ハザ部プレボテラがマウスに定着するには食事由来の微生物がアクセス可能な炭水化物を必要とする

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論文|42巻11号113233頁2023年11月28日
ハザ部プレボテラがマウスに定着するには食事由来の微生物がアクセス可能な炭水化物を必要とする

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01245-7?rss=yes&utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

レベッカ・H. ゲルマン
マシュー・R・オルム
ニコラス・テラポン
スティーブン・K・ヒギンボトム
ジャスティン・L・ソネンバーグ
エリカ・D・ソネンバーグ 5
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脚注を表示オープンアクセス掲載:2023年10月31日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113233

ハイライト

ハザ族の糞便サンプルからバクテロイデス属とプレボテラ属が分離され、塩基配列が決定された。

Bacteroides属はPrevotella属よりも粘液分解能力をコードしている。

バクテロイデスとは異なり、プレボテラのコロニー形成には食物繊維が必要である。

バクテロイデスは低植物繊維食でプレボテラに勝る。
まとめ
工業化によって腸内細菌叢は変容し、バクテロイデスに比べてプレボテラの有病率は低下した。ここでは、プレボテラが多いタンザニアのハザ狩猟採集民の微生物叢からバクテロイデス株とプレボテラ株を分離した。我々は、植物由来の微生物がアクセス可能な炭水化物（MAC）が、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）の生体内での持続に必要であるが、バクテロイデス・テタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）の生体内での持続には必要でないことを示した。炭水化物代謝遺伝子の含量、発現、in vitroでの増殖の違いから、HadzaのPrevotella株は植物の炭水化物の分解に特化しているのに対し、HadzaのBacteroides分離株は植物と宿主由来の炭水化物の両方を利用していることが明らかになった。直接競合する場合、P. copriはB. thetaiotaomicronの存在下でコロニー形成を維持するために植物由来のMACを必要とする。プレボテラが植物由来のMACに依存し、バクテロイデスが宿主の粘液糖質を利用する能力を持つことは、低MACの工業化食を摂取する集団におけるプレボテラの有病率の減少を説明できるかもしれない。
図解抄録
図サムネイルfx1
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キーワード
ヒト腸内細菌叢
マイクロバイオーム
CAZyme
グリコシド加水分解酵素
多糖リアーゼ
ムチン
工業化
食物繊維
ダイエット
プレボテラ
バクテロイデス
研究テーマ
CP: 微生物学
はじめに
工業化されたライフスタイルは、高度に加工された食品の消費、抗生物質の高い投与率、帝王切開による出産、生活環境の衛生化、動物や土壌との接触の減少によって定義され、これらすべてがヒトの腸内細菌叢に影響を及ぼす可能性がある1、 すなわち、工業化されていない集団では優勢で豊富であるが、工業化された集団では減少または欠乏している、あるいはその逆である。9 工業化された微生物叢は、かつて優勢であった分類群が消滅することによる微生物の絶滅と、優勢でない分類群または新しい分類群の拡大の両方の産物であるようだ。
工業化食は非工業化食とは大きく異なり、遠位消化管の微生物にとって主要な代謝インプットである微生物がアクセス可能な炭水化物（MAC）の量が減少している10,11,12。食餌性MACsの変化は微生物の相対量を変化させ、炎症や腸内病原体への感受性を高める可能性がある14,18,19。マウスモデルでは何世代にもわたって食餌性MACsが不足し、ヒトでは米国に移住するにつれて分類群が失われる20。
2,3,21これらの属はともにバクテロイデス門に属し、哺乳類宿主にコロニー形成することが知られており、ヒト腸内細菌叢のかなりの部分を占めている。29,30,31。腸内プレボテラ属の特性解析は、コロニー形成、特に無菌マウスの単コロニー形成という課題によって制限されてきた。今回我々は、このような障壁を克服し、無菌マウスモデルにおいて、食餌とプレボテラ属菌（Prevotella copri）の存在量との間に因果関係があることを明らかにした。
産業個体群におけるプレボテラ属菌の有病率の低下は、個々の微生物群における相対的な存在量の低下と関連している可能性が高い32。個体における細菌分類群の存在量が低下すると、母親から乳児への感染の可能性が低下する1,5。ヒトの腸内で優勢なプレボテラ属の一種であるP. copriの特定の株の存在量と有病率は、宿主のライフスタイル、特に食餌によって集団間で異なる。
結果
ハッザ人の微生物叢から得られたバクテロイデスおよびプレボテラゲノムは、生活様式によって有病率が異なる
産業化されていない生活様式の集団から採取したプレボテラとバクテロイデスを比較するために、13人のハッザ人から採取した便サンプルから6株のバクテロイデス株と7株のプレボテラ株を分離し、塩基配列を決定した。単離したゲノムは、MiSeqで生成したショートリード（146 bp）とナノポアで生成したロングリード（10-100 kb）の両方を用いてアセンブルした（表1）。
表1使用菌株
ゲノムサイズ (bp) ゲノムサイズ (Mb) 遺伝子数 コンティグ数
Bt H-2209 Bacteroides thetaiotaomicron H-2209 ハザヒト糞便 6,119,319 6.119319 4,722 1
Bt H-2622 バクテロイデス テタイオタオミクロン H-2622 ハザヒト糞便 6,037,034 6.037034 4,686 1
Bc H-1617 バクテロイデス・カッカエ H-1617 ハザ人の糞便 5,112,756 5.112756 4,360 1
Bf H-2631 バクテロイデス・フラジリス H-2631 ハザヒト糞便 4,877,774 4.877774 4,622 3
Bo H-1813 バクテロイデス・オバタス H-1813 ハザヒト糞便 6,715,646 6.715646 5,536 4
Bo H-2495 バクテロイデス・オバータス H-2495 ハザヒト糞便 6,789,892 6.789892 5,086 1
Bt VPI 5482 バクテロイデス・テタイオタミクロン VPI 5482 参照ヒト糞便、国籍不明 6,260,000 6.26 5,108 1
Bc ATCC 43185 バクテロイデス・カッカエ ATCC 43185 参照ヒト糞便、テキサス州 5,280,000 5.28 4,399 1
Bf NCTC 9343 Bacteroides fragilis NCTC 9343 （ヒト盲腸膿瘍を対象としたヒト由来レファレンス） 英国 5,190,000 5.19 4,194 2
Bo ATCC 8483 Bacteroides ovatus ATCC 8483 （ヒト由来糞便、国籍不明） 6,470,000 6.47 4,896 1
Pc DSM 18205 Prevotella copri DSM 18205 基準ヒト糞便、日本 3,510,000 3.51 2,968 1
Pc H-2379 Prevotella copri H-2379 Hadzaヒト糞便 4,350,632 4.350632 3,611 1
H-2383 プレボテラ・コプリ H-2383 ハザ人の糞 4,506,031 4.506031 3,836 1
H-2446 プレボテラ・コプリ H-2446 ハザ人の糞便 4,057,255 4.057255 3,383 3
H-2477 プレボテラ・コプリ H-2477 ハザ人の糞便 4,111,062 4.111062 3,405 1
H-2489 プレボテラ・コプリ H-2489 ハザ人の糞便 4,115,122 4.115122 3,563 1
H-2497 プレボテラ・コプリ H-2497 ハザ人の糞便 4,081,238 4.081238 3,548 1
H-2632 プレボテラ・コプリ H-2632 ハザ人の糞便 3850424 3.850424 3251 4
Pc N-01 Prevotella copri N-01 非ハザ人の糞便、米国 4,057,390 4.05739 3,880 1
Pc YF2 Prevotella copri YF2 基準不明 3,860,000 3.86 3,060 2
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ゲノム分類データベース（GTDB）バージョンr207を用いて、これらの新たに分離された菌株の分類を評価した（図1A）。すべてのBacteroides分離株は既知の種に属する： Bacteroides ovatus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides caccae、Bacteroides fragilisである。Prevotellaのうち3株はPrevotella sp015074785とPrevotella sp900551275という既知種に属し、残りの5株はGTDBによると新規種であった。この発見を検証するために、我々のプレボテラ分離株、GTDBの最も近縁な代表種の代表株、およびGTDBのすべてのP. copri代表ゲノムを用いて系統樹を作成した（図S1A；表S1）。私たちの分離ゲノムは、最も近縁な代表ゲノムとの系統学的距離が、代表ゲノム同士の系統学的距離とほぼ同じであることが観察され、新規種としての特徴を裏付けている。GTDBとは別に、Prevotella属の広範なゲノム多様性を明らかにするための取り組みが行われている34。クレード間の遺伝的分岐が10％を超える4つのP. copriサブグループが提案されているが、本研究で回収された8つのHadza Prevotella株はすべてクレードAに属している（図S1B）。
図サムネイルgr1
図1ハドザ菌のバクテロイデス株とプレボテラ株は、これまでに配列決定された分離株と関連しており、集団によって有病率が異なる。
キャプション
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ヒト集団におけるこれらのゲノムの有病率を理解するために、ハッザ族の成人と乳幼児、採食生活者（チェパン）、最近の農耕生活者（ラウテ、ラジ）、長期農耕生活者（タル）、産業生活者（カリフォルニア）を含む生活様式勾配上に住むネパールの4つの集団におけるプレボテラ菌とバクテロイデス菌の有病率を比較した（図1B；表S2）。これらの集団を選んだ理由は、生活様式が多様であることと、メタゲノム配列決定深度が非常に深く、1サンプルあたり平均23Gbpであったためである3,4。逆に、ハザ族から分離されたものを含むほぼすべてのバクテロイデスゲノムは、カリフォルニアのサンプルでより多く見られる。バクテロイデス属とプレボテラ属の有病率に関連する明らかなライフスタイルの変化は、産業的ライフスタイルのどのような側面がこのような変化を促したのかという疑問につながる。
P. copriの持続性には食事性MACが必要である。
ハッザ族の食生活は、採食した塊茎、ベリー類、バオバブから採れるMACsを豊富に含んでいる。無菌（GF）マウスにHadza B. thetaiotaomicron (Bt) H-2622またはHadza P. copri (Pc) H-2477をコロニー形成させた。マウスは高MAC食で7日間維持した後、MACを含まない食餌（MACなし）、高脂肪／低MAC食（Western）、または高MAC食で7日間維持のいずれかに切り替えた（図2A）。高MAC食でのベースライン時のBt H-2622のコロニー形成密度（糞便中109コロニー形成単位[CFU]/mL）は、3つの食餌条件すべてで維持された（図2B）。Pc H-2477 は、高MAC食ではコロニー形成の程度が低く（0日目に107 CFU/mL）、Western食またはnoMAC食に切り替えると急激に減少し、食餌切り替え後7日目には糞便中CFUが検出されなくなった（図2C）。MAC非存在下でPc H-2477が検出されな かったことは、この単結合状態で他の微生物との競合がな かったことを考えると、特に顕著であった。私たちの知る限り、これは食餌の変化により単結合状態で株が明らかに根絶した最初の例である。他の2つのP. copri株（Hadza Pc H-2497と、アフリカ出身の個体から分離された非Hadza株Pc N-01）も、食餌性MACの非存在下でin vivoで消失しており（図S2AおよびS2B）、P. copriのin vivoでの生存は、食餌性MACの存在に依存していることを示している。
図サムネイルgr2
図2BtとPcのコロニー形成は食餌依存的に異なる
キャプション
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ハザPcとBtがin vivoで採用した遺伝子発現を測定するために、高MAC食を与えたPc H-2477またはBt H-2622を単コロニー化したマウスの糞便内容物から得られた転写プロファイリングデータを、ペプトン酵母グルコースブロス（PYG）でのin vitro増殖と比較して解析した。Bt H-2622とPc H-2477はともに、高MAC食条件下でin vivoで多数の遺伝子をアップレギュレートした。Bt H-2622およびPc H-2477ゲノムの遺伝子のそれぞれ18％および13％が予測される炭水化物利用タンパク質をコードしているにもかかわらず、in vitroに比べてin vivoでアップレギュレートされた遺伝子の86％（Bt H-2622）および65％（Pc H-2477）が炭水化物利用をコードしていた（p < 4e-12 for Bt、 Pcではp < 5e-13、フィッシャーの正確検定）、糖質利用がこれらの生物のin vivoでの主要な代謝機能であることを示している（図2D）。
グリコシド結合を切断するCAZymes、グリコシドヒドロラーゼ（GHs）および多糖リアーゼ（PLs）を比較すると、Bt H-2622およびPc H-2477はともに、高MAC食を与えたin vivoではin vitroよりも多くのCAZymesを発現することが明らかになった（Pc, 71/6 CAZymes significantly expressed in vivo/in vitro; Bt, 244/55 CAZymes significantly expressed in vivo/in vitro）（図S2CおよびS2D）。しかしながら、Bt H-2622はPc H-2477と比較して、動物由来の糖質利用に専念するGHとPLの割合をより多くアップレギュレートした（図2E）。具体的には、高MAC食条件下でin vivoでは、Bt H-2622はコードされる22個の粘液標的GHのうち8個（GH18 10個のうち3個；GH20 12個のうち5個）をアップレギュレートするのに対し、Pc H-2477はGH18をコードせず、GH20を1個のみコードし、これは高MAC食条件下ではアップレギュレートされない（図2E、S2C、およびS2D）。粘液糖質を標的とすることに加えて、Bt H-2622は97個の植物標的GHおよびPLのうち40個もアップレギュレートするのに対し、Pc H-2477は高MAC食条件下で植物標的GHおよびPLの38個すべてをアップレギュレートした（図2E）。
in vitro条件下と比較すると、無MAC飼料では、Bt H-2622はさらに2つのGH20（高MAC飼料でアップレギュレートされた他の8つのムチンCAZymとともに）と27の植物標的GHおよびPLをアップレギュレートした（図2EおよびS2E）。言い換えると、高MAC食条件下では、Btは植物、動物、およびその他の炭水化物に関連するCAZymesを同等にアップレギュレートする（動物48、その他45、植物46）。一方、MACなし食条件下では、Btは動物に関連する炭水化物の利用に関連するCAZymesの数と割合をより多くアップレギュレートする（動物51、その他27、植物35）。Pc H-2477はMAC無添加の餌を与えたマウスにはコロニー形成しないため、この条件でのプロファイリングは行わなかった。無MAC食と高MAC食を比較すると、Bt H-2622は3つのGH（そのうち2つはムチンを分解するGH18）のみをアップレギュレーションした（図S2F）17。
これらのデータを総合すると、生体内ではBt H-2622は粘液と植物由来の炭水化物の両方に依存していることがわかる。食餌から植物性炭水化物が除去されると、Bt H-2622は粘液分解機構をさらにアップレギュレートする。一方、Pc H-2477の粘液分解能力は最小限のため、MACがない場合にはコロニー形成を維持することができない。
Hadza BacteroidesとPrevotellaの工業化株の炭水化物分解能力の違い
ハザPcとバクテロイデス分離株は、対応する種の基準株とGHとPLの数と予測される機能が類似している（表S3；図3）。GHsとPLsの教師なしクラスタリングから、Hadza株は、同じ種のゲノム間の遺伝的類似性と一致するように、タイプ株の対応する株とクラスタリングしていることが明らかになった；各ゲノム中のCAZymesのセットは、同じ種に割り当てられたゲノムに見られるCAZymesと最も類似している（図3A）。Hadza株と非Hadza株でコードされるGHとPLの総数を比較すると、これらの遺伝子の総数と基質特異性の分布は、同じ種の株間で類似していた（図3Bと3C）。HadzaのPc CAZymesの比較は、CAZyデータベースでアノテーションされたPcゲノムの数が限られている（この発表の時点では2つしか存在しない）ため、限界がある。現在さらに7つのPcゲノムを追加しており、より多くのPcゲノムが公開されれば、CAZymeレパートリーのバリエーションが増えるかもしれない。
図サムネイルgr3
図3バクテロイデス属とプレボテラ属のGHとPLの分布の違い
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ハドザ菌のバクテロイデス株とプレボテラ株は非ハドザ菌の糖質分解能力を反映しているが、バクテロイデス株とプレボテラ株には大きな違いがある。ゲノムサイズで補正した場合でも、バクテロイデス属はプレボテラ属より多くのGHとPLをコードしている（バクテロイデス属の平均GH/PLは251/21、プレボテラ属は101/5、Welchの2標本のt検定、p = 0.0056）（表S3；図3B）。植物性炭水化物または動物性炭水化物を標的とすると予測されるバクテロイデス属のGHとPLの割合は同等である（それぞれ平均34％と37％）が、プレボテラ属がコードする炭水化物分解は動物性炭水化物よりも植物性炭水化物に偏っている（それぞれ平均44％と19％）（図3C）。Bacteroides属はまた、より幅広いGHおよびPLファミリーをコードしており（ゲノムあたり平均68のCAZymeファミリー）、一方Pc属の分離株はゲノムあたり平均40のCAZyファミリーをコードしている（図3A）。すべてのHadza Bacteroides分離株は11-14個のGH20と1-13個のGH18 CAZymesを持つが、Hadza Prevotella分離株は1個か2個のGH20しか持たず、1個のGH18を持つのはPc H-2497だけである（図3D；Wilcoxon検定、p＝4e-4）。
ハザ・バクテロイデス（Hadza Bacteroides）およびプレボテラ（Prevotella）分離株のCAZyme含量は、ハザ以外の分離株と類似している。Hadza Bacteroides分離株は、Hadza Prevotella分離株と比較して、植物と動物由来の炭水化物の両方を含む幅広い基質分解能力を持つだけでなく、全体としてより多くのGHとPLを含んでいる。ハザ・バクテロイデス株とプレボテラ株のこの違いは、ハザ以外の株や産業生活微生物群に見られるものと同様であり、プレボテラのニッチはバクテロイデスに比べて植物性炭水化物への依存度が高いことを示唆している38,39。
食餌性MACはBt存在下でPcのコロニー形成を維持するのに十分である。
ハザ・バクテロイデス（Hadza Bacteroides）およびプレボテラ（Prevotella）分離株が、植物および粘液由来の炭水化物を利用する能力が異なるかどうかを調べるため、植物炭水化物イヌリン、ブタ胃ムチン糖鎖、ブタ腸ヘパリン、またはフルクトースを唯一の炭素源として含む培地で、ハザ・バクテロイデス（Hadza Bacteroides）およびプレボテラ（Prevotella）分離株を培養した。しかし、ムチン存在下での増殖は属によって異なっており、ほとんどのBacteroides分離株はムチン上で増殖するが、P. copri分離株は増殖しない（図4A）。これらのデータは、Pcゲノムにムチンを分解する能力がないこと、および宿主が主要な炭水化物源である場合、生体内でPcのコロニー形成が失われることと一致している。
図のサムネイルgr4
図4P. copriのコロニー形成を維持するにはMACの再導入で十分である。
キャプション
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高脂肪／低MAC西洋食およびMACなし食（図2C）で観察されたPc H-2477のコロニー形成の消失が、食餌由来のMACの欠乏に起因しているかどうかを調べるために、Pc H-2477を単コロニー化したマウスに高MAC食を与えた後、高MAC食のMAC含量に一致するように、唯一の発酵性炭水化物として34重量％のイヌリンを含むカスタム食に切り替えた（カスタム食は結合剤としてゼラチンを使用し、"-g "で示されている； イヌリン-g）または無MAC食（no-MAC-g）であった。 41 no-MAC-g食ではPc H-2477のコロニー形成は維持されず、株は3日以内に検出されなくなった（図4B）。しかし、Pc H-2477はイヌリン-g食の存在下でも、高MAC食で観察されたのと同レベルのコロニー形成を維持した（図2Cおよび4B）。これは、Pc H-2477のin vivoコロニー形成にMACが必要であることと一致している。
食餌性MACが、マウスにPcとBtを一緒にコロニー形成させ たときの相対的存在量にどのような影響を与えるのか、私 たちは興味津々であった。GFマウスにPc H-2477とBt H-2622を共培養し、高MAC食を7日間与えた後、高MAC食を維持するか、無MAC-g食に切り替えるか、またはイヌリン-g食に切り替えて2週間飼育し、その後1週間はすべてのマウスが高MAC食を摂取した（図4C）。食餌切り替え前（0日目）、マウスはPc H-2477とBt H-2622の両方を保有しており、Pcの存在量はBtより有意に低かった（Pc index = 1.9e-4; Bt index = 9e-4; 対にしないt検定, p = 0.002; n = 15）（図4Dおよび4E）。しかし、MAC-g無添加の飼料に切り替えてから7日後には、Pc H-2477は検出されなくなったが、Bt H-2622のコロニー形成は変わらなかった。イヌリン-g飼料に切り替えた場合、Pcは7日後にはまだ検出可能であったが、14日後には検出できなくなり、イヌリンがMAC無添加飼料以上にPcをサポートしたことを示している（図4D）。Btのコロニー形成はイヌリン-g食で安定したままであったが、14日目には高MAC食と比較してわずかではあるが有意な増加がみられた（図4E）。14日目にマウスを高MAC食に戻したところ、イヌリン-g食を与えたマウスは、ベースラインおよび実験期間を通して高MAC食を与えたマウスと同等のPc H-2477の相対存在量を回復した。しかし、無MAC-g食から高MAC食に切り替えたマウスでは、Pc H-2477 DNAは検出されないままであった。Btレベルは、高MAC食を与えたマウスに比べ て21日目にわずかに減少したものの、無MAC食の条件 では一定であった（図4E）。これらのデータは、Bt存在下でのPcのコロニー形成に食餌性MACが必要であることと一致し、高MAC食（小麦、トウモロコシ、オート麦、アルファルファ由来）に含まれる多様な炭水化物が、単一MAC食（イヌリン）よりもPcのコロニー形成をよりよくサポートすることを示している。Btによるイヌリンの消費はin vivoではわずかであることから（図4A）、イヌリン-g食の条件下でPcのコロニー形成が減少したことは予想外であった（図4D）。Pcは宿主から供給される炭水化物にアクセスするためにBtとの競争に直面している可能性（図2E）、あるいはBtのコロニー形成が環境を変化させ、Pcの存在量がイヌリン-g食では影響を受けるが、高MAC食では影響を受けない可能性がある（図2E）。我々のデータはさらに、MACsを長期間摂取しないと、食餌性MACsを再導入したときにPcが存在量を回復する能力が制限されることを示している。
考察
宿主のライフスタイルに基づくバクテロイデス優勢微生物叢かプレボテラ優勢微生物叢かのトレードオフはよく説明されているが、その根拠はよくわかっていない8,42。
ここで我々は、バクテロイデス（Bacteroides）とプレボテラ（Prevotella）のハッザ（Hadza）分離株が、ゲノム全体の平均ヌクレオチド同一性と炭水化物利用において、ハッザ以外の分離株と劇的に異なるわけではないことを証明した。このことは、生活様式による相対的な存在量と有病率の違いは、集団特異的な菌株自体の固有の性質によるものではなく、環境の違いによるものであることを示唆している。さらに我々は、プレボテラがコロニー形成を維持するためにはMACが不可欠であることを示した。たとえ唯一の微生物であっても、食餌性MACを除去するとプレボテラは根絶されてしまう。一方、バクテロイデス属細菌は、植物由来の炭水化物と宿主由来の炭水化物の両方を利用する能力があるため、MACの少ない工業化飼料でもコロニー形成を維持できる。われわれのデータは、食餌性MACsが存在する非同胞モデルにおいて、ハザ菌の微生物叢に見られるように、ハザ菌バクテロイデス（Bacteroides）とプレボテラ（Prevotella）が共存できることを示している。しかし、食餌性MACsを除去するとプレボテラが急激に減少し、MACsを再導入しても回復しない。イヌリンという単一のMACが食事に含まれていれば、コロニー形成の中間レベルを維持するのに十分であり、MACをより完全に摂取できるようになると回復した。これらのデータは、ハッザ族におけるプレボテラ（Prevotella）の存在量の季節的パターンを彷彿とさせる。
これらのデータを総合すると、工業化以前のヒトの微生物叢はバクテロイデス属とプレボテラ属の両方を保有していたというモデルと一致する。食生活が高MACの採食食品から低MACの工業生産食品へと移行するにつれて、プレボテラ属細菌の存在量と有病率は減少し、一部の個体では絶滅に至った。しかし、プレボテラ属菌は、関節リウマチやインスリン感受性など、否定的な結果にも関連している45,46。菌株レベルの変異、微生物叢の他のメンバーの違い（すなわち、文脈特異的効果）、および宿主の免疫状態の違いが、これらの矛盾を説明している可能性がある。高MAC食は健康全般に広く有益であるが、プレボテラの存在がこれらの有益性に影響するかどうかは不明である47,48,49,50。さらに、工業化された微生物叢におけるプレボテラの消失とバクテロイデスの増加により、ヒトの生理学にどのような影響があるのかは、依然として重要な問題である。
研究の限界
この研究以前には、ヒト由来のPcの分離株はほとんど研究されていなかったため、今回分離された株と既存の株との比較は限られていた。より多くのPc分離株が入手できるようになれば、本研究で行った比較を更新することが重要になるであろう。さらに、Pcのコロニー形成がMAC無添加の餌に反応して減少することを示したが、このコロニー形成の減少は非常に急速に起こるため、この餌条件下での転写データを取得することはできなかった。このデータセットがあれば、高MAC食のPcコロニー形成マウスや無MAC食のBtコロニー形成マウスとの比較に役立ったであろう。さらに、本研究では、Pcコロニー形成に対する食餌の影響を測定した。
STAR★方法
主要リソース 表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
生物学的サンプル
ハザ族のヒト糞便サンプル Smits et al.
重要な市販アッセイ
MasterPure グラム陽性 DNA 精製キット LGC Biosearch Technologies Cat#NC9197506
QIAquick PCR 精製キット Qiagen Cat#28106
MinION フローセル

FLO-MIN106 ナノポアキット SQK-LSK109

バーコードキット EXP-NBD104
MiSeq イルミナ https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html
Epoch2 マイクロプレートリーダー BioTek https://www.biotek.com/products/detection-microplate-readers/epoch-2-microplate-spectrophotometer/
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Qiagen Cat#12855-50
Brilliant III、Ultra Fast SYBR Green QPCR マスターミックス Agilent Cat#600883
CFX Connect リアルタイム PCR 検出システム Bio-Rad Cat#1855201
RNeasy PowerMicrobiome キット Qiagen Cat#26000-50
RiboMinus™トランスクリプトーム単離キット、バクテリア Invitrogen Cat#K155004
TruSeq® Stranded Total RNA Library Prep ヒト／マウス／ラット イルミナ Cat#20020597
NovaSeq SPフローセルIllumina NovaSeq 6000システム
寄託データ
ハザ16Sシーケンス Smits et al.
メタゲノムリード： Hadza、ネパール、カリフォルニアの集団 Carterら、20234 N/A
全ゲノム配列： Bacteroides および Prevotella 分離株 この研究 NCBI BioProject PRJNA1015720: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/1015720
RNAseqデータ 本研究 Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.7651179
バクテロイデスおよびプレボテラ参照ゲノム GenBank NCBI
実験モデル 生物／株
P. copri分離株 本研究 N/A
バクテロイデス属分離株 本研究 N/A
プレボテラ・コプリ DSM 18205 DSMZ Cat#DSM 18205
Bacteroides ovatus ATCC 8483 ATCC Cat#8483
Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 ATCC Cat#29148
バクテロイデス フラギリス NCTC 9343 ATCC Cat#25285
Bacteroides caccae ATCC 43185 ATCC Cat#43185
マウス Swiss Webster、胚芽フリー Taconic Cat#SW-F GF
オリゴヌクレオチド
P. copri フォワードプライマー： hpc_gyrB_03_F1 本研究 CACCCACCATGTAAACCGCCAG
P. copri reverse primer: hpc_gyrB_03_R this study TGTACCGACATCGAAGTTACCATCAACGAAG
B. thetaiotaomicron フォワードプライマー：HBT05_03F 本研究 GCAGGCACGGCAGTATCAGTATCG
B. thetaiotaomicronリバースプライマー：HBT05_03R 本研究 CGCCACGGATAGGCAGACATTTGTCA
細菌16Sフォワードプライマー：16S rRNA 515F Paradaら、199851 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′．
細菌16Sリバースプライマー：16S rRNA 806R Paradaら，199851 5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′．
ソフトウェアとアルゴリズム
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seriation version 1.4.1 Hahsler et al., 200878 https://www.rdocumentation.org/packages/seriation/versions/1.4.1
Prism 9 for macOS グラフパッドソフトウェア https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/citing_graphpad_prism.htm
その他
ヘパリンナトリウム塩（ブタ腸粘膜由来）Sigma H3393-50KU
D-グルコース、無水 Alfa-aesar aaa16828-0e
D-Fructose 99% Alfa-aesar AAA17718-30
イヌリン（チコリ） Beneo Orafti®HP
カイバエ プレミアムバオバブフルーツパウダー アマゾン N/A
豚胃由来ムチン、III型、シアル酸結合 0.5-1.5%、部分精製粉末 Sigma M1778-100G
バクテロイデス胆汁酸エスクリン（BBE）寒天平板 Anaerobe Systems AS-144
カナマイシン・バンコマイシン添加ブルセラ菌血液寒天培地（LKV）プレート Anaerobe Systems AS-142
ブレインハートインフュージョン寒天培地（BHI） BD ダイアグノスティックス DF0418177
除細動ウマ血液止血剤 DHB500
96ウェル、細胞培養処理、平底マイクロプレート Falcon Cat#353072
炭水化物入り酵母カシトン脂肪酸ブロス - YCFAC Broth Anaerobe Systems AS-680
MAC飼料なし Teklad カスタム飼料、グルコースのみ炭水化物（93G、Irrad） Envigo TD.150689
西洋食 テクラッドカスタムダイエット、調整脂肪食 Envigo TD.96132
高MACチャウ LabDiet® JL Rat and Mouse/Auto 6F LabDiet 5K67
AIN-93G ベーサルミックス（CHO、セルロースフリー） Envigo TD.200788
ゼラチン（ウシ）Sigma G9391
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リソースの有無
連絡先
リソースに関するすべての情報およびリクエストは、リードコンタクト（Erica Sonnenburg, erica.sonnenburg@stanford.edu）までご連絡ください。
材料の入手可能性
本試験では新規の試薬は使用しなかった。
実験モデルおよび研究参加者の詳細
細菌培養
本研究で単離されなかった細菌は、DSMZ（P. copri DSM 18205）またはATCC（他のすべての参照株）から購入した。グリセロールストックは、10％脱血ウマ血液（BHIBA）添加Brain Heart Infusion寒天培地上で打ち抜き、37℃で24～48時間嫌気培養した。バクテロイデスおよびプレボテラ株の増殖および培養はすべて、87％N2、10％CO2、3％H2を含むコイ嫌気チャンバー内で嫌気的に行った。
マウスの飼育
すべてのマウス実験はStanford Institutional Animal Care and Use Committeeに従って行われた。マウスは周囲湿度20.5℃で12時間の明暗サイクルに維持され、飼料は自由摂取とし、すべての実験期間中はフレキシブルフィルムのグノトビオティックアイソレーター（クラスバイオロジカルクリーン）で維持した。gnotobiotic実験にはSwiss-Websterマウスを用い、無菌マウスの無菌性は16S PCR増幅と糞便の嫌気培養で確認した。サンプルサイズは、産仔数に基づいて選択され、実験内で性別と年齢をコントロールした。研究者はサンプル採取中、盲検化されていない79。
先住民との共同作業に関する声明
先進国の人々のみを反映し利益を得るのではなく、すべての人間集団を正確に反映する科学的知識を得るためには、先住民集団を合法的、倫理的、非搾取的な方法で研究に参加させることが必要である25,80。サンプルは、タンザニア政府、国立医学研究所（MR/53i 100/83、NIMR/HQ/R.8a/Vol.IX/1542）、タンザニア科学技術委員会（Tanzania Commission for Science and Technology）の許可を得て、タンザニアの科学者の協力を得て収集した。タンザニア国立医学研究所との試料移転契約では、収集された試料は学術目的のみに使用されることが明記されている。ハザ族にこれらのプロジェクトの結果を伝えるための、私たちの現在進行中の取り組みと、それに従った同意の実践についての詳細は、Carter et al.4とOlm et al.5を参照されたい。
方法の詳細
糞便サンプルからの菌株分離
菌株分離用のサンプルは、バクテロイデス属またはプレボテラ属のいずれかの16S存在量に基づいて、以前に報告されたサンプルから選択した6。すべての分離は、5％グルコースまたはバオバブ粉末を加えたYCFA寒天培地を用い、嫌気条件下で行った。1μLの凍結糞便を1枚の寒天平板上に打ち込んだ。最初のプレートから目に見えるコロニーを、細菌16Sプライマーを用いたコロニーPCRで同定し、BBEおよびLKVプレート（Anaerobe Systems社製）に再プレートした。PCR産物はQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）を用いて精製し、Elim Biopharm社でサンガー配列決定を行った。得られた配列は、nucleotideBLASTを用いて同定した。82 バクテロイデス属またはプレボテラ属と95%以上の同一性を持つと予測されたコロニーは、純粋な培養を確実にするために、それぞれBBEプレートまたはLKVプレートでさらに2回再打撃を行った。グリセロールストックは、単一コロニーの液体培養液をPYGで一晩培養し、50%グリセロール、50%PBS溶液を1:1の割合で混合することで作製した。
全ゲノム配列決定
MasterPure Gram Positive DNA Purification Kitを用いて、24時間培養した単離株からゲノムDNAを抽出した。ロングリードシーケンスはNanopore MinION（フローセルFLO-MIN106、ライゲーションシーケンスキットSQK-LSK109、バーコードキットEXP-NBD104）を用いて行い、ショートリードシーケンスはIllumina MiSeqを用いて行った。ナノポアベースコールは、Guppyバージョン3.4.2mを用いて、コマンド "guppy_basecaller -r -i raw_fast5/--flowcell $flowcell --kit $kit -x auto --compress_fastq --gpu_runners_per_device 8 -q 0 --chunks_per_runner 4096 "を用いて行った。ショートリードの配列品質はFastqcを使って "fastqc --nogroup -q "コマンドで評価し、アダプターはBBToolsを使って "bbduk.sh -Xmx2g -eoom ref = adapters, phix threads = 8 ktrim = r k = 23 mink = 11 edist = 2 entropy = 0.05 tpe tbo qtrim = rl minlength = 100 trimq = 30 pigz = t unpigz = t samplerate = 0.25 "コマンドでトリミングした。ゲノムのカバレッジが100倍を超える場合は、"bbnorm.sh target = 100 min = 2 "コマンドを使用してリードを正規化した。短いリードと長いリードのハイブリッドアセンブリは、SPAdesを使用し、"spades.py -careful --cov-cutoff auto -k 21,33,55,77,99,127 "というコマンドで実行した。83 RagOUTは、Bacteroidesの場合は同じ種のマッチした参照ゲノム（表1）、Prevotellaの場合はPc H-2477を使用して染色体レベルのスキャフォールディングに使用した。
ゲノムの亜種へのクラスタリング
ncbi-genome-downloadプログラム（https://github.com/kblin/ncbi-genome-download）を用いて、2023年5月15日にNCBI GenBankから "Scaffold "品質以上のすべての公開BacteroidesおよびPrevotellaゲノムをダウンロードした。使用したコマンドは "ncbi-genome-download --genera Bacteroides --section GenBank --formats fasta --assembly-levels complete, chromosome,scaffold bacteria "と "ncbi-genome-download --genera Prevotella --section GenBank --formats fasta --assembly-levels complete, chromosome,scaffold bacteria "で、PrevotellaとBacteroidesのゲノムはそれぞれ888と1894となった。
公開ゲノムは、dRep v3.2.154を用い、"dRep dereplicate -S_algorithm fastANI -sa 0.98 "コマンドを用いて、本研究で回収した分離株ゲノムとともにクラスタリングした。98％のANI閾値は、報告されたANI値のヒストグラムに基づいて手動で選択した（図S4A）。代表ゲノムは、dRepのデフォルトスコアリングシステムに以下の調整を加えて選択した：本研究で配列決定された単離ゲノムはさらに100点、本研究で使用された単離ゲノムはさらに80点、Refseqで「代表ゲノム」とマークされた公開ゲノムはさらに60点、「完全ゲノム」および「染色体」品質の公開ゲノムはそれぞれさらに40点および20点。
亜種有病率の評価と系統解析
すべてのメタゲノミックリードはCarter et al.4からダウンロードした。メタゲノミックリードは、デフォルト設定のBowtie2（コマンド "bowtie2 -x $index -1 $r1 -2 $r2 | samtools sort -o $output.bam"）を使用してPrevotellaおよびBacteroides亜種代表ゲノムにマッピングし、得られた.bamファイルは、デフォルト設定のinStrain（コマンド "inStrain profile $bam $fasta -s $stb --coverm"）56で実装されているcoverMを使用してプロファイル化した。ゲノムの幅が65%以上で検出されたゲノムをメタゲノム中に「存在する」とみなした。この閾値は、ゲノム幅ヒストグラムの手動検査に基づいて選択した（図S4B）。
各集団における各ゲノムの有病率は、そのゲノムが検出されたメタゲノム中の割合として計算した。GToTree v1.5.36を用い、"GToTree -H Bacteria -T IQ-TREE "コマンドで、少なくとも1つのメタゲノムから検出されたバクテロイデス属とプレボテラ属の代表ゲノムについて系統樹を作成した。各ツリーには異なる属のアウトグループを1つずつ含めた。図S1Aには、i)種名に "copri "を含む全種、ii)本研究で回収した分離株の全Prevotella種、iii)本研究で回収した全分離株ゲノムに最も近い代表ゲノム(GTDBによる)のGTDB代表ゲノムが含まれている。図S1Bでは、各クレードから10ゲノムをランダムに選んでツリーに含めた。Prevotella stercoreaはアウトグループとして含めた。
CAZymeアノテーション
各単離株についてCAZymeアノテーションを行った。NCBIで入手可能なPrevotella copriの追加20株（アセンブリーレベルは様々）についても、単離株と2つのモデル株との比較の目的でアノテーションを行った。すべてのアミノ酸配列は、まずBlastP（バージョン2.3.0+）を使用して、CAZyデータベース（2021年9月）61に保存されている全長配列と比較した62。カバレッジ100％、配列同一性50％以上、E値10-6以下のクエリーは、最も近い参照ホモログと同じドメイン構成で自動的にアノテーションされた。残りのすべての配列は、各推定モジュールの存在を確認するために、ヒトによるキュレーションを受けた。このプロセスにおいて、キュレーターは、(i)全長タンパク質、モジュールのみ、または特徴付けられたモジュールのみのライブラリに対するBLAST、および各CAZy（サブ）ファミリーに対して社内で構築されたモデルに対するHMMERバージョン3.163を含むバイオインフォマティクスツール、(ii)（サブ）ファミリー間で異なる適切なカバレッジ、配列同一性、およびE値の閾値に関する人間の専門知識、そして最終的には触媒アミノ酸の保存性の検証に頼ることができた。単離株のCAZymeレパートリーの階層的クラスタリングは、ComplexHeatmapを用いて行った。
In vitro多糖類増殖アッセイ
グリセロールストックを10%除細動したウマ血液を加えたBrain Heart Infusionプレート上で打ち抜き、37℃で24時間嫌気培養した。分離株はBHI-S（Bacteroides）およびYCFA-G（Prevotella）で一晩継代した。16時間後、培養液をBacteroidesは1:50、Prevotellaは1:10に希釈し、透明な平底96ウェルプレートに200uL入れた。培地はYCFAバックグラウンドに0.5%の炭水化物を加えたもので、イヌリンは1.5%の濃度で添加した。OD600は、BioTek Epoch2プレートリーダーを用いて48時間、15分ごとに測定した。正規化ODは、各炭水化物条件について、対応する多糖類で増殖した各単離株の生のOD600から平均ブランクOD600を引くことにより計算した。最大ODは最初の24時間で最も高い規格化ODとして計算した。
非同胞マウスのコロニー形成と菌数測定
B. thetaiotaomicron H-2622のコロニー形成には、BHI-Sで16時間培養した3mLの液体培養液300uLをマウスに投与した。P.copriのコロニー形成には、YCFACで16時間培養した3mL液体培養液300uLをマウスに投与し、その中にBHIBAで48時間培養したP.copriを10-15匹（マウス1匹あたり約1匹）浮遊させた。プレボテラを投与する前に、マウスに10%炭酸水素ナトリウム水溶液300uLを投与した。食餌は投与2時間後に戻した。バイコロナイゼーション実験では、マウスにまずPc H-2477をコロニー形成させ、7日後にBt H-2622を経口投与した。バイコロナイゼーションを5-7日間安定させてから、食餌を切り替えた。
細菌密度を測定するために、個々のマウスから糞便を採取した。1μLの糞便の生物学的複製2個を200μLの滅菌PBSに懸濁し、96ウェル組織培養プレートを用いて滅菌PBSで1：10に連続希釈し、各希釈液2μLの技術的複製3個をBHIBA上にプレーティングした。37℃で36時間嫌気性増殖させた後、CFUをカウントした。
In vivo競合アッセイ
個々のマウスから糞便を採取した。DNeasy PowerLyzer PowerSoil kit（Qiagen）を用いて、2生物学的複製糞便からゲノムDNAを抽出した。PcおよびBt DNAの濃度は、種特異的qPCRプライマー（Key Resources Table）を用いて評価した。qPCRはBrilliant III, Ultra Fast SYBR Green QPCRマスターミックスとBio Rad CFXサーモサイクラーを用いて行った。Bt H-2622 と Pc H-2477 のゲノム DNA を用いて、各プライマー対の標準曲線を作成した。標準曲線は、サンプル中のBtまたはPc DNAの絶対量を算出するために使用した。各プライマーペアの効率値(E)は、Ct値に対するlog10(DNAインプット)の10(1/-傾き)として計算した： E-Ctプライマーペア
マウス飼料
Inulin-g および No MAC-g 飼料は、No MAC 飼料（TD.150689）の炭水化物含量と一致させるため、32% の AIN-93G Basal Mix（CHO、セルロースフリー）と 68%の炭水化物を用いて作製した。Basal Mixと炭水化物成分は、水（Basal Mix 250gパッケージあたり1100mL）と結合剤として5%の牛ゼラチンの混合液に懸濁させた。炭水化物（100％グルコース、MAC-gなし；50％グルコースと50％イヌリン、イヌリン-g）とゼラチンは別々にMilliQ水に溶解し、オートクレーブ滅菌した。ゼラチンミックスとAIN-93G Basal Mix (CHO, Cellulose Free) (TD.200788)を組織培養フード内で炭水化物溶液に添加し、4℃で固化させた。飼料は主要リソース表に記載されている。コロニー形成後1週間後、標準飼料を除去し、目的の試験飼料に交換し、敷料を交換した。ゼラチンチョーは3日ごとに交換した。
RNAseq
RNeasy PowerMicrobiome Kit（Qiagen）を用いてマウスの糞便内容物およびin vitro培養物からRNAを抽出した。リボソームRNAの枯渇はRiboMinus Transcriptome Isolation Kit（Invitrogen）を用いて行った。TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Ratキットを用いてcDNAライブラリーを構築した。シーケンシングはNovaSeq SPフローセルを用いて行った。生リードの品質は、"multiqc "コマンドを使用してMultiqcで評価した。64 アダプターは、Trimomaticと "trimomatic PE ILLUMINACLIP -PE.fa:2:30:10LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36 "コマンドを使用してトリミングした。 65 HiSAT2コマンド "hisat2-build "でインデックスを作成し、"hisat2 -p 8 --dta -x "でインデックスにリードをアライメントし、Pc H-2477およびBt H-2622ゲノムにアライメントした66。SAMtoolsを使用して、"samtools sort -@ 8 -o "および "samtools index "コマンドで.bamファイルを生成した67。Stringtieコマンド "stringtie"、"stringtie-merge"、および "stringtie -e -B -p 11 -G "を使用して、転写産物をアセンブルした68。
定量化と統計解析
定量および統計解析は、Rバージョン4.2.2またはGraphPad Prismバージョン9を用いて行った（key resources table）。ComplexHeatmapおよびggplot2パッケージは、ヒートマップおよびバープロットの可視化に使用した。Prism は、糞便 CFU および qPCR データのグラフ作成、これらのデータの平均値および標準誤差値の算出、およびこれらの実験の統計解析に使用した。各実験のグループあたりのサンプル数（n）は、図の凡例または図自体に示した。両側Mann-Whitney検定は、正規分布の仮定なしに、マッチしていない2群の分布を比較するために使用した。対または非対t検定は、それぞれ対または非対標本の正規分布の2群を比較するために用いた。Welchの2標本のt検定は、標準偏差の異なる正規分布の2群を比較するために用いられた。フィッシャーの正確検定は、標本サイズが小さい2組のカテゴリー変数間の非ランダムな関連性の有無を決定するために使用された。ウィルコクソン検定は、独立標本の2群の平均の明瞭性を決定するために用いた。実験の統計解析の詳細は、結果のセクションと図の説明にある。
データとコードの利用可能性
WGSとRNAseqの生データファイルはZenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.7651179。図や追加データの生成に使用したコードはZenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.8339517。単離ゲノムはNCBIで入手できる： PRJNA1015720で公開される。本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要望に応じて主担当者から入手可能である。
謝辞
本研究で使用したサンプルを提供してくれた参加者に感謝する。Dorobo Safaris、Human Food Project、John Changalucha、Alphaxard Manjuranoなど、米国、タンザニア、ネパールで後方支援を提供し、サンプル採取を行ってくれた多くの人々や組織に感謝する、 Alphaxard Manjurano、Maria Gloria Domiguez-Bello、Allison Weakley、Samuel Smits、Gabriela Fragiadakis、Hannah Wastyk、Yoshina Gautam、Dinesh Bhandari、Sarmila Tandukar、Katharine Ng、Guru Prasad Gautam、Jeevan B．Sherchand、そしてスタンフォードのGardner研究室のメンバーに感謝する。Bryan Merrill、Madeline Topf、Michelle St.Ongeの技術サポート、Gabriela Gall Rosaの解析支援、Samuel Lancaster、Brittany Sison、Audrey ZhangのRNAシーケンスデータ処理支援、Michael FischbachとNiokhor DioneのP. copri N-01の提供、Brian YuとRose Yanのシーケンス支援、David Schneiderのアドバイスと組織培養フードの使用、Bernard HenrissatのCAZymeアノテーションに関するアドバイスに感謝する。
R.H.G.は、NIH/NHGRI T32 training grantおよびBlavatnik Family Foundationの支援を受けた。この研究は、J.L.S.に対するNIHからの助成金（R01-DK085025、DP1-AT009892）の支援を受けている。J.L.S.はChan Zuckerberg Biohubの研究員である。
著者貢献
R.H.G.、M.R.O.、N.T.、F.E.、S.K.H.が実験を行い、データ解析の設計と実行を行った。R.H.G.、J.L.S.、E.D.S.は本研究の発案と原稿執筆を行った。J.L.S.とE.D.S.は実験デザイン、データ解析と解釈に貢献した。
利害関係
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
インクルージョンと多様性
我々は、包括的で多様性があり、公平な研究実施を支持する。
補足情報
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資料S1. 図S1-S4
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表S1. バクテロイデス属とプレボテラ属の系統解析に使用したゲノムビン
ダウンロード .docx (.05 MB)
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表S2. メタゲノム解析および細菌分離に使用したサンプルの情報
ダウンロード .docx (.05 MB)
docxファイルのヘルプ
表S3. ゲノムごとの注釈付きCAZymes
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論文情報
出版履歴
オンライン公開 2023年10月31日
受理済み 受理：2023年9月22日
改訂版受理 2023年8月16日
受理：2023年8月16日 受理日：2023年3月28日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113233

著作権
© 2023 著者
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図
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図1Hadzaのバクテロイデス属とプレボテラ属の株は、以前に配列決定された分離株と関連しており、集団によって有病率が異なる。
図のサムネイルgr2
図2BtとPcのコロニー形成は食餌依存的に異なる
図のサムネイルgr3
図3Hadza BacteroidesとPrevotellaはGHとPLの分布が異なる
図3バクテロイデスとプレボテラのGHとPLの分布の違い
図4P. copriのコロニー形成を維持するのに十分なMACの再導入
表
表1使用菌株
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