（論文）SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、ACE 2のダウンレギュレーションを介して血管内皮に炎症を起こす

2021年8月19日 07:00

Gerald S. Shadel, Mark Hepokoski, Ting Lei, Hongliang Wang, Jin Zhang,Jason X.-J. Yuan, Atul Malhotra, Uri Manor, Shengpeng Wang
, Zu-Yi Yuan, John Y-J. Shyy

【解説】
この論文は世界的に有名になりました。この論文が明らかにしたことは、

「SARS-CoV-2のウイルス本体は不要で、スパイクタンパク単体でも血管内皮細胞に炎症を起こす」

ということです。ワクチンを接種すると、ｍRNAはスパイクタンパクを体内で大量に生産し、接種後の発熱や血栓症を引き起こします。
また、スパイクタンパクは数カ月間血液中に存在します。（コロナ感染より長い期間）

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.121.318902

SARS-CoV-2（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2）の感染は、Sタンパク質（スパイク糖タンパク質）が宿主細胞内のACE（アンジオテンシン変換酵素）2と結合することに依存している。血管内皮がSARS-CoV-2に感染すると1、ミトコンドリアの活性酸素産生と解糖系シフトが誘発される2。逆説的だが、ACE2は循環器系で保護的な働きをしており、SARS-CoV-1のSタンパク質は、感染した肺のACE2レベルを低下させることで肺傷害を促進する3。

今回の研究では、Sタンパク質が単独でACE2を低下させ、その結果、ミトコンドリア機能を阻害することで、血管内皮細胞（EC）にダメージを与えることを明らかにした。

我々は、Sタンパク質を発現するシュードウイルス（Pseu-Spike）をシリアン・ハムスターに気管内投与した。Pseu-Spikeを投与した動物では、肺胞隔壁の肥厚や単核細胞の浸潤の増加など、肺の損傷が明らかになった（図[A]）。AMPK（AMP-activated protein kinase）はACE2のSer-680をリン酸化し、MDM2（murine double minute 2）はACE2のLys-788をユビキチン化し、AMPKとMDM2のクロストークがACE2のレベルを決定する4。さらに、eNOS（内皮性NO合成酵素）のThr-494およびSer-1176のリン酸化が相補的に増加・減少したことから、eNOSの活性が低下していることがわかった。このような内皮におけるpACE2、ACE2、MDM2の発現およびAMPK活性の変化は、Pseu-Spikeを感染させた肺動脈ECを用いたin vitro実験でも再現され、活性酸素種抑制剤であるN-アセチル-L-システインで処理すると回復した（図[B]のii）。

図．SARS-CoV-2（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2）のSpikeタンパク質は、ACE（アンジオテンシン変換酵素）2のダウンレギュレーションとミトコンドリアの障害を介して内皮細胞（EC）の機能を悪化させることを示している。 A, 8〜12週齢の雄のシリアン・ハムスターにスパイクタンパクを過剰発現させたシュードウイルス（Pseu-Spike）または対照群のモックウイルスを投与して5日後の肺標本の代表的なH&E組織像（各群n=3匹、1×108PFU）。肺胞隔壁の肥厚（赤矢頭）と単核細胞（赤矢印）。スケールバー＝20μm。B, Pseu-Spike（n=4）またはモックウイルス（n=4）に感染したハムスターの肺は、pAMPK（phospho-AMPK）T172、AMPK、pACE2（phospho angiotensin-converting enzyme）S680、ACE 2、MDM2、peNOS S1176、peNOS T494、eNOS（endothelial NO synthase）、およびβ-actinのウェスタンブロット分析を行った（B, i）。ヒト肺動脈EC（PAECs）は、N-アセチル-L-システイン（NAC；5mmol/L）を2時間前処理するかしないかにかかわらず、Pseu-Spikeまたはモックウイルスを24時間感染させた。タンパク質抽出物は、表示されたタンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロットで分析した（n=4；B、ii）。C, ヒトリコンビナントS1タンパク質またはIgG（4μg/mL）で24時間処理したEC（C, i）、またはヒトアデノウイルスACE2 S680D（ACE2-D）またはACE2 S680L（ACE2-L; 10 MOI）で48時間感染させたEC（C, ii）のミトコンドリア形態の代表的な共焦点画像。ミトコンドリアはTOM20抗体を用いて可視化した（n=4、各レプリケートで50細胞をカウント）。スケールバー=2.5μm。Tubular：ECのミトコンドリアの大部分は長さが10μm以上であった；Intermediate：ミトコンドリアは≈10μm未満であった；Fragment：ミトコンドリアの大部分は球状であった（明確な長さや幅はない）。D, ACE2-D vs ACE2-L（10 MOI）に48時間感染させたEC（n=3）、またはIgG vs S1タンパク質（4μg/mL）で24時間処理したEC（n=3）における酸素消費率（OCR、D、iおよびiii）および細胞外酸性化率（ECAR、D、iiおよびiv）の測定。E, ACE2-D (n=4) およびACE2-L (n=4) ノックインマウスの肺ECにおける表示されたmRNAレベルのリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応分析。C57BL/6をバックグラウンドとする8週齢のACE2-DおよびACE2-L雄マウスを使用した。F, Pseu-Spike（ACh n=8, SNP n=5）またはmock（ACh n=6, SNP n=5）ウイルスに感染したシリアン・ハムスター（1×108 PFU。）のフェニレフリン（1μmol/L）で前収縮した肺動脈内筋の緊張に対するアセチルコリン（ACh, 左）およびニトロプルシドナトリウム（SNP, 右）を介した緩和の用量反応曲線。F, i）およびACE2-D（n=6）またはACE2-L（n=5）マウス（F, ii）を用いて行った。動物実験は，西安交通大学の倫理委員会の承認を得た。2-DGは2-デオキシ-D-グルコース、ACE2-Dは安定性が向上したホスホ模倣型ACE2、ACE2-Lは安定性が低下した脱ホスホ模倣型ACE2、AMPKはAMP活性化プロテインキナーゼ、AA/RはアンチマイシンA&ロテノン、ENO2はエノラーゼ2、FCCPはカルボニルシアニド-p-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン、H&Eはヘマトキシリン・エオシン。HK2、ヘキソキナーゼ2、HO1、ヘムオキシゲナーゼ1、MDM2、マウスダブルミニッツ2、MOI、感染の多重度、NRF1、核呼吸因子1、peNOS、phospho-eNOS、PFKFB3、6-ホスホフルクト-2-キナーゼ／フルクトース-2,6-ビフォスファターゼ3、Resp、呼吸、TFAM、転写因子A、ミトコンドリア、である。

次に、Sタンパク質がミトコンドリアの機能に与える影響を調べた。S1タンパク質を投与したECの共焦点画像では、ミトコンドリアの断片化が進み、ミトコンドリアの動態が変化していることがわかった（図[C]、i）。このようなミトコンドリアの変化が、ACE2の量の減少に一部起因しているかどうかを調べるために、ECでACE2のS680D（ACE2-D、安定性が向上したホスホーマイメティックなACE2）またはS680L（ACE2-L、安定性が低下した脱ホスホーマイメティックなACE2）4を過剰発現させた。図[C]のiiに示すように、ACE2-Lを用いたECは、ACE2-Dを用いたECと比較して、断片化したミトコンドリアの数が多かった。酸素消費率と細胞外酸性化率のアッセイを行ったところ、ACE2-Lを過剰発現させたECは、ACE2-Dを過剰発現させたECに比べて、基礎的なミトコンドリア呼吸量、ATP産生量、最大呼吸量が減少していた（図[D]のi）。さらに、ACE2-Lを過剰発現させると、基礎酸性化率、グルコース誘導解糖、最大解糖能、解糖予備能が増加した（図[D]のii）。また、S1タンパク質をインキュベートしたECは、IgGで処理したコントロール細胞と比較して、ミトコンドリア機能が減衰したが、解糖が増加した（図[D]のiiiおよびiv）。また、ACE2-DまたはACE2-Lノックインマウスから分離した肺ECで、ミトコンドリア関連遺伝子と解糖関連遺伝子の発現を比較した4。図[E]に示すように、ACE2-Dマウスの肺ECでは、NRF1、HO1、TFAM（ミトコンドリア生合成関連遺伝子）のmRNAレベルが上昇し、HK2、PFKFB3、ENO2（解糖関連遺伝子）のmRNAレベルがACE2-Lマウスのそれと比較して低下していた。

SARS-CoV-2感染は、ECの炎症を誘発し、内皮炎を引き起こす1,5。Sタンパク質がACE2レベルを低下させ、NOバイオアベイラビリティを損なうことから、Sタンパク質の侵入が内皮の機能不全に不可欠であるかどうかを調べた。図[F](i)に示すように、Pseu-Spikeを投与したハムスターから単離した肺動脈では、アセチルコリンによる内皮依存性の血管拡張が損なわれていたが、ニトロプルシドナトリウムによる内皮非依存性の血管拡張には影響がなかった。また、ACE2-DマウスとACE2-Lマウスの肺血管で、アセチルコリンとニトロプルシドナトリウムによる血管拡張を比較した。予想通り、ACE2-Lマウスから分離した肺動脈では、ACE2-Dマウスに比べてアセチルコリンによる血管拡張が阻害されていた（図[F]、ii）。しかし，ニトロプルースナトリウムによる血管拡張は，ACE2-DマウスとACE-Lマウスの間でほとんど差がなかった。

今回の研究では、非感染性のシュードウイルスを使用したことが制限となったが、今回のデータは、Sタンパク質が単独で内皮に損傷を与え、ミトコンドリア機能とeNOS活性が低下し、解糖が増加することを示している。これらの知見は、今後、SARS-CoV-2ウイルスを用いて確認する必要があるが、Sタンパク質によってACE2が減少すると、ウイルスの感染力が低下し、それによって内皮が保護されるというのは逆説的であるように思える。しかし、ACE2の低下によるレニン・アンジオテンシン系の調節不全は、内皮の機能障害を悪化させ、内皮炎を引き起こす可能性がある。これらの結果を総合すると、Sタンパク質によるEC損傷は、ウイルスの感染力低下に勝ることが示唆される。この結果は、Sタンパク質に対するワクチン生成抗体や外因性抗体は、SARS-CoV-2の感染力から宿主を保護するだけでなく、Sタンパク質が引き起こす内皮傷害を抑制することを示唆している。