PCR検査で偽陽性が生じる科学的根拠 Corman-Drosten論文への反論
プライマーにヒトゲノムに近いものが混じっているため、Ct上げるとノイズとなって偽陽性を生じる。その他たくさんの問題点。
https://cormandrostenreview.com/report/
レビューレポート Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020
2020年11月27日
この広範なレビューレポートは、2020年11月27日にEurosurveillance編集委員会のsubmission-portalを介して正式に提出されました。このレビューレポートには、すべての主著者および共著者が署名した撤回要求書が同封されています。最初と最後に記載されている名前は、第一と第二の主著者です。最初と最後の名前は第一、第二の主著者であり、それ以降の名前はすべて共著者です。
SARS-CoV-2を検出するためのRTPCRテストの外部査読により、分子レベルおよび方法論レベルでの10の主要な科学的欠陥が明らかになった：偽陽性結果の影響。
Pieter Borger(1)、Bobby Rajesh Malhotra(2)、Michael Yeadon(3)、Clare Craig(4)、Kevin McKernan(5)、Klaus Steger(6)、Paul McSheehy(7)、Lidiya Angelova(8)、Fabio Franchi(9)。トーマス・ビンダー(10), ヘンリック・ウルリッヒ(11), 大橋誠(12), ステファノ・スコリオ(13), マルヨレイン・ドエスブルグ・ファン・クレフェンス(14), ドロテア・ギルバート(15), ライナー・クレメント(16), ルース・シュルーファー(17), ベルベル・W. Pieksma(18), Jan Bonte(19), Bruno H. Dalle Carbonare(20), Kevin P. Corbett(21), Ulrike Kämmerer(22)
概要
Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR」と題した論文（Eurosurveillance 25(8) 2020）において、著者らは2019-nCoV（現在はSARS-CoV-2として知られている）を検出・診断するための診断ワークフローとRT-qPCRプロトコルを提示しているが、これは検証済みであり、公衆衛生の検査室環境で使用できる堅牢な診断方法であると主張している。
この出版物が世界中の社会に与えた影響を考慮し、独立した研究者のグループが、上記の出版物をポイントごとにレビューしました。このレビューでは、1）提示された試験デザインのすべての構成要素をクロスチェックし、2）RT-qPCRプロトコルの推奨事項を優れた実験室での実践と照らし合わせて評価し、3）この分野の関連科学文献と比較してパラメータを検討しました。
発表された2019-nCoVの検出・診断のためのRT-qPCRプロトコルおよび原稿には、不十分なプライマー設計、問題のある不十分なRT-qPCRプロトコル、正確なテスト検証の欠如など、多くの技術的・科学的誤りがあります。提示されたテストや原稿自体は、科学的な出版物として認められる要件を満たしていません。さらに、著者の重大な利益相反についても言及されていません。最後に、論文を投稿してから受理されるまでの時間が非常に短い（24時間）ことから、ここでは系統的な査読プロセスが行われていないか、あるいは問題となるほど質が低いことがわかります。 私たちは、いくつかの科学的不備、エラー、欠陥の説得力のある証拠を提示します。
今回発表された科学的・方法論的な傷を考慮すると、Eurosurveillanceの編集委員会はこの出版物を撤回する以外に選択肢がないと確信しています。
簡潔なレビューレポート
この論文では、Corman-Drosten論文の重大な欠陥を数多く紹介する。その重要性から、SARS-CoV-2に起因する感染症やCOVID-19という病気に関連する感染症が世界中で誤診されている。私たちは、多くの人々の生活や人生を破壊し、教育へのアクセスを制限する厳しいロックダウンに直面しています。世界中の政府によるこれらの課せられた制限は、人々の基本的な権利や個人の自由に対する直接的な攻撃であり、その結果、世界規模で経済全体が巻き添えになっています。
Corman-Drosten論文には10の致命的な問題点があります。
第一の大きな問題は、新規コロナウイルスSARS-CoV-2（論文では2019-nCoVと命名され、2020年2月にはウイルス専門家の国際コンソーシアムによってSARS-CoV-2と命名された）が、中国の研究所から提供されたインシリコ（理論的）配列に基づいていることである[1]。現在までに、著者らは単離されたSARS-CoV-2ウイルスやその全長RNAに基づいた検証を行っていない。Cormanらによると。
"我々は、ウイルス材料を入手できなくても、公衆衛生研究所の環境で使用できる堅牢な診断方法を開発し、展開することを目的とした。" [1]
ここでは、次の2つの目的に焦点を当てる必要があります: a) 公衆衛生検査室環境で使用する診断テストの開発と展開。これらの目的は、実際のウイルス材料（例えば、感染性のウイルス負荷を決定するため）が利用できなければ達成できない。いずれにしても、最大の精度を持つプロトコルのみが、このような大規模なシナリオ・アウトカムにおける必須かつ主要な目標となり得る。重要なウイルス量の決定は必須の情報であり、これらの実験を行い、重要なデータを提供するのはChristian Drosten氏のグループの責任です。
それにもかかわらず、これらのインシリコ配列は、前述のウイルスを特定するためのRT-PCR検査方法を開発するために使用されました。このモデルは、この新規ウイルスが2003年に発生したSARS-CoVと非常によく似ており、どちらもβ-コロナウイルスであるという仮定に基づいています。
そのため、PCR検査は、SARS-CoVのゲノム配列をSarbecoコンポーネントの対照物質として用いて設計された。このことは、Corman-Drosten論文の共著者の1人である[2]氏との個人的な電子メールのやりとりから分かった。このSARS-CoV-2のモデル化方法は、コーマン・ドロステン論文に次のように記載されている。
"2019-nCoVのスクリーニングと特異的な確認のための診断ワークフローの確立と検証、利用可能なウイルス分離株や患者のオリジナル検体がない場合に設計された。設計と検証は、2003年のSARS-CoVとの遺伝的な近縁性によって可能となり、合成核酸技術の使用によって支援された。"
逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、あらかじめ分かっている希少なRNA断片を迅速に検出するための重要な生体分子技術である。最初のステップでは、サンプル中に存在するRNA分子が逆転写されてcDNAが得られます。このcDNAは、特定のプライマーペアと耐熱性DNAポリメラーゼ酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応で増幅されます。この技術は高感度であり、その検出限界は理論上1分子のcDNAである。PCRの特異性は、生体分子の設計誤差に大きく影響されます。
RT-PCRテストやCorman-Drostenの論文に記載されている定量的RT-qPCRテストを設計する際に重要なことは何ですか？
1. プライマーとプローブです。
a) プライマーとプローブの濃度が最適な範囲であること。
(100-200nM)
b) 増幅させたい標的遺伝子に特異的であること。
c) 全窒素塩基に対するGC含有率が最適であること（最低40％、最高60％）。
d) ウイルス診断のためには、少なくとも3つのプライマーペアが3つのウイルス遺伝子を検出する必要がある（ウイルスゲノムの中でできる限り離れていることが望ましい）。
2. 全ての反応が行われる際の温度
a) DNAの融解温度（＞92°）。
b) DNAの増幅温度（TaqPol特有のもの
c) Tm; アニーリング温度（プライマーとプローブが標的に結合/脱離する温度、プライマーペアあたり2̊Cを超えないこと）。TmはプライマーのGC含量に大きく依存する。
3. 増幅サイクル数（35サイクル以下、好ましくは25～30サイクル）。
ウイルス検出の場合、35サイクル以上では、細胞培養で分離された感染性ウイルスと相関しないシグナルしか検出されない（2のレビュー）。35サイクル以上の閾値を使用した場合にPCRで陽性と判定された人がいた場合（欧米のほとんどの検査機関ではそうなっている）、その人が実際に感染している確率は3％未満であり、その結果が偽陽性である確率は97％である（3のレビュー）。
4. 分子生物学的検証；増幅されたPCR産物は、DNA定規を用いてゲル中で実行するか、直接DNA配列を決定することによって検証されなければならない。
5. 5. 特定のウイルス検出を確認/反証するために、陽性および陰性コントロールを指定すること。
6. 6. 標準操作手順（SOP）が用意されていること。
SOP は上記のパラメータを明確に規定することで、すべての検査室がまったく同じ試験条件を設定できるようにする。妥当性が確認された世界共通のSOPがあることは、国内および海外でのデータ比較を可能にするために不可欠である。
Corman-Drosten論文の主な懸念事項
1. Corman-Drosten論文のTable 1では、「nM」が指定されているのに対し、「nm」は指定されていないなど、異なる略語が記載されている。また、正しい命名法については、nmは「ナノメートル」を意味するので、ここではnmをnMとすべきである。
2. 2. 遺伝子配列は、リバースプライマーも含めて、常に5'-3'方向に記述するのが一般的な考え方です。Corman-Drosten論文の図2で著者らが行ったように、プライマー配列を逆相補的に書いてアライメントを行うのは非常に珍しいことです。また、ここでは、ウォブル塩基を「Y」と表記しているが、そのYがどの塩基を表すのかの説明はない。
3. Corman-Drosten論文の2つの誤解を招く落とし穴は、表1にTm値（アニーリング温度の値）が含まれていないことと、GC値（全塩基数に対する配列中のGとCの数の割合）が示されていないことである。
Corman-Drosten論文の主な懸念事項
A) 背景
著者は、自分たちの科学的研究の背景を次のように紹介しています。"最近発生した新型コロナウイルス（2019-nCoV）の進行中のアウトブレイクは、ウイルスの分離株が入手できないため、公衆衛生研究所に課題を突きつけているが、その一方で、アウトブレイクは当初考えられていたよりも広く発生しており、旅行者を通じた国際的な広がりがすでに発生しているという証拠が増えている」。
BBCニュース[4]やGoogle Statistics[5]によると、原稿が投稿された2020年1月21日には、世界全体で6人の死者が出ていました。当初考えられていたよりも感染が拡大していることを示す実質的な証拠がその時点ではなかったにもかかわらず、なぜ著者は公衆衛生検査機関の課題を想定したのでしょうか。
著者らは、その目的として、ウイルスの材料がなくても、公衆衛生検査室で使用できる堅牢な診断方法を開発し、展開することを宣言しています。さらに、「本研究は、国内およびヨーロッパの研究ネットワークにおける学術的および公的な研究所の連携によって達成された膨大な対応能力を実証するものである」と認めている。
B) 方法と結果
1. プライマーとプローブの設計
1a) 誤ったプライマー濃度
信頼性の高い正確なPCRテストプロトコルは，通常，1本のプライマーにつき100nMから200nMの間で設計される[7]。Corman-Drostenの論文では、いくつかのプライマーについて、プライマー濃度が異常に高く、バラバラであることが確認された（表1）。RdRp_SARSr-FとRdRp_SARSr-Rのプライマーペアについては、それぞれ600nMと800nMが記述されている。同様に、N_Sarbeco_FとN_Sarbeco_Rのプライマーセットについては、それぞれ600nMと800nMを提唱している[1]。
これらの濃度は、標的遺伝子の特異的な増幅に最適な濃度としては、あまりにも高すぎることは明らかでしょう。このプロトコルでこのような高濃度のプライマーを使用する理由は特にありません。むしろ、これらの濃度では、非特異的な結合やPCR産物の増幅が増加します。
表1: プライマーとプローブ（Corman-Drosten論文より引用、誤ったプライマー濃度は強調表示
1b) 特定できない（"Wobbly"）プライマーとプローブの配列
再現性のある比較可能な結果を得るためには、プライマーペアを明確に定義することが不可欠です。Corman-Drostenの論文では、R、W、M、Sの文字で示された6つの不特定の位置が確認された（表2）。Wはこの位置にAかTのどちらかが存在することを、RはGかAのどちらかが存在することを、MはAかCのどちらかが存在することを、Sはこの位置にGかCのどちらかが存在することを示す。
このように多くのバリアントが存在することは異常であるだけでなく、検査室にとっても非常に混乱を招くことになる。これらの6つの不定形な位置は、SARS-CoV-2とは関係のないいくつかの異なる代替プライマー配列（2つの異なるRdRp_SARSr_Fプライマー＋8つの異なるRdRp_SARS_P1プローブ＋4つの異なるRdRp_SARSr_R）を容易に設計することができる。このようなデザインの違いにより、SARS CoV-2とは関係のない結果が出ることは避けられない。したがって、Corman-Drosten論文の紛らわしい不特定多数の記述は、Standard Operational Protocolとしては適さない。これらの不特定多数の位置は、明確に設計されるべきであった。
これらの不安定な配列は、すでに研究者の間で問題視されており、Pillonelらは、記載された配列の明らかな誤りについて、Letter to the Editorを執筆しました[8]。これらの誤りは、Cormanらの追補版でも明らかです。
表2：プライマーとプローブ（Corman-Drostenの論文より引用：プライマー中の特定できない（"Wobbly"）ヌクレオチドは強調表示されている
Corman-Drosten論文に直接由来するWHOプロトコル（図1）では、SARS-CoV-2の存在を確認するためには、2つのコントロール遺伝子（E遺伝子とRdRp遺伝子）をアッセイで同定する必要があると結論づけている。RdRd遺伝子は、フォワードプライマーでは1つの不確実な位置（"wobbly"）があり（R=G/A）、リバースプライマーでは2つの不確実な位置（R=G/A; S=G/C）があり、RdRpプローブでは3つの不確実な位置（W=A/T; R=G/A; M=A/C）があることに留意すべきである。つまり、RdRd遺伝子に対して、2種類のフォワードプライマー、4種類のリバースプライマー、8種類のプローブを合成することができる。つまり、プライマーとプローブの組み合わせは64通りにもなるのだ。
Corman-Drostenの論文では、さらに、WHOのプロトコルによれば、さらなる検証が行われず、不要とされた第3の遺伝子が特定されています。
"注目すべきは、N遺伝子のアッセイも良好な結果を示したが、感度がわずかに劣るため、集中的な追加検証を受けなかったことである。"
これは、3つの遺伝子PCRをすべて確認用のアッセイとして使用することが最善であり、そうすれば、ほぼ十分なウイルスRNA検出診断ツールのプロトコルになったはずなので、残念な省略でした。3つの確認アッセイのステップは、少なくとも、"Wobbly "スポットに関するすべてのフォールドステップでのエラーと不確実性を最小限に抑えることができます。しかし、その他の設計上の問題を考慮すると、このプロトコルは「良い実験方法」とは言えないでしょう。
現状では、N遺伝子検査は、残念ながらWHO勧告（図1）では必須かつ重要な第3の確認ステップとして提案されておらず、Corman-Drosten論文では「ルーチンワークフローのための」重要なオプションの安心材料として強調されていない（表2）。
その結果、世界中のほぼすべての検査方法において、3つのプライマーマッチではなく、単に2つのプライマーマッチが使用されていました。このようなミスがあったため、現在進行中のパンデミックにおいて実際に重要な意味を持つ正確な検査結果を出すためには、この検査プロトコル全体が役に立たないものとなってしまったのです。
図1：N-Gene確認試験は、以下のWHO Drosten-Cormanプロトコル推奨の公式資料[8]では、必要な第3段階として強調されておらず、Eurosurveillanceの出版物では、より高い検査精度のための重要なステップとして要求されていません。
1c) 誤ったGC含有量（2cでアニーリング温度（Tm）と合わせて説明している
1d) ウィルス遺伝子の検出
RT-PCRは、感染症の一次診断には推奨されていない。このため、COVID-19の検出のために臨床現場で使用されているRT-PCRテストは、規制上、COVID-19の診断には適応されません。
"臨床家は、感染症の診断において、分子診断技術の精度とスピードが向上したことを認識する必要がありますが、同時にその限界も理解する必要があります。検査結果は、常に患者の臨床症状との関連で解釈されるべきであり、信頼性の高い検査結果を得るためには、適切な部位、品質、および検体採取のタイミングが必要である」と述べています。[9]
しかし、医師が肺の異なる感染症を判別しなければならないときに、医師の鑑別診断の助けになることがあります（インフルエンザ、Covid-19、SARSは症状が非常に似ています）。特定のウイルスの確定診断のためには、3つのウイルス特異的遺伝子を検出するために、少なくとも3つの特異的プライマー対を適用する必要がある。好ましくは、これらの標的遺伝子は、ウイルスゲノムの中で可能な限り大きな距離を置いて配置されていることが望ましい（反対側の端も含む）。
Corman-Drostenの論文では3つのプライマーが紹介されているが、これらのプライマーはウイルスゲノムの約半分しかカバーしていない。このことも、COVID-19ウイルスのRNAを検出する際の特異性を低下させ、検査結果の偽陽性率を高める要因となっている。
したがって、たとえ1つのサンプルで3つの陽性シグナル（すなわち、3つのプライマーペアが3つの異なる増幅産物を与える）が得られたとしても、これはウイルスの存在を証明するものではありません。より良いプライマーデザインは、ウイルスゲノムの両末端に末端プライマーを配置することである。これは、ウイルスゲノム全体がカバーされ、3つのポジティブシグナルによって、完全な（つまり感染力のある）ウイルスと断片化された（感染力のない）ウイルスゲノムをよりよく識別できるからです。ウイルスの感染力を推測するためには、SARS-CoVウイルスの必須レプリカーゼ酵素をコードするOrf1遺伝子がターゲットとして含まれるべきだった（図2）。ターゲットを、ウイルスゲノムの中で最も大量かつ可変的に転写される領域に配置したことも、このプロトコルの弱点である。
Kimらは、Sars-CoV-2におけるサブゲノムRNAの高度に可変な3'発現を実証している[23]。これらのRNAは、無症候性および非感染性の患者のシグネチャーとして積極的にモニターされています[10]。プライマーの3プライムエンドに6塩基対のプライマーダイマーを持つqPCRプライマーを用いて、無症候性の人々の集団をスクリーニングすることは、非常に疑問です（図3）。
WHOはこのようなプライマーを推奨しているようです。私たちは、Corman-Drosten論文に掲載されたすべてのウォブル誘導体を、Thermofisher社のprimer dimer web toolでテストしました[11]。RdRpフォワードプライマーは、Sarbeco E Reverseと6bp 3primeの相同性を持っています。高濃度のプライマーでは、これは不正確さを生み出すのに十分です。
特筆すべきは、Nプライマーの1つが、免疫不全患者に見られる臨床病原体（Pantoea）と完全に一致していること。リバースプライマーも同様にPantoeaにヒットしますが、同じ領域ではありません（図3）。
この検査では、ウイルス全体とウイルス断片を識別することができないため、これらは重大な設計ミスです。この検査法は、SARSウイルスの診断法としては使用できない。
図2：SARSコロナウイルスと2019年の新型コロナウイルスのゲノム上のアンプリコン標的の相対的な位置。ORF：オープンリーディングフレーム；RdRp: RNA依存性RNAポリメラーゼ。アンプリコンの下の数字は、SARS-CoV, NC_004718 [1]によるゲノムの位置。
図3：Thermofischer社のprimer dimer web toolを用いたテストでは、RdRpのフォワードプライマーがSarbeco E Reverseと6bpの3`prime相同性を持つことが明らかになった（左枠）。また、別のテストでは、N-プライマーの1つが、免疫不全患者に見られる臨床病原体（Pantoea）と完全に一致することが判明した（右枠）。
2. 反応温度
2a) DNAの融解温度（>92°）。
Corman-Drosten論文で十分に対応しています。
2b) DNA の増幅温度。
Corman-Drosten論文に十分に記載されています。
2c) GC-contentsとTmの誤記
アニーリング温度とは、プライマーが標的配列にどのような温度でくっついたり離れたりするかを決めるものである。効率的で特異的な増幅のためには，プライマーのGC含量は最低でも40％，最高でも60％の増幅率を満たす必要がある。表3に示すように、Corman-Drosten論文に記載されている3つのプライマーは、GC含有量が通常の範囲内ではない。2つのプライマー（RdRp_SARSr_FおよびRdRp_SARSr_R）は、ウォブル塩基のすべての可能なバリアントに対して28%〜31%という異常に低いGC値を示し、一方、プライマーE_Sarbeco_Fは34.6%のGC値を示した（表3および表3の2番目のパネル）。
ここで注目すべきは、GC値は、塩基対の3つの水素結合により、特定の標的への結合を大きく左右するということである。したがって，プライマーのGC含量が低いほど，特定の標的遺伝子配列（すなわち検出すべき遺伝子）に対する結合能力は低くなる。つまり、ターゲット配列を認識するためには、プライマーが再び剥離しないように、実際のアニーリング温度（ベストプラクティス値）にできるだけ近い温度を選択すると同時に、ターゲット配列を特別に選択しなければならないのである。
Tm値が非常に低い場合、RdRpリバースプライマーのすべてのウォーブリーバリアントで観察されたように、プライマーは複数のターゲットに非特異的に結合し、特異性が低下して偽陽性の可能性が高くなる。
アニーリング温度（Tm）は、qPCR法の特異性/精度を決定するための重要な要素であり、qPCRプロトコルの精度を評価するために不可欠である。ベストプラクティスの推奨事項 両プライマー（フォワードおよびリバース）は、ほぼ同様の値、できれば同一の値であることが望ましい。
Corman-Drosten論文で使用されたすべてのプライマーについて，自由に利用できるプライマー設計ソフトウェアPrimer-BLAST [12, 25]を用いて，最良の実践値を評価した（表3）。我々は，Tm値が60°Cになるようにし，同様にすべてのプライマーで可能な限り高いGC%値を求めた。プライマーペア内の最大Tm差は2°Cとした。Corman-Drostenの論文で指定されたプライマーペアをテストしたところ、プライマーペア1（RdRp_SARSr_FとRdRp_SARSr_R）のアニーリング温度Tmに関して10°Cの差が確認された。これは非常に重大な誤りであり、このプロトコルは特定の診断ツールとしては役に立たない。
追加のテストでは、N遺伝子を増幅するように設計されたプライマーペア（N_Sarbeco_FとN_Sarbeco_R）のみが、十分なGC含量を持ち、プライマー間のTm差が1.85℃（重要な最大値である2℃差を下回る）であるため、診断テストで動作するのに十分な基準に達していることが示された。重要なのは、この遺伝子は、ウイルスサンプルでは検査されず（表2）、確認試験としても強調されなかった遺伝子であることだ。プライマーの融解温度が大きく変化していることと、プライマーの配列が縮退していることに加えて、手順の特異性に影響を与える別の要因があります。dNTPs（0.4uM）は、高特異性増幅のために推奨される量の2倍で、さらに硫酸マグネシウムも加えられている。この手順と低いアニーリング温度を組み合わせると、非特異的な増幅が生じる可能性があります。qPCRに追加のマグネシウムが必要な場合、アッセイの特異性をさらに精査する必要があります。
ここで述べた設計上の誤りは非常に深刻であり、Corman-Drosten論文のプロトコルを用いてSARS-CoV-2の遺伝物質の特異的な増幅が起こる可能性は極めて低いと考えられる。
表3：プライマーとプローブのGC含有量（Corman-Drosten論文より引用、最適化されたGC含有量からの異常は強調表示されている。2枚目のパネルは、Corman-Drosten論文で使用されたすべてのプライマーとプローブのPrimer-BLASTベストプラクティス値を表にしたもので、Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & her teamによるものです。
3. 増幅サイクルの数
Corman-Drostenの論文には、検査が陽性か陰性か、あるいは何をもって陽性か陰性かを定義するのかについて、どこにも言及されていないことに注意すべきである。このようなタイプのウイルス診断検査は、有効で固定されたPCRサイクル数（Ct値）を含むSOP（標準操作手順）に基づいて行われなければならず、その結果、サンプルは陽性または陰性と判断されます。合理的に信頼できるCt値の最大値は30サイクルです。Ct値が35サイクル以上になると、偽陽性の数が急速に増加することが予想されます。
Ct値が35サイクルを超えて陽性と評価されたPCRデータは、全く信頼できません。
Jaafarらの2020[3]を引用します。"PCRの陽性結果を報告するために使用した値であるCt=35では、<3%の培養が陽性である。" つまり、これらの高いCt値では、SARS-CoV-2のウイルス分離に成功していないのです。
さらに、科学的な研究によると、Ct値が35の場合、非感染性の（死んだ）ウイルスしか検出されないことがわかっています[22]。
30と35の間にはグレーゾーンがあり、確実に陽性と判定することはできません。この領域は除外すべきです。もちろん、Corman-Drosten WHO-protocol（図4）で推奨されているように、45回のPCRサイクルを行うこともできますが、その場合、妥当なCt値（30を超えてはいけない）を定義する必要があります。しかし、Ct値が45の分析結果は、科学的にも診断的にも全く意味がありません（妥当なCt値は30を超えてはいけません）。このようなことを明確に伝える必要があります。Corman-Drostenの論文では、サンプルが陽性または陰性と明確に判断できる最大のCt値について言及されていないのは大きな間違いです。この重要なサイクル閾値の上限も、これまでのフォローアップ論文には明記されていません。
図4：Corman-Drosten WHO公式プロトコル[8]におけるRT-PCRキットの推奨事項。対応する科学的に妥当なCt（カットオフ値）を伴わない「サイクラー」値（サイクル数）のみが発見されます。このサイクル値やその他のサイクル値は、Corman-Drostenの実際の論文にはどこにも見当たりません。
4. 生体分子の検証
増幅された産物が本当にSARS-CoV-2の遺伝子であるかどうかを判断するためには、増幅されたPCR産物の生体分子の検証が不可欠である。診断テストとしては、このバリデーションは絶対に必要である。
PCR産物の検証は、PCR産物を1%アガロース-EtBrゲルで、サイズインジケーター（DNAルーラーまたはDNAラダー）と一緒に泳がせ、産物のサイズを推定することで行う。このサイズは、算出された増幅産物のサイズと一致していなければなりません。しかし、増幅産物の塩基配列を決定することはさらに望ましいことです。後者であれば、増幅産物の同一性について100％の確信が得られます。分子レベルでの検証なしには、増幅されたPCR産物の同一性を確信することはできません。前述の深刻な設計ミスを考慮すると、増幅されたPCR産物は何でもありです。
また、Corman-Drostenの論文では言及されていませんが、qPCRの小さな断片（100bp程度）の場合もあります。1,5%アガロースゲルでも、アクリルアミドゲルでもよい。
これらのPCR産物が分子レベルで検証されていないという事実は、このプロトコルのもう一つの顕著な誤りであり、このプロトコルに基づいた検査は、SARS-CoV-2ウイルスを特定するための診断ツールとしては役に立たない。
5. 5.ウイルス検出の確認・反証のための陽性・陰性コントロール。
Corman-Drosten論文に記載されている未確認の仮説は、SARS-CoV-2が、現在、ヒトに感染症を引き起こすSARS様β-コロナウイルスグループの唯一のウイルスであるというものである。彼らのPCR法のベースとなっている配列は、中国の研究所から提供されたin silico配列である[23]。なぜなら、PCR法の開発時点では、感染性（「生きた」）または不活化されたSARS-CoV-2の対照物質を著者らは入手できなかったからである。そこで、既知のSARS-CoVの配列をSarbecoコンポーネントの対照物質として用いてPCR検査を設計した（Meijer博士、共著者のCorman-Drosten論文、Peter Borger博士との電子メール交換）[2]。
Corman-Drosten論文に記載されているように、RT-PCRテストで陽性と判定された人はすべて、SARS-CoV-2感染症が陽性であると想定されています。彼らの仮定には3つの重大な欠陥がある。まず、Corman-Drosten論文に記載されているRNA分子の検査が陽性であることは、「ウイルスへの感染」と同一視することはできない。RT-PCRの陽性反応は、単にウイルスのRNA分子の存在を示しているに過ぎません。ポイント1d（上記）で示したように、Corman-Drostenテストは、完全な長さのウイルスを検出するように設計されておらず、ウイルスの断片のみを検出するように設計されている。このことから、この検査法はSARSウイルス感染症の診断法としては不適当であると結論づけた。
SARSウイルス感染症の診断テストとしては不適切であると結論づけた。
第2に、重要な点として、科学的に必須のゴールドスタンダードであるポジティブコントロール（単離されたSARS-CoV-2 RNA）を用いて、発表されたRT-PCRテストの機能性が実証されていないことが挙げられる。
第三に、Corman-Drostenの論文には次のように書かれている。
"このアッセイが他のコウモリ由来のSARS関連ウイルスを検出できることを示すために、Drexlerら［...］およびMuthら［...］から入手した6つのコウモリ由来の糞便サンプルをE遺伝子アッセイで検査した。これらのウイルス陽性のサンプルは、ヨーロッパのライノロフィンコウモリに由来するものである。SARS関連のCoVクラードの中にこれらの系統的に外れたウイルスが検出されたということは、アジアのすべてのウイルスが検出される可能性があるということです。これにより、理論的には、動物リザーバーから複数の独立した変異型ウイルスが獲得された場合でも、幅広い感度が確保されることになる。"
この記述は、Corman-Drosten論文に記載されているように、RT-PCRテストで使用されるE遺伝子がSARS-CoV-2に特異的ではないことを示している。
E遺伝子のプライマーは、他のSARSウイルスも幅広く検出する。
コロナウイルスのゲノムは、ヒトに感染するすべてのRNAウイルスの中で最大であり、すべてのウイルスは非常に似通った分子構造を持っている。しかし、SARS-CoV1とSARS-CoV-2は、他のコロナウイルスとは異なる2つの極めて特異的な遺伝子フィンガープリントを持っている。まず、SARS-CoVとSARS-CoV-2のN-proteinには、ユニークなフィンガープリント配列（KTFPPTEPKKDKKKK）が存在する[13,14,15]。第二に、SARS-CoV1とSARS-CoV2はともにHEタンパク質を含んでいないのに対し、他のコロナウイルスはすべてこの遺伝子を持っている[13,14]。したがって、SARS-CoV1およびSARS-CoV2のPCR産物を特異的に検出するためには、N遺伝子の上記領域を増幅標的として選択する必要があった。信頼性の高い診断テストでは、確認テストとしてN遺伝子のこの特定領域に焦点を当てるべきである。このN遺伝子のPCRは、SARS-CoVのオリジナルプローブでは「あまり感度が高くない」という理由で、Drosten-Corman論文では検査遺伝子としての検証も推奨もされていない[1]。
さらに、SARS-CoV1とSARS-CoV-2の両方にHE遺伝子が存在しないことから、この遺伝子は他のコロナウイルスを除外するための理想的な陰性コントロールとなっている。Corman-Drosten論文にはこのネガティブコントロールが含まれておらず、他のネガティブコントロールも含まれていない。したがって，Corman-Drosten論文のPCR検査には，他のコロナウイルスの存在を排除するための独自の陽性コントロールも陰性コントロールも含まれていない。これは、このテストが診断に適さないと分類される、もう一つの大きな設計上の欠陥である。
6. 標準作業手順書（SOP）が利用できない
すべての試験所が同一の試験条件を設定できるように、上記のパラメータを明確に規定した標準操作手順（SOP）が利用可能であること。妥当性が確認された世界共通のSOPを持つことは、国内および海外でのデータ比較を容易にするために不可欠である。すべてのプライマーパラメータを明確に規定することは非常に重要である。これが行われていないことに注目しています。さらに、サンプルを陽性または陰性と見なすべきタイミングを示すCt値も指定されていません。また、どのような場合にSARS-CoVウイルスに感染していると判断するかも明記されていない。上記のように、この検査ではウイルスとウイルスの断片を識別することができないため、陽性を示すCt値は非常に重要である。このCt値は、標準操作手順書（SOP）に明記され、オンラインで公開されるべきであり、この検査を実施するすべての検査室がまったく同じ境界条件を持つようにすべきであった。このようなSOPが存在しないのは、科学的に欠陥があることを示している。そのため、各試験所は適切と思われる方法で自由に試験を行うことができ、その結果、膨大な量のばらつきが生じます。ヨーロッパ中の研究室が多くの疑問を抱えている。どのプライマーを注文するか、どのヌクレオチドで未定義の場所を埋めるか、どのTm値を選択するか？いくつのPCRサイクルを実行するか？どのようなCt値であればサンプルは陽性か？また、どのような場合に陰性となりますか？テストする遺伝子の数は？全ての遺伝子を検査すべきなのか、それともCorman-Drosten論文の表2にあるようにE遺伝子とRpRd遺伝子だけを検査すべきなのか？また、N遺伝子も検査すべきでしょうか？また、ネガティブコントロールは何ですか？ポジティブコントロールは何ですか？
記載されているプロトコルは、残念ながら非常に曖昧で、何十通りもの方向に進むことができる誤った設計になっています。標準化もSOPもないようなので、このテストがどのように実施できるのかは明確ではありません。
7. 1-5で述べた誤りの結果：偽陽性結果。
Corman-Drosten論文に記載されているRT-PCRテストには、分子生物学的な設計上の誤り（1-5参照）が非常に多く含まれており、明確な結果を得ることはできません。このテストで膨大な数のいわゆる「偽陽性」が発生することは避けられません。偽陽性の定義は、最初は陽性と判定されたが、同じテストで再検査した結果、陰性となったサンプルのことである。偽陽性とは、誤った陽性の検査結果、つまり、陽性と判定された陰性のサンプルのことです。Corman-Drostenの論文では、これが実際に見つかっています。原稿PDFの6ページで、著者らは、十分に管理された実験室条件であっても、このテストではかなりの割合で偽陽性が発生することを示しています。
"4つのテスト反応において、初期に弱い反応が見られたが、同じアッセイで再検査すると陰性であった。これらのシグナルは特定のウイルスに関連したものではなく、初期に陽性反応を示した各ウイルスについて、同じウイルスをより高濃度で含むが陽性反応を示さなかったサンプルもあった。前述の広範な技術評価の結果から，この初期反応はリアルタイムPCRプローブの化学的不安定性によるものではなく，この評価試験中に新しい診断テストとコントロールが急速に導入されたことによる取り扱い上の問題である可能性が高いと結論づけられた。" [1]
この抜粋の最初の文は、Corman-Drosten論文に記載されているPCRテストが偽陽性を発生させることを示す明確な証拠です。最新のシャリテ研究室の十分に管理された条件下でさえ、310の一次検査のうち4つが定義通りの偽陽性である。4つの陰性サンプルは、最初は陽性と判定されましたが、再検査で陰性となりました。これは偽陽性の典型的な例です。この場合、著者はこれらを偽陽性と認めていませんが、これは知的に不誠実です。
もう一つの特徴は、著者が偽陽性を「新しい診断テストの急速な導入によって生じるハンドリングの問題」として説明していることである。SOPに通常記載されているすべての必要な情報なしに検査を導入しなければならない検査室を想像してみてください。
8. Corman-Drosten論文は査読を受けていない
科学・医学論文は、学術雑誌に正式に掲載される前に、伝統的に「査読」によって認定されます。このプロセスでは、ジャーナルの編集者は、論文を評価した様々な専門家（「査読者」）からアドバイスを受け、論文の仮定、方法、結論の弱点を指摘されることがあります。通常、ジャーナルは、著者が査読者の懸念に対処し、提示されたデータが論文で導き出された結論を裏付けるものであると編集者が納得した場合にのみ、その論文を出版します。" このプロセスは、Eurosurveillance[16]でも説明されています。
Corman-Drostenの論文は、2020年1月21日にEurosurveillanceに投稿され、2020年1月22日に出版が認められました。2020年1月23日には、論文がオンラインになりました。2020年1月13日にプロトコルのバージョン1-0がWHOの公式サイトで公開され[17]、2020年1月17日にドキュメントバージョン2-1として更新された[18]が、Corman-Drostenの論文が1月23日にEurosurveillanceで発表される前に公開された。
通常、査読は、その分野の少なくとも2人の専門家が投稿された論文を批判的に読み、コメントしなければならないため、時間のかかるプロセスです。私たちは、この論文は査読を受けていないと考えています。徹底した査読を行うには、24時間では到底足りません。我々の結論は、非常に多くの深刻な設計上の欠陥が我々によって発見されたという事実によって裏付けられている。これらの欠陥により、PCR検査はSARS-CoV-2ウイルスを特定するための診断ツールとしては全く適さない。RT-PCRの設計に精通した分子生物学者であれば、Corman-Drostenの論文に存在する重大な誤りを、実際の査読プロセスの前に容易に見抜くことができたはずです。私たちは、2020年10月26日にEurosurveillance社に査読報告書のコピーを送るように依頼しました。そして、2020年11月18日付けの手紙で、EurosurveillanceのホストであるECDCは、その決定の実質的な科学的理由を示すことなく、アクセスを提供することを拒否しました。それどころか、彼らは "開示は科学的調査の目的を損なうだろう "と書いている。[24].
9. 編集者としての著者
最後の点は、大きな関心事である。Corman-Drosten論文の2人の著者、Christian DrostenとChantal Reuskenは、本誌の編集委員会のメンバーでもあることが判明しました[19]。したがって，深刻な利害の対立があり，この論文が査読されていない疑いが強まっています。著者がEurosurveillanceの編集委員会のメンバーであるという理由だけで、迅速な出版が可能であったかのように見えます。このような行為は、科学的誠実さを損なうものとして分類されます。
論文に見られる誤りの概要
Corman-Drostenの論文には、以下のような具体的な誤りがある。
1. 1. このプロトコルで、極めて高い濃度のプライマーを使用する理由は明示されていない。この濃度では、非特異的結合やPCR産物の増幅が起こり、SARS-CoV-2ウイルスを特定する診断ツールとしては不適当である。
2. Corman-Drosten論文の混乱を招くような非特異的な記述は、SARS-CoV-2ウイルスを特定するための特異的診断ツールとしてこのテストを不適当にする標準操作プロトコルとしては適切ではない。
3. 3. このテストは、ウイルス全体とウイルス断片を識別することができない。そのため、SARS-CoV-2ウイルスを同定し、感染の有無を推測するための特定の診断ツールとしては適していない。
4. プライマーペア1（RdRp_SARSr_FとRdRp_SARSr_R）のアニーリング温度Tmに10℃の差がある場合も、SARS-CoV-2ウイルスを特定するための診断ツールとしては不適である。
5. 5. 重大な誤りとして、サンプルが陽性および陰性とみなされるCt値が省略されている。このCt値はフォローアップ資料にも記載されていないため、この検査はSARS-CoV-2ウイルスを特定するための診断ツールとしては不適当である。
6. 6. PCR産物は、分子レベルでの検証が行われていない。この事実により、このプロトコルはSARS-CoV-2ウイルスを特定するための診断ツールとしては役に立たない。
7. PCR検査には、SARS-CoV-2に対する特異性を評価するための独自の陽性対照や、他のコロナウイルスの存在を排除するための陰性対照が含まれていないため、SARS-CoV-2ウイルスを特定するための特異的診断ツールとしては不適当である。
8. Corman-Drosten論文のテストデザインは非常に曖昧で欠陥があり、何十通りもの方向性があり、何も標準化されておらず、SOPも存在しない。このことは、このテストの科学的妥当性に大きな疑問を投げかけており、SARS-CoV-2ウイルスを特定するための診断ツールとしては不適当である。
9. Corman-Drostenの論文は査読されていないため、この検査はSARS-CoV-2ウイルスを特定する診断ツールとしては不適当であると考えられる。
10. Corman-Drosten論文の著者のうち2人（Christian DrostenとChantal Reusken）がEurosurveillanceの編集委員であることに加え、少なくとも4人の著者に深刻な利益相反があることがわかった。2020年7月29日には、原版では宣言されていなかった（PubMed版ではまだ欠落している）利益相反が追加されました（Olfert LandtはTIB-Molbiol社のCEO、Marco KaiserはGenExpress社のシニアリサーチャーでTIB-Molbiol社の科学顧問を務めています）。TIB-Molbiol社は、Corman-Drostenの原稿に掲載されたプロトコルに基づいてPCRキット（Light Mix）を「最初に」製造した会社であり、彼ら自身の言葉によれば、出版物が投稿される前にこれらのPCRテストキットを配布していた[20]。さらに、Victor CormanとChristian Drostenは、2番目の所属先について言及していない。さらに，ヴィクター・コーマンとクリスチャン・ドロステンは，彼らの2つ目の所属先である「Labor Berlin」について言及していない。さらに、Victor CormanとChristian Drostenは、彼らの第二の所属先である商業検査機関「Labor Berlin」について言及していない。
Corman-Drostenの論文に記載されているSARS-CoV-2を同定するためのテストプロトコルを再検討した結果、SARS-CoV-2 PCRテストを無意味なものにしてしまうような誤りや固有の誤謬があることがわかった。
結論
どのテストプロトコルを発表し、広く利用できるようにするかは、ユーロサーベイランスの手に委ねられています。Corman-Drostenの論文で明らかになった誤りを認識するという決定は、今後の人的コストと苦しみを大幅に最小限に抑えるという利点がある。
この論文を撤回することは、Eurosurveillanceの最善の利益にならないのでしょうか？私たちの結論は明確です。ここに記載されているすべての途方もないPCRプロトコルの設計上の欠陥とエラーに直面して、私たちは結論を出します。科学的誠実さと責任の枠組みの中では、選択の余地はあまりありません。