抗生物質による腸内細菌叢異常症は胆汁酸代謝を介して宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランススクリプトームを修飾する

記事内容へスキップ
記事情報へスキップ
ワイリーオンラインライブラリー

先端科学早見2307981
研究論文
オープンアクセス
抗生物質による腸内細菌叢異常症は胆汁酸代謝を介して宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランススクリプトームを修飾する

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202307981

楊孟、鄭小奇、范嘉軍、鄭偉、厳同盟、頼玉山、張寧平、呂毅、斉佳莉、霍振毅、徐子和、黄嘉、焦玉廷、劉彪迪、龐瑞、中翔、黄詩、羅冠正、ジーナ・リー、クリスチャン・ジョビン、A. ムラト・エレン、ユージン・B・チャン、ホン・ウェイ、タオ・パン、シャオユン・ワン
初出：2024年5月7日
https://doi.org/10.1002/advs.202307981
について
セクション

要旨
腸内細菌叢は、代謝産物を通じて宿主の遺伝子発現や生理機能に影響を及ぼす可能性がある。また、腸内細菌叢の有無は、N6-メチルアデノシン（m6A）に代表されるように、宿主のトランスクリプトームやエピトランスクリプトームをリプログラムすることができる。しかし、腸内細菌叢由来の代謝産物が、どのようにして宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランススクリプトームを再プログラムするのかについては、まだ十分に解明されていない。ここでは、複数のマウスモデルとマルチオミクスアプローチを用いて、腸内細菌叢由来の代謝産物が宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランスクリプトームにどのような影響を与えるかを調べた。その結果、胆汁酸産生微生物叢の存在量の変化とともに、胆汁酸代謝が有意に変化することが示された。アンバランスな腸内細菌叢と胆汁酸は、宿主のトランスクリプトームと複数の組織におけるm6Aエピトランスクリプトームを劇的に変化させる。メカニズム的には、抗生物質で処理した動物や胆汁酸で処理した培養細胞では、m6Aライタータンパク質の発現が制御されており、胆汁酸代謝とm6Aの生物学との間に直接的な関連があることを示している。これらの結果を総合すると、抗生物質による腸内環境の異常が、胆汁酸代謝経路を介して宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランススクリプトームの景観を制御していることが明らかになった。本研究は、微生物代謝産物と宿主遺伝子発現の相互作用に関する新たな知見を提供するものである。

1 はじめに
腸内細菌叢は、消化や栄養素の取り込み、代謝、発育、免疫など、宿主の生理機能の維持に重要な役割を果たしている[1-4]。分子レベルでは、腸内細菌叢は無数の代謝産物（例、 微生物の代謝産物は宿主の腸を横切って吸収され、全身循環を通じて私たちの身体のあらゆる細胞と相互作用することができる[6]。そのため、腸内細菌叢ネットワークの崩壊は、しばしばディスバイオシスと呼ばれるプロセスであり、炎症性腸疾患、神経疾患、代謝異常などの多くの疾患と関連している[7, 8]。

宿主の遺伝子発現との関係における腸内細菌叢の変化は、複数の方法で起こりうる。トランスクリプトームレベルでは、エピジェネティックな変化によって、宿主細胞はその転写プログラムを環境的な合図に適応させることができる。エピジェネティックな変化と腸内細菌叢との関連は、宿主の主要なエピジェネティック酵素の基質や補酵素として作用する微生物叢由来の代謝産物によって媒介される可能性がある[10]。しかしながら、腸内細菌叢が宿主の遺伝子発現や生理機能を化学的に制御する分子メカニズムは、依然としてほとんど解明されていない[11-14]。

N6-メチルアデノシン（m6A）は、安定性、スプライシング、翻訳、崩壊を含むmRNAの寿命のすべての側面に影響を与える、最も豊富な哺乳類のmRNA修飾である[15, 16] m6A修飾は、環境の手がかりに応答して哺乳類細胞内のライタータンパク質によってインストールされ、したがって、腸内細菌叢の種類や状態に容易に応答する可能性がある。我々は以前、マウスの腸内細菌叢が複数の組織において宿主のmRNAメチロームとtRNAメチロームを再プログラムすることを示した[17, 18]。この宿主-微生物相互作用は他のグループによっても観察されており、RNAエピトランスクリプトーム制御が宿主-微生物相互作用の付加的なレベルに相当することが示唆されている[19-21]。 [19-21] 宿主のRNAエピトランスクリプトームの制御における腸内細菌叢の役割は認識されているが、エピトランスクリプトーム応答を媒介する特定の微生物叢由来代謝産物については、未だ解明されていない。

ここでは、腸内細菌叢の変化とそれに関連する代謝産物が、動物および細胞の宿主トランスクリプトームとm6Aエピトランスクリプトームに及ぼす影響を調べた。メタボローム解析の結果、抗生物質による腸内細菌叢の異常は、従来のマウスにおいて胆汁酸代謝を有意に変化させることが明らかとなり、これは無菌（GF）マウスの糞便微生物叢移植（FMT）を用いて検証された。さらに、特定の胆汁酸を投与すると、哺乳動物細胞におけるm6A機械タンパク質の発現が直接変化することを示した。この結果は、胆汁酸代謝が宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランススクリプトームの制御に重要な役割を果たしていることを示している。

2 結果
2.1 抗生物質により誘導された腸内細菌叢異常症マウスモデルの特性解析
宿主のトランスクリプトームとエピトランスクリプトームを制御する特異的な細菌群を同定するために、我々はいくつかの腸内細菌叢異常症モデルマウスを作製した（図1A）。従来のSPFマウスを、アンピシリン（Amp）、ゲンタマイシン（Gen）、メトロニダゾール（Met）、ネオマイシン（Neo）、バンコマイシン（Van）を含む異なる抗生物質の単回投与、あるいは上記5種類の抗生物質を混合した抗生物質カクテル（Abx）に40日間、飲料水を通して曝露した。蒸留水のみで処理したマウスをコントロール（Con）とした。40日目に糞便と組織サンプルを採取し、マイクロバイオーム、メタボローム、トランスクリプトーム、m6Aエピトランスクリプトーム、プロテオームなどのマルチオミクスプロファイリングを行った。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
まず、16SリボソームRNA（rRNA）アンプリコンシークエンシングにより、抗生物質曝露量の異なる糞便サンプルの腸内常在菌組成を解析した。主座標分析（PCoA）により、抗生物質投与群（Amp、Gen、Met、Neo、Van、Abx）のβ多様性は、抗生物質無投与の対照群に比べ大きく乖離しており、生物学的複製は各群内でよくクラスター化していた（図1B）。多様性指標（Sob、Chao1、Shannon、Simpson）により、対照群は優れた多様性と豊かさを維持していたが、他の群の多様性と豊かさは減少しており、一部は非常に減少していた（図1C,D；図S1A-C、Supporting Information）。予想されたように、門レベルの相対存在量分析から、コントロールマウスの糞便サンプルでは、バクテロイデーテス門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門が支配的であった（図1E）。コントロールと比較して、すべての抗生物質は腸内細菌叢の組成を大きく変化させ、特に3つの門が支配的であった（図1E-G）。我々のデータから、ファーミキューテス/バクテロイデーテス比はほぼ全ての抗生物質処理によって有意に乱され（図S1D、Supporting Information）、抗生物質処理群におけるプロテオバクテリアの相対存在量はコントロールに比べて増加した（図1E,F; 図S1A、Supporting Information）。属レベルでは、抗生物質処理群の微生物組成は大きく異なり（図1H,I；図S1E,F、Supporting Information）、操作分類単位（OTU）数も抗生物質処理によって有意に減少した（図1J,K）。また、Abx群とCon群について微生物組成分析を行った結果、Abx群の微生物組成は抗生物質カクテル処理によって明らかに減少していた（図S2、Supporting Information）。しかし、処理40日後の糞便サンプルからはまだ多くの細菌が検出され、特にグラム陰性菌と病原性細菌が多かった。全体として、我々の微生物分析から、抗生物質投与は腸内細菌叢の細菌多様性を著しく減少させることが示唆された。

哺乳類にとって支配的な腸内細菌門は、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、ベルコミクロビア門であり[22]、その中でもファーミキューテス門とバクテロイデス門が2大門である。ファーミキューテス/バクテロイデーテス比は、ヒトやマウスの腸内細菌叢の微生物恒常性の指標として広く用いられており、ファーミキューテス/バクテロイデーテス比の変化は腸内細菌異常症の指標として提案されている[23, 24]。さらに、プロテオバクテリアは腸内細菌異常症の微生物シグネチャーと考えられている[25]。ファーミキューテス/バクテロイデーテス比はすべての抗生物質処理によって変化し、殺菌活性も抗生物質によって異なる。例えば、アンピシリンとゲンタマイシンは、ファーミキューテスに対して強い殺菌力を示したが、ゲンタマイシンはまた、疣贅菌の相対的存在量を増加させた（図1E；図S1A、Supporting Information）。これらを総合すると、腸内細菌叢異常症のモデルマウスはうまく構築され、それぞれの抗生物質が異なる腸内細菌叢異常症を発生させたと結論づけられる。

2.2 抗生物質による腸内細菌叢の乱れは胆汁酸代謝の不均衡を引き起こす
これまでの研究から、微生物の代謝産物は様々な主要酵素の基質や補酵素として作用することで、宿主のトランスクリプトームやエピトランスクリプトームに影響を与えることが示唆されている[5, 11, 26]。我々は、抗生物質による腸内細菌叢の乱れが糞便サンプル中の微生物由来の代謝産物に変化を与えるかどうかを調べるために、非標的メタボローム測定を行った。アンピシリン誘発群およびアンピシリン含有カクテル群の微生物組成は、抗生物質曝露後の多様性が最も低かったため、Con群、Amp群、Abx群のマウス糞便を対象にメタボローム研究を行った。

非標的メタボローム解析により合計1725代謝物を同定した（表S1、Supporting Information）。PCAの結果、3つの実験群（Con、Amp、Abx）はよく分離しており、AmpまたはAbx処理下の微生物由来代謝物はCon群とは有意な差があることが示唆された（図2A）。さらに、AmpまたはAbx投与群における代謝物の全体量はCon投与群よりも有意に少なかった（図2B）。各投与群間の差分代謝物を解析した結果、Amp/Con、Abx/Con、Abx/Ampでそれぞれ129、96、48の差分代謝物が同定された（図2C）。差分代謝物のほとんどは、AmpまたはAbx処理により発現が低下した（図2D）。驚くべきことに、胆汁酸が対照と比較して抗生物質処理によって最も明らかに変化した代謝物であることがわかった（図2E,F）。中でも、リトコール酸、デオキシコール酸、7-ケトリトコール酸はAmpまたはAbx処理によって著しく減少し、タウロコール酸はAmpまたはAbx処理によって著しく増加した（図2G）。差分代謝産物のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ解析から、胆汁分泌や一次胆汁酸生合成などのパスウェイが、Amp/Con比較（図2H）、Abx/Con比較（図2I）ともに濃縮されていることが明らかになった。次に、変化した代謝物と顕著に変化した腸内細菌叢との相関解析を門レベルおよび属レベルで行った。Amp（図2J；Supporting Informationの図S1G）またはAbx（図2K；Supporting Informationの図S1H）により減少した代謝物は、ファーミキューテス（Firmicutes）およびバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の存在量と密接に相関しており、制御された代謝物の減少はファーミキューテス／バクテロイデーテスの変化による可能性が示唆された。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図2
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
2.3 FMTによる抗生物質誘発腸内細菌叢異常症と胆汁酸代謝との関連性の検証
胆汁酸の変化がAmp誘発性腸内細菌叢異常症の原因であるかどうかを調べるため、Con群またはAmp群の糞便サンプルをGFマウスにコロニー形成させ、FMTを行った後、マイクロバイオームおよびメタボローム解析を行った（図3A）。16S rRNA遺伝子配列データのPCoA解析から、FMT-Con群とFMT-Amp群の間で明らかな微生物叢の分離が認められた（図3B）。FMT-Amp群の腸内細菌叢の多様性はFMT-Con群より有意に低かった（図3C-E；図S3A-D、Supporting Information）。従来のSPFマウスの微生物構造と同様に、FMT-Con群およびFMT-Amp群においても、GFマウスの糞便サンプルでは、ファーミキューテス（Firmicutes）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の2つの門が支配的であった（図3F）。また、属レベル（図3G；Supporting Informationの図S3E-G）およびOTUレベル（図3H）でも微生物構造を解析したところ、いずれもFMT-Conマウスに比べてFMT-Ampマウスでは腸内細菌叢の豊富さが減少していた。門レベル、属レベルに加え、抗生物質投与マウス（図S4A-D、Supporting Information）とFMTマウス（図S4E-H、Supporting Information）について、他のレベル（綱、科、目、種）の微生物構造も解析した。また、抗生物質投与マウス（図S4I、Supporting Information）とFMTマウス（図S4J、Supporting Information）の両方で腸内細菌叢の機能解析を行ったところ、Amp群とFMT-Amp群の間で、ほとんどの濃縮機能が重複していた。全体として、FMTレシピエントマウスと抗生物質投与マウスの微生物プロファイリングは、抗生物質投与実験（図S3H、Supporting Information）とFMT実験（図S3I、Supporting Information）の両方で、ファーミキューテス類が一貫して枯渇している、同様の腸内細菌叢異常症を示した。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図3
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
次に、胆汁酸に焦点を当てたメタボローム研究を行った。2群の糞便メタボロームはPCA解析で示されるように異なっていた（図3I）。219代謝物のうち、FMT-Amp群では209代謝物、FMT-Con群では213代謝物が同定された（Table S2, Supporting Information）。差分代謝物のうち、FMT-Con群と比較してFMT-Amp群で減少した代謝物は46種類、増加した代謝物は45種類であった（図3J、Supporting Information）。これらの差分代謝物についてKEGGパスウェイ解析を行ったところ、FMT-Amp/Con比較で多様な代謝パスウェイが濃縮されていた（図3K）。さらに、両群間の胆汁酸の差分を解析した結果、ほとんどの胆汁酸の差分がFMT-Con群に比べてFMT-Amp群で低く（図3L,M）、ほとんどの胆汁酸の差分がファーミキューテス（Firmicutes）と強い相関があることがわかった（図3N）。重要なことは、リトコール酸、デオキシコール酸、7-ケトリトコール酸の3つの胆汁酸がFMT-Amp群とAmp群の両方で発現低下していたことである（図S3J、Supporting Information）。また、GFマウスのマイクロバイオームおよびメタボロームプロファイルはSPFマウスのそれとは異なっていた。しかし、GFマウスを用いたFMT実験では、抗生物質による腸内細菌異常症で観察されたマイクロバイオームおよびメタボロームプロファイルが、SPFマウスで観察されたものと概ね再現された。

2.4 抗生物質投与およびFMT後のマウスのトランスクリプトームに対する腸内細菌叢の影響
抗生物質とFMTを用いて腸内細菌叢異常症モデルを確立した後、変化した腸内細菌叢と代謝産物が宿主遺伝子発現に与える影響を調べた。まず、上記3群（Con、Amp、Abx）におけるマウス8組織のmRNAトランスクリプトーム・プロファイルを解析した（図S5A、Supporting Information）。トランスクリプトームデータセット（脳、肝臓、腸、腎臓、肺、心臓、脾臓、精巣）のPCA結果は、グループ間のサンプルがよく分離されていることを示し（図4A）、腸内細菌叢異常症がマウスのトランスクリプトームに与えるグローバルな影響を示した。すべての組織において、多くの発現差遺伝子がアンピシリン（図4B；表S3、Supporting Information）または抗生物質カクテル（図4C；表S3、Supporting Information）によって組織特異的に発現上昇または発現低下した。発現差のある遺伝子の数は、組織によって数百から数千まで様々であった。KEGG解析から、抗生物質によって誘導された腸内細菌異常症によって、多数の組織特異的パスウェイが影響を受けることが示唆された（図4D）。GFマウスのFMT実験から得られた脳、肝臓、盲腸組織のトランスクリプトーム解析でも、FMT-AmpとFMT-Conの間に大きな違いがあり（図4E,F; Table S3, Supporting Information）、様々なパスウェイが腸内細菌異常症に影響を受けていた（図4G）。特に、SPFトランスクリプトームとGFトランスクリプトームの両方が、脳、肝臓、盲腸／腸組織において、抗生物質投与後に胆汁酸代謝関連経路が濃縮され、異なる発現遺伝子が見られた。また、神経活性リガンド-受容体相互作用経路は、抗生物質投与後の多くの組織で濃縮されていた。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図4
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
脳組織については、他の抗生物質で処理したサンプルも収集し、サンプル間のmRNAトランスクリプトーム解析を行った（Con、Gen、Met、Neo、Van）。脳内の異なる抗生物質処理により、発現レベルに差のある転写産物が数百個見つかった（図S5B-Gおよび表S3、Supporting Information）。Gene OntologyおよびKEGG解析から、抗生物質処理によって発現量の差が生じた遺伝子は、神経シグナル伝達経路に富んでいることが示された（図S5H,I、Supporting Information）。また、定量的プロテオミクスアプローチを用いて、腸内細菌異常症が宿主の遺伝子発現に及ぼす影響をタンパク質レベルで調べた（図S5Jおよび表S4、Supporting Information）。アンピシリン投与群と対照群で検出された数千個のタンパク質のうち、脳、肝臓、腸でそれぞれ588個、250個、245個の異なる発現タンパク質を同定した（図S5K、Supporting Information）。これらのタンパク質のうち、多くは神経シグナル伝達経路または代謝関連経路のいずれかに濃縮されていた（図S5L、Supporting Information）。トランスクリプトームとプロテオームから得られた結果を総合すると、抗生物質による腸内細菌叢の異常が、複数の組織におけるマウスの遺伝子発現に影響を与えていることが確認された。

2.5 腸内細菌叢擾乱はマウス脳mRNA m6Aエピトランスクリプトームを再構築する
宿主の遺伝子発現に対する腸内細菌叢と代謝産物の影響をさらに調べるために、比較的m6A含量の高いマウスの脳組織におけるmRNA m6Aエピトランスクリプトームのプロファイリングを行った[17]。m6A-seq（MeRIP-seq）ライブラリーは、m6A-seq2プロトコルを用いて構築した。このプロトコールは、バーコード化RNAのm6A-免疫沈降を多重化し、シーケンスサンプルのスループットを大幅に向上させるものである。マウス脳mRNAを用いたm6A-seqライブラリーとRNA-seqライブラリーの塩基配列を決定し、3群（Con、Amp、Abx）の脳mRNA m6Aエピトランスクリプトームのプロファイルを評価した。MeRIP-seqデータセットのPCA結果から、3群間のサンプルはよく分離されていることが示され（図5A）、腸内細菌叢異常症がマウス脳mRNA m6Aエピトランスクリプトームに及ぼすグローバルな影響が示された。全体として、マウスの脳組織において、Con、Amp、Abxについてそれぞれ17 256、11 981、18 455のm6Aピークが同定された（図5B）。先行研究[15, 17]と一致し、すべてのサンプルにおいてm6Aピークは5′UTR、CDS、3′UTRに位置し、ストップコドン領域周辺に濃集していた（図5C）。同定されたm6Aピークは、Con、Amp、Abxについてそれぞれ9544、7101、9991遺伝子に濃縮され（表S5、Supporting Information）、各グループに共通する遺伝子と特異的な遺伝子があった（図5D）。KEGGパスウェイの濃縮では、腸内細菌叢のアンバランスが脳の神経シグナル関連経路の濃縮につながることが示された（図5E）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図5
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
他の抗生物質（Gen、Met、Neo、Van）で処理したマウス脳組織のmRNA m6Aエピトランスクリプトームもプロファイリングした結果、腸内細菌叢異常症がマウス脳mRNA m6Aエピトランスクリプトームに及ぼす影響が支持された（図S6A-C、Supporting Information）。よく確立された哺乳類のm6AモチーフRRACH（RはGまたはAを表し、HはA、C、またはUを表す）、特にGGACUは、すべてのサンプルグループの同定ピークにおいて高い信頼性で濃縮され（図5F）、我々のMeRIP-seqデータセットの妥当性と信頼性を示した。SncaとPink1は、神経変性疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病）に関連するよく特徴付けられた遺伝子である。Integrative Genomics Viewer (IGV)の追跡から、これらの遺伝子の3′UTR領域におけるm6Aピークは、異なる抗生物質投与群で実際に変化していることが明らかになった（図5G）。また、個々の抗生物質処理条件によるm6Aピークの増減も解析した（図5H；Supporting Informationの表S6）。神経シグナル伝達経路は、m6Aピークを増加または減少させる遺伝子に富み、抗生物質特異的経路も存在した（図5I,J）。

脳遺伝子発現の制御における腸内細菌異常とm6A修飾の変化の役割を理解するために、マウス脳m6Aエピトランスクリプトームと対応するトランスクリプトームとの相関解析を行った。その結果、数百の転写産物がm6A修飾と正または負の相関があることが示唆された（図5K）。m6Aピーク密度の解析を続けたところ、ほとんどの抗生物質処理はエクソン上のm6Aピーク密度に影響を与え（図S6D、Supporting Information）、そのパターンはm6Aピーク数と一致していた。さらに、転写産物上のm6Aピーク強度も、抗生物質処理によってm6Aクラスターが変化することを示していた（図S6E、Supporting Information）。これらの結果から、抗生物質投与により、宿主脳内のmRNA m6Aエピトランスクリプトームとトランスクリプトームが有意に変化することが示唆された。

2.6 腸内細菌異常症は宿主の肝臓と腸のmRNA m6Aエピトランスクリプトームをリプログラミングする
宿主遺伝子発現に対する腸内細菌異常症の理解を深めるため、MeRIP-seqも行い、Con群、Amp群、Abx群それぞれの肝臓と腸組織のm6Aメチロームを比較した。PCAの結果、肝臓（図6A）と腸（図6B）では3つのグループがよく分離していた。また、GGACUモチーフは、3群すべての肝臓および腸から同定されたピークにおいて、高い信頼性で濃縮されていた（図6C）。肝臓組織では、Con、Amp、Abxでそれぞれ6739、5951、12339のm6Aピークが同定された（図6D）。肝組織のm6Aピーク数はアンピシリン処理により減少したが、抗生物質カクテル処理により増加し、これは脳組織のこの変化と同じ傾向であった。腸組織では、Con、Amp、Abxでそれぞれ2540、5589、19 595のm6Aピークが同定された（図6E）。腸組織におけるm6Aピーク数は、アンピシリン処理と抗生物質カクテル処理の両方で有意に増加した。予想されたように、肝臓と腸のm6A修飾部位は主に5′UTR、CDS、3′UTRに分布し、停止コドンと3′UTR周辺に濃厚であった（図6F）。特に、腸のm6Aメチロームプロファイルは、抗生物質処理によるピーク数とピーク分布パターンの点で、肝臓組織よりも動的であるように見えた（図6G）。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図6
図ビューアーで開く
パワーポイント
キャプション
次に、肝臓と腸の組織におけるm6A修飾を持つ転写産物のプロファイルを解析した。異なるグループで同定されたm6Aピークは、肝臓では4094-6967の転写産物に、腸では1974-10374の転写産物に濃縮された（図6H；Supporting Informationの表S7）。m6A修飾を受けた転写産物のKEGGパスウェイ濃縮は、アンピシリン誘発と抗生物質カクテル誘発の腸内細菌叢不均衡の両方が、スプライソソーム、ERでのタンパク質プロセッシング、mRNA監視を含む多様なパスウェイに著しい変化をもたらしたことを示した（図6I,J）。相関解析の結果、多くの転写産物が転写産物全体でm6A修飾と相関していることが示唆された（図6K-N）。また、抗生物質処理に伴う肝臓と腸のm6Aピークの増減（表S6、Supporting Information）を解析したところ（図S7A,B、Supporting Information）、2つの組織で様々な主要機能パスウェイが濃縮された（図S7C,D、Supporting Information）。エクソン上のm6Aピーク密度の解析（図S7E、Supporting Information）では、アンピシリン誘発および抗生物質カクテル誘発腸内異常症の両方が、肝臓または腸のエクソン上のm6Aピーク密度を変化させた。転写産物のm6Aピーク強度も、抗生物質処理によって変化した（図S7F、Supporting Information）。

SPFマウスの宿主m6Aエピトランススクリプトームに対する腸内細菌叢の影響に加えて、GFマウスのFMT-ConおよびFMT-Apの脳、肝臓、盲腸組織を用いたm6Aエピトランススクリプトーム研究も行った（図S8A-C、Supporting Information）。SPFマウスの結果と同様に、3つの組織においてFMT-ConとFMT-Ampの間でm6Aピーク数は異なり（図S8D、Supporting Information）、GGACUモチーフは高い信頼性で同定されたピークに濃縮されていた（図S8E、Supporting Information）。FMT実験における宿主m6Aエピトランスクリプトームのリプログラミングのパターンは、抗生物質処理実験におけるパターンと類似していた。また、FMT実験から得られた3つの組織について、m6A修飾を受けた転写産物のプロファイルを解析した（図S8F,G、Supporting Information）。KEGG濃縮解析により、Amp処理した糞便サンプルを用いた細菌コロニー形成が、これら3つの組織における多様な生物学的経路に影響を及ぼすことが明らかになった（図S8H-J、Supporting Information）。SncaおよびHsp90ab1遺伝子のIGVトラックは、これらの遺伝子のm6Aピークが3つの組織で変化していることを支持した（図S8K）。また、FMTデータセットの相関解析から、多くの転写産物が3つの組織で転写産物全体のm6A修飾と相関していることが示唆された（図S8L-N、Supporting Information）。全体として、FMT実験の結果から、腸内細菌異常症は、近位組織（肝臓と盲腸）と遠位組織（脳）の両方において、組織特異的にm6Aエピトランスクリプトームを再プログラムすることが確認された。

2.7 組織特異的エピトランスクリプトーム -腸内細菌異常症によるm6Aライターの制御
腸内細菌異常症によるm6Aエピトランスクリプトーム変化のメカニズムを理解するために、まずポリ(A)選択RNAのm6A A-1比を測定するために、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を用いてm6A解析を行ったところ、脳組織のm6A A-1比が抗生物質処理によって有意に減少することが観察された（図7A）。哺乳類のmRNA m6A修飾は、METTL3タンパク質とMETTL14タンパク質を含むライター酵素複合体によって動的に制御されている。様々な抗生物質に曝露したマウスの脳におけるmRNA m6Aライタータンパク質のレベルを解析したところ、METTL3とMETTL14は抗生物質誘発腸内細菌異常症によって有意にダウンレギュレートされることが観察され（図7B；図S9A,B、Supporting Information）、腸内細菌異常症が実際に異なるパターンでマウスの脳のm6A書き込みを制御していることが示された。さらに、ほとんどの抗生物質によって誘導された腸内細菌叢異常症は、読み手のYTHDC1と消しゴムのFTO（図S9C、参考情報）、およびメチルドナー関連タンパク質（METTL16、MAT1A、MAT2A、図S9D、参考情報）をダウンレギュレートする傾向があることが観察された。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図7
図ビューアーで開く
パワーポイント
キャプション
動物実験では、抗生物質投与実験またはFMT実験から組織を採取したときの表現型を記録した。臓器相対重量の表現型の違いは、肝臓と盲腸で見られた（図S9E,F、Supporting Information）。重量の変化に加えて、抗生物質投与マウスでは盲腸が対照マウスに比べて明らかに肥大していることがわかった（図S9G、Supporting Information）。次に、マウスの肝臓および盲腸組織におけるmRNA m6A修飾およびmRNA m6Aライタータンパク質のレベルを解析した。肝臓組織では、アンピシリン処理（図7C-F）またはFMT実験（図7G-J）により、m6A A-1比とm6Aライタータンパク質の両方がアップレギュレートされた。アンピシリン処理による盲腸組織では、m6A A-1比とm6Aライタータンパク質は、アンピシリン処理（図7K-N）またはFMT実験（図7O-R）によっても発現が上昇した。全体として、m6A A-1比とm6Aライタータンパク質は、抗生物質によって誘導された肝臓と盲腸の腸内細菌異常症によって直接制御される可能性があることが示された。異なる抗生物質処理に対するm6A機構の表現型と応答は組織特異的である傾向があり、これはm6Aパターンの組織特異的MeRIP-seqデータと一致していた。

2.8 哺乳類細胞における胆汁酸処理はm6Aライターの発現を変化させる
m6A mRNAの修飾には、様々な代謝産物や代謝経路が関与していることが新たな証拠によって示されている[27, 28]。すべての酵素反応と同様に、m6Aライターは様々な基質や補因子によって動的に制御されている。腸内細菌叢異常症モデルのメタボローム解析の結果、微生物の代謝産物、特に胆汁酸に高レベルの変化が見られた。そこで我々は、3種類の哺乳動物細胞を様々な胆汁酸（リトコール酸、デオキシコール酸、7-ケトリトコール酸、チェノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸）で処理し、胆汁酸がm6Aライタータンパク質の交替を介して宿主のm6Aエピトランススクリプトームに直接影響するかどうかを調べた。ヒト膠芽腫U251細胞（図8A；図S10A,B、Supporting Information）およびヒト結腸癌HCT116細胞（図8B；図S10C,D、Supporting Information）については、m6AライターのMETTL3とMETTL14が、胆汁酸の添加により、特に高濃度でダウンレギュレートされることが強く支持された。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図8
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
ヒト肝癌HepG2細胞に異なる胆汁酸を添加した結果、mRNA m6A作家METTL3およびMETTL14は、リトコール酸を除くほとんどの胆汁酸によってダウンレギュレートされることが示された（図8C；図S10E,F、Supporting Information）。さらに、m6A抗体を用いた免疫蛍光分析によって、HepG2細胞における総m6Aレベルを分析した（図8D）。細胞はリトコール酸、デオキシコール酸、および7-ケトリトコール酸で処理した。これらは、我々の腸内細菌異常症モデルマウスで主な変化代謝産物として同定されたものである。一貫して、総m6Aレベルはデオキシコール酸と7-ケトリソコール酸によって低下制御されたが、リトコール酸によって上昇制御された（図8D）。METTL3またはMETTL14抗体を用いた免疫蛍光分析により、リトコール酸処理によってMETTL3とMETTL14の両方の発現レベルが実際に上昇することがさらに確認された（図8E,F）。

これらを総合して、本研究の作業モデルを提案する（図9）。健康な腸内細菌叢条件下では、微生物叢由来の胆汁酸が粘膜から吸収され、宿主組織に循環して、mRNAメチル化レベルと遺伝子発現を維持し、m6A機械タンパク質（METTL3、METTL14など）の発現レベルを制御する。環境因子（抗生物質など）により誘導される微生物叢異常条件下では、微生物叢由来の胆汁酸が減少し、宿主組織におけるm6Aライタータンパク質の発現レベルを変化させ、宿主トランスクリプトームとm6Aエピトランスクリプトームの再構築につながる。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図9
図ビューアで開く
パワーポイント
キャプション
3考察
近年、腸内細菌叢が宿主に与える影響に関する知識は、特にマルチオミクス技術の進歩に伴い、大幅に増加している。代謝産物を通じて腸内細菌叢が宿主の細胞機能に影響を及ぼすことを考えると、腸内細菌叢の組成が変化すると宿主の遺伝子発現が変化し、疾患を引き起こす可能性があることは確実である[12]。腸内細菌叢が宿主の生理機能と相互作用する分子メカニズムを解明することは、健康と疾患における腸内細菌叢の役割を理解する上で極めて重要である。

本研究では、マウスの腸内細菌叢異常症が、胆汁酸代謝を介して、宿主mRNA m6Aエピトランスクリプトームの組織特異的リプログラミングを誘導することを実証し、さらに、このことをGFマウスの糞便中微生物叢コロニー形成実験により検証した。メカニズム的には、動物組織におけるmRNA m6Aエピトランスクリプトームの再形成は、m6A機構酵素の変化を伴っており、これは特定の胆汁酸で処理した培養細胞でも再現できることが示された。 m6Aは、発生、腫瘍形成、概日時計、免疫応答を含む多様な生物学的プロセスに影響を及ぼす、最も豊富な哺乳類のmRNA修飾である[15]。 [15] これまでの研究で、腸内細菌叢が宿主のm6Aエピトランススクリプトームと遺伝子発現を制御する上で重要な役割を担っていることが支持されているが[17, 19-21, 29-31] 、宿主と微生物の相互作用の文脈におけるこの制御の基礎となる分子機構はまだ不明である。今回の結果は、特定の代謝産物や微生物叢に関連する複数の組織における宿主mRNA m6Aエピトランスクリプトームの包括的な景観を提供するものである。

腸内細菌叢の多様性と組成については10年以上前から研究されているが、宿主の生理機能に影響を及ぼし、組織の恒常性を維持する上での正確な役割については、現在も研究が続けられている。胆汁酸は肝臓でコレステロールから合成され、さらに腸内細菌叢によって二次胆汁酸に代謝され、生物学的機能を発揮する[34]。腸内細菌叢は、遠位小腸および結腸で一次胆汁酸の脱共役、脱水素化、および脱水酸化を促進することにより、胆汁酸代謝に重要な影響を及ぼし、胆汁酸の化学的多様性を制御することがよく立証されている[35, 36]。 [35,36］我々の研究では、リトコール酸、デオキシコール酸、コール酸、7-ケトリトコール酸がAmp投与マウスやAbx投与マウスの糞便サンプルで有意に減少していたのに対し、タウロコール酸はこれらのマウスで増加していた。この結果は、GFマウスの糞便や抗生物質処理マウスの糞便で胆汁酸のほとんどが減少していることを示した先行研究と一致している[37-39]。重要なことは、抗生物質の擾乱のないGFマウスで我々の知見を検証したこと、そしてSPFマウスで観察された効果はGFマウスのFMT実験でも観察されたことであり、SPFマウスでは抗生物質の作用から生じる可能性のある副作用は除外された。これまでの報告では、放線菌、バクテロイデーテス、ユウレイアーキア、プロテオバクテリアなど他の微生物門と比較して、胆汁酸ヒドロラーゼ遺伝子が多いことから、ファーミキューテス門が胆汁酸産生微生物叢の主要な供給源であることが明らかにされている[40] 。

我々の研究は、胆汁酸が腸内細菌異常症における宿主のトランスクリプトームとm6Aエピトランスクリプトームを制御する主要な代謝産物であることを示している。胆汁酸は、遺伝子転写の際に宿主のDNAやヒストンのメチル化に影響を与えることが示されている[41, 42]。最近の報告では、胆汁酸が疾患条件下でmRNAのm6A触媒酵素を標的とすることにより、mRNAのm6A修飾に影響を与えることが示されている[43, 44]。しかしながら、腸内細菌叢異常症の文脈で胆汁酸代謝と宿主のRNAメチロームを結びつける橋は、本研究以前には欠けていた。今回の結果で初めて、腸内細菌叢と宿主mRNA m6Aエピトランスクリプトームとの分子的リンクとして胆汁酸が追加された。本研究で得られた微生物代謝産物およびm6Aメチロームの完全なアトラスは、腸内細菌叢と宿主mRNAエピトランスクリプトームとの間のギャップを埋める重要な手がかりとなる。また、本研究の結果は、代謝性疾患やその他の腸内細菌叢異常症に関連する疾患の治療に役立つ可能性がある。バランスのとれた腸内細菌叢の維持は、腸のホメオスタシスとヒトの健康にとって不可欠であり、微生物叢が介在するエピジェネティックあるいはエピトランスクリプトームシグネチャーのアンバランスは、多くの疾患に関連している[45-47]。したがって、抗生物質誘発腸内細菌叢異常症を用いた我々の結果は、疾患治療における抗生物質使用の注意点を支持するものである。また、異常な胆汁酸やその他の代謝産物は、疾患のバイオマーカーとして示唆されており、これらの代謝産物を標的とすることで、疾患の治療に新たなアプローチを提示できる可能性がある[48-50]。したがって、胆汁酸や胆汁酸産生微生物叢を用いて宿主のRNAエピトランスクリプトーム・マシナリーを標的とすることは、胆汁酸に関連するヒト疾患の治療オプションとして、効果的かつ正確なアプローチとなり得る。

分子レベルでは、動物における腸内環境の異常と培養細胞における胆汁酸処理によって、m6A機構タンパク質とメチルドナー関連タンパク質のレベルが変化することが示された。しかし、この制御の根底にある微生物-宿主RNAエピトランススクリプトーム相互作用のメカニズム的理解はまだ限られており、さらなる調査が必要である。例えば、腸内細菌叢や微生物叢由来の代謝産物が宿主のm6Aメチロームやm6A機械タンパク質に及ぼす制御パターンは、組織特異的である傾向がある。さらに、他の宿主因子（年齢、食物、性別など）も制御プロセスを複雑にする可能性がある。加えて、我々のメタボローム解析から、胆汁酸以外の代謝産物が多数明らかになり、これらの代謝産物もまた宿主のRNAエピトランスクリプトームに影響を与える可能性がある。以前の研究で、胆汁酸はMETTL3に結合し、METTL3-METTL14-WTAP複合体の形成に影響を与えることによって、マイクロRNA m6Aの修飾を調節することが報告されている[43]。同様のメカニズムが、胆汁酸によって調節されるmRNA m6Aエピトランスクリプトームにも適用できるかどうか、今後の研究で正確なメカニズムを調べるための実験が必要である。宿主RNAエピトランスクリプトームと遺伝子発現に対するこれらの代謝産物の影響を評価するためには、今後の研究が必要である。また、微生物叢由来の代謝産物が、プソイドウリジンのようなm6A修飾以外の宿主エピトランスクリプトームに関与しているかどうかも、今後の研究で幅広く調査していく予定である。

4 実験セクション
倫理声明
動物実験のプロトコールは、華南師範大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）の審査を受け、承認された（プロトコルコードSCNU-SLS-2022-009）。

通常マウスにおける抗生物質投与実験
本試験で用いた特定病原体フリー（SPF）マウス（雄、6週齢、C57BL/6J）は、12時間の明暗サイクルで飼育した。SPFマウスはSPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.から購入し、オートクレーブ滅菌した餌と飲料水を個々に換気したケージで飼育した。異なる微生物組成で腸内細菌叢異常症モデルを誘導するため、マウスにそれぞれアンピシリン（Amp, 1 g L-1）、ゲンタマイシン（Gen, 1 g L-1）、メトロニダゾール（Met, 1 g L-1）、ネオマイシン（Neo, 1 g L-1）、バンコマイシン（Van, 0.5 g L-1）を含む抗生物質を40日間単独で飲水投与した。また、アンピシリン、メトロニダゾール、バンコマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシンを上記の濃度で組み合わせた抗生物質カクテル（Abx）で40日間処理した。対照マウス（Con）には40日間飲料水のみを与えた。マウス（Con/Amp/Gen/Van/Abx群は各6匹、Met/Neo群は各7匹）を犠牲にして組織と便のサンプルを採取し、サンプルは直ちにクライオチューブに分注し、使用するまで-80℃で保存した。

GFマウスにおける細菌コロニー形成
無菌（GF）マウス（雄性、4週齢、C57BL/6J）は華中農業大学（中国武漢市）のGF動物プラットフォームで作製・提供され、これらのマウスは滅菌されたトレクスラー型アイソレーターで維持され、病原体のないマウス群（温度25±2℃、相対湿度45～60％、日照時間12時間-1日、光周期06:30～18:30）で飼育され、オートクレーブ滅菌された餌と飲料水を摂取できた。SPFマウスおよびアンピシリン処理SPFマウスを糞便微生物移植（FMT）実験のドナーとして用いた。糞便微生物懸濁液は、以前の研究[51]に記載されているように調製した。簡単に言うと、SPFマウスおよびアンピシリン処理SPFマウスの新鮮な糞便をホモジナイズし、15%グリセロール（v/v）を含む滅菌リン酸カリウム緩衝液（0.1 m、pH 7.2）で5倍に希釈した。その後、糞便微生物懸濁液を直ちにクライオチューブに分注し、-80℃で保存した。FMT実験では、GFマウスを無作為に2群（それぞれFMT-Con群とFMT-Amp群）に割り付けた。これらのマウスに0.2 mLの糞便微生物懸濁液を7日間毎日1回経口接種した。さらに2mLのアリコートを各マウスの毛皮にまいた。7日間の細菌コロニー形成後、マウスを8週齢まで無菌環境で飼育した後、糞便サンプル採取のために犠牲にした（FMT-Amp群では各n＝4、FMT-Con群では各n＝5）。

糞便16S rRNA遺伝子配列決定および微生物分析
異なる抗生物質を投与したマウスの新鮮糞便検体から細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅して塩基配列を決定した。FMT実験後のGFマウスの糞便サンプルを採取し、細菌DNAが抽出されるまで凍結し、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅して塩基配列を決定した。通常、HiPure Stool DNA Kit (Magen, Guangzhou, China)を用いて、150～200 mgの糞便サンプルから微生物DNAを抽出した。ハイスループット配列決定は、Gene Denovo Biotechnology Co. Ltd.のNovaseq 6000プラットフォームで行った。定量はシーケンサーにロードする前にABI StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Life Technologies、米国）で行った。精製したアンプリコンを等モルでプールし、標準プロトコールに従ってイルミナプラットフォームでペアエンドシーケンス（PE250）を行った。

微生物組成解析のために、イルミナのペアエンドリードは、FLASH（バージョン1.2.11）ソフトウェア[52]を用いて、最小オーバーラップ10bp、ミスマッチエラー率2%でマージし、FASTPソフトウェア[53]を用いて解析用の高品質リードを得た。高品質なリードをUPARSE（バージョン9.2.64）ソフトウェアを用いて類似度97％の操作的分類単位（OTU）にアライメントし[54]、Silva（bacteria）データベース（バージョン132）[55]を用いてOTUのアノテーションを行った。OTUはRDP classifier (version 2.2)[56]を用いて分類された。QIIME (version 1.9.1)[57]を用いて、alpha-diversity、beta-diversity、differential OTU abundance解析が希薄化OTU表に対して行われた。指標種解析のために、OUT配列の数がRプロジェクトのedgeRパッケージで差分OUTを得るために用いられ、Rプロジェクトのindicspeciesパッケージとlabdsvパッケージが各生物種の指標値を計算するために用いられた。指標値は最終的にクロスバリデーションでテストされ、バブルプロットとして表示された。

糞便サンプル中の代謝物の非標的メタボローム解析
異なる処理を施したマウス糞便サンプルの非標的メタボローム解析をGene Denovo Biotechnology Co. (Ltd.（広州、中国）で実施した。簡単に説明すると、各レプリケートから≈250 mgのマウス糞便サンプルを使用し、以前に発表された方法に従って300 µLの80%メタノールを添加して代謝物を抽出した[58]。サンプルはホモジナイザーを用いて連続的にホモジナイズし、10分間超音波処理した後、-20℃で1時間インキュベートし、25,000rpm、4℃で15分間遠心分離した。最後に、同量のサンプルとQCサンプルをオートサンプラーバイアルに移し、LC-MS/MS分析を行った。化合物カバレッジを向上させるため、超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析計（Thermo Scientific社製）を用いて、化合物イオンのポジティブモードとネガティブモードを分離・検出した。

データ解析のために、UHPLC-MS/MSによって生成された生データファイルをCompound Discoverer 3.1（Thermo Scientific）を用いて処理し、各代謝物のピークアライメント、ピークピッキング、定量を行った。パラメータは次のように設定した：保持時間許容差0.2分、実質量許容差5ppm、シグナル強度許容差30％、シグナル/ノイズ比3、最小強度100 000。その後、ピーク強度を全スペクトル強度に対して正規化した。正規化されたデータは、付加イオン、分子イオンピーク、フラグメントイオンに基づいて分子式を予測するために使用された。最後に、同定されたピークを mzCloud (https://www.mzcloud.org/) と mzVaultand Mass Listdatabase で照合した。異なるサンプルグループ間の差異を可視化するために、Rパッケージmodels (http://www.r-project.org/)を用いて、教師なし次元削減法主成分分析を全サンプルに適用した。VIPが1以上、T検定のP値が0.05未満、log2 (foldchange) ≥ 1の代謝物がサンプル間の差分解析のために選択された。濃縮された代謝物は、アノテーションと濃縮パスウェイ解析のためにKEGGにマッピングされた。

胆汁酸代謝物のターゲットメタボローム解析
異なる処理を施したマウス糞便サンプルのターゲットメタボローム解析を上海応用蛋白技術有限公司で実施した。試料から代謝物を抽出するため、100 mg の試料に冷メタノール/アセトニトリル/水（2:2:1、v/v）抽出溶媒 800 µL を加え、ホモジナイズ、解離、遠心分離を行った。代謝物の絶対定量には、安定な内部標準物質のストック溶液を抽出溶媒に同時に添加した。LC-MS 分析は、UHPLC (1290 Infinity LC、Agilent Technologies) と QTRAP MS (6500、SCIEX) を組み合わせて行いました。MRM 検出モードを使用して、標的代謝物 350 種の質量分析定量データを取得しました。ターゲットメタボローム解析は、ポジティブおよびネガティブスイッチモードで実行されました。システムの安定性と再現性を評価するために、サンプルキューにポーリングされた品質管理 (QC) サンプルを設定しました。

定量データ処理にはMultiQuant[59]を使用しました。QCは生体試料と一緒に処理され、変動係数が30%未満のQC中の代謝物は再現性のある測定値として示された。データ処理では、各群に存在するヌル値サンプルに各群の代謝物の平均値を代入し、その代謝物の最終レベルとした。全サンプルの代謝物レベルを正規化した後、Rパッケージのmodelを使用して全サンプルの主成分分析を行い、グループ間の全体的な代謝物レベルのばらつきを求めた。P値＜0.05かつVIP値＞1の代謝物をFMT-Amp群とFMT-Con群の有意差代謝物とした。最終的な差分代謝物の生物学的機能を決定するためにKEGG濃縮解析を用いた。

m6A MeRIP-シークエンシングおよびRNAシークエンシング
m6A MeRIP-seqライブラリーは、以前の研究から適応されたm6A-seq2プロトコルを用いて構築された[60]。m6A-seq2プロトコルは、バーコード化RNAとプールされたサンプルの多重化m6A免疫沈降を採用しており、サンプルのスループットを大幅に向上させることができる。RNAバーコーディングとライゲーションの前に、最初に各サンプルに対してOligo d(T)25 Magnetic Beads（S1419S、NEB社）を用いてポリA選択mRNAを1.8 µg N-1（Nはプーリングのためのサンプル数を示す）使用した。RNA断片化バッファー（AM8740, Thermo Scientific）を用いて、≈150-ntのRNA断片化を行った。断片化後のRNAサンプルの精製にはVAHTS RNA Clean Beads (N412, Vazyme Biotech)を用いた。その後のDNaseおよび脱リン酸化処理のために、各サンプルをT4 PNK（M0201、NEB）、TURBO DNase（AM2238、Thermo Scientific）およびFastAP（EF0651、Thermo Scientific）中、5×FNK Buffer中、37℃で30分間インキュベートし、続いてVAHTS RNA Clean Beadsを用いてRNAをクリーンアップした。3′RNAバーコードアダプターライゲーションは、100pmolのRNA ILLアダプター（表S8、Supporting Information）と36UのT4 RNAリガーゼ（NEB、M0204）を用いて、各サンプルについて室温で1.5時間行った。バーコード化RNAアダプターの3′ライゲーション後、すべてのサンプルを多重化m6A-IP用にプールし、サンプルプールの10％をインプット-RNAサンプルとした。

マルチプレックスm6A-IPでは、40μlのプロテインGビーズ（10004D、Thermo Scientific）と40μlのプロテインAビーズ（88 846、Thermo Scientific）を200μlのIPPバッファー（10 mm Tris-HCl, pH 7.5, 150 mm NaCl, 0.1% NP-40 in RNase-free water）で2回洗浄し、4μlのウサギ抗m6A抗体（E1610S、NEB）と共に4℃で6時間、回転させながらインキュベートした。RNAサンプルは70℃で2分間変性させ、抗m6A-プロテインA/Gビーズと4℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、RNA-プロテインA/GビーズをIPPバッファー、低塩IPPバッファー（50 mm NaCl、0.1% NP-40、10 mm Tris-HCl、pH7.5）、高塩IPPバッファー（500 mm NaCl、0.1% NP-40、10 mm Tris-HCl、pH7.5）でそれぞれ2回洗浄した。RNAを30μlのRLTバッファー（79 216, Qiagen）でプロテインA/Gから溶出し、その後VAHTS RNA Clean BeadsでRNAをクリーンアップした。rTd RTプライマー（表S8、Supporting Information）とSuperScript III Reverse Transcriptase（18 080 051、Thermo Scientific）を用いて、m6A-IP RNAまたはinput-RNAの第一鎖cDNAを合成した。cDNAはMolPure PCR Purification Kit (19106ES50, Yeasen)を用いて精製し、次いでRNAを70℃の1 m NaOHで12分間加水分解し、VAHTS DNA Clean Beads (N411, Vazyme Biotech)を用いてDNAをクリーンアップした。イルミナの5′アダプターライゲーションは、50 pmolの5iLL-22 DNAアダプター（表S8、Supporting Information）と45 U T4 RNA Ligase 1（M0437M、NEB）を用いて、23℃で6時間行った。

PCR濃縮はKAPA HiFi PCR Kit (KK2601, KAPA Biosystems)を用い、DNAバーコードを含むユニバーサルフォワードプライマーとリバースプライマーで行った（表S8、Supporting Information）。最後に、増幅したcDNAライブラリーを洗浄し、Qubit 4蛍光光度計でライブラリー濃度を測定した。調製したライブラリーのRNA-seqおよびMeRIP-seqを、Berry Genomics社でNovaSeq 6000プラットフォーム（Illumina, CA, USA）を用いて行い、150-bpのペアエンドリードを得た。ライブラリーの品質はシーケンサーにロードする前にAgilent Bioanalyzer 4200 TapeStationで評価し、各デマルチプレックスライブラリーで約8Gの生リードを得た。

MeRIP-seqデータ解析
MeRIP-seq IPライブラリーの生データは、まずRNA-seqと同じアップストリームパイプラインで処理した。MeRIP-seq IPライブラリーとインプットライブラリーの両方のマッピング結果をm6Aピークの呼び出しに使用した。グループ間の1因子比較の差分m6Aピークは、RパッケージexomePeak2（バージョン1.6.1）（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/exomePeak2.html）を用いて、定量法としてPoisson一般化線形モデルを用いて解析した。該当する場合は "consistent_peak "オプションを使用した。偽陽性を減らすため、各生物学的複製からのコールされたm6Aピークは有意とみなされ、以下の閾値に従って以降の解析に保持された：ピーク幅≦1500 bp、フォルドチェンジ≧2、P＜0.05、FDR＜0.05。同様に、グループ間で差のあるm6Aピークと呼ばれるものは、以下の閾値で有意とみなされた：ピーク幅≦1500 bp、fold change≧1.5、P＜0.05、FDR＜0.05。HOMER（バージョン4.11）[61]は、ピーク山頂を中心とした300bp領域周辺のde novoモチーフ検索に使用した。RパッケージChIPseeker（バージョン1.18.0）[62]とGuitar（バージョン2.10.0）[63]は、アノテーションと有意／差のあるm6Aピークの分布特性の表現に使用した。InputデータとIPデータを遺伝子レベル（遺伝子発現に基づく）でPCA解析した。IntegrativeGenomicsViewer（IGV）ソフトウェア（バージョン2.12.2）[64]を使用し、IPと入力ライブラリーのマッピング結果を用いて、標的遺伝子のリードカバレッジトラックをbigWig形式で表示した。

RNA-seqデータ解析
まず、MeRIP-seq入力ライブラリーを含むすべてのRNA-seq生データにCutadapt（バージョン2.8）（https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200）を適用して、低品質塩基を含むアダプターおよび生リードを除去した。得られた50bp以上のリードをUCSCデータベース（/goldenPath/mm39/bigZipsのIndex）で公開されている参照ゲノム（mm39）にマッピングした。SourceForgeのSubreadパッケージ(version 2.0.2)のfeatureCountsプログラム[65]を用いて、遺伝子にマップされたリードをカウントした。どのグループでも平均リードカウントが10未満である遺伝子、またはどのレプリケートでもリードカウントが欠けている遺伝子は、主にフィルタリングされた。RパッケージDESeq2（バージョン1.34.0）[66]を、有意性の閾値として偽発見率補正P値<0.05およびfold change≥2を設定することにより、差次的に発現した遺伝子（DEG）の同定に使用した。RパッケージDESeq2は、サイズ因子によるサンプル間のリードカウントの正規化にも使用され、遺伝子発現は正規化されたリードカウントに基づいて測定された。

ラベルフリー定量プロテオミクス解析
ラベルフリー定量プロテオミクス解析の詳細は、以前の研究で報告されている[67]。一般的に、プロトコルは以下の4つの部分に分けられる：タンパク質消化・抽出、SDS-PAGE、LC-MS/MS解析、タンパク質同定、定量。まず、SDTバッファー（4% SDS、100 mm Tris-HCl、1 mm DTT、pH7.6）を用いてサンプルの溶解とタンパク質の抽出を行い、続いて12.5% SDS-PAGEゲルを用いてタンパク質を分離し、クマシーブリリアントブルーR-250染色を行った。LC-MS/MS分析は、Q Exactive質量分析計でペプチド認識モードを有効にして行った。MaxQuant（バージョン1.5.3.17）を用いて、各サンプルの生のMS/MSデータを統合・検索し、同定と定量分析を行った。最後に、同定されたペプチドをUniProtKB Swiss-Protデータベース（Swissprot_Mus_musculus_17 063_20 210 106.fasta）にマッピングした。

m6A修飾レベルのLC-MS/MS定量
精製 mRNA (各サンプル≈200 ng) を 30 µL の反応液中で、2 U nuclease P1 (N8630, Sigma), 250 mm NaCl, 25 mm ZnCl2 を用いて 37 °C で 2 時間消化した後、2 U FastAP (EF0651, Thermo Scientific) と 3.5 µL の 10× FastAP Buffer を加え、さらに 37 °C で 4 時間インキュベートした。消化したヌクレオシド混合物をLC-MS/MS定量に用いた。簡単に説明すると、各消化サンプルの5μLを、Agilent 6490 Triple Quad質量分析計（Agilent Technologies）に結合したC18逆相カラムに注入した。多重反応モニタリング（MRM）ポジティブエレクトロスプレーイオン化モードで、ヌクレオシドは、A（A9251、Sigma）およびm6A標準（S3190、Selleck Chemicals）からの検量線を用いた保持時間およびヌクレオシド-塩基イオン質量遷移（Aについては268.1-136.1、m6Aについては282.1-150.1）を用いて定量した。m6AのA-1比は検量線濃度に基づいて算出した。

細胞培養と胆汁酸処理
ヒト細胞株（U251細胞、HepG2細胞、HCT116細胞）は、10％ウシ胎児血清（FBS500-S、AUSGENEX）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（15140-122、Gibco）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（11965-092、Gibco）を用い、37℃、5％CO2で培養した。リトコール酸（Cat# A832268、Macklin）、デオキシコール酸（Cat# D806701、Macklin）、7-ケトリトコール酸（Cat# A184646、Aladdin）、チェノデオキシコール酸（Cat# C104902、Macklin）、ヒオデオキシコール酸（Cat# H106315、Macklin）をDMSOに溶解した。細胞が≈70%のコンフルエントになった時点で、個々の胆汁酸を異なる濃度（20、100、500μm）で細胞培養液に添加した。対照細胞にはDMSOのみを添加し、24時間後にその後の実験のために全細胞を回収した。

ウェスタンブロッティング分析
新鮮な組織または細胞を150μlのRIPAバッファー（P0013B、Beyotime）中で組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、氷上で30分間溶解した。懸濁液を13000×rpmで30分間遠心し、上清を回収し、サンプルのタンパク質濃度をBCAアッセイ（20201ES76、Yeasen）で測定した。サンプルをゲルローディングバッファーと混合し、105℃で10分間加熱した。タンパク質サンプルを10% SDS-PAGEに溶解し、PVDF膜（ISEQ00010, Millipore）に4℃で1.5時間転写した後、異なる一次抗体とインキュベートした。二次抗ウサギ抗体（A0208、Beyotime）または抗マウス抗体（A0216、Beyotime）でインキュベートした後、Clarity Western ECL Substrate（1 705 061、Bio-Rad）を用いて標的タンパク質を検出し、ImageJソフトウェアとGraphPadPrism9を用いてタンパク質バンドの強度を定量した。

免疫蛍光
細胞をスライド付き12ウェル組織培養プレートで培養し、胆汁酸で処理した。24時間後、細胞を4% w/vホルムアルデヒド（P0099、Beyotime）で固定し、リン酸緩衝生理食塩水（C0221A、Beyotime）中0.5% v/v Triton X-100（DH351-4、Dingguo Biotechnology Co. スライドを、5% w/vヤギ血清（C0265、Beyotime）入りのブロッキングバッファーで、室温で30分間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体をブロッキングバッファー中、4℃で一晩インキュベートし、ヤギ抗ウサギIgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 (A-11008, Thermo Scientific)と共に室温で1時間インキュベートした。組織をPBT緩衝液にマウントし、DAPI染色液（P0131、Beyotime）で染色した。FLUOVIEW FV3000共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス、日本）を用いて免疫蛍光画像を撮影した。

抗体
ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光に用いた一次抗体は以下の通りである： ウサギ抗METTL3（Cat# 15073-1-AP、Proteintech）、ウサギ抗METTL14（Cat# HPA038002、Sigma）、マウス抗WTAP（Cat# 60188-1-Ig、Proteintech）、マウス抗FTO（Cat# ab92821、Abcam）、ウサギ抗YTHDC1（Cat# A7318、Abclonal）、 ウサギ抗METTL16（Cat# A304-192A、BETHYL）、ウサギ抗Mat1a（Cat# 12395-1-AP、Proteintech）、ウサギ抗Mat2a（Cat# 55309-1-AP、Proteintech）、マウス抗ベータアクチン（Cat# ab6276、Abcam）、ヤギ抗GAPDH（Cat# A00192、GenScript）。

統計分析
すべてのデータは平均値±SDで表し、代表的なデータを示した。本研究で用いた統計解析には、Wilcoxon検定、Kruskal-Wallis、両側Studentのt検定が含まれる。有意水準はP < 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001とした。

謝辞
著者らは、m6A-seq2プロトコルを用いたMeRIP-seqに協力してくれたワイツマン科学研究所のSchraga Schwartz博士とDavid Dierks博士に感謝したい。また、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のKoh Fujinaga博士には、原稿に対する洞察に富んだコメントをいただいた。また、m6AレベルのLC-MS/MS定量にご協力いただいた北京大学タンパク質科学研究センター（National Center for Protein Sciences at Peking University）に感謝するとともに、技術的支援と洞察に満ちた議論をいただいたWang研究室のすべてのメンバーに感謝する。本研究は、中国国家自然科学基金会（32070615、81902093）、広東省自然科学基金会（2021A1515010823、2022A1515010569）、広州科学技術プロジェクト（2024A04J6265）、米国国立衛生研究所（K22CA234399）、およびX.W.の広東省大学珠江奨学生基金スキームの支援を受けた。

利益相反
著者らは利益相反はないと宣言している。

著者貢献
M.Y.、X.Z.、J.F.、W.C.は本研究に等しく貢献した。X.W.、T.P.、H.W.は本研究の構想、実験計画、全データの解釈を行った。M.Y.とX.Z.はY.L.、N.Z.、Y.L.、J.Q.、Z.H.の協力を得てすべての実験を行った。W.C.とH.W.はGFマウスでのFMT実験に協力した。T.M.Y.はm6A修飾のLC-MS/MS定量に協力した。X.W.とM.Y.は、X.Z.、S.H.、G.L.、C.J.、A.M.E.、E.B.C.、T.P.の助言を得て原稿を執筆した。X.W.は、本研究の監督と資金獲得を行った。

公開研究
サポート情報
参考文献
PDFダウンロード
戻る
その他のリンク
ワイリーオンラインライブラリーについて
プライバシーポリシー
利用規約
クッキーについて
クッキーの管理
アクセシビリティ
ワイリーリサーチDE&Iステートメントと出版ポリシー
発展途上国へのアクセス
ヘルプ＆サポート
お問い合わせ
トレーニングとサポート
DMCAと著作権侵害の報告
チャンス
購読エージェント
広告主・企業パートナー
ワイリーとつながる
ワイリーネットワーク
ワイリープレスルーム
著作権 © 1999-2024 John Wiley & Sons, Inc または関連会社。テキストマイニング、データマイニング、人工技術または類似技術のトレーニングに関する権利を含む。

ワイリーホームページ