ファイザーのBNT162B ワクチンが、肝細胞で逆転写を引き起こすという研究論文
（論文タイトル）
Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line
Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 のヒト肝細胞内での細胞内逆転写について
by Markus Aldén, Francisko Olofsson Falla, Daowei Yang, Mohammad Barghouth, Cheng Luan, Magnus Rasmussen and Yang De Marinis
【 解説 】
2022年2月に発表された、世界的に有名な論文です。
ファイザー社のｍRNAワクチンが人の肝細胞内で逆転写によりDNAを更新することが実験で確認されたという内容です。
逆転写には、逆転写酵素が必要ですが、ヒト内在性逆転写酵素（LINE-1）が逆転写酵素として働くことで、RNAの逆転写が起こることが確認されました。
ｍRNAワクチン接種の当初から、RNAが逆転写するリスクが指摘されていましたが、政府もメディアも「デマ」であるとして否定し続けました。
下は、池上彰氏の記事です。
池上氏は、逆転写のリスクを指摘する人に対して「教養の基礎体力」が不足していると言っていましたが、自身では「逆転写酵素」による逆転写が起こること、内在性逆転写酵素（LINE-1）が人間の体内に存在することを知らないことが明らかになりました。
池上氏は、推進派の意見だけを参考にし、反対派の意見については読んでもいない可能性があります。
高校の生物の知識レベルで世界的権威の博士の指摘を「デマ」呼ばわりしていたということです。とても恥ずかしいことです。
池上氏は「教養の基礎体力」が低く「ジャーナリストの基本」が出来ていないということです。
デマの出所はロシアと中国？ （池上氏の記事より）
こうしたデマの出所として、ロシアと中国が名指しされています。
「ワクチンは怖いもの」と信じている人は、ロシアや中国の情報操作にまんまとひっかかっているのかもしれません。
「デマの出所」は中国でもロシアでもなく「池上彰」です。
以下、論文の翻訳。
概要
ファイザー社とバイオテック社が開発したCOVID-19 mRNAワクチンBNT162b2の前臨床試験において、BNT162b2注射を受けた動物に可逆的な肝機能の効果が見られた。さらに、最近の研究では、SARS-CoV-2 RNAが逆転写され、ヒト細胞のゲノムに統合されることが示された。本研究では，ヒト肝細胞株Huh7に対するBNT162b2の影響をin vitroで検討した．Huh7細胞をBNT162b2に暴露し，細胞から抽出したRNAに対して定量PCRを行った．その結果、Huh7細胞においてBNT162b2が高レベルで検出され、内因性逆転写酵素であるlong interspersed nuclear element-1（LINE-1）の遺伝子発現が変化していることが確認された。BNT162b2 で処理した Huh7 細胞で LINE-1 open reading frame-1 RNA-binding protein (ORFp1) に結合する抗体を用いた免疫組織染色により、LINE-1 の核内分布が増加することが示唆された。BNT162b2に暴露されたHuh7細胞のゲノムDNAをPCRしたところ、BNT162b2に特異的なDNA配列が増幅された。この結果は、BNT162b2がヒト肝細胞Huh7に速やかに取り込まれ、LINE-1の発現と分布に変化をもたらすことを示している。
また、BNT162b2のmRNAは、BNT162b2曝露後、6時間という短時間で細胞内でDNAに逆転写されることも示している。
１．はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス病2019（COVID-19）は、2020年3月11日に世界保健機関（WHO）によってグローバルパンデミックと発表され、破壊的な健康危機として浮上しました。2022年2月現在、COVID-19は世界中で4億3,000万人以上の感染症例と590万人の死者を報告しました[1]。COVID-19に関連する罹患率と死亡率を減らすために、効果的で安全なワクチンが緊急に必要とされています。
COVID-19用のいくつかのワクチンが開発されており、特にmRNAワクチン（Pfizer-BioNTechおよびModerna）、複製欠損組み換えアデノウイルスベクターワクチン（Janssen-Johnson and Johnson、Astra-Zeneca、Sputnik-VおよびCanSino）、不活化ワクチン（Sinopharm、Bharat BiotechおよびSinovac）に焦点が当てられています。mRNAワクチンは、免疫原の設計や製造が柔軟かつ効率的に行えるという利点があり、現在、数多くのワクチン候補が様々な開発・応用段階にある。具体的には、Pfizer社とBioNTech社が開発したCOVID-19 mRNAワクチンBNT162b2が臨床試験で評価され[2,3,4]、世界各地の国家COVID-19接種キャンペーンで投与された[5,6,7,8]成功例です。
BNT162b2は、脂質ナノ粒子（LNP）カプセル化された、ヌクレオシド修飾RNAワクチン（modRNA）であり、抗原的に最適な融合前コンフォメーションを確保するために2つのプロリン変異で修飾されたSARS-CoV-2のスパイク（S）タンパク質全長をコードし、ウイルス中和抗体を誘発するために無傷のウイルスを模しています［3］。
無作為化臨床試験と一致して、BNT162b2は、実環境におけるCOVID-19関連の幅広い転帰において高い有効性を示しました[5]。とはいえ，ワクチンの長期的な安全性と有効性のモニタリングなど，多くの課題が残っている．このため、さらなる評価と調査が必要です。BNT162b2の安全性プロファイルは、現在、短期間の臨床試験からしか得られていません。BNT162b2の副作用として、心膜炎、不整脈、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、頭蓋内出血、血小板減少症などがあまり報告されていない[4,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]。
また、他の種類のワクチンで観察された副作用を報告する研究もあります[21,22,23,24]。ワクチンに関連する副作用のメカニズムをよりよく理解するためには、臨床研究だけでなく、細胞や分子レベルでの解析が必要です。
最近の研究で、SARS-CoV-2 RNAが逆転写され、ヒト細胞のゲノムに統合されることが示された[25]。これは、SARS-CoV-2 RNAの一部をコードするBNT162b2でも起こりうるかどうかという疑問を生じさせる。
ファイザー社が欧州医薬品庁（EMA）に提供した薬物動態データでは，BNT162b2の生体内分布が，放射性標識したLNPとルシフェラーゼmodRNAをマウスとラットに筋肉内注射することで調べられた．最初の時間点（0.25 時間）からほとんどの組織で放射能が検出され、その結果、注射部位と肝臓が主な分布部位であり、投与後 8-48 時間で最大濃度が観察された [26]．さらに，BNT162b2 の注射を受けた動物では，肝臓の肥大，空胞化，γGT（γglutamyl transferase）値の上昇，AST（aspartate transaminase）値および ALP（Alkaline phosphatase）値の上昇などの可逆的肝障害が観察された [26]．LNP送達システムによる一過性の肝障害は以前から報告されていますが[27,28,29,30]、それでも、modRNAを含まない空のLNPだけでは、有意な肝障害は生じないことも示されています[27]。
そこで、本研究では、BNT162b2のヒト肝細胞株への影響をin vitroで調べ、BNT162b2が内因性メカニズムによりDNAに逆転写されるかどうかを調べることを目的とする。
２．材料と方法
2.1. 細胞培養
Huh7 細胞 (JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) は、10% (v/v) 牛胎児血清 (Sigma-Aldrich, F7524-500ML, Burlington, MA, USA) および 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (HyClone, SV30010, Logan, UT, USA) で補充した DMEM培地で37℃, 5% CO2にて培養を行った。BNT162b2処理には、Huh7細胞を24ウェルプレートに200,000 cells/wellの密度で播種した。BNT162b2 mRNAワクチン（Pfizer BioNTech, New York, NY, USA）は、製造者のガイドラインに記載されているように、滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射液、USPで最終濃度100 μg/mLに希釈した［31］。次に、BNT162b2懸濁液を、0.5、1.0、または2.0μg/mLの最終濃度となるように細胞培養液中に添加した。Huh7細胞を、BNT162b2と共に、またはBNT162b2なしで、6、24、および48時間インキュベートした。細胞をPBSで十分に洗浄し、トリプシン化によって採取し、さらなる使用まで-80℃で保存した。
2.2. リアルタイムRT-QPCR
細胞からのRNAは、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen, 74134, Hilden, Germany）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって抽出した。RT-PCR は RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA) を用いて、製造元のプロトコルにしたがって実施した。リアルタイムqPCRは、BNT162b2、LINE-1、ハウスキーピング遺伝子ACTBおよびGAPDHのプライマーを用いて、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, USA) を用いて行った（Table 1）。
表1. RT-qPCRおよびPCRのプライマー配列。
2.3. 免疫蛍光染色と共焦点画像化
Huh7細胞を8室スライド（LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, USA）で40,000細胞/ウェルの密度で、BNT162b2（0.5、1または2μg/mL）の添加または無添加で、6時間培養した。免疫組織化学は、一次抗体抗LINE-1 ORF1p マウスモノクローナル抗体（Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, USA）、二次抗体 Cy3 Donkey anti-mouse (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) および Hoechst (Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, USA) を用いて、Thermo Fisher (Waltham, MA, USA) からのプロトコルに従い実施された。Zeiss LSM 800と63X油浸対物レンズを用いて1条件につき2枚の画像を撮影し、ImageJ 1.53cにより1画像あたり15細胞について個々の全細胞領域と核領域について染色強度を定量化した。細胞質に対するLINE-1染色強度は、細胞全体の染色強度から核の染色強度を差し引くことで算出した。細胞のすべての画像には、偏りを防ぐためにランダムな番号を割り当てた。核（Hoechst染色により決定）と細胞全体（LINE-1蛍光の境界により決定）をマークするために、フリーハンド選択ツールを使用した。その後、これらの領域を測定し、平均強度を用いて、各グループを比較した。
2.4. ゲノム DNA 精製、PCR 増幅、アガロースゲル精製、サンガーシークエンス
ゲノム DNA は、PBND バッファー（10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.45% NP-40, 0.45% Tween-20）を用いて細胞ペレットから抽出した（32)。DNA調製物から残留RNAを除去するために、RNase (100 µg/mL, Qiagen, Hilden, Germany) をDNA調製物に加え、37℃で3時間、その後95℃で5分インキュベートした。その後、BNT162b2を標的とするプライマー（配列は表1に示す）を用いて、以下のプログラムでPCRを行った。95℃で5分、95℃30秒、58℃30秒、72℃1分の35サイクル、最後に72℃5分、12℃5分。PCR産物を1.4% (w/v)アガロースゲルで泳動した。予想されるサイズ（444 bps）のアンプリコンに対応するバンドを切り出し、QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen, 28104, Hilden, Germany）を用いて、メーカーの説明書に従って、DNAを抽出した。DNAアンプリコンの配列は、Sanger sequencing (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany)によって確認した。
統計情報
統計的比較は、両側スチューデントのt検定およびANOVAを使用して実施した。データは平均値±SEMまたは±SDで表した。p < 0.05の差は有意とみなす。
2.5. 倫理的記載事項
Huh7 細胞株は、Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank から入手した。
３．結果
3.1. BNT162b2 はヒト肝細胞株 Huh7 細胞に高効率で侵入する
BNT162b2がヒト肝細胞に侵入するかどうかを調べるために、ヒト肝細胞株Huh7にBNT162b2を暴露した。Huh7細胞におけるLNP送達の取り込み動態に関する以前の研究では，LNPの最大生物学的効果は4-7時間の間に観察された[33]。
そこで，本研究では，Huh7細胞を，濃度の増加したBNT162b2（0.5，1.0および2.0 µg/mL）とともに，あるいはまったく加えずに6，24および48時間培養し，細胞からRNAを取り出して，図1に示すようにBNT162b2配列を標的とするプライマーでリアルタイム定量RT-qPCR（RT-sequencing polymerase chain reaction）を実行した。
BNT162b2の全配列は公開されており［34］、2ヌクレオチドのキャップ；ヒトα-グロビン遺伝子の5′-UTRを組み込んだ5′-非翻訳領域（UTR）を含んでいる。SARS-CoV-2のSタンパク質全長と2つのプロリン変異；ヒトミトコンドリア12S rRNA（mtRNR1）セグメントとヒトAES/TLE5遺伝子セグメントと2つのC→U変異を含む3′-UTR；ポリ（A）テールを含む。
BNT162b2のSタンパク質配列を詳細に解析した結果、ヒトゲノム配列と100％同一の配列が124個、19〜26ntsに1塩基（nt）のみミスマッチのある配列が3個見つかった（表S1、補足資料参照）。BNT162b2のRNA量を検出するために、フォワードプライマーがSARS-CoV-2のSタンパク質領域に、リバースプライマーが3′-UTRに位置するようにプライマーを設計し、ヒトゲノム領域と非特異結合せずにBNT162b2固有のPCRアンプリコンを検出することができるようにした。
RT-qPCRの結果、BNT162b2で処理したHuh7細胞は、6、24、48時間においてハウスキーピング遺伝子と比較して高レベルのBNT162b2 mRNAを有した（図2、例外的に高レベルであるためログ2-ΔCTで表示された）。
3つのBNT162b2濃度は、1.0と2.0μg/mLの間の有意差が48時間で観察されたことを除いて、異なる時点で同様の細胞内BNT162b2 mRNAレベルを導いた。BNT162b2 mRNAレベルは6時間と比較して24時間で著しく減少し、48時間で再び増加した。
3.2. ヒト内在性逆転写酵素Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1)に対するBNT162b2の影響
ここでは、LINE-1遺伝子の発現に対するBNT162b2の影響を検討した。BNT162b2 (0, 0.5, 1.0, 2.0 µg/mL) で6, 24, 48時間処理したHuh7細胞から精製したRNAについて、LINE-1を標的とするプライマーを用いてRT-qPCRを実施したところ、LINE-1の発現が増加した。2.0 µg/mL BNT162b2によって6時間後にコントロールと比較して有意に増加したLINE-1発現が観察されたが、より低いBNT162b2濃度はすべての時点でLINE-1発現を減少させた（図3）。
次に、BNT162b2がLINE-1タンパク質量に及ぼす影響を調べた。全長のLINE-1は、5′非翻訳領域（UTR）、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）、ORF1とORF2、3′UTRからなり、そのうちORF1はシャペロン活性を持つRNA結合タンパク質である。LINE-1のレトロトランスポジション活性は、ORF1の核への移行が関与していることが示されている[35]。BNT162b2（0.5, 1.0, 2.0 µg/mL）で6時間処理したまたは処理していないHuh7細胞を固定し、細胞核を可視化するためにLINE-1 ORF1pに結合する抗体、およびDNA特異的プローブHoechstで染色した（図4a）。免疫蛍光染色強度の定量化は、BNT162b2が、試験したすべての濃度において、細胞全体領域および核の両方においてLINE-1 ORF1pタンパク質レベルを増加させることを示した（図4b〜d）。
3.3. Huh7細胞における逆翻訳されたBNT162b2 DNAの検出
以前の研究で、LINE-1タンパク質の核内への侵入がレトロトランスポジションと関連していることが示された[35]。上記の免疫蛍光染色実験では、核内のLINE-1レベルの増加は、BNT162b2の最低濃度（0.5 µg/mL）で既に観察された。LINE-1が上昇したときにBNT162b2がDNAに逆転写されるかどうかを調べるために、0.5 µg/mLのBNT162b2で6、24、48時間処理したHuh7細胞からゲノムDNAを精製した。精製DNAをRNase処理してRNAを除去し、図1に示すようにBNT162b2標的プライマーによるPCRに供した。増幅されたDNA断片は、電気泳動によって可視化され、ゲル精製された（図5）。BNT162b2のDNAアンプリコンは、3つのタイムポイント（6、24、48時間）すべてで検出された。サンガーシークエンスにより、このDNAアンプリコンがプライマーに挟まれたBNT162b2の配列と同一であることが確認された（表2）。DNAアンプリコンがBNT162b2 RNAではなくDNAに由来することを確認するために、0.5 µg/mL BNT162b2で6時間処理したHuh7細胞から精製したRNAについても、RNase処理ありまたはなしでPCRを行った（図5のCtrl 5および6）が、PCRにかけたRNA試料からはアンプリコンが検出されなかった。
４．考察
本研究では、COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2がin vitroでヒト肝細胞株Huh7に侵入することができるという証拠を提示した。
BNT162b2 mRNAは、BNT162b2曝露後6時間という速さで、細胞内でDNAに逆転写される。
逆転写のメカニズムとして、内因性の逆転写酵素であるLINE-1を介する可能性があり、LINE-1の核内タンパク質分布はBNT162b2によって上昇する。
肝細胞におけるLNPの細胞内蓄積はin vivoで証明されている[36]。BNT162b2に関する前臨床研究では，BNT162b2がヒト細胞株HEK293T細胞に入り，BNT162b2抗原の強固な発現につながることが示された[37]．そこで、本研究では、まず、ヒト肝細胞株Huh7細胞におけるBNT162b2の侵入を検討した。この研究で使用したBNT162b2濃度の選択には説明が必要である。BNT162b2は3週間間隔で2回投与され，各投与量は0.3 mLに30 µgのBNT162b2を含むので，注射部位の局所濃度は最高でも100 µg/mLとなる[31]．同様のLNP送達システムを用いたH10N8およびH7N9インフルエンザに対するmRNAワクチンに関する以前の研究では，mRNAワクチンは，肝臓，脾臓，心臓，腎臓，肺，脳などのいくつかの器官にむしろ非特異的に分布し，肝臓での濃度は，筋肉内注射部位での濃度の約100倍であることが示されている[38]．
ファイザーがEMAに提出したBNT162b2の評価報告書では、ラットの薬物動態分布試験で、総投与量の比較的大きな割合（最大18％）が肝臓に分布することが実証された[26]。そこで、肝細胞を用いた実験では、0.5、1、2μg/mLのワクチンを使用することにした。しかし，より広い範囲の低濃度および高濃度のBNT162b2の効果も，今後の研究で検証する必要がある．
今回の研究では、in vitroでの検討にはヒト肝細胞株を採用した。肝細胞にもワクチン由来のSARS-CoV-2スパイク蛋白が存在し、あらかじめプライミングされたスパイク蛋白反応性細胞傷害性T細胞のターゲットとなる可能性があるため、検討に値すると思われる。BNT162b2ワクチン接種後に自己免疫性肝炎を発症した人の症例報告[39]がある。BNT162b2の肝機能への潜在的影響についてより良く理解するために、今後の研究ではin vivoモデルが望まれる。
BNT162b2 の毒性報告では，遺伝毒性試験および発がん性試験は行われていない[26]．我々の研究では，肝細胞株Huh7においてBNT162b2がDNAに逆転写されることが示されており，BNT162b2由来のDNAが宿主ゲノムに統合されてゲノムDNAの完全性に影響を与え，遺伝毒性副作用を介する可能性があるのではないかという懸念が生じる可能性がある。現段階では、BNT162b2から逆転写されたDNAが細胞ゲノムに統合されるかどうかは分かっていない。BNT162b2がゲノムの完全性に及ぼす影響を示すためには、BNT162b2に暴露された細胞の全ゲノム配列決定や、BNT162b2のワクチン接種を受けたヒト被験者の組織など、さらなる研究が必要である。
ヒト自律型レトロトランスポゾンLINE-1は、細胞内在性逆転写酵素であり、ヒトに唯一残る活性トランスポゾンで、自身と他の非自律型要素をレトロトランスポーズすることができ[40,41]、ヒトゲノムの約17%はLINE-1配列で構成されています[42]。
非自律的なAlu要素，short, interspersed nucleotide element (SINEs), variable-number-of-tandem-repeats (VNTR) や細胞内のmRNA処理された偽遺伝子は，トランスで働く LINE-1 retrotransposition protein によって逆翻訳される [43, 44]．最近の研究では、内在性のLINE-1がSARS-CoV-2配列の逆転写と感染ヒト細胞のゲノムへの組み込みを仲介していることが示された[25]。
さらに、内因性LINE-1の発現は、SARS-CoV-2感染を含むウイルス感染時にしばしば増加する [45,46,47].。
これまでの研究から，LINE-1のレトロトランスポジション活性は，RNA代謝 [48,49]，DNA損傷応答 [50]，オートファジー [51] によって制御されていることが分かっています．LINE-1の効率的なレトロトランスポジションは，しばしば細胞周期や有糸分裂中の核膜破壊 [52,53] ，外因性レトロウイルス [54,55] と関連しており，LINE-1の核内への侵入が促進されます．我々の研究では，試験したすべての濃度（0.5，1，2μg/mL）で，BNT162b2によって核内の免疫組織化学で決定されるLINE-1 ORF1p分布が増加し，LINE-1遺伝子発現の上昇が最高BNT162b2濃度（2μg/mL）で検出された。
遺伝子の転写はクロマチン修飾、転写因子制御、RNA分解速度によって制御され、一方、タンパク質の翻訳制御には開始コドン上でのリボソーム動員、ペプチド伸長の調節、タンパク質合成の終了、またはリボソーム生合成が含まれることは注目に値する。この2つのプロセスは異なるメカニズムで制御されているため、外的なチャレンジに応答して必ずしも同じ変化パターンを示すとは限りません。BNT162b2に対するLINE-1活性の正確な制御については、さらなる研究が必要である。
本研究で用いた細胞モデルは癌細胞であり、非分裂性の体細胞とは異なり、DNA複製が活発である。また、Huh7細胞は、RNA代謝に関与するタンパク質の発現が増加するなど、大きく異なる遺伝子およびタンパク質発現を示すことが示されている[56]。しかし，骨髄や上皮基底層などのヒト組織や胚発生期においても細胞増殖は活発であり，そのような状況下でのBNT162b2のゲノムインテグリティへの影響を検討する必要がある．さらに、LINE-1の効果的なレトロトランスポジションは、ヒト神経細胞のような非分裂細胞や終末分化細胞においても報告されている[57,58]。
ファイザー社のEMA評価報告書は、BNT162b2が脾臓（1.1％未満）、副腎（0.1％未満）に分布し、さらに卵巣および精巣（0.1％未満）において低濃度で測定可能な放射能を示すことも示しました[26]。
さらに、BNT162b2の胎盤移行に関するデータは、ファイザー社のEMA評価報告書からは得られない。
その結果，BNT162b2のmRNAは，注射部位濃度の0.5％に相当する濃度（0.5 μg/mL）でHuh7細胞に容易に入り，LINE-1遺伝子およびタンパク質の発現変化を誘発し，6時間以内にBNT162b2の逆転写が検出されることが示された．
したがって、in vitroおよびin vivoの両方で、他の細胞タイプおよび組織に対するBNT162b2の効果をさらに調査することが重要である。
5.結論
本研究は、COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2のヒト肝細胞株への影響に関する初のin vitro研究である。
我々は、BNT162b2の細胞への迅速な侵入と、その後のBNT162b2 mRNAのDNAへの細胞内逆転写の証拠を提示する。
翻訳ここまで。
参考情報
河野太郎氏のブログ。
mRNAは細胞内の酵素で速やかに分解されます。（⇦ デマでした）
mRNAがヒトの遺伝子に変化を起こすことはありません。（⇦ デマでした）
自称ジャーナリスト、池上彰の超恥ずかしい記事。（知ったかぶりで解説）
以上