父親のマイクロバイオーム摂動は子孫のフィットネスに影響する

2024年5月2日 18:01

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出版：2024年5月1日
父親のマイクロバイオーム摂動は子孫のフィットネスに影響する

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07336-w

アイレ・アーガウ＝デンボバ、トーマス・S・B・シュミット、...ジェイミー・A・ハケット著者一覧を見る
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メトリクス詳細

要旨
腸内細菌叢は、宿主と環境の相互作用の接点で活動し、ヒトのホメオスタシスと代謝ネットワークに影響を与えている1,2,3,4。そのため、腸内微生物の生態系をアンバランスにする環境因子は、体組織全体の生理学的反応や疾患関連反応を形成する可能性がある5,6,7,8,9。しかしながら、腸内細菌叢が生殖細胞、ひいてはそれが生み出すF1子孫に及ぼす全身的な影響については未解明である10。ここでわれわれは、腸内細菌叢がマウスにおいて、父親の妊娠前環境と世代間の健康との間の重要な接点として機能していることを示す。父親候補の腸内細菌叢に乱れが生じると、その子孫が低出生体重、重度の成長制限、早死を呈する確率が高まる。疾患リスクの伝達は生殖細胞系列を介して起こり、非吸収性抗生物質や浸透圧性下剤などの腸内細菌叢の擾乱によって誘発されるが、受胎前に父親の細菌叢を回復させることで救済される。この効果は、レプチンシグナル伝達の障害、精巣の代謝物プロファイルの変化、精子中の低分子RNAペイロードの再マッピングなど、男性生殖系における誘導性ディスバイオシスに対する動的反応と関連している。その結果、父親が不衛生であることが子宮内胎盤不全のリスク上昇の引き金となり、哺乳類の世代間影響の胎盤起源が明らかになった。私たちの研究は、環境暴露に敏感で、胎盤機能に影響を与えることで子孫のフィットネスをプログラムする、男性における制御「腸-生殖細胞軸」を定義している。

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主な内容
精子は遺伝情報（DNA配列）とエピジェネティック情報（DNA配列に基づかない情報）の形で次世代に伝達する11,12。クロマチン状態、低分子RNA、高分子を含むエピジェネティックな要素は、受精前の環境によって改変され、子孫の表現型に影響を与える可能性があることが、系統間の証拠から示されている13,14,15,16,17,18,19,20,21。それにもかかわらず、哺乳類において父親から受け継いだエピジェネティックな影響の程度とその基礎となるメカニズムは依然として不透明であり22、また環境因子がどのように生殖細胞に収束しシグナルを送るのかも不明である。腸内細菌叢は、環境シグナルを宿主の反応に統合する上で主要な役割を果たすことが次第に理解されつつある1,9。実際、哺乳類のライフサイクルは、代謝、ホルモン、免疫機能において重要な役割を担う腸内細菌群集の存在下で進化してきた。それにもかかわらず、腸内微生物生態系の組成は、食事や投薬などの環境要因によって大きく形成される23,24,25。したがって、近代化に伴う腸内生物多様性の喪失は、ヒトの健康に対するリスクとなる。しかし、マイクロバイオームのバランスが崩れると（ディスバイオーシス）、体組織全体で生理的反応が引き起こされるという証拠が蓄積されているにもかかわらず5,6,7,8,26,27,28,29、マイクロバイオームの摂動が生殖細胞系列に及ぼす影響についてはほとんど知られていない。

このことを調べるために、私たちは、非吸収性抗生物質（nABX）を用いた腸内細菌叢異常の誘導可能なモデルを同系雄性マウスに確立した（図1a）。これらのnABXは消化管上皮を通過することができないため、生殖反応は全身的な薬物曝露ではなく、腸内微生物群集の急性擾乱を反映している30。16SリボソームRNA配列決定法を適用すると、6週間の低用量nABX投与（6週間と表記）により、腸内細菌叢の多様性、存在量、豊かさが著しく減少した（P = 0.000003、Wilcoxon順位和）が、これは可逆的であり、8週間のnABX休薬後に徐々に回復した（図1bおよび拡張データ図1a,b）。nABXを6週間投与しても、雄の体重、生殖能力、生存率に有意な影響は見られなかった（Extended Data Fig.）さらに、nABXは循環血清および精巣において質量分析で検出されなかったことから、腸における特異的な作用が確認された（Extended Data Fig.）

図1：父親の腸内細菌異常症は確率的にF1の主要な表現型を誘発する。
図1
a, nABXを用いた父親腸内細菌異常症の誘導と回復の戦略を示す概略図。b, nABX処理6週間後および回復（rec）時間経過中の雄における微生物分類群の豊富さを16S rRNA配列決定により定量化した（CON t0 = 18, 6 wk = 18, 6 wk + 4 rec = 14, 6 wk + 8 rec = 11; nABX t0 = 19, 6 wk = 12, 6 wk + 4 rec = 13, 6 wk + 8 rec = 12個体/タイムポイント）。棒グラフは中央値を表し、ひげは1.5×四分位範囲を表す。 c, 生後日数P3およびP15におけるF1子孫の体重を父親のnABX処理に従って示す。両側入れ子の（階層的）t検定によるP値（CON n = 172、N = 26の父親に入れ子；nABX n = 181、N = 28の父親に入れ子）。e, P15まで生存した子孫における体重異常クラスのリスクの対数ORを示すフォレストプロット。ヒゲは95％信頼区間を示し、P値は両側カイ二乗検定による（死亡率P＝0.0001；SGR P＝0.044）。 f, 父親のnABX処理レジームによるF1子孫の出生後生存率を示すカプランマイヤープロット（CON n＝179；nABX n＝199）。P値はMantel-Cox（log-rank）検定による。 g, コントロールまたはnABX産駒に由来するF1脳のトランスクリプトームのPCA。nABXの子孫は正常またはSGRの表現型によって層別化されている。h, nABXを投与した父親が産んだ独立した産仔のF1 SGR脳における発現上昇遺伝子と発現低下遺伝子の上位の発現を示すヒートマップ。 i, 左, 一般的な抗生物質（avaABX）による6週間の治療で誘導されたディスバイオシスを持つ雄が産んだ場合のF1の体重異常と死亡率の感受性のOR。ひげは95％信頼区間を示し、P値は両側カイ二乗検定による（死亡率 P = 0.014; SGR P = 0.038）。右、avaABXを投与した雄から生まれたF1子孫の出生後生存率を示すKaplan-Meierプロット。 j、左、PEG下剤による6週間の腸内洗浄によって誘導された腸内異常症を持つ雄を父に持つ場合のF1子孫の体重異常リスクのOR。ひげは95％信頼区間を示し、P値は両側カイ二乗検定による（死亡率 P = 0.013; SGR P = 0.014）。右、PEGを投与した雄のF1子孫の生存を示すKaplan-Meierプロット。 nは子孫、Nは産仔、NDは検出されなかった。

出典データ

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不衛生な父親の子孫
誘導された微生物叢異常が子孫に与える影響を評価するため、nABXを投与した雄と未処理の雌を交配させ、F1の表現型をスコア化し、世代間有意性について厳密なネステッド統計解析を適用した。その結果、nABXの父親が産んだ子供は、対照の父親が産んだ子供に比べ、新生児出生時体重（P3）が有意に低いことがわかった（P = 0.023、ネステッド非対t検定；対照（CON）n = 172（26産仔）、nABX n = 181（28産仔））（図1c）。雌性（P = 0.017）と雄性（P = 0.029）の双方に影響がみられたが、産子サイズは一定であった（Extended Data Fig.）さらに、nABX雄が産んだF1子孫の平均体重は、出生後の発育を通じて有意に低いままであった（P15（離乳前）でP = 0.013、P21（離乳）でP = 0.015、ネステッド非対t検定）（図1cおよびExtended Data図2c,d）。

また、生殖機能異常の雄が産んだ子では、生後に重度の成長制限（SGR；体重Zスコア＜-3）という、部分的ではあるが主要な表現型が観察された（図1dおよび拡張データ図2e,f）。これを定量化すると、nABX由来の子孫のSGRのオッズ比（OR = 3.52; P = 0.044、カイ二乗）が有意に増加した（図1e）。これはさらに、nABX子孫の体重の負のスキューと過剰な尖り度（スキュー-1.98；Rku 5.0）によっても反映された。しかし、最も顕著なことは、nABXを投与した雄が産んだF1子供は、対照の雄が産んだ子供と比較して、出生後の死亡率が非常に有意に増加したことである（P = 0.0002、Mantel-Cox検定）（図1f）。これはSGR産駒で優先的に発生し、死亡率の上昇が成長制限に対するF1感受性の増加と関連していることを示唆している。

独立したnABX雄が産んだSGR子孫のトランスクリプトーム・プロファイリングを行ったところ、主成分分析（PCA）によりクラスタリングされ、対照種雄の子孫とは別個にクラスタリングされたことから、再現性のあるF1分子応答が示された（図1g）。実際、F1の脳と褐色脂肪組織（BAT）では、それぞれ2,973個と1,563個の差次発現遺伝子（DEG）が検出された。DEGは代謝プロセスに関連するリアクトーム経路に優先的に富み（トップターム：代謝 P = 2.51-9; 脂質代謝 P = 0.000018）、独立した産仔のSGR子孫間で頑健であった（図1hおよび拡張データ図2g,j）。これらのデータは、子孫の成長、代謝ネットワーク、生存に対する、nABXが介在する父親の不育症の世代間影響を支持するものである。重要なことは、これらの表現型は、父親の状態に対する決定論的な反応ではなく、確率論的な反応として生じるということである。

次に、父親微生物叢の摂動に類似した戦略もF1反応を引き起こすかどうかを検討した。まず、別の抗生物質の組み合わせ（avaABX）を用い、avaABXの父親へのab lib投与により、F1子孫の体重減少（SGR OR = 7.0、P = 0.038、カイ二乗）および死亡率増加（P = 0.014、Mantel-Cox検定）に対する感受性が増加することを観察した（図1i）。第二に、浸透圧性下剤（ポリエチレングリコール（PEG））を用いた胃腸洗浄を行うことで、抗菌薬に曝露することなく父親の腸内細菌叢を擾乱させ、広範なディスバイオシスを誘導した31,32。PEGを投与した雄が産んだ子孫は、F1体重が有意に低く（P = 0.021、入れ子の不対t検定；CON n = 76（13産仔）、nABX n = 76（13産仔））、SGR感受性（OR = 5.8、P = 0.0142カイ二乗）と早死率（P = 0.013、Mantel-Cox検定）が増加した（図1j）。このように、将来の父親における腸内細菌叢の複数の異なる擾乱は、発達障害と早死を呈する子孫のリスクを増加させ、誘発された父親の不健全性と子孫の体力との間の直接的な関連を支持する。

父親の影響の可逆性
次に、父親が腸内細菌異常症から回復することでF1の表現型効果が回復するかどうかを調べた。4週間のnABX休薬（6週＋4回休薬（回復））の後、父親マイクロバイオームの有意な擾乱が持続すると、F1子孫は再び有意に低い新生児体重を示した（P = 0. 012, nested unpaired t-test; CON n = 160 (24 litters), nABX n = 146 (22 litters))、SGR感受性の増加(OR = 8.1; P = 0.020 カイ二乗)、成長軌道の障害を示した(Fig. 2a and Extended Data Fig. 3a,b)。しかしながら、8週間のnABX休薬（6週＋8回）後に父親のマイクロバイオームが回復すると（図1bおよび拡張データ図1a,b）、F1新生児体重の表現型も同時に回復することが観察された（P = 0. 55、ネステッド非対t検定；CON n = 87（13産仔）、nABX n = 89（13産仔））と正常な発育成長（SGR OR = 0.97、P = 0.98、カイ二乗）が同時に観察された（図2bおよび拡張データ図3a,b）。さらに、6週＋4回帰のnABXの父親から生まれた子孫は、有意に上昇したF1死亡率（P = 0.0009、Mantel-Cox検定）を再現したが（図2c）、6週＋8回帰で微生物叢を回復させた同じ父親から生まれた子孫は、過剰な死亡率を示さなかった（P = 0.73）（図2d,e）。これらのデータから、F1影響の確率上昇は父親の腸内細菌叢異常の期間中（6週、6週＋4回）持続するが可逆的であり、父親の腸内細菌叢の回復（6週＋8回）および精子形成周期（約5週間）と同時に回復することが示唆される（図2e）。

図2：父親の腸内細菌叢が回復すると、F1表現型に対する感受性が回復する。
図2
a,b,腸内細菌叢異常が残存しているnABX休薬期間中の雄（6週＋4回）（a）と微生物叢回復後の雄（6週＋8回）（b）、および年齢をマッチさせた対照種雄のF1子孫の成長曲線。c,d, Kaplan-Meierプロットは、微生物叢異常の雄（c）または回復したnABXの雄（d）が産んだF1子孫の出生後の生存率を示す。e,フォレストプロットはF1子孫の体重異常と早死率のORを示す。ヒゲは 95%信頼区間を示し、P 値は両側カイ二乗検定による（死亡率：6 wk P = 0.0001, 6 wk + 4 rec P = 0.0014, 6 wk + 8 rec P = 0.76; SGR：6 wk P = 0.044, 6 wk + 4 rec P = 0.020, 6 wk + 8 rec P = 0.99）。f, 6 wkまたは6 wk + 4 recのnABXまたはコントロールの雄が産んだF1 SGR脂肪組織のトランスクリプトームのPCA。父親の腸内細菌叢の豊かさ（右）はF1子孫の表現型と相関する。h,i,左、コントロールまたはnABX処理精子ドナーを用いた同系卵子の体外受精後の新生児F1体重。右、体外受精後のP15におけるF1の体重分布。データはCD1株代理母（CON n = 66子孫、N = 12父親にネスト；nABX n = 75、N = 12にネスト）（h）またはBL6株代理母（CON n = 33子孫、N = 8父親にネスト；nABX n = 41、N = 7父親にネスト）（i）から独立に得られた。ネステッド（階層）両側t検定によるP値。

出典データ

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トランスクリプトミクスでは、6週齢のnABXの父親が産んだSGRの子どもは、6週齢＋4週齢のrecの父親が産んだ独立した子どもとクラスター化し、非常に類似した遺伝子オントロジー濃縮を示した（図2fおよびExtended Data図3c,d）。このことは、父親が不育症に罹患している期間に妊娠した子供は、一貫した分子表現型に変化することを示唆しており、共通の病因があることを示唆している。さらに、SGR児のde novoゲノム配列決定では、構造変異、一塩基多型（SNPs）、小挿入・欠失（INDELs）において、変異負荷の上昇も、対照に対する説明的な差異も示されなかった（Extended Data Fig.4a,b）。さらに、伝達されるF2効果を検出することはできなかった（Extended Data Fig.）これらのデータから、生殖異常の父親から生じるF1表現型は、遺伝的差異の遺伝によるものではなく、第一世代を超えて伝播することはないことが立証された。

世代間伝達の様式
世代間遺伝の様式を調べるために、まず腸内細菌叢異常の父親からの遺伝があるかどうかを調べた33。その結果、分娩後の母親はマイクロバイオームにおいて有意な組成変化を示さず（P = 0.77, alpha diversity Wilcoxon; paternal CON n = 8, nABX n = 11）、糞便16Sプロファイリングによって判定される父親の曝露によるクラスタリングも見られなかった（Extended Data Fig.）さらに、nABX雄との交配後数日間における母親のマイクロバイオームへの有意な影響も、子孫や精液のマイクロバイオームにおける差異も検出されなかったことから、変化した父親のマイクロバイオームが母親や子孫に伝播しないことが示唆された（Extended Data Fig.）実際、子孫の表現型は自身のマイクロバイオームよりもむしろ父親のマイクロバイオームと相関しており（図2g）、いくつかの特定の分類群では優先的な関連が見られた（Extended Data 図5e）。また、親同居中に残存するnABXの共食作用の可能性についても検討したところ、わずかではあるが有意ではない傾向が認められ、この傾向は数日で解消した（Extended Data図5f-h）。この影響、あるいは他の間接的な（生殖細胞系列以外の）父親要因が子孫の表現型に影響を与えるかどうかを経験的に検証するために、一連の同居実験を行った。この実験では、雌はコントロールあるいはnABXの雄とその環境下で維持されたが、その後、独立した未治療の雄と交配した。その結果、出生体重（P = 0.85、ネステッドt検定）、成長（P = 0.98）、生存率（P = 0.35、Mantel-Cox）には、母親が過去にnABX雄に抗生物質を投与されたかどうかにかかわらず、差は見られなかった（Extended Data Fig.）我々は、変化した微生物叢の父親からの伝達も、間接的な母親の反応も、F1効果の根底にはないと結論づけた。

そこで我々は、体外受精（IVF）を行うことで、F1の表現型が父親の配偶子を通して特異的に伝達されるかどうかを調べた。ここでは、nABX処理雄または対照雄の精子と同種の卵子を受精させ、CD1高品質代理母ダムに移植することで、親との接触を遮断した（Extended Data Fig.）体外受精の子孫は、コントロールと比較して、新生児出生時体重が有意に減少し（P = 0.034、ネステッド非対t検定、CON n = 65、nABX n = 80）、出生後の成長が損なわれ（P = 0.047）、SGR発生率が上昇した（図2hおよびExtended Data図6f）。BL6レシピエントダムを用いた独立体外受精では、nABX精子ドナーによるF1出生体重の影響が、より大きなエフェクトサイズで再現された（図2iおよびExtended Data図6g）（P = 0.050、入れ子の不対t検定、CON n = 33、nABX n = 41）。これらのデータは、父系に誘導されたF1表現型は子宮内の独立した遺伝的背景で生じ、主に配偶子と共培養分子を通じて伝達されることを示唆している。

腸-生殖細胞系列軸
生殖系列を介した伝達が、急性の腸内細菌叢異常によって引き起こされる父親の生殖系における生理学的変化を調査することを促した。我々はまず、nABXに6週間暴露された腸内細菌叢異常症の雄は、対照群と比べて精巣の質量が有意に小さく（P = 0.001、対応のないt検定；CON n = 31、nABX n = 32）、これは精子数の減少と相関していることを観察した（図3aおよび拡張データ図7a,b）。組織学的解析では、対照の精巣では観察されなかった、生殖細胞の部分的な消失によって形成された空胞を含む、精細管のサブセットにおける建築的変化が観察された（図3bおよび拡張データ図7a）。実際、nABX雄は、異常精巣細管の数が有意に増加し（P = 0.032、入れ子のMann-Whitney；CON平均0.64％、nABX平均3.84％）、上皮の厚さが減少した（P = 0.016、入れ子の不対t検定）（図3c,dおよびExtended Data図7b-d）。これらのデータは、精巣生理が腸内細菌叢の摂動によって影響を受けることを示している。

図3：腸内細菌叢異常に対する精巣の反応は、腸-生殖細胞系軸の制御を示す。
図3
a,男性における6週間のnABX投与後の体重に対する精巣の質量比を示す箱ひげ図。棒グラフは中央値、ひげは5-95パーセンタイルを示す。p 値は対応のない両側 t 検定による（CON n = 31; nABX n = 32）。 b 対照および nABX 雄の精巣の代表的なヘマトキシリン・エオジン染色組織切片。生殖機能異常の雄の精細管は、上皮の喪失によって形成された空胞の発生率と有糸分裂（精原細胞）区画の欠如を示す。アスタリスクは異常尿細管を示す。c, コントロールおよびディスバイオティック雄における異常精巣尿細管の定量化。ネステッドMann-Whitney検定によるP値（CON n = 54切片、N = 4雄にネステッド；nABX n = 72、N = 5；P = 0.032）。d,精細管の上皮の厚さの定量。ネステッドt検定によるP値（CON n = 854 tubules, N = 4 males; nABX n = 1,061, N = 4; P = 0.016）。棒グラフは中央値、ひげは5～95パーセンタイルを示す。 e, コントロールまたは腸内細菌叢異常の雄の精巣（6週間、6週間+4回）と腸内細菌叢回復後（6週間+8回）の独立した精巣から得られた非標的メタボロミクスプロファイルのPCA。g,独立した（n = 5）nABX雄の精巣における遺伝子発現変化を示すMA（（M（log2比）とA（平均平均値））プロット。 h,nABX6週間後のdysbiotic雄の精巣（左）と循環血漿（右）におけるレプチンホルモンレベルのELISAによる定量。棒グラフは平均値と95％信頼区間を示す。i, 6週間レプチン欠乏（ob/ob）させた雄と野生型対照（WT n = 3; ob/ob n = 3）における精巣の特徴。左はヘマトキシリン・エオジン染色した精細管切片で、星印は組織構造の異常を示す。右は精巣重量で、P値は対応のない両側t検定によるもので、バーは平均値と95％信頼区間を示している。データポイントは、それぞれ独立した3人の父親とコントロールとして同腹の父親を用いた、独立した体外受精の二重実験からの単一胚を表す。スケールバー、100μm（左パネル）または50μm（右パネル）（b）；50μm（i）。FC、fold change。

出典データ

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ディスバイオシスに対する生殖系の反応を分子レベルで特徴付けるため、まず父親の精巣を対象にした非標的メタボロームプロファイリングを行い、3,803の特徴をアノテーションした34。アノテーションされた代謝物のグローバルPCAでは、精巣が腸内細菌叢の状態によってクラスタリングされ、F1効果が伝達される時期に相当する6週齢と6週齢＋4週齢の両方で、nABX雄と対照雄が明確に分離した（図3e）。対照的に、6 wk + 8 recにおける精巣のメタボロームプロファイルは区別できないことから、代謝物は腸内細菌叢の回復と同時に動的に回復し、F1感染による影響が逆転することが示された。この代謝物には、エンドカンナビノイド経路で作用する脂肪酸アナンダミドやシグナル伝達脂質のスフィンゴシン-1-リン酸（S1P）が含まれていた（図3fおよび拡張データ図8a）。スフィンゴ糖脂質とグリセロリン脂質、そしてエンドカンナビノイドは、生殖細胞機能に深く関与している35（Extended Data Fig.）さらに、生殖機能異常の雄の精巣におけるトランスクリプトーム・プロファイルを調べたところ、バルクレベルと単一細胞レベルの両方で、限られた発現の変化が観察された（図3g、Extended Data Fig.）遺伝子セットの濃縮により、グリセロリン脂質およびステロイド生成関連遺伝子が優先的に発現異常であることが示され、メタボロームプロファイルの変化と一致した（Extended Data Fig.）しかし、最も感受性の高い遺伝子はレプチンであった（図3gおよびExtended Data図9h）。レプチンは、主に脂肪細胞で産生されるが、生殖細胞でも産生され、エネルギーの恒常性と生殖に重要な役割を果たすホルモンをコードしている36,37。

蓄積された証拠から、腸内細菌叢の擾乱に反応して、代謝産物プロファイル、生理学、ホルモンの変化など、精巣の環境が大きく変化することがわかる。このことは、ショウジョウバエにおける最近の報告38,39と同様に、重要な恒常性維持機能を担う腸-生殖細胞軸が哺乳類に存在することを示唆している。

nABXに対する父親の反応の中で、レプチンの強い調節異常が見られた（図3g）。ELISAによる検証の結果、nABXが介在する生物異常は、循環血液中の全身レベル（P = 0.0001、不対t検定、CON n = 3; nABX n = 3）と精巣特異的レベル（P = 0.0003; CON n = 9; nABX n = 9）の両方で、レプチンホルモンのレベルを有意に低下させることが示された（図3h）。このことの意味を調べるために、6週間のnABX曝露によって誘導されるレプチン欠乏の時期をモデル化した6週齢のob/obマウス（レプチン-ヌル）を用いた。このような若いob/obマウスの精巣重量は減少し（P = 0.014）、正常な組織構築の中に尿細管異常が散在しており、6週間nABXに暴露された異種マウスと同様であった（図3iおよびExtended Data Fig.）そこで我々は、短期間のレプチン欠乏が世代間に及ぼす影響を評価した。自然交配は失敗したが、6週齢のob/ob精子を用いた体外受精は、対照精子と同様に効率よく野生型卵子を受精させたことから、生殖細胞の生存能力が基礎にあることが示唆された（Extended Data Fig.）得られた胚盤胞の単一胚トランスクリプトーム解析から、レプチン欠乏症の父親が産んだ子孫は、対照の父親が産んだ胚から強く離れていることが示された（図3jおよびExtended Data Fig.）実際、クロマチン経路が優先的に調節されている500以上のF1高信頼度DEGが検出された（Extended Data Fig.）重要なことは、レプチン自体は発生初期には発現していないことで、F1ヘテロ接合体のハプロイン不全効果は否定された（Extended Data Fig.）これらのデータを総合すると、レプチンは誘導されたマイクロバイオーム・ディスバイオシスによって全身的に制御されること、そして受胎前に父方のレプチンを直接摂動させると、子孫の遺伝子発現プログラムに世代間レガシーが生じることが示され、レプチンが腸-生殖細胞軸における重要なシグナル伝達成分であることが示唆された。

次に、腸-生殖細胞系軸が成熟配偶子に与える影響を、精子における分子的変化を探索することで理解しようとした。まず、DNAメチル化を塩基分解能で図にした。nABX雄から精製した精子の独立したメチローム（n = 5）は、コントロールとほぼ同等であり、DNAmeは全体的にもゲノムの特徴的にも変化していなかった（図4aおよび拡張データ図11a,b）。ゲノムワイドで同定されたメチル化領域（DMR）は21カ所のみであった（ロジスティック回帰P(adjusted(adj)) < 0.05、絶対変化率20%以上、50 CpGタイル）（図4aおよび拡張データ図11c,d）。これらの領域は通常、エピバリアブルCpG海岸領域と重なっており、自然変異を反映している可能性を示唆している。対照精子とnABX精子の両方で、ゲノムインプリントはすべて正しく確立された（Extended Data図11e）。次に、独立した精子コレクション（n = 9雄、N = 3にプール）から採取した高品質のライブラリーを用いて、精子が産生するsmall RNAをアッセイした。miR-141（P(adj)=1.15×10-9）やmiR-200a（P(adj)=0.008）を含むいくつかのマイクロRNAにおいて、有意な存在量の変化が検出された。これらのマイクロRNAは、上皮間葉転換や胎盤の発達を制御するために一緒に作用する（図4bおよび拡張データ図11f,g）40,41。我々はまた、5′転移RNA断片（tRF）の存在量の変化も観察し、特にtRF-Gly-GCCのアップレギュレーションを観察した（図4bおよび拡張データ図11f-h）。低分子RNA量の定量的な違いは、独立したサンプルでTaqMan定量的PCRによって確認された（Extended Data 図11i）。全体として、DNAメチル化は比較的安定しているが、精子中のsmall RNAの組成はnABXが介在するdysbiosisに反応して変化する。代謝物およびホルモンプロフィールの変化と合わせて考えると、高分子組成の複合的な変化が子孫に伝達されることが示唆される。

図4：父親のディスバイオシスによりF1胎盤不全が誘導される。
図4
a,左、全ゲノムバイサルファイト-seqによるコントロールまたはnABX処理雄の精子（各条件につきn = 5メチローム）のゲノム特徴にわたるDNAメチル化レベルを示すヒートマップ。右は、ゲノム全体のDNAメチル化（50 CpGタイル）の散布図であり、差分タイルは強調表示されている。 b, 独立した（n = 9）コントロールまたはnABX処理雄の精製精子プールにおける、選択したmiRNA（左）およびtRNA断片（右）の存在量の差を示すヒートマップ。c, 胚（E13.5）の脳と胎盤のトランスクリプトームのPCA（父方の曝露量による）。 d, E18.5の胎盤のトランスクリプトームのPCA（独立した産仔による）。f,E18.5胎盤における胎盤形成の主要遺伝子の発現。各データ点は独立した胎盤である（CON n = 5胎盤（3産仔）；nABX n = 5胎盤（3産仔））。g, E18.5における胎盤量に対する胎児量の比率（受胎前の父親の条件による）。h, nABXの父親由来のE18.5胎盤における子癇前症（PE）のバイオマーカーの発現。棒グラフは平均値、ひげはs.d.。多重検定補正DESeq2によるP値。CON n = 5胎盤（3産仔）；nABX n = 5胎盤（3産仔）。i, コントロールまたはdysbiotic male（nABX）が産んだ代表的な胎盤で、DAPI（青）およびVE-カドヘリン（赤）で染色し、迷路帯（LZ）を画定した。以下の定量化は、総面積に対するLZの割合を示している。バーは平均値±95％CIを示す。各データポイントは独立した胎盤組織切片である（CON n = 4胎盤（4産仔）；nABX n = 6胎盤（6産仔））。JZは接合帯。j,胎盤のPEマーカーである胎盤成長因子(PLGF)タンパク質(左)とsFLT1/PLGF比(右)のレベル。両側t検定によるP値。バーは中央値を示す。各データポイントは独立した胎盤である（CON n = 12胎盤（7産仔）; nABX n = 12胎盤（6産仔）; avaABX n = 8胎盤（3産仔））。アスタリスクは0.05以下および0.0001以下**のP値を示す。スケールバー、100μm。Prom, プロモーター。

出典データ

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父親に対する胎盤の反応
精子が子孫の表現型に影響を与えるメカニズムを理解するために、胚の欠陥の最初の原因を特定しようとした。E13.5（ほぼ妊娠中期）において、nABXを投与した雄の産んだ胚には、コントロールに比べてDEGが見られず、胚のトランスクリプトームはPCAで区別できなかった（図4c）。対照的に、独立した交配から得られたE13.5の胎盤のトランスクリプトームは、父方のnABX体制に依存して強くクラスター化し（図4c）、538個のDEGが存在し、その中にはいくつかのプロラクチン遺伝子のダウンレギュレーションも含まれていた（Extended Data Fig.）これをさらに調べるために、E18.5の成熟胎盤をアッセイし、そのトランスクリプトームが父親のマイクロバイオームの状態によってクラスター化されていることを観察した。アップレギュレートされたDEGはステロイド代謝に富み（P(adj) = 2.31 × 10-7）、一方ダウンレギュレートされたDEGは解糖に関連している（P(adj) = 0.00039）（図4e）。注目すべきは、Hand1やSynaのような胎盤の発達に重要な因子のダウンレギュレーションも含まれていることで、胎盤の形成が損なわれていることが示唆される（図4f）。この可能性をさらに検討するために、E18.5における胎盤量の胚に対する比をスコア化した。その結果、nABXの雄を父系とする場合、F1の胎仔対胎盤比に有意な変化が見られ（P = 0.0004、対応のないt検定；CON n = 82 nABX n = 53）、これは胎盤量の減少によって特に引き起こされることがわかった（図4g）。このことは、生物多様性異常の父親に由来する胎盤の欠陥と一致する。

この根底にある分子的病因を解明するために、nABX由来の胎盤におけるDEGsのトップ10には、子癇前症のようなヒト胎盤不全疾患の臨床マーカーがいくつか含まれていることに注目した（図4dおよびExtended Data図12c）。例えば、Plgfは生物多様性に異常のある父親が産んだ成熟胎盤で有意にダウンレギュレートされ、一方、アップレギュレートされた子癇前症マーカーにはFlt:Plgf比、Clu、Afpが含まれる（図4h）。父親が胎盤不全を引き起こす可能性をさらに調べるために、胎盤の構造を調べた。ここで、nABXの父親由来の胎盤は、胎盤障害の基礎原因として頻度の高い迷路帯の有意な減少（P = 0.0098）と関連していた44（図4i）。実際、我々はさらに、有意な血管障害（P = 0.0076）と胎盤梗塞の増加（P = 0.0296）を発見した（Extended Data Fig.）最後に、胎盤成長因子(PLGF)ホルモンを測定した。その結果、nABX（P = 0.034）またはavaABX（P = 0.0006）のどちらかによって誘導された生物多様性異常の雄に産ませた子では、胎盤中のPLGFが有意に低く、一方、sFLT/PLGF比は有意に上昇していた（図4j）。

考察
以上をまとめると、腸内細菌叢に環境的に誘発された摂動が、父親候補において有意な生殖反応を誘発することを示唆する証拠が蓄積された。このことは、腸-生殖細胞系列の調節軸を支持するものであり、この軸が乱されると、少なくとも部分的には胎盤機能に影響を及ぼすことによって、子孫の疾患リスクに影響を及ぼす。従って、腸内細菌叢は、抗生物質投与や食事といった異なる環境インプットが、男性の生殖細胞に直接的または間接的に収束してシグナルを送り、最終的に子孫に影響を及ぼす主要なインターフェースとして働く可能性がある。しかし、このような父方のF1効果は確率的に現れ、精子内／精子上で作用する多因子的な分子メカニズムが相互作用して伝達を支えていると考えられる。ここでは、脂質代謝物、レプチンなどのホルモン、低分子RNAの変化が確認されたが、表現型に関連する遺伝の様式を解明し、マウスモデル以外にも適用できるようにするためには、今後の研究が必要である。しかしながら、父方の条件付けが胎盤の発生に影響を与えるという我々の観察は、哺乳類の世代間影響についてメカニズム的根拠を与えている46。さらに、受胎前に父親の腸内細菌叢を回復させると、出現したF1の表現型が回復することから、この影響は可逆的であり、治療可能である。ヒトの微生物群集を（再）形成するような生活習慣や抗生物質投与が蔓延していることを考えると23,24,25,47、これは妊娠の有害な転帰を軽減するための関心分野であることがわかる。より一般的には、我々のデータは、直接的な分子応答から世代間の疾患感受性に至るまで、環境要因がスケールを超えて複雑な生物学的システムをどのように変化させるかを理解することの重要性を強調している。

方法
動物の飼育
マウスを用いた実験はすべて、European Molecular Biology Laboratory（EMBL）の実験動物管理・倫理委員会（ライセンス番号20190708_JH）およびイタリア保健省（認可コードNo. 308/2021-PR。近交系C57BL/6J系統を初代モデルマウスとして使用し、CD1 IGSまたはC57BL/6Jのダムを体外受精の代理母として使用した。レプチン欠損C57BL/6Jマウス（ob/obマウス）は、父親の精巣レプチン欠損の世代間影響を研究するために用いられた。マウスは12時間の明暗サイクル（07:00から19:00まで）で飼育され、通常の食事と水を自由に摂取できた。タンパク質18.5％、脂肪5.3％、繊維4％、その他の栄養添加物を含むペレット状の標準飼料で、長期維持、繁殖、授乳期、妊娠期に適している（NFM18、Mucedola）。

動物にディスバイオシスを誘発する実験戦略
5週齢の特定病原体フリー（SPF）雄性C57BL/6J近交系マウスを従来のコロニー施設に移した。(1)対照群：通常の餌と滅菌濾過水（0.2μm）を6週間連続投与（CONマウスと略す）; (2)処理群：通常の餌と滅菌濾過水（0. 2μm）水にFDA承認のnABX（ネオマイシン2.5mg ml-1、バシトラシン2.5mg ml-1、ピマリシン1.25μg ml-1；nABXと略記）のカクテルを6週間連続投与した。水ボトルとnABXカクテルは5日ごとに新しく交換した。6週間の治療が終了した時点で、両群の雄マウスを治療を受けていない6週齢のC57BL/6J近交系雌マウスと交配させた。交配後、雄マウスはnABXなしで8週間維持され（回復期間）、通常の餌と滅菌濾過水（0.2μm）を自由に摂取できた。8週間の回復期間中、各雄は2つの時点で交尾した：nABX休薬後4週とnABX休薬後8週である（それぞれ6wk + 4recと6wk + 8recと表記）。すべての雌マウスは、妊娠期間および授乳期間中、通常の食事と水を摂取した。特筆すべきは、使用した各抗生物質の投与量が、ヒトに相当する標準的な投与量よりも低く、過去の研究でマウスに投与された標準的な投与量の半分であるため、腸内細菌叢を破壊するのではなく、むしろ擾乱するように設計された比較的低用量レジームであることである30,48,49。

急性の腸内細菌叢異常症を誘発する代替戦略として、同等の実験セットアップと6週間の時間経過を用いた。第一に、吸収性抗生物質のカクテル（アンピシリン0.5 mg ml-1、バンコマイシン0.25 mg ml-1、アムホテリシンB12.5 μg ml-1；avaABXと略記）をろ過水（0.2 μm）に溶解して自由摂取させた。次に、5％PEG（PEG 4000、EMD Millipore）を用いた腸内洗浄を行った。ここで、種雄にはavaABXまたは5％PEGを6週間飲水投与し、急性腸内細菌叢異常を誘発させたが、無作為に割り付けた対照群には無菌濾過（0.2μm）水のみを与えた。6週間後、各群の雄マウスは、治療を受けていない6週齢のC57BL/6J近交系雌マウスと交配した。各抗生物質について、投与量は過去の研究で用いられた標準抗生物質投与量の半分に調整した50,51,52。同様に、PEG濃度は、ヒトの腸管洗浄や便秘治療、および過去のマウス研究で用いられた標準用量よりも低くした31。

雄の生殖能力パラメータ
繁殖雄に対する nABX 誘発性腸内細菌異常症の影響を評価するため、精巣対体重比および標準的な雄の生殖能力パラメータを、種雄の体重、精巣重量、精子数および繁殖能力を含む定量的記述分析に基づいて特徴付けた：

精巣対体重比：nABX処理の効果を評価するため、6週間処理した種豚の体重を測定し、年齢をマッチさせたCON種豚の体重と比較した。さらに、生殖器官への影響を評価するため、CONおよびnABX投与マウスから精巣を注意深く採取し、重量を測定し、両群間の精巣対体重比の差を算出した。

精子数：ref. 53に記載されている方法で精子数を算出した。要するに、精子懸濁液は、1mlの1×PBS（pH7.2）中で、カウダをミンチすることにより調製した。懸濁液をピペッティングし、80μmのナイロンメッシュで濾過して組織片を除去した。精子懸濁液（1ml）のアリコート（0.05ml）を1:40のPBS（pH7.2）で希釈し、十分に混合した。精子懸濁液を数滴排出した後、ビュルカーチャンバーを用いてカウントした。ミリリットルあたりの精子数を測定するため、4つの正方形（1 mm2）のそれぞれの精子数を平均し、希釈倍率×104を乗じてマウス1匹あたりの総精子数を算出した。

3.繁殖能力：11週齢の種雄（CONおよびnABX処理雄）を、未処理の6週齢C57BL/6J雌と交配させた。雌は最初の4日間で交尾栓の有無を確認し、栓が陽性になった時点で飼育ケージに移し、3週間後に妊娠と産仔数について再度確認した。

子孫の作出
F1子孫の作出には自然交配と人工交配（体外受精）の両方を用いた。研究者と動物飼育スタッフが父方の治療方針について二重盲検になるよう、コードシステムを使用した。

自然交配
F1子孫を作出するために、CONまたはnABX雄マウスは、6週齢の治療を受けていない処女雌マウス1匹と交配させた。交配期間中（1～4日間）、マウスは標準的な最適化された環境条件下で飼育され、通常の餌と水を自由に摂取できた。毎朝、雌の膣の状態をチェックし、交尾の陽性徴候（膣栓）が認められた雌はすべて雄ケージから取り出し、新しいケージに収容した。一方、膣栓が認められなかった雌はすべて午後に雄ケージに戻し、毎朝検査した。同居させたペア間の微生物移行を最小限に抑えるため、交尾期間中、ペアの交尾時間は午後遅くから早朝（15:00～09:00）に制限した。

体外受精
先に述べたように54、このF1子孫作出方法は5つの重要なステップを踏む： (1)卵子提供雌の過排卵、(2)種雄からの新鮮精子の調製、(3)提供雌からのアイソジェニック卵子の採取、(4)体外精子-卵子受精、(5)擬妊娠CD1またはC57BL/6J代理母への胚移植。このプロセスは以下のように行われた：

過排卵： 4週齢のC57BL/6J卵子提供雌マウスに0.2mlのPMSG＋インヒビン抗血清（IAS）を腹腔内注射した。正確に48時間後、hCG（0.15 ml）を卵子提供マウスに腹腔内注射した。ここで、hCG注射は、予定された精子-卵子受精時間（hCG注射後約13-14時間）に従って行われた。

新鮮精子の調製：11週齢のマウスから尾側精巣上体を剥離し、余分な脂肪組織と血液をきれいに取り除いた。その後、尾側精巣上体を、120μlの凍結保護剤（CPA）を入れたセンターウェル器官培養皿（ファルコン社製）に移した。最適化されたはさみで5～6箇所、精巣上体を切開し、精巣上体の表面を軽く押して精子を放出させた。新鮮な精子をCPA中で37℃、3分間プレインキュベートし、1分ごとにシャーレを穏やかに攪拌した。10μlの精子懸濁液を90μlのTYH-MBCD培地の中心滴に移し、5％CO2インキュベーター内で37℃、少なくとも10～30分間インキュベートすることにより、新鮮な精子を受精させた。精子が急速に動き出し、培地中で平衡化するまで、皿は乱されないようにした。

卵子採取：卵子採取の前日、1 mM GSHを含む90 μlのHTF培地をパラフィンオイルで覆い、5% CO2インキュベーター内で37℃で一晩静置して平衡化させた。翌日、過排卵雌（合計10匹のドナー）から単離した卵管を2つに分け、半分はCONマウスの精子で、半分はnABX処理マウスの精子で受精させた。各半数の卵管膨大部を HTF ドロップの入った受精皿に移した後、膨潤した膨大部を 18G 針でクリップし、卵丘塊を油中に放出させた後、受精ドロップに移した。

4.精子-卵子受精：TYH-MBCD滴下液中の容量精子から、最も運動性の高い精子を含むプレインキュベーション滴下液の周辺部から10μlの精子懸濁液を採取した。その後、CONマウスまたはnABX処理マウスの精子を、卵子の入った受精皿の滴下液の中央に移した。卵子に精子を授精させた後、精子-卵子受精皿を37℃、5％CO2下で3～4時間培養した。3～4時間培養後、推定接合体を150μlのM2培地滴下で3～4回洗浄し、アミノ酸添加KSOM培地（KSOMaa）500μlを入れた4ウェルNUNCプレートで、37℃、5％CO2、5％O2インキュベーター下で一晩培養した。18-24時間後、受精した2細胞期胚を擬妊娠CD1またはC57BL/6J雌代理マウスの卵管に移植した。

胚移植：胚移植は既述の方法で行った55。精管切除した雄を6-8週齢のCD1雌またはC57BL/6J（27-30g）と交配させ、0.5日後（dpc）の偽妊娠レシピエントを作製した。プラグ陽性の雌を選択し、イソフルオラン吸入により麻酔した。2細胞期胚を移植するために、以下の手順を踏んだ：背側正中線を開き、卵巣体壁を切開して体外に保持し、包皮を破った後、キャピラリーの先端を卵管内腔に挿入し、1匹の仮妊娠CD1またはC57BL/6Jマウスあたり±20個の胚を移植し、最後にマウスピペットで優しく押し、ガラスキャピラリーチューブから1つの卵管内腔に胚を移動させた。

間接的影響を調べるための共同飼育後のF1表現型
生物多様性障害のある雄と雌を一緒に飼育することによる子孫への間接的な影響（母親への微生物移行やnABX糞便の共食害など）を分離するため、対照雄（独立した雄）との交配と組み合わせた同居戦略を用いた。日中（09:00-16:00）、6週間のnABX曝露歴のある雄または対照雄を、6週齢の未処女雌1頭と同居させ、完全な親同居曝露を再現した。オスは夜間の交尾を防ぐため16:00にケージから取り出し、メスはオスのケージに残した。毎日16:00に雌の膣の状態をチェックし、交尾の兆候（膣栓）が陽性であった雌はすべて試験から除外し、膣栓が陰性であった雌はすべて雄ケージで飼育した。4日間の同居期間中、マウスは標準的な最適化された環境条件に維持され、餌と水は自由に摂取できた。4日間の同居期間の後、すべての膣栓陰性の雌（nABXまたはCON雄に曝露）を、通常飼育した11週齢のC57BL/6J雄マウス（独立したナイーブ雄）と交配させ、以前のnABX雄への曝露の間接的な影響がF1の表現型に検出されるかどうかを検討した。

F2子孫の作製
F2子孫は、F1世代から、dysbiotic(nABX)またはCONのF0種親に由来する2匹の兄弟を交配して作製した。

表現型解析と組織採取
子孫の体重および生存指標
F1の出生前から出生後の発育を評価するために、比較成長表現型分析を適用した。交配は盲検コードシステムを用いて設定され、F1 の表現型は父方の状態を知らない個人および／または飼育スタッフが記録した。出生後の分析では、出生時の仔のサイズを記録し、まだ生まれていない仔をモニターした。出生後3日目から離乳期（P3-P21）まで3日ごとに、またP56までは1週間ごとに仔ウシの体重を測定した。F1子孫の罹病率と死亡率もこの年齢範囲（P0～P60）で毎日記録した。極端な産仔サイズの影響による外れ値を考慮するため、平均産仔サイズ（1産仔あたり6±2頭）の2 s.d.以内の産仔（すなわち、4～8頭の産仔）のみを調査対象とした。同様に、体外受精によって生まれたF1子孫の出生後の体重軌跡を前述の方法で特徴づけ、分析した。なお、F0妊娠雌およびF1子孫には、妊娠期、授乳期、離乳期を通じて通常の飼料と滅菌水を与えた。CONまたはnABX処理雄に由来する出生前のF1コンセプタスを表現型解析するために、妊娠中のダムをE13.5またはE18.5のいずれかで殺した。胎盤と胎児を注意深く分離し、洗浄し、重量を測定した。その後、胚組織と胎盤をトランスクリプトーム・プロファイリング用に単離した。胎盤組織はさらに、免疫蛍光分析またはELISA分析のために採取された。

オミックス用の組織と精子の分離
精巣および精巣上体精子は、最大限の純度と品質を確保するため、前述の方法で単離した42。簡単に説明すると、精巣は11週齢のマウスから慎重に解剖し、すべての脂肪パッドを除去した後、個別に重量を測定し、液体窒素でスナップ凍結し、トランスクリプトミクスまたはELISAアッセイ用に処理するまで-80℃で保存した。対側の精巣は組織染色用に処理した。精子を採取するため、マウスから精巣上体を切り離し、37℃に加温したM2培地に入れた。26Gの注射針を用いて尾状精巣の近位端に2つの小さな切開を加え、精子を泳ぎ出させ精巣上体液を放出させるために残りの組織に穴を開けた。精子含有培地を37℃で30分間インキュベートした後、新しいチューブに移し、37℃でさらに15分間インキュベートした。インキュベーション後、2,000gで5分間遠心分離して精子を回収し、1×PBSで洗浄した後、体細胞溶解バッファー（0.1% SDSと0.5% Triton-100Xを蒸留H2Oで希釈したものを含む）で20分間氷中で2回目の洗浄を行った。体細胞溶解バッファーで処理した精子サンプルは、3,000g、5分間の遠心分離で回収し、最後に1×PBSで2回洗浄し、-80℃で保存した。精子細胞の精製は顕微鏡検査で確認した。

10×シングルセルRNA配列決定のための精巣単細胞分離
精巣単細胞は、以前に記載された2段階の酵素消化プロトコルを用いて単離した56。簡単に説明すると、nABXおよびCONの雄の精巣を摘出し、PBSで2回洗浄し、アルブギニアを除去し、各精巣を1mlの溶解バッファー（PBSで希釈したコラゲナーゼAを1mg ml-1）に移し、P1000チップを用いて5回トリチュレートして組織を破壊し、37℃で300rpmで穏やかに振りながら5分間インキュベートした。尿細管を重力沈降させ、室温で300g、5分間遠心した。上清を除去し、残った組織をPBSで洗浄し、TrypLE（1×）とDNase Iで消化した。懸濁液を激しく10回トリチュレーションし、37℃で5分間インキュベートし、その後トリチュレーションを繰り返し、15分間終了までインキュベートした。消化した単細胞懸濁液を順次サイズフィルターにかけ、70μmと40μmのストレーナーで洗浄し、300g、5分間の遠心分離でペレット化した。ペレット化した細胞を1mlの冷PBS+0.04%BSAに再懸濁し、ファルコンチューブにプールし（各群4精巣）、Countess IIを用いて計数した（平均生存率85-90%）。標的細胞濃度は、0.04% BSA入りの冷PBSを用いて約1,100細胞μl-1の範囲に調整し、10x Chromiumチップにロードするまで氷上に置いた。

精液採取
精嚢は層流フード内で、前述57 に若干の修正を加えた通りに採取した。クロスコンタミネーションを防ぐため、1回のサンプル採取につき1匹の実験動物（CONまたはnABX）をフードに入れた。最大限の滅菌を確実にするため、実験者は滅菌ガウン、手袋、マスクを着用し、70％エタノールで手を擦り、以下の手順に従った。簡単に説明すると、マウスはあらかじめ70％エタノールと2％Virkonで洗浄した後、紫外線を2時間照射した層流フードに入れた。無菌的に精嚢を採取するため、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、腹部を70％エタノールで洗浄し、滅菌したピンセットとハサミで切開した。その後、滅菌した新しいピンセットとハサミを用いて精嚢を摘出し、滅菌した2mlのエッペンドルフチューブに入れ、ドライアイスで急速冷凍し、精嚢液マイクロバイオームプロファイリング用のDNA抽出まで-80℃で保存した。なお、このサンプル採取に使用した解剖器具は、マウス1匹につき1回のみ使用した。

血液採取
血液サンプルは伏在静脈マイクロベット採血管（Microvette 100K3E SARSTEDT、カタログ番号20.1278.100）から採取し、5,000rpm、4℃で10分間遠心分離した；血漿を得、アッセイするまで-80℃で保存した。

胎盤組織の収集
胎盤組織はref. 58. 簡単には、交尾栓が発見された日をE0.5として、E13.5とE18.5でサンプルを採取した。妊娠マウスから受精卵を取り出し、1個の受精卵を含む子宮角を分割した。顕微鏡用はさみを用いて、子宮筋を抗子宮筋膜側（最も血管が少ない側）から静かに剥がし、卵黄嚢を切断して羊膜嚢を露出させ、胎盤を注意深く剥離して臍帯と卵黄嚢から分離し、切断や裂傷の残骸のない胎盤ディスク全体を採取した。サンプルは液体窒素でスナップ凍結し、RNA-seqのために処理するか、組織学と免疫組織化学分析のために4％パラホルムアルデヒドで固定するまで-80℃で保存した。

胚盤胞前胚
胚盤胞期の胚を作製するために、体外受精を用いた。簡単に述べると、4週齢のC57BL/6J卵子提供雌マウスに、48時間後にPMSG（0.1ml）およびhCG（0.1ml）を腹腔内注射して過排卵させ、6週齢のコントロールまたはレプチン欠損（ob/ob）マウスのいずれかから容量精子懸濁液を調製し、卵子を含む受精皿の調製した滴の中央に移した。なお、コントロール（wt/wt）とレプチン欠損（ob/ob）の雄精子ドナーは、ヘテロ接合体交配（wt/ob）に由来する同腹子であり、ほぼ同系であった。単離精子で卵子を授精させた後、精子-卵子受精皿を37℃、5％CO2下で3-4時間培養した。3-4時間培養後、推定接合体を150μlのM2培地滴下で3-4回洗浄し、アミノ酸添加KSOM培地（KSOMaa）500μlを入れた4ウェルNUNCプレートで、37℃、5％CO2、5％O2インキュベーター内で4.5日間培養した。4.5日後、各胚盤胞期胚を0.2mlのPCRチューブストリップ（2μlの溶解バッファー＋1μlのdNTPs＋1μlのオリゴdTプライマーを含む）に回収し、単一胚RNA-seq解析（Smart-Seq）を行った。溶解バッファー組成 H2O中0.5% Triton-X100（vol/vol）+2Uμl-1のSUPERase In RNase inhibitor（20U μl-1; Thermo, AM2694）およびオリゴdTプライマー：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGTACT30VN-3′。

組織学的染色
6週間処置（nABX）またはCON種雄マウスから採取した精巣組織をBouin固定液で固定し、次いで段階的エタノールおよび清澄剤（キシレン）で処理し、次いでパラフィンに包埋した。その後、サンプルを5～7μmの厚さで連続的に切り出し、標準的なヘマトキシリン・エオジン染色で染色した。精細管（すなわち、精原細胞、精母細胞、精細胞、セルトリ細胞）およびライディッヒ細胞の精巣形態分析は、LMD 7000 laser microdissector microscope (Leica)を用いて行った。異常精細管の定量的評価は以下のように行った：各サンプルについて、少なくとも10切片を分析し、1,000個以上の精細管を評価し（正常または異常）、それに応じて異常精細管の割合を算出した。この解析のために、NanoZoomer S60 Digital slide scanner (Hamamatsu Photonics, C13210-01)を用いて画像を撮影した。

免疫蛍光染色
E18.5で採取した胎盤サンプルを4%パラホルムアルデヒドで4℃固定し、パラフィンに包埋後、7μm厚に切片化した。切片化したサンプルをスライドにマウントし、ホットプレート上で40℃で乾燥させた。乾燥した切片をpH6.0のクエン酸緩衝液を用いて熱による抗原回収を行い、抗マウスVE-カドヘリン（Thermo Fisher Scientific; eBiosciencesのカタログ番号14-1441-81; 2.5 μg ml-1）と4℃で一晩インキュベートし、抗ラットアレキサフルオロ568（Thermo Fisher Scientific; カタログ番号A-11077; 4 μg ml-1）で検出した。核を4′，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（Thermo Fisher Scientific；カタログ番号D1306；5μg ml-1）で対比染色した。ProLong Glass（Thermo Fisher Scientific; カタログ番号 P36983）でマウントする前にスライドを洗浄し、Leica THUNDER Imager Live Cellで20倍の対物レンズ（開口数=0.8）で画像化した。QuPath v.0.2.1画像解析ソフトウェアを用いて、迷路帯および胎盤全体の面積を測定した。

E13.5およびE18.5の胎盤血管をイソレクチンB4で染色した。簡単に述べると、胎盤サンプルの矢状7μm切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノール濃度を下げながら再水和した。スライド切片を10mMクエン酸pH6.0緩衝液中で10分間、熱による抗原回収を行った。その後、これらの切片を0.3% Triton-X100で透過処理し、5%ロバ血清でブロックし、ウサギIsolectin HRP（シグマ、カタログ番号L5391）を2μg ml-1で4℃で一晩インキュベートした。クロマゲン検出は、ABC DABキット（Vector Laboratories、カタログ番号PK-6100）の試薬を用い、メーカーの指示に従って行った。

高分子分析
ELISAアッセイ
ELISAキットを用いて、生物学的サンプル中の特定の標的タンパク質の濃度を測定した。F0種雄のレプチン(Lep)の測定には凍結血漿と精巣サンプルを用い、胎盤成長因子(Plgf)と可溶性fms様チロシンキナーゼ-1(sFlt1)の測定にはF1胎盤組織を用いた。Lep、PlgfおよびsFlt1の定量には、マウスレプチンELISAキットMOB00、マウスPlGF-2 ELISAキットMP200およびマウスVEGFR1/Flt-1 ELISAキットMVR100(R&D Systems社製)を、製造元の指示に従い使用した。試薬、標準曲線希釈液およびサンプルはキットに記載されているとおりに調製し、すべてのサンプル、標準品およびコントロールは、複数の生物学的複製を用いて技術的に二重にアッセイした。標的タンパク質濃度を定量するために、生成されたデータは非線形回帰モデル曲線フィットにより補間された。

血漿レプチンを定量するために、F0 種雄血から採取し、-80 ℃で保存しておいた血漿サンプルのアリコートを氷中で解凍し、キャリブレーター希釈液で 20 倍に希釈し、製造業者の指示に従って測定した。

組織中のレプチン、PlgfおよびsFlt1を定量するために、精巣または胎盤サンプルを氷上で融解し、PBSで洗浄した。続いて、プロテアーゼ阻害剤カクテルを混合したRIPA緩衝液（Sigma-Aldrich）1mlを入れたDounce組織粉砕機2ml中で、乳棒A（約10回）と乳棒B（約20回）でホモジナイズし、氷中で穏やかに撹拌しながら5分間保ち、15,000rpm、4℃で20分間遠心した。遠心後、透明な上清のアリコートをELISAアッセイに使用した。

抗生物質残基をスクリーニングし、nABXまたはその残基が遠位組織または循環系で検出可能かどうかを調べるために、独立した相補的アプローチをとった。

質量分析
精巣組織中の抗生物質を定量するためのサンプルは、以下のメタボロミクスのセクションで説明したように調製した。抽出・乾燥したサンプルを20μlのメタノール：水（1：1）に懸濁し、10μlのサンプルをAgilent 6550 iFunnel qToF質量分析計に直接注入した。バクテリオシン（5.6～90.0pmol）、プリマリシン（7.0～112.5pmol）、ネオマイシン（5.3～85.0pmol）。抗生物質の定量は、MassHunter Quantitative Analysis Software (Agilent Technologies, v.10.0)を用いて行い、検出限界はRを用いた線形回帰により決定した。

機能性残基スクリーニング
PremiTestキット（R-Biopharm社製）を用いて、-80℃で保存した精巣サンプル中のnABXまたはavaABX残基を測定し、食肉用として製造元の説明書に従って実施した。この検査の原理は、数種の抗生物質およびサルファ剤に高い感受性を示す好熱性細菌の芽胞（Bacillus stearothermophilus）に基づいている。簡単に説明すると、6週間処理（nABXまたはavaABX）および未処理（CON）の種雄から採取した精巣を氷中で解凍し、1×PBSで洗浄した後、200μlの1×PBSを含む2mlのDounce組織粉砕器を用いて、乳棒「A」（約10ストローク）と乳棒「B」（約ストローク）でホモジナイズした。ここで、陰性コントロールとして滅菌水を用い、陽性コントロールとして、最小残留検出限界（0.5μg ml-1）の濃度で水に希釈したnABXカクテルを用いた。ホモジナイズしたサンプル溶液から100μlをアンプル内の寒天培地にピペッティングし、室温で20分間放置して予備拡散させた。予備拡散後、サンプル溶液を水で2回洗浄してアンプルから流し、蒸発を防ぐためにホイルで覆った。その後、陰性コントロールが紫色から黄色に変わるまで、テストアンプルを64±0.5℃のエッペンドルフ・ブロックヒーターで約3～3.5時間インキュベートした。この段階でアンプルをブロックヒーターから取り出し、キットの2色インジケーターに基づいて結果を解釈した。

微生物叢分析
糞便サンプル採取
個別に収容したF0種雄から、いくつかの異なる時点で新鮮な糞便サンプルを採取した：(1)0日目のnABX投与前、(2)交配を設定する前の6週間の治療終了時、および(3)nABX中止後の回復期間中。糞便サンプルは、離乳期（P21）にダムおよびF1子孫から採取した。新鮮な糞便サンプルを採取するため、糞便を採取する親または子を、餌と水とともに清潔なオートクレーブ滅菌ケージに2～3時間入れ、滅菌したピンセットで糞便ペレットを採取し、マイクロバイオームプロファイリング用のDNA抽出まで-80℃の冷凍庫で直ちに保存した。

微生物DNA抽出
すべてのサンプルは、16S rRNA配列決定まで-80℃で保存した。糞便検体（F0親から約200 mg、F1子から約100 mg）からの微生物DNA抽出は、QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（QIAGEN社製）を用い、製造者の指示に従って行った。簡単に説明すると、DNA抽出キットで処理した糞便サンプルをPowerBead beat tubeに加え、Vortex-Genie 2ミキサー（Scientific Industries）を用いてVortex Adapter（QIAGENカタログ番号13000-V1-24）上で急速にホモジナイズした。細胞が溶解され、潜在的阻害因子が除去されると、全ゲノムDNAがシリカメンブレンに捕捉され、洗浄後、下流の腸内細菌叢プロファイリング用に溶出される。

16S rRNA遺伝子コピー数の測定
マウスの糞便中の16S rRNA遺伝子コピー数の相対量は、コントロールサンプルの連続希釈に基づいて作成した標準曲線から、F341 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′およびR534 5′-ATTACCGCGCTGCTGG-3′プライマーを用いて、前述のように定量的リアルタイムPCR法により決定した59。

16S rRNA V4領域の標的化増幅（プライマー配列F515 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′およびR806 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′（参考文献60））は、KGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′（参考文献60）を用いて行った。60）を用いて、KAPA HiFi HotStart PCR mix (Roche)を用いて、2段階のバーコードPCRプロトコル(NEXTflex 16S V4 Amplicon-Seq Kit; Bioo Scientific)で、製造元の説明書から若干の修正を加えて行った。PCR産物をプールし、サイズ選択性SPRIselect磁気ビーズ（0.8レフトサイズ）を用いて精製した後、ハイデルベルグのEuropean Molecular Biology LaboratoryのGenomics Core Facilityで、Illumina MiSeq（イルミナ）を用いて2×250塩基対（bp）の塩基配列を決定した。

生の16S rRNAリードをトリミングし、DADA2（ref.61）を用いてキメラPCRアーティファクトを除去するためにノイズ除去およびフィルター処理を行った。得られたアンプリコン配列バリアントは、オープンリファレンスアプローチを用いて、98%の配列類似度で分類単位（OTU）にクラスタリングされた。信頼性の高いマップが得られなかったリードは、Infernal63を用いて細菌および古細菌の二次構造を考慮したrRNAモデルにアライメントし、前述のようにhpc-clust64を用いて98%の平均連鎖でOTUにクラスタリングした65。得られたOTU数表は、サンプルが少なくとも1,000リードを保持し、分類群が少なくとも2つのサンプルで流行していることを保証することでノイズフィルターをかけた。このフィルターにより、偽のOTUは58%除去されたが、データセットからの全リードの0.09%しか除去されなかった。

ローカルサンプルの多様性は、OTUリッチネス、指数シャノンエントロピー、逆シンプソン指数（次数0、1、2のHill多様性に対応（文献66））として、サンプルあたり5,000リードに対する100回の希釈反復の平均値として計算した。サンプル間のコミュニティ多様性はBray-Curtis非類似度として計算した。群集組成の傾向は、順序法（主座標分析、距離ベースの冗長性分析）を用いて定量化し、Rパッケージvegan68に実装されているように、並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA67）を用いて検定した。

交配中の微生物叢相互移入を測定するためのコホージング
この4日間の実験では、各群（CONおよび6週齢のnABX）の雄を、プラグ陽性にかかわらず、治療を受けていない6週齢の雌のC57BL/6Jマウスと1：1の割合で1つのケージに連続的に同居させた（単一繁殖ペア）。交配期間中、両群とも通常の餌と滅菌水を自由摂取させた。ベースラインの微生物叢を調べるために飼育前0日目に、そしてnABX雄との雌の暴露／同居の影響を調べるために交配後4日目（それぞれ交配前、交配後と表記）の2つの時点で糞便を採取した（上記の通り）。さらに、交尾時に微生物叢の移行が起こるかどうかを調べるため、交尾直後のメスの膣部から交尾栓を採取した。スワブを用いて作業領域から対照サンプルを採取し、滅菌した鋭利な歯のピンセットを用いてプラグサンプルを採取した。

RNA配列決定（トランスクリプトミクス）
mRNA-seq法
RNeasy Protect Mini Kit（Qiagen）を用いて、メッセンジャーRNA配列決定のために、4つの異なる組織タイプ（種牡馬の精巣、F1胎盤、F1脳、F1（BAT））から、製造者の指示に従って全RNAを抽出した。トータル RNA の量と質は、NanoDrop Spectrophotometer と Agilent TapeStation システム（Agilent）を用いて評価し、RNA インテグリティナンバーが 8.5 以上であることを確認した。ライブラリー調製のために、まずmRNAを1μgのインプットRNAでNEBNext Poly(A) mRNA磁気分離モジュールを用いて濃縮した。精製されたmRNAはその後、NEBnext Ultra II directional RNA library prep kitを用いて、メーカーのガイドラインに従って鎖状ライブラリーにプレップされた。増幅ライブラリーをマルチプレックスし、Illumina NextSeq 500（PE40）でシーケンスした。

小分子RNA-seq
精子small RNA解析のために、miRVana microRNA isolation kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてtotal RNAを単離した。この手順は、精子を完全に溶解させるために細胞溶解ステップで若干の変更を加えたが、製造元の説明書に従って行った。簡単に言うと、精製精子サンプルを氷上で解凍し、miRVana溶解バッファーを室温で5分間加え、40mMジチオスレイトールと12μl ml-1のプロテイナーゼKをサンプルに加えた。その後、サンプルを56℃で20分間、450rpmのサーモシェーカーでインキュベートした。このステップの後、miRNAホモジネートを溶解液に加え、トータルRNA単離に推奨されるキットの説明書に従った。この全RNAの1μgから、製造元の説明書に従ってIllumina Truseq small RNAライブラリー調製キットを用いてsmall RNAライブラリーを調製した。ライブラリーはIllumina Hiseq 2000で配列決定した。

単一細胞RNA-seq（10X）
PBS+0.04%BSAに再懸濁した精巣単細胞を、10x Chromiumチップにロードするために約1,100細胞μl-1の濃度に調整した。細胞のキャプチャーとライブラリーの調製は、キットの説明書（Chromium Next GEM Single Cell 3′ v.3.1 (Dual Index) User Guide）に従って行った。簡単に説明すると、1サンプルあたり約6,000個の細胞を捕捉対象とし、相補的DNA合成後、12～14サイクルでライブラリー増幅を行った。得られたライブラリーはサイズ選択、プールされ、Illumina NextSeq 2000 P2フローセル（100CYC）シーケンスプロトコルを用いてシーケンスされた。

ハイブリダイゼーションin situシーケンス
プロトコルはref. 69. 簡単に述べると、mRNA転写物は、SuperFrost Plus接着スライドにマウントした10μm厚で凍結摘出した精巣組織から標的にした。切片を3％ホルムアルデヒドで固定し、0.1 M HClで5分間透過処理し、PBSで洗浄した。組織切片の周囲にSecureSeal Hybridization Chambers（Grace Bio-Labs）を貼り、ランダムヘキサマー、RNase阻害剤、逆転写酵素（BLIRT）を用いて37℃で一晩mRNAを逆転写した。逆転写後、組織切片を40分間固定し、PBSで洗浄した後、リン酸化パドロックプローブ（PLP）を最終濃度10nM/PLPでハイブリダイズさせ、Tthリガーゼ（BLIRT）とRNaseHでライゲーションした。切片をPBSで洗浄した後、ファイ29ポリメラーゼとエキソヌクレアーゼI（Thermo社製）を用いてローリングサークル増幅を30℃で一晩行った。インキュベーション後、試薬を除去し、サンプルをPBSで2回洗浄し、SecureSealチャンバーを鉗子で除去した後、Bridge-probes（10 nM）をハイブリダイゼーションバッファー（2×SSC、20％ホルムアミド）中、室温、暗所、ロッカー上で1時間ハイブリダイズさせた。この後、リードアウト検出プローブ（0.1μM）をハイブリダイゼーションバッファー中、暗所、室温で1時間ハイブリダイズさせ、PBSで2回洗浄し、DAPI（0.5μg ml-1）で室温で5分間染色した。切片をPBSで洗浄し、約20μlのFluoromount-G Mounting mediumでマウントし、カバースリップで覆い、画像化するまで4℃で保存した。画像はslideview vs200スライドスキャナー（オリンパス製）で撮影し、TissUUmapsを用いて解析した。

低分子RNAのTaqManアッセイ
小分子RNA-seqサンプルから独立した雄を用い、miRVana microRNA単離キットを用いて精製精子全RNAを抽出した。miRNAおよびtRNAの定量は、CONマウス（n = 4）およびnABXマウス（n = 4）から得た7ngの全RNAを用いて、製造業者のプロトコール（Applied Biosystems）に従って、あらかじめ設計された（miR-141-3p）およびカスタム設計された（tRNA-Gly-GCC-2）TaqManアッセイを用いて行った。逆転写による定量的PCRは、TaqMan Fast Advanced Master Mixを用い、標準プログラム（95℃で10分、95℃で15秒、60℃で1分、40サイクル）に従って15μlの反応で行った。miRNAおよびtRNAレベルの標準化のために、snoRNA202（Applied Biosystems）を内因性コントロールとして用いた。相対量は内因性コントロール値で正規化し、2-∆∆Ct 法により foldchange を算出した。TaqManプローブの増幅効率は、テンプレートランの連続希釈によって確認した。

シングルエンブリオRNA-seq（Smart-Seq）
シングルエンブリオRNA-seqは、文献70に記載されているように、Smart-Seqプロトコルを用いて実施した。70. 品質管理およびデータ前処理のために、生のリードをSTAR v.2.7.10a (参考文献71)を用いて、デフォルトのパラメータ設定でmm10 (GRCm38)プライマリーゲノムアセンブリにアライメントした。データはSubread v.2.0.1(参考文献72)のfeatureCountsモジュールを用いて定量した。微分発現とPCAはR (v.4.1.2)で行った。微分発現は、DESeq2（v.1.34.0）パッケージ73に生カウントを渡して実行した。vst関数を使用してデフォルト設定でカウントを正規化し、上位500の可変遺伝子をPCAに使用した。遺伝子オントロジー解析には、遺伝子オントロジー用語の濃縮を推測するためにMetascapeウェブアプリケーション（https://metascape.org/gp/index.html）を使用した74。検査する遺伝子のリストをテキストファイルとしてMetascapeにアップロードした。Input as species "と "Analysis as species "パラメーターをM. musculusに設定した後、"Express Analysis "オプションを選択した。

DNA配列決定
全ゲノムbisulfite-seq
全精子DNAの抽出は、精子ゲノムDNAの精製に最適化されたDNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN Hilden）を用いて行った。DNA抽出は以下のように行った。80 mMジチオスレイトールおよび12 μl ml-1のプロテイナーゼKを含むDNA抽出バッファー（20 mM Tris Cl pH 8、20 mM EDTA、200 mM NaCl、4% SDS）100 μlをサンプルに添加し、エッペンドルフのサーモミキサーで56 °C、精子が完全に溶解するまで（約1時間）インキュベートした。インキュベーション後、動物精子から全DNAを精製するためにユーザーが開発したプロトコールDY03（QIAGEN）を適用した。BS-Seqライブラリーは、TruSeq DNA Methylation Library Prep Kit（Illumina）を用いて、メーカーの説明書に従って構築した。増幅ライブラリーをマルチプレックスし、Illumina NextSeq 500（PE75）でシーケンスした。

デノボgDNA-seq
コントロールまたはnABX由来のF1子孫（正常またはSGR）の肝臓から、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）を用いて、製造元の指示に従ってgDNAを抽出した。DNA の量と質は NanoDrop Spectrophotometer と Agilent TapeStation system (Agilent) で評価し、DNA インテグリティナンバーが 7 以上であることを確認した。ライブラリー調製には NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit を使用し、メーカーのガイドラインに従った。増幅されたライブラリーはマルチプレックスされ、Illumina Hiseq 4000（PE150）で適切な深度までシーケンスされた。

メタボロミクス
非標的メタボロミクス測定
水およびアセトニトリル（LC-MSグレード）を含む液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）分析用のすべての化学物質はFisher Scientificから購入した。オンライン質量較正用の標準物質はAgilent Technologiesから購入した。

サンプル調製
精巣サンプルは、CON および nABX を投与した種雄の両方から、投与 6 週間直後（11 週齢マウス）、投与中止 4 週間後（15 週齢マウス）、および投与中止 8 週間後（19 週齢マウス）の 3 つの繁殖時点にわたって採取した。サンプルは採取後すぐに液体窒素でスナップ凍結し、-80℃で保存した。回収後、氷冷した混合溶媒（アセトニトリル：メタノール：水、2：2：1）300μlとQiagen製タングステンカーバイドビーズ（3mm）2個を各睾丸サンプルに添加した。Qiagen tissueLyser IIを用い、30%の強度で5分間ホモジナイズした。溶解したサンプルを12700RCF、4℃で10分間遠心した。等量（125μl）の抽出上清を2つのNunc 96ウェル、V字型プレートに移し、Genevac遠心濃縮機（Genevac）で25℃、2時間蒸発させた。濃縮サンプルは-80℃で保存し、LC-MS分析のために同じ溶媒混合物20μlに再懸濁した。

LC-MS測定
クロマトグラフィ分離は、Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、3.0 × 150 mm2、2.7 μm カラムと、6550 iFunnel qToF 質量分析計に接続した Agilent 1290 Infinity II LC システムを用いて行いました。カラム温度は45℃に保ち、流速は0.4 ml min-1とした。以下の移動相を使用した：移動相A-0.1%ギ酸を含む水；および移動相B-0.1%ギ酸を含むアセトニトリル。5μlのサンプルを5%の移動相Bで注入し、0.10分間維持した後、0.5分間で30%の移動相Bにリニアグラジエントし、続いて10分間で95%の移動相Bにリニアグラジエントし、95%の移動相Bで1分間維持した。各サンプル注入の前に、カラムを開始条件で3分間再平衡化させた。質量分析計は、ポジティブおよびネガティブスキャンモード（50-1,700 m/z）の両方で、以下のソースパラメータで操作した： VCap、3,500 V、ノズル電圧、2,000 V、ガス温度、275 °C、乾燥ガス、13 l min-1、ネブライザー、45 psi、シースガス温度、275 °C、シースガス流量、12 l min-1、フラグメンター、130 V、スキマー、0 V。オンライン質量校正は、第二イオン化源と一定流量（10 µl min-1）のリファレンス質量溶媒（ネガティブ操作モードではそれぞれ119.0363と1033.9881 m/z、ポジティブ操作モードではそれぞれ121.0509と922.0098 m/z）を用いて行いました。各サンプルは、正イオン化モードと負イオン化モードの両方で別々に測定されました。

代謝特徴抽出
MassHunter Qualitative Analysis Software（Agilent Technologies、v.10.0）を使用して、取得した LC-MS データから代謝の特徴を抽出しました。絶対高さのピークフィルター：5,000 カウント、電荷状態の割り当てを 1 に制限、化合物の品質スコアが 80% 以上の ±H+ 荷電分子のみを対象としました。ピークのアライメントと同定は、Mass Profiler Professional（Agilent、v.15.1）を使用し、デフォルトパラメータ：質量許容差2 mDaまたは20 ppm、保持時間許容差0.2 minまたは2%で行いました。抽出およびアライメントされたフィーチャーは、さらなるデータ解析のために .csv ファイルとしてエクスポートされました。

統計解析
統計解析はGraphpad Prism v.8.4.3およびR v.3.6.2を用いて行った。F1子孫の体重と表現型における有意差は「入れ子」解析で決定された。これにより、複製数は子孫の数（n）ではなく、一意に暴露された父親の数（N）によって決定され、どちらが大きいかが決まる。したがって、効果量と部分的に浸透した表現型を確実に捕捉するために、通常1回の実験でn > 150の子孫を作成するが、統計的に言えば、同じ父親に由来する各個体は、階層的に1つのN値に入れ子になっている。例えば、ネストされたt検定は、2つのマッチしていないグループ（コントロールまたはdysbioticの父親から生まれたすべてのF1子孫）の平均を比較し、それらの処理グループ（各子供の間で共有された父親）にはネストされた因子が存在する。これは、世代間研究において個々の子孫を独立変数として用いると、アルファエラー率が高くなり、偽有意性が生じるため、必要なことである。精巣対体重比、胎盤対胎盤比、迷路帯は両側無対t検定で分析した。オッズ比（OR）と95％信頼区間（CI）はBaptista-Pike法を用いて計算し、ORの統計的有意性はカイ二乗検定を用いて決定した。生存分析曲線の作成にはKaplan-Meier法を適用し、log-rank（Mantel-Cox）検定で比較した。ELISA検量線は、Hyperbola（Xは濃度）非線形回帰モデルを用いて補間した（R2 > 0.99は許容可能な曲線適合）。

バイオインフォマティクス解析
シングルセルRNA-seqのアライメントとマッピング
生リードは、10x Genomics Cellranger 6.1.2（文献75）のcountモジュールを用いて、mm10トランスクリプトームアセンブリ（2020-A）にデフォルトパラメータでアライメントおよびマッピングした。

シングルセルRNA-seq品質管理
以降のすべてのステップは、Seuratパッケージ76を用いてR（v.4.1.2）で行った。まず、後述するように、3つのパラメータ-ユニークな分子識別子の数（nCount_RNA; 1,000:5,000）、検出されたユニークな遺伝子の数（nFeature_RNA; 500:5,000）、ミトコンドリア率（percent.mito）およびリボソーム率（percent.ribo; 0:20）に基づいて細胞をフィルターした。次に、nABXサンプルとCONサンプルを、デフォルトのSeuratクラスタリングアプローチを用いて別々にクラスタリングした。どちらの条件でも、一意に発現した遺伝子を持たないクラスター（logfc.threshold = 0.5、min.pct = 0.5でFindMarkers関数を使用）は破棄された。

シングルセルRNA-seq統合
nABXサンプルとCONサンプルを、Seuratパッケージが推奨するデフォルトのパラメータ設定で、正準相関分析アプローチを用いて統合した。

シングルセルRNA-seq細胞タイプアノテーション
統合されたデータセットはクラスタ化され、ユニークに発現したマーカー遺伝子を用いてアノテーションされた。上記のように、一意に発現した遺伝子を示さないクラスターは無視された。より細かいアノテーションを定義するために、体細胞と生殖細胞を別々のSeuratオブジェクトに分割し、別々にクラスタリングした。

シングルセルRNA-seqによる細胞タイプ特異的差次発現
データセットで同定された各細胞タイプについて、logfc.threshold = 0.25、p_val_adj < 0.01を用いて、FindMarkers関数を用いてnABX細胞とCON細胞間のDEGを同定した。

RNA-seqの品質管理とデータ準備
生のリードをTrim Galore（0.4.3.1, -phred33 --quality 20 --stringency 1 -e 0.1 --length 20）を用いて品質トリミングした。これらのリードをRNA Star (2.5.2b-0, --outFilterMultimapNmax 1000を除くデフォルトパラメータ)を用いてマウスmm10 (GRCm38)ゲノムアセンブリにマッピングし、MAPQスコアが20未満のリードは破棄して、ユニークマッピングされた高品質なアラインメントのみを遺伝子発現解析に用いた。データはseqmonkソフトウェアのdirectional library用RNA-seq定量パイプラインを用いて定量し、log2 reads per million（RPM）または遺伝子長調整（RPKM）遺伝子発現値を生成した。

RNA-seq差分解析
DEGはDESeq2パッケージ（v.1.24.0）を用い、生のマッピングカウントを入力し、多重検定調整P値（偽発見率（FDR））＜0.05の有意性閾値を適用して決定した。 < 0.05の有意閾値を適用した。最終的なDEGを生成するために、2以上の余分なfoldchangeフィルターが適用された。

RNA-seq主成分分析
トランスクリプトームの主成分分析は、すべての発現遺伝子を入力として、seqmonkとR統計ソフトで計算した。これらは、すべてのアッセイサンプルにわたって、少なくとも2つのレプリケートでRPKM > 0.1を有するものとして定義された。

RNA-seq 遺伝子オントロジークラス濃縮
興味のあるDEGまたは遺伝子リストをSTRING v.11.0データベース77に入力し、FDRランクでフィルタリングしながらReactomeおよびKEGGパスウェイに関連する濃縮解析を抽出した。

Small RNA-seqの品質管理とデータ準備
fastx-clipperを用いてアダプターを除去し、カスタムperlスクリプトを用いてfastqファイルをfastaに変換し、カスタムperlスクリプトを用いて18-33ヌクレオチド長のリードを保持した。最良のアライメントのみを報告し、ミスマッチは0とする（パラメータ -v 0 -k 1 -- best -sam）。アラインメントのsamファイルはsamtools v.1.9を用いてbamファイルに変換し、bamファイルはbettools v.2を用いてbedファイルに変換した。miRNAの定量にはintersectBed -cを用い、既知のM. musculus miRNAの位置（miRbase www.miRBase.org）と重なるリードの数をカウントした。tRNAは、tRNA scan database (http://gtrnadb.ucsc.edu/genomes/eukaryota/Mmusc10/)からダウンロードした予測マウスtRNA座標を記録したbedファイルに重なるリードの数をカウントするためにintersectBed -cを使用して得られた。piwiと相互作用するRNAの座標はref. 78から取得し、リフトオーバーを用いてmm10に変換した。piRNAは、最初のヌクレオチドとしてUを持つ26～32ヌクレオチド長のRNAを選択し、intersectBed -cを用いてこれらのRNAとpiRNA座標を交差させることにより定量した。

小分子RNA-seq解析
有意差を調べるために、DESeq2を用いてデータを処理し、Benjamani-Hochberg多重検定補正後の有意差を同定するために負の二項検定を用いた。

全ゲノムbisulfite-seq
生のfastq配列は、Trim Galore（0.4.3.1）を用いて品質およびアダプターをトリミングし、Bismark（0.20.0）を用いてmm10にアライメントした。Bismark methylation extractorツールを用いて、マップされたリードからシトシンメチル化状態を抽出した。ゲノム全体のメチル化コールは、Seqmonkソフトウェア(1.44.0)を用いて、各条件について生物学的に独立した5つの複製データセットを用いて解析した。DMRを同定するために、まずゲノムを50個の連続したCpGを含むスライディングタイルにビニングし、DNAメチル化パイプラインを用いてメチル化状態を決定した。DMRは、最小10リードでリード深度に敏感なロジスティック回帰（P(adj)<0.05）を実行し、DNAメチル化の絶対変化20%の閾値を適用して同定した。特定のゲノム特徴（例えば、インプリント）におけるメチル化レベルは、SeqmonkのDNAメチル化パイプラインを使用して、ターゲット特徴上で計算した。

デノボgDNA-seq
Trim Galore（v.0.6.3）79を用いてアライメントリードをトリミングし、Cutadapt（v.2.3）80を用いて両方のリードの最初の10塩基を除去した。bwa mem (BWA-0.7.17)81 を用いてM. musculus refence genome (mm10)にアライメントした後、samtools (v.1.10)82 viewで'-h -F 256 -f 2 -q 30'のフラグでフィルタリングし、Picard toolkit (v.2.9.0) MarkDuplicates83で重複除去した。SNPとsmall INDELはGATK (v.4.1.6.0)84 HaplotypeCallerを用いてコールした。バリアントは、PHREDで呼ばれるサイトクオリティ（QUAL）が30未満、アリル頻度が0.2未満、または複数の個体でサイトカバレッジ（スライディングスケール）が低いものを除去するためにフィルタリングした。バリアントの機能領域はANNOVAR (2020Jne07) annotate_variation.pl85を用いてアノテーションした。構造バリアントはDelly2 call (v.0.8.7)86 を用いてコールした。

メタボロミクスの品質管理とデータ準備
すべての統計解析とプロッティングはR v.3.6.2（文献87）で行った。下流の解析から不良サンプル注入を除外するため、抽出された全代謝物特徴の合計（TIC）をサンプル間で比較し（平均値 = 1.600 × 1010、範囲 = [1.419 × 1010; 1.808 × 1010]）、TICが平均値から3 s.d.以内でないサンプルを除外しました（除外サンプル0）。欠測データは5,000カウントの固定閾値でインプットした。(1)0.002amu（絶対しきい値）または20ppm（相対しきい値）のウィンドウおよび(2)0.15分（絶対しきい値）または2％（相対しきい値）の保持時間のウィンドウ内にある完全重複特徴または特徴は、スプリットピークとみなされたため、一緒に折りたたまれた。精巣重量と動物体重の相関を計算し、2つの値に有意な相関がないことを確認した（cor = 0.1870, P = 0.2477）。したがって、精巣重量Zスコアは、精巣サイズに由来する信号強度のばらつきを考慮するために、曲線下面積強度値を正規化するために使用された。(1)分散がゼロ、(2)シングルトン、(3)各クラスのサンプルの75%未満に存在する、は削除された。最後に、ポジティブモードとネガティブモードから得られたフィーチャーテーブルは、フィーチャーが完全に重複していないか、0.002 Daまたは20 ppmのウィンドウに該当するフィーチャーが存在するかどうかをチェックした後、一緒に折りたたまれた。その結果、全30サンプルと合計10,582の代謝フィーチャーを含むテーブルが作成されました。

メタボロミクス代謝物アノテーション
アノテーションは、Human Metabolome Database (HMDB, https://hmdb.ca/)88,89から、代謝物のモノアイソトピック質量から0.002 amuまたは20 ppmのウィンドウで、全く同じ質量の代謝物または該当する代謝物を検索して取得しました。アノテーションが存在する場合は、複数のアノテーションが検索されました。アノテーションが付加されたフィーチャーのみが下流の解析に残されました。さらに、各フィーチャーについて、代謝物クラスとスーパークラスが存在する場合は、HMDB から検索しました。

メタボロミクス主成分分析
全データセット、および全代謝物フィーチャーとアノテーションフィーチャーのみについてサンプリング週で層別化した後、PCAを計算した90。

メタボロミクス差分解析
特徴強度の差の統計的有意性は、logスケールしたデータの両側t検定（Rのstats::t.test関数）を用いて評価し、P値はBenjamini-Hochberg手順（BHパラメータを持つRのstats::p.adjust関数）を用いていくつかの仮説検定のためにFDR補正した。調整後のP値とfoldchangesはVolcano plotを用いて可視化した。質量、保持時間、HMDBアノテーション、クラス、スーパークラス、および複合スペクトルは、治療群と対照群の間で有意に異なる強度を示し、絶対的なfold変化が2より大きいすべての特徴について検索されました。

メタボロミクス代謝物クラス濃縮解析
治療群と対照群間の代謝物クラスおよびスーパークラスの濃縮解析は、フィッシャーの正確検定を用いて計算した。すべてのP値は、Benjamini-Hochberg手続き（BHパラメータを使用したRのstats::p.adjust関数）を使用していくつかの仮説検定のためにFDR補正した。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの入手可能性
本研究の結果を裏付けるデータは入手可能であり、RNA-seq (E-MTAB-10034)、バイサルファイト-seq (E-MTAB-10033)、gDNA-seq (E-MTAB-10273)に関するArrayExpressに寄託されている。16S rRNA-seqデータセットはENA (PRJEB43500)に、メタボロミクスはMetaboLights (MTBLS1629)に寄託されている。メタボロミクスはMetaboLights（MTBLS1629）に寄託されている。

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参考文献のダウンロード

謝辞
EMBLコア施設、特にE. Perlas (Histology)、V. Benes (Genecore)、C. Giradot (GBCS)、およびS. Kandelsの実験協力に感謝する。I. Adams、A. Boskovic、C. Grossには原稿に対するコメントをいただいた。本研究は、EMBLプログラム助成金No.50650（J.A.H.）、EMBL Interdisciplinary Postdoc (EIPOD) program under Marie Curie CoFund Actions MSCA-COFUND-FP 664726 (A.A.-D.)、Medical Research Council MC-A652-5PY80 (P.S.)の助成を受けた。

資金提供
European Molecular Biology Laboratory (EMBL)よりオープンアクセスファンドの提供を受けた。

著者情報
著者および所属
欧州分子生物学研究所（EMBL）、エピジェネティクス・神経生物学ユニット、ローマ、イタリア

Ayele Argaw-Denboba、Monica Di Giacomo、Bobby Ranjan、Catrin T. Lloyd、Danilo Pugliese、Violetta Paribeni、Juliette Dabin、Alessandra Pisaniello、Sergio Espinola、Alvaro Crevenna、Neil Humphreys、Olga Boruc、Jamie A. Hackett。

欧州分子生物学研究所（EMBL）構造・計算生物学ユニット（ドイツ、ハイデルベルク

Thomas S. B. Schmidt、Saravanan Devendran、Eleonora Mastrorilli、Michael Zimmermann、Peer Bork

MRCロンドン医科学研究所（LMS）（英国・ロンドン

スバニタ・ゴーシュ & ピーター・サーキーズ

英国・オックスフォード大学・生化学部門

スバニタ・ゴーシュ & ピーター・サーキーズ

ドイツ、ヴュルツブルク、ヴュルツブルク大学バイオセンター、バイオインフォマティクス科

ピア・ボーク

延世大学・延世フロンティアラボ（YFL）／韓国・ソウル

ピア・ボーク

貢献
A.A.-D.とJ.A.H.が研究を考案し、実験をデザインした。T.S.B.S.とA.A.-D.は16S rRNA-seq実験の実施と解析を行った。M.D.G.およびA.A.-D.は精巣組織学的実験を行い、解析した。A.A.-D.とB.R.はシングルセルRNA-seq実験を行い、解析した。A.A.-D.、S.D.、E.M.およびM.Z.がメタボロミクス実験を実施し、解析した。A.A.-D.とC.T.L.は全ゲノムバイサルファイト実験を実施し、解析した。J.A.H.が全ゲノムbisulfite-seq実験を解析した。D.P.とV.P.はA.A.-D.と共同で子孫の表現型解析と飼育管理を行った。J.D.はA.A.-D.と協力して胎盤表現型実験を行った。A.A.-D.とA.P.は体外受精実験を行った。A.A.-D.、S.E.およびA.C.はin situシークエンシング実験を実施し解析した。A.A.-D.、S.G.、J.A.H.およびP.S.がsmall RNA-seq実験を行い、解析した。N.H.とO.B.は子孫の表現型と体外受精実験を監督した。A.A.-D.とJ.A.H.はデータを解釈し、原稿を執筆した。P.B.が共同監修し、J.A.H.が研究を監督した。

責任著者
ジェイミー・A・ハケット宛。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
本論文の査読にご協力いただいたKun Tan氏と他の査読者（匿名）に感謝する。査読者の報告書はこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

図表
Extended Data 図1 nABX誘発性ディスバイオシスに対する父親のマイクロバイオームと生理的応答。
(a)主成分分析（PCA）は、6週間のnABX投与後または対照群における雄の腸内細菌叢組成（Bray-Curtis）を示す。追加パネルは、nABX休薬後4週間または8週間の回復期間後の腸内細菌叢組成を示し、nABX休薬8週間後の腸内細菌叢のレスキューを示す。(b)6週間のnABX投与後、および4週間および8週間の回復（+rec）後の微生物の総存在量を16S rRNAで定量したqPCR。(nABX t0=7、6wk=8、6wk+4rec=8、6wk+8rec=7個体/タイムポイント）。エラーバーはS.D.を示す。 (c) nABX投与6週間後のオスの体重をボックスプロットで示す。棒グラフは中央値を、ひげは5-95パーセンタイルを示す。(d)nABXで処置した雄の生存曲線は、その後の死亡率に影響を及ぼさないことを示す。(e) nABXを6週間投与したオスの体重に対するケカの比率。ケカの肥大は、主要なディスバイオシスおよび/または微生物量の減少の徴候であり、nABX雄における腸内コミュニティの変化をさらに示している。棒グラフは中央値、ひげは5-95パーセンタイル、p値は対応のない両側t検定による（CON n = 25匹の雄、nABX n = 26匹の雄）。棒グラフは中央値を表し、ひげは5-95パーセンタイルを示す。p値は対にしない両側t検定による（CON n = 31産仔、nABX n = 36産仔）。(g)6週間のnABX後、雄が子孫を残す可能性。コントロールと比較して受胎率に差がないことを示す（CON = 51個のプラグ陽性から41個受胎、nABX = 55個のプラグ陽性から43個受胎）。(h)6週間のnABX曝露後の100万個あたりの運動精子数をスコア化することで判定した精子の生存率（CON n = 6雄；nABX n = 6雄、採取精子サンプル）。(i-k) nABXカクテルの各成分が非吸収性であり、遠位組織に到達しないことを確認するため、処理した雄マウスの組織におけるnABXカクテルの各成分の質量分析。高感度と検出限界（LoD）を示す標準曲線を示す。nABXを投与したマウスの精巣および血液（血清）のいずれにおいても、(i) Bacitracin (j) Neomycinおよび(k) Pimaricinを検出することはできなかった(l) nABXを投与した雄の精巣に残留する抗生物質を検出するための機能的アッセイでは、生物学的に利用可能なnABXは検出できない（LoD検出閾値は最大残留レベル（MRL）未満）。すべてのアッセイから、nABXに対する全身および精巣の反応は、nABXが消化管に留まり、全身レベルや精巣に到達しないため、薬剤との直接的な化学的相互作用によるものではないことが示された。

出典データ

Extended Data 図2 nABX誘発性生物多様性異常の父親から生まれたF1子孫の成長と分子表現型。
(a & b)コントロールまたはnABXを投与した父親を持つF1子孫の成長曲線。(a)雄の子孫（CON n = 87; nABX n = 96）と(b)雌の子孫（CON n = 85; nABX n = 85）について層別化した。右図は、子孫の体重の代表的な高分解能タイムポイント（P15）。産仔数（N）を自由度とした階層的（入れ子）両側t検定による有意性（CON = 25; nABX = 28産仔）。(c) すべてのF1子孫（雄と雌）を合わせた成長曲線とP15（P3 n = 172/181 (CON/nABX), N = 26/28 fathers; P15 n = 164/180 (CON/nABX)）。階層（入れ子）両側t検定による有意性。(d) P15におけるF1子孫の体重分布。nABX由来の子孫の中に重度成長制限（SGR）個体が増加する集団シフトが見られる。体重区分はコントロールに対するZスコアで決定した： < -3 = 重度成長制限（SGR）; -3:-2 = 成長制限（GR）; 2:3 = 過体重（OW）; >3 = 肥満（OB）。(e)P17におけるnABX処理種親のF1子孫の成長表現型の範囲を示す代表的な画像で、正常から重度の成長制限(SGR)に及ぶ。肥満個体は観察されなかった。(f)コントロールとnABX由来のF1子孫の生後(P)日数における表現型の追加比較。同じ日に生まれたコントロールとnABXの、それぞれ異なる産仔からの3組の独立したペアを示す。(g)生物多様性障害の父親が産んだ子供の褐色脂肪組織(BAT)における有意なDEGを示すボルケーノプロット。アップレギュレートされたDEGとダウンレギュレートされたDEGの遺伝子オントロジー用語の上位エンリッチされたものを上に示す。(h)独立したF1子孫のBATにおいて、アップレギュレートされた上位50遺伝子とダウンレギュレートされた上位50遺伝子を示すヒートマップ。丸印は観察可能な表現型がないことを示し、三角印はその個体で観察された生理学的表現型（SGR）を示す。各父親処理群につき3産仔から得られたデータ。(i) F1子孫の脳における有意な差次発現遺伝子を示すボルケーノプロット。多重検定で調整したP値。(j)F1子孫の脳における発現上昇および発現低下遺伝子の上位50個のヒートマップ。丸印は観察可能な表現型がないことを示し、三角印はその個体で観察された生理学的表現型（SGR）を示す。各父親処理群につき3産仔から得られたデータ。

出典データ

Extended Data 図3 受胎前の父親腸内細菌叢の回復と同時にF1の表現型が逆転した。
(a)nABXに6週間暴露した雄（dysbiotic）、およびnABXを中止して4週間後に回復した雄（6週間＋4rec；依然としてdysbiotic）、および8週間後に回復した雄（6週間＋8rec；回復）から生まれたF1子孫の体重。p値は、示された子孫の数ではなく、処理されたオス（父親）の数に基づいて有意性を計算する入れ子式（階層式）の両側検定なしのt検定を示している。(b) 6週齢のnABX（左）、6週齢＋4rec（中央）、または回復した6週齢＋8rec（右）の父親が産んだ場合のF1子孫の体重のQQ正規性プロット。このプロットは、異常栄養の父親から生まれたSGR（低体重）の子どもが予想よりも高い頻度で発生することを示しており、過剰尖頭値で示されるように、F1体重の分布に（平均値に加えて）変化があることを示している。このことは、異常値（SGR）の頻度を増加させる確率的影響を示唆している。 (c) 6週＋4recのnABX父親から生まれたF1の脂肪における遺伝子発現のボルケーノプロット。緑/灰色で重ねたのは、6wk nABX父親由来の独立した子孫からの発現差のある遺伝子であり、独立したdysbiotic父親から産まれたコホート間の発現変化と方向性が同等であることを示している。(d)6週齢または6週齢＋4recの父親から産まれたF1 SGR子孫における発現差遺伝子の遺伝子オントロジー解析を示すバブルプロットは、濃縮の著しい類似性を示す。このことは、これらの独立したデント子孫が父方の腸内細菌叢異常に対する再現性のある分子応答を獲得していることを示唆している。一方、6wk + 8recの時点からはSGRの子孫は観察されず、この影響は父方の腸内細菌叢擾乱の期間中は頑健であるが、回復と同時に元に戻ることを示している。

出典データ

Extended Data Fig. 4 F1子孫または世代を超えたF2表現型において、構造バリアントまたはヌクレオチドバリアントの増加を示す証拠はない。
(a)コントロールまたはnABXを投与した父親が産んだ独立したF1子孫における構造変異の解析では、父親の状態や子孫の表現型（正常または重度の成長制限：SGR）にかかわらず、その頻度に変化は見られなかった。各バーは独立したF1子孫である。(b)コントロールまたはnABXの父親からの独立したF1子孫のヌクレオチドバリアントの解析。これらのデータは、nABX父親由来のSGR F1表現型は遺伝的異常の割合の増加とは無関係であることを示している。また、SGR表現型の基礎となるコード変異も同定されなかった。なお、同定されたインデルのほとんどは「common」（n＝6（全）子孫に存在）、または「uncommon」（n＝2〜5子孫に存在）であり、参照ゲノムに対して我々のC57BL/6Jマウスコロニー全体に内在するベースライン塩基多型であることを示している。(c）実験デザインを示す概略図。コントロールまたはnABX処理したF0雄をナイーブ雌と交配し、そのF1子孫を交配して潜在的なF2効果を調べた。なお、重度の成長制限（SGR）表現型を持つF1子孫のサブセットは、一般的に性成熟前に死亡を示すため、交雑させることができなかった。このような理由から、F2の表現型にかかわらず、nABXに暴露されたF0雄は、F2の（世代を超えた）フィットネスが低下すると予測される。これは性的に成熟したF1子孫の減少を反映しており、ひいてはF2の絶対数が減少することになる。(d) F2子孫の新生(P3)体重と離乳後(P21)体重が変化していないことを示すドットプロット（F2 n = 6交配F1 CON子孫から39子孫、F2 n = 10交配F1 nABX子孫から50子孫）。ネステッド両側t検定による有意性。(e) 祖父母のコントロールまたはnABX条件（CON n = 39 F2（6産仔）；nABX n = 50 F2（10産仔））からの全F2産仔の成長曲線。ネステッド両側t検定による有意性。(f) F2子孫の生存プロット。n = F2子孫の数、N = 独立したF1両親の数。

出典データ

Extended Data 図5 母体または子孫のマイクロバイオームに有意な変化は見られなかった。
(a & b)ブレイカーティス非類似度は、(a)nABXの父親が産んだF1子孫、または(b)nABXの雄と交配した母親における腸内マイクロバイオームの組成に変化がないことを示し、伝達されたF1効果はF1または母親のマイクロバイオータ自体への影響とは無関係であることを示している。(c)微生物叢のベータ多様性から、父親の微生物状態の関数としてF1の微生物叢に一貫した変化がないことが確認された。(d) 父親の治療によって層別化した父親、母親、子供のレアファクション分析。(e)子孫の分類群存在量と子孫の表現型との間のスピアマン解析は相関を示さず（左）、一方、父親の微生物叢の分類群存在量と子孫の表現型との間のスピアマン解析は、父親における特定の分類群のF1表現型に対する正または負の相関との関連を示す。灰色の点は平均相関を示す。(f) 4日間同居させ、コントロールまたはnABX雄のいずれかと交配させる前と交配させた後の母親と父親の微生物叢の豊かさの分析。交尾前と交尾後の糞便サンプルを両方のペアから採取した（CON = 6; nABX = 6）。その結果、nABX雄に4日間曝露した後、母親には有意な変化は見られなかった。棒グラフは中央値、ひげは1.5倍のIQRを示す。(g)コントロールまたはnABXオスとの交尾前後の母親の特定の分類群におけるフォールド変化。ばらつきが大きく、nABXオスに関連する有意な効果はないことが明らかになった。交尾前後に採取した糞便サンプル（CON = 6; nABX = 6、雌）。エラーバーは95％C.I.を示す（h）上；qPCR解析では、交尾後およびnABX雄に4日間曝露した後の母親の微生物叢の存在量に変化はない。また、この情報伝達様式を否定する精液マイクロバイオームが検出されなかったことも示す（CON = 8; nABX = 7、精液サンプル）。誤差はS.D.を示す。下段：交配前後の父親と母親のBray-curtis非類似度。

Extended Data Fig. 6 体外受精と同居は、生殖細胞系列の伝達がF1の表現型に直接寄与していることを示唆している。
(a)nABX雄またはその環境に対する母体の事前の曝露が、例えば共食性やマイクロバイオーム伝達を介して、生殖細胞とは無関係に子孫の表現型に影響を及ぼすかどうかを経験的に決定するための同居戦略の概略図。雌はコントロールまたはnABX雄のケージ内で4日間維持された。これはこの研究を通して自然交配に用いられた最長期間（1～4日以内の交尾）を再現したものである。交尾は、夕方にオスを追い出し、メスは糞便、微生物、化学的な合図にさらされるなど、オスの環境内に残すことで防いだ。4日後、nABX雄との同居による機能的効果を調べるため、独立した対照雄を交尾に用いた。(b)対照の雄と交配させたが、対照またはnABXの雄/環境に事前に暴露させた母親からのF1子孫の生存率。Mantel-Cox検定（log-rank）による有意性。(c)新生児出生体重、入れ子の両側t検定によるp値およびバーは95％C.I.を持つ平均値を示す。 (d)コントロールのオスと交配させたが、コントロールまたはnABXのオスの環境に事前に暴露させた母親からのF1子孫の成長曲線。ns = 入れ子の両側t検定分析による非有意。(e)対照または異種生物（nABX）精子ドナーを用いた体外受精の実験戦略の概略図。C57BL/6J雌の卵子をプールし、CONまたはnABX処理（6週間）したC57BL/6J雄から採取したばかりの精子で受精させるために均等に分割した。CONおよびnABX雄からの体外受精を並行して行った。受精胚はレシピエントである里親ダムに移植され、その後出生後のF1効果を解析した。(f)CD1サロゲートダムに移植されたIVFからのF1子孫の成長曲線は、nABXドナー精子と受精した場合、出生時および出生後の平均体重が減少することを示している。P15までの極端な低体重（Zスコア＜-3）を特徴とする重度の成長制限表現型の有病率はnABXの異常値で観察される。右図はP15における体外受精胚の全データポイントである。ネステッド両側t検定によるp値。(g)C57BL/6Jサロゲートダムに移植された独立した体外受精児の成長曲線。CD1の母親はC57BL/6Jの母親よりも大きな仔マウスを育てているが、これは仔マウスがC57BL/6Jと遺伝的に同一であるにもかかわらず（図BとCのスケールを比較）、CD1がより質の高い子宮内／母親ケアを行ったためである。それにもかかわらず、両方の胎内背景において、自然なC57BL/6Jの交配で観察されたようなF1体重の表現型の再現が観察された。

出典データ

Extended Data 図7 腸内細菌叢の摂動に対する精巣の特徴の変化。
(a)ヘマトキシリン・エオジン(H&E)で染色した、コントロールの雄またはnABX6週間後の精巣精細管切片。CONおよびnABX精巣の複数の異なる精細管ステージの対応する切片を示し（ローマ数字で表示）、各ステージで予想される生殖細胞タイプの分布を示した（左）。nABX精巣では、精原細胞幹細胞プールが影響を受けた可能性を反映して、細胞タイプ区画全体の異常と消失が日常的に認められた。円形精子（RS）、伸長精子（ES）、パキテン（P）、ザイゴテン（Z）、プレレプトテン（Pl）、レプトテン（L）、ディプロテン（D）、減数分裂（M）。スケールバー： 100μm。(b)対照とnABXを6週間投与した雄の精子数。対にしない両側t検定によるp値（CON n = 29, nABX n = 33）。棒グラフは平均値を95％C.I.で示す。 (c) 個々の精巣への影響によって層別化した異常精巣の定量化（CON n = 7精巣、N = 4雄から；nABX n = 10精巣、N = 5雄から）。1個のnABX精巣を除くすべての精巣で、コントロール平均と比較して異常の平均率が高かった。棒グラフは平均値を95％C.I.で示す。 (d) コントロールとnABX処理（6週間）の精巣における総精細管直径の定量化。入れ子の両側検定なしのt検定によるp値（CON n = 854精細管、N = 4雄に入れ子；nABX n = 1061、N = 4雄）。棒グラフは中央値、ひげは5-95パーセンタイルを示す。(e) nABXで処理した独立した雄の精巣上体切片の代表的な画像。星印は異常を示す。(f）精子の形態の評価。正常な精子と頭部、中間部、尾部に異常のある精子の代表例を示す。右図は、コントロールおよびnABX処理雄における異常精子の全体的なレベルを定量化したものである。すべての値は正常範囲内であり、繁殖力は正常であるが分子ペイロードが変化していることと一致する。各オスの精子サンプルを異なる濃度で3枚のスライドスミアに調製し、1スライドあたり〜100個の精子細胞をカウントした（N = 2オス；1オスあたりn = 300個の精子細胞をカウント）。各群600精子細胞のうち、CON群では279個、nABX群では339個に1つ以上の形態学的欠陥が認められた。

出典データ

Extended Data 図8 腸内細菌叢擾乱に対する精巣の分子変化。
(a)nABXによって腸内細菌叢異常が誘導されたマウスの精巣で特異的に存在量の変化を示す代謝物の代表例。アンターゲットメタボロミクスを用いて、独立して処理した5つの精巣サンプルを分析した（CON = 5; nABX = 5）。6週間のnABXによる腸内細菌叢形成不全後の影響と、腸内細菌叢の回復過程における精巣代謝産物の動的な存在量を示す。特定の代謝物を括弧内にそのクラスとともに示す。棒グラフは中央値、ひげはデータ範囲を示す。(b)nABX曝露雄の精巣における発現量の異なる代謝物のパスウェイ解析。多重検定で調整したp値。(c)対照（青）またはnABXに曝露した雄の精巣の6週間におけるグローバルトランスクリプトームの変化の主成分分析（PCA）。(d) nABXで6週間処理した対照または生物多様性異常の雄の精巣における代謝物組成のPCA分析。(e)nABXを投与した雄の精巣におけるトランスクリプトームとメタボローム変化の両方から生じるパスウェイの濃縮の統合共同解析。(f)nABX投与雄の精巣におけるトランスクリプトームの遺伝子セット濃縮解析を用いた、コントロールに対する濃縮KEGGパスウェイ。(g)nABX後の精巣における特定の細胞タイプのマーカー遺伝子の集合的変化（Green et al, 2018）。生殖細胞マーカーは全体的にダウンレギュレートされている一方で、セルトリ細胞などの体細胞マーカーは増加している。

Extended Data 図9 生体機能不全男性における精巣のシングルセルRNA-seqとhybISS。
(a & b) 各条件についてn = 4の独立したオスからプールされた、約3,000細胞のシングルセル(sc)RNA-seq解析から、マウスの精巣で不偏分析により同定された細胞同一性クラスターのマーカー遺伝子発現を示すヒートマップ。(c)マウス精巣における特定の細胞型クラスター内の選択されたマーカー遺伝子の発現プロファイルを示すバイオリンプロット。(d) コントロールまたはnABX処理雄の精巣における細胞型特異的割合を示す単一細胞RNA-seqデータのUMAP投影。nABXを投与した雄の精巣では、減数分裂後の細胞タイプ（強調表示）が優先的に減少し、その結果、体細胞であるセルトリ細胞が割合的に濃縮されている。n=4匹の独立した雄の各条件のデータをプールした。(e) 伸長精子におけるDEGの単一細胞発現プロファイルの代表例を示すバイオリンプロット。(f)nABXに暴露したオスの各精巣細胞タイプにおける示差的発現遺伝子(DEG)。(g). 伸長精子細胞から得られた差次発現遺伝子のKEGGパスウェイ解析。多重検定で補正したq値。(h)nABXに暴露された雄（CON=5；nABX=5、精巣）の精細管におけるレプチン発現の減少を確認した単一細胞のin situシーケンス。中パネル：バーは中央値を、ひげは5-95パーセンタイルを示す。右パネル：バーは平均値、95％C.I.を示す。

ソースデータ

Extended Data 図10 父方のレプチン欠乏は精巣の表現型と主要な世代間発現変化を引き起こす。
(a)レプチンが障害されている6週齢のnABX雄（WT = 3; ob/ob = 3、精子サンプル）と同等の期間、レプチンシグナルを欠く若い（6週齢）ob/ob雄の精子数を示す棒グラフ。棒グラフは平均値をS.D.で示し、両側t検定で有意性を示した。(b-c)6週齢のob/ob雄の(b)体重と(c)精巣/体重比を示す棒グラフ。満腹度の上昇に関連して体重が増加しているにもかかわらず、ob/obの雄では精巣重量が絶対値で（図3i参照）、また体重に対する比率で依然として減少しており、生殖反応を示していることに注意。(d)コントロールまたはob/ob雄から妊娠に成功した自然交配の割合。ob/obの妊娠の欠如は、直接的な精子の欠陥、あるいは行動や身体能力の低下などの間接的な影響による不妊を示す可能性がある。これらは体外受精によって区別することができ（パネルE-F参照）、ob/ob精子からの体外受精はWT精子からのものと同様に効率的であったことから、この年齢でのob/ob自然交配の失敗は間接的影響によるものであることがわかる。(wt/obマウスを交配してob/obとwt/wtのオスを作製し、その同腹子の精子を分離してWTの卵子に受精させたところ、受精率や胚盤胞までの発育に差は観察されず、ob/obとwt/wtのオスからの精子が生存可能であることが示された。(f)E4.5（左）とE5.5（右）の胚盤胞からの単一胚トランスクリプトームの主成分分析。各胚はコントロールまたはレプチン欠損精子を用いた平行受精によって作製した。条件ごとに、独立した体外受精実験を複数回行い、独立した雄を3個ずつ使用した。父親のレプチンレベルによって、遺伝子発現パターン、ひいては表現型に再現性のある変化が観察される。(g) 初期胚におけるレプチンの発現は検出できない。このことは、レプチン欠損（ob/ob）産駒に由来するwt/ob胚における遺伝子発現に対するハプロ不全効果の可能性を否定している。その代わりに、これは精子における父系遺伝性の欠陥を指摘している。(h)レプチン欠損の父親由来の胚で発現が異なる遺伝子のGene ontologyパスウェイ。検定統計量はp値として報告されている。(i) 父親のレプチンの状態によって、胚盤胞で発現が異なる代表的な遺伝子（WT = 9; ob/ob = 10、胚盤胞）。各データ点はE4.5における個々の胚での対数発現を示す。

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Extended Data 図11 生体機能不全の男性から精製した精子におけるDNAメチル化と低分子RNAプロファイル。
(a)全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）により確認された、複数の独立したオス（各条件につきn = 5）の精子におけるDNAメチル化のグローバルレベルを、50個のCpGタイルを用いて定量化したボックスプロット。棒グラフは中央値を表し、ひげは中央値に2を掛けたIQRのプラス/マイナスを示す。 (b) nABX処理にかかわらず、精子中のDNAメチル化パターンが非常に再現性が高いことを示すゲノムトラックの例。各データポイントは、50CpGタイル全体のメチル化率を表す。灰色の領域はメチル化過剰ゲノムゾーンを示す。(c)有意な差メチル化領域（DMR）を強調したボルケーノプロット。21のDMR遺伝子座が同定されたが、その効果の大きさは控えめで、主にCpGの海岸に重なっている。(d)代表的なDMR（緑色）におけるDNAメチル化の変化を、深読みに敏感なロジスティック回帰を用いて示したゲノムトラック（p < 0.05 & >20% abs.変化）。パーセンテージは各精子サンプルのDMRにわたるDNAメチル化レベルを示す。データポイントは、各スライディング50CpGタイルにおけるメチル化を示す。(e) コントロール精子とnABX処理精子におけるゲノムインプリンティング領域でのDNAメチル化を示す散布図。父方と母方のインプリントを示す。(f)nABX雄の精製精子において、対照精子と比較して発現が1倍変化した低分子RNAを示す棒グラフ。(tRNA-Gly-GCC-2（およびtRNA-Gly-GCC-4）は成熟精子中の全RNA量の主要な構成要素であるため、その発現における比較的小さなfold変化の差は、精子頭部の絶対コピー数の大きな変化を構成する。各サンプルは3反復にプールされたn = 9個の男性サンプルである。挿入図は、各スモールRNAクラスの全体的な存在量（リードの割合）である。 (h) (B)の拡大図。miR-141とLet-7がマイクロRNAとpiRNAクラスの中で非常に豊富であることがわかる。(i) nABX曝露雄の精製精子を用いたsmall RNA-seqデータセットからのトップヒット（miR-141-3pとtRNA-Gly-GCC）のTaqMan qPCR定量。棒グラフは平均値とS.D.、有意差は片側t検定。精子サンプルは、small RNA-seqに使用したサンプルとは独立した処理で得られた（CON n = 4; nABX n = 4）。

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Extended Data 図12 父親のnABX曝露は、近接胎盤において分子的および生理学的応答を誘導する。
(a) コントロールまたはnABX処理した父親が産んだ独立した産仔の胎盤トランスクリプトームの主成分分析。(b)コントロールとnABXを投与した父親由来の胎盤(E13.5)における発現差のある遺伝子(DEG; 黄土色は発現低下、緑色は発現上昇)を示すボルケーノプロット。(c)異なる産仔の独立した胎盤の間で、父親の微生物状態に依存した遺伝子発現の一貫した変化を示すヒートマップ。(d) 内皮細胞のマーカーであるIB4でE13.5胎盤を染色し、迷路内の胎盤脈管形成を明らかにした。nABX由来の胎盤組織は、異常な脈管形成（矢印）と総脈管形成の減少を示した（右図）。(e)E13.5胎盤における絨毛細胞（矢印は不在を示す）の有病率を決定するための免疫蛍光染色。(f）CONまたはnABX雄由来のE18.5胎盤における胎盤梗塞（病変、矢印）の数と大きさの増加。(g) E18.5胎盤をIB4内皮細胞マーカーで染色し、迷路帯内の胎盤脈管形成障害を示す（矢頭は正常血管、矢印は異常を示す）。各群について、独立した父親（CON = 3; nABX = 3）が産んだ3つの仔の胎盤を調べた。パネルd-fのデータはそれぞれ胎盤サンプル（CON n = 迷路の30サブ領域、N = 5胎盤（3産仔）；nABX n = 迷路の27サブ領域、N = 5胎盤（3産仔））から収集され、各胎盤から迷路の異なるサブ領域をカバーする5つの組織切片が分析された。これらのサンプルはFig. 4とは独立した産仔であることに留意されたい。棒グラフは平均値（95％C.I.付き）。データ解析には、対にしないStudentの両側t検定を用いた。スケールバー： 50 μm（d,e）、20 μm（f）、500 μm、20 μm（g）。胎盤血管網と絨毛細胞数はQUPath-V0.2.3を用いて解析した。

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出典データ図1
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ拡張データ図1
ソースデータ拡張データ図2
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Argaw-Denboba、A.、Schmidt、T.S.B.、Di Giacomo、M.ら、父親マイクロバイオームの摂動は子孫のフィットネスに影響を与える。Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07336-w

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受領
2021年06月08日

受理
2024年3月20日

出版
2024年05月01日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-024-07336-w

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ネイチャー (Nature) ISSN 1476-4687 (online) ISSN 0028-0836 (print)

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