキナーゼのプロテアーゼ活性がSタンパク質分解に重要な役割を果たすことを示唆している。これらの結果から、納豆エキスによるSARS-CoV-2感染の阻害は、ナットウキナーゼによるSタンパク質の分解に起因するという考え方が支持される。
したがって、我々のデータは、ナットウキナーゼおよび納豆エキスが、Sタンパク質分解を介してSARS-CoV-2の宿主細胞侵入を抑制する潜在的な効果を有することを示した。
翻訳ここまで。
参考資料
以上