miR-29の異常は小児クローン病における重篤な表現型の予測因子である

2024年3月9日 14:13

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研究論文消化器遺伝学オープンアクセス｜10.1172/jci.insight.168800

miR-29の異常は小児クローン病における重篤な表現型の予測因子である
Alexandria J. Shumway,1 Michael T. Shanahan,1 Emilie Hollville,2 Kevin Chen,3,4 Caroline Beasley,3 Jonathan W. Villanueva,1 Sara Albert,1 Grace Lian,3 Moises R. Cure,3 Matthew Schan. Cure,3 Matthew Schaner,3 Lee-Ching Zhu,5 Surekha Bantumilli,5 Mohanish Deshmukh,2 Terrence S. Furey,3,4,6 Shehzad Z. Sheikh,3,4 and Praveen Sethupathy1.
著者注：AJSとMTSはこの研究に等しく貢献した。

2024年2月22日発行 - 詳細

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要旨
クローン病（CD）は慢性炎症性腸疾患である。クローン病の臨床的不均一性の根底にある分子機序は、まだ十分に解明されていない。マイクロRNA（miRNA）は腸生理学の重要な制御因子であり、そのいくつかは成人CDの病因に関与している。しかし、小児CDに関する大規模なmiRNA研究はほとんどない。われわれは、特定のmiRNAが小児CDを特異的に特徴付けるという仮説を立てた。我々は、治療歴のない小児CD患者（n=169）と対照コホート（n=108）から得られた、患者をマッチさせた結腸および回腸生検のsmall RNA-Seqを行った。包括的なmiRNA解析により、小児CDで変化している58のmiRNAが明らかになった。特に、多項ロジスティック回帰分析により、回腸のmiR-29の指標レベルは、重度の炎症と厳格化を強く予測することが明らかになった。miR-29を過剰発現させたトランスジェニックマウスのトランスクリプトーム解析では、タイトジャンクションタンパク質遺伝子Pmp22と古典的なパネス細胞マーカーの有意な減少が示された。パネス細胞の劇的な減少は、組織学的アッセイによって確認された。さらに、miR-29が上昇した小児CD患者では、パネス細胞数が有意に減少し、炎症スコアが上昇し、PMP22のレベルが低下することがわかった。これらの所見は、miR-29の上昇が小児CDの特徴であり、重篤な表現型の高い予測因子であり、炎症およびパネス細胞の消失と関連していることを強く示している。

グラフィカル抄録
グラフィカル抄録
はじめに
クローン病（CD）は一次性炎症性腸疾患（IBD）であり、遺伝的感受性の高い個体における炎症反応の調節異常により発症すると考えられている。特に過去10年間で、クローン病はますます世界的な疾患となり、新興工業国での罹患率が増加している(1-3)。米国では、2025年までにCD患者数が1.5倍近く増加すると予測されている(4)。一部の報告では、この増加の実質的な一因として、小児におけるCD症例の増加が挙げられている。この種の症例の発生率は、21世紀に入ってから2倍以上に増加しており、小児は依然として最も急速に増加している罹患年齢層である(5-8)。

CDの正確な原因はいまだ謎に包まれているが、CDは環境暴露、遺伝、腸内細菌叢を含む因子の複雑な相互作用に対する異常な免疫反応であると考えられている。成人のCDも小児のCDも、慢性的な腹痛、下痢、瘻孔、膿瘍の原因となる消化管の非連続性病変を特徴とする。CD患者の30%までが小児であり、これらの患者は成長障害、骨密度の低下、思春期の遅れなどの問題を併発するため、より重篤な表現型を示す傾向がある(9, 10)。一部の患者では、既存の治療法によって粘膜の治癒を助け、外科的介入の必要性を減らし、全体的なQOLを向上させることができるが、現在のところCDを完治させる治療法はない(10, 11)。CDの治療は患者によって大きく異なる。適切な治療レジメンは、疾患の部位や挙動、併存疾患、以前の治療、年齢など多くの要因に依存するからである(12, 13)。CDの寛解は、特に小児患者では依然として困難である(12)。CDの複雑性と不均一性、および既存の治療法の有効性が非常に不安定であることから、新規の治療法の必要性が強調されている。新規のバイオマーカーや予後指標が開発されれば、病気の経過や治療に対する反応を判断する上で、臨床医をさらに助けることができるだろう(14)。

近年、私たちや他の研究者たちは、成人CDの診断マーカー、重症度の予後指標、治療標的候補として、マイクロRNA（miRNA）を研究してきた(15-17)。miRNAは、遺伝子の発現を転写後制御する小さなノンコーディングRNA（長さ約22nts）であり、ほとんどの主要な生物学的過程や疾患に影響を及ぼすことが示されている(18)。これらの分子はタンパク質をコードする遺伝子の大部分を制御し、それぞれのmiRNAは最大で数百のmRNAを標的とし、mRNAの不安定化や翻訳の阻害をもたらす(18, 19)。miRNA活性の機能不全は、CDに特徴的な急性または慢性の炎症を引き起こす可能性がある(20, 21)。2010年には、miRNA活性全体が腸の構造と機能に寄与していることを示す画期的な研究がなされた(20)。さらに最近では、特定のmiRNAがIBDに関与していることが示唆されている(22-24)。例えば、我々は、単一のmiRNA（miR-31）が成人CDの2つの分子サブタイプ間の違いの主要なドライバーであることを示した(25)。さらに、miR-31がアクチビンA受容体様タイプ1（ALK1）の発現を制御することによって、部分的にはバリア機能を制御していること、そしてmiR-31の高レベルが臨床的転帰の不良や寛解後の再発の可能性の増大と強く関連していることが、機能研究によって証明された(26)。この研究だけでなく、他のいくつかの研究により、miRNAは成人CDにおける疾患行動の貴重な予後指標であり、潜在的な治療標的であることが確立された（15、24、27）。

これらの進歩にもかかわらず、これらの研究の大きな限界は、大部分が成人CDに関するものであるということである。小児CDにおけるmiRNAに焦点を当てた研究はほんの一握りであり、そのほとんどは、包括的なmiRNAプロファイルを定義するためにシーケンスベースのアプローチを用いていない(24, 27-33)。最近、我々は小児CDにおけるmiRNAの大規模シークエンシングを行ったが、その解析対象はたった1つのmiRNAだけであった(25)。ここでは、コホートを大幅に拡大し、小児患者およびIBDのない患者（non-IBD [NIBD]）を対照として、一致させた回腸および結腸サンプルにおけるすべてのmiRNAの包括的な定量解析を行った。我々は、小児CDにおける主要な臨床転帰の予測分子的特徴として最も有用性を示す特定のmiRNAを発見し、報告した。また、小児CD（成人CDと比較して）の特徴である特定の1つのmiRNAのin vivoでの機能追跡研究を行い、さらなる研究に値する潜在的な標的および機能を定義した。

結果
回腸および大腸のmiRNAプロファイルは、NIBD患者から小児CDを層別化する。我々は以前、小児CD患者から採取した回腸組織60例と大腸組織76例の指標生検、およびNIBD患者から採取した回腸組織50例と大腸組織48例についてsmRNA-Seq（smRNA-Seq）を行った（25）。この研究では、1つのmiRNAに焦点を絞って解析を行った。そのため、小児CDの臨床転帰に対するmiRNAの予測力の可能性は未知のままであった。この重要な知識のギャップを埋め、小児CDの包括的なmiRNAシグネチャーを定義するために、我々はまずコホートを277サンプルまで拡大し、バイオインフォマティック解析パイプラインmiRquant 2.0を導入、適用した。このパイプラインの導入後、miRNAにマッピングされたリードが100万未満のデータセットを削除した（図1Aおよび表1）。また、smRNA integrity metric (SIM)、年齢、性別などの詳細な臨床情報がないサンプルも解析から除外した。さらなる解析のためにサンプルが残った小児患者の属性は、表2に示されている（n = 245）。

回腸および大腸のマイクロRNAプロファイルは、疾患の状態によって層別化される。
回腸および大腸のマイクロRNAプロファイルは疾患状態によって層別化される。(A）smRNA-Seq解析のワークフロー。(B) CDおよびNIBDの全サンプル（n = 245）の分散安定化変換（VST）正規化カウントの主成分分析（PCA）で、small RNA integrity metric（SIM）、グループ化された年齢（VEO ≤ 6; child = 7-12; teen = 13-17）、および性別の共変数を考慮した。サンプルはそれぞれCDとNIBDについて青と緑で色分けされている。2つの組織タイプは、結腸サンプルは円形、回腸サンプルは三角形で表される。x軸は主成分1、y軸は主成分2について説明された変動の割合を示す。(C）全小児検体（n＝245）間のユークリッド距離の教師なし階層クラスタリングは、SIM、グループ化された年齢、性別の共変量を考慮したVST正規化カウントに基づいて計算された。CDとNIBDのサンプルは、それぞれ桃色とピンク色のボックスで示されている。その他の共変量は凡例で示した色で表している。(D)大腸（n=127）（左）と回腸（n=118）（右）組織における小児miRNAプロファイルのPCAで、SIM、グループ化した年齢、性別の共変量を考慮した。 (E)グループ化した患者の年齢と性別の表現型情報を重ねた大腸（左）と回腸（右）のPCAプロット。緑、赤、青はそれぞれVEO、小児、10代のグループ化された年齢を表す。女性患者と男性患者はそれぞれ赤と青で示されている。疾患の状態は形状で示されている。

表1
閾値が適用されたサンプルの内訳

表2
CDおよびNIBDの小児患者の人口統計学的属性

全245検体にわたるmiRNAプロファイルの教師なし階層クラスタリングおよび主成分分析（PCA）は、疾患状態（CD対NIBD）による強い層別化を示した（図1、BおよびC）。この結果は、患者適合サンプル（n = 228）のみを考慮しても維持された（補足図1A；本論文とともにオンラインで入手可能な補足資料；https://doi.org/10.1172/jci.insight.168800DS1）。大腸と回腸のmiRNAデータセットを別々にPCAしたところ、第一主成分に沿って疾患別（CD対NIBD）にしっかりとグループ分けされた（図1D）。年齢、性別、人種、民族による層別化は検出されなかった（図1Eおよび補足図1B）。

大腸miRNAは小児CDを2つのクラスターに分ける。各組織を個別にPCA解析すると、小児CD患者は大腸miRNAプロファイルに基づいて2つのクラスターに層別化されているように見えるが（図1D）、回腸miRNAプロファイルではこれは明らかではなかった（図1D）。興味深いことに、大腸CD症例間のクラスタリングは、将来的な回腸の厳格化状態に部分的に起因していることが明らかである（補足図2A）。この層別化を説明しうる大腸miRNAを定義するために、2つのクラスター間で有意に発現が異なるmiRNAを同定しようとした（補足図2B）。DESeq2を用いたところ、回腸ストレッチングを発症した1人を除く全ての個体が含まれるクラスター#1では、2つの大腸miRNA（miR-99bとmiR-146b）が有意に高発現しており、クラスター#2では1つの大腸miRNA（miR-451a）が有意に高発現していた（補足図2C）。

小児CDで有意に変化したmiRNAの全てではないが多くは回腸と結腸で共有されている。私たちのデータは、同じコントロール（NIBD）から得られたマッチした組織を用いて、ベースライン時にヒトの大腸または回腸のどちらかで濃縮されるmiRNAを定義するユニークな機会を与えてくれた。DESeq2を用いて、回腸と結腸の間で有意に存在量の異なる10個のmiRNAを発見した（図2A）-回腸で有意に濃縮された7個のmiRNA（図2B）と結腸で有意に濃縮された3個のmiRNA（図2C）。回腸に濃縮されたmiRNAにはmiR-31が含まれ、このmiR-31は我々が以前に報告したもので、成人CDにおいて最も顕著であった(25, 26)。大腸に濃縮されたmiRNAにはmiR-196bが含まれ、このmiR-196bは大腸CD（23, 34）や潰瘍性大腸炎（35, 36）と長い間関連してきた。全体として、この解析結果は、一致したNIBD患者の回腸と結腸のmiRNAプロファイルは驚くほど類似しており、識別可能なmiRNAはわずかであることを示している。

小児CDの大腸のmiRNAプロファイルは2つのクラスターに分かれる。
小児CDの大腸におけるmicroRNAプロファイルは2つのクラスターに分かれる。(A) 大腸NIBD患者と回腸NIBD患者（n = 105）の間で有意に発現が異なるmiRNAを示すMAプロット。破線は発現のlog2 fold change (log2FC)-1.0/+1.0（水平）を表す。アップレギュレートまたはダウンレギュレートされたmiRNAは、調整P < 0.05およびbaseMean > 1,000で、それぞれ赤または青に着色されている。(BとC）回腸で有意に濃縮された7つのmiRNA（B）と結腸で有意に濃縮された3つのmiRNA（C）の正規化リードカウントの箱ひげ図。ウィスカーは最小値と最大値を、ボックスの境界は上下25分位数を、ボックス内の水平線は中央値を示す。各データ点は患者サンプルを表す。***P＜0.001、***P＜0.0001；Student's t testおよびMann-Whitney U test。

次に、小児CDとNIBDで発現が異なるmiRNAを同定するために、DESeq2による解析を両組織タイプで別々に行った。この解析により、対応するNIBDサンプルと比較して、小児CD患者の回腸で30個（12個発現上昇、18個発現低下）、結腸で52個（26個発現上昇、26個発現低下）のmiRNAが有意に変化していることが明らかになった（図3A）。これらのうち約40%は2つの組織型間で重複している（図3B）。小児CDで最も強固に発現差のあるmiRNAの多くは回腸と結腸で共有されているが、いくつかの注目すべきmiRNAはどちらか一方の組織型に特異的である。例えば、miR-215とmiR-31はそれぞれ回腸と結腸でのみ小児CDで有意に変化している（図3C）。これらのmiRNAはどちらも、我々が以前に発表したデータセット(23, 25)によると、成人のCD患者の結腸で有意に変化している。小児CD患者の回腸と結腸組織の両方で有意に変化しているmiRNAの例は、miR-29b、miR-29c、miR-375である（図3D）。

小児CDで有意に変化した多くのマイクロRNAは、回腸と大腸の間で共有されている（図3）。
小児CDで有意に変化した多くのマイクロRNAは、2つの組織型で共通している。(A）大腸（左）と回腸（右）において、CD患者とNIBD患者（n = 245）の間で有意に発現が異なるmiRNAを示すMAプロット。破線は発現のlog2倍変化-0.75/+0.75（水平）を表す。アップレギュレートまたはダウンレギュレートされたmiRNAは、調整P < 0.05およびbaseMean > 500でそれぞれ赤または青に着色されている。(B）回腸と結腸で有意に変化した小児miRNA（baseMean > 500、調整P < 0.05、log2FC > 0.75または< -0.75）のベン図：全体（左）、ダウンレギュレート（中央）、アップレギュレート（右）。パラログは1つのmiRNAとして記載されている。(C) 大腸または回腸組織サンプルに特異的に有意に発現差のある2つのmiRNAであるmiR-215とmiR-31の正規化カウントの箱ヒゲプロット。(D)小児CD患者の回腸と結腸組織の両方で有意に変化しているmiR-29b、miR-375、miR-29cの正規化数の比較。ひげは最小値と最大値、枠の境界は上下25分位数、枠内の水平線は中央値を示す。各データ点は患者サンプルを示す。****P < 0.0001；Wald検定およびMann-Whitney U検定。

回腸miR-29b/cの指標レベルは、小児CD患者における重篤な炎症と厳格化の発症と関連している。我々は、大腸または回腸（図3A）において有意に発現差のあるmiRNAのどれかが、臨床的特徴と関連しているか、あるいは将来の疾患転帰を予測できるかどうかを調べようとした（補足表1）。まず、すべての二値転帰について二項回帰分析を行った。その結果、8つの大腸miRNAが家族歴と中等度の関連性を示し、1つの回腸miRNAアイソフォーム（miR-215_-1）が吻合を伴う手術と中等度の予測性を示し、7つの大腸miRNA（miR-21ファミリーおよびmiR-31を含む）が直腸またはS状結腸病変と強い予測性を示した（補足表2）。miR-31とmiR-21の両者は、大腸炎のマウスモデルと同様に成人CDにも以前から関与していた。次に、より複雑な臨床的転帰について多項回帰分析を行ったところ、8つの回腸miRNAの指標レベル（表3）が、回腸疾患のサブタイプ（重症炎症、厳格化、貫通）のうち少なくとも1つの発症と有意に関連することが示された。これら8個のうち3個は、重度の炎症と厳格化の両方に有意に関連している（表3）。これらの3つのうち、2つ（miR-29bとmiR-29c）だけが、我々が以前に発表した解析（図4A）（23, 25）によると、成人のCDでも変化しておらず、小児CDの顕著な特徴であることを示唆している。次に、miR-29bとmiR-29cの指標レベルが、小児患者が時間とともに発症する回腸疾患のタイプと関連しているかどうかを調べるために、ロジスティック回帰分析を行った（図4B）。その結果、回腸のmiR-29bとmiR-29cの指標レベルの増加は、重度の炎症と厳格化を強く予測することがわかった（図4B）。

回腸miR-29b/cの指標レベルは、重篤な炎症の発症と関連している（図4B）。
回腸miR-29b/cの指標レベルは、小児CD患者における重篤な表現型の発現と関連している。(A）小児および成人患者（n = 142）の結腸組織におけるmiR-29bの正規化カウント。各データ点は患者サンプルを表す。(B) miR-29b（上）とmiR-29c（下）の効果プロット。x軸に各マイクロRNAのVST変換カウント、y軸に回腸疾患のタイプとの関連確率（結腸はn = 75、回腸はn = 65）。各患者について、各miRNAのVST変換カウントと回腸疾患のタイプを用いて多項ロジスティック回帰を行った（modest inflammationを参照として使用）。多重検定補正にはFDRを用いた。回腸疾患のタイプは図中の色で示した。各関連についての調整P値は、該当する回腸疾患のタイプの上に配置した。*P < 0.05, ****P < 0.0001; Wald検定およびMann-Whitney U検定。

表3
多項ロジスティック回帰分析による調整P値

miR-29bのアップレギュレーションは、マウスおよびヒトにおけるタイトジャンクションタンパク質PMP22をコードする遺伝子の欠損と関連している。miR-29のアップレギュレーションが腸に及ぼす影響を調べるために、我々はドキシサイクリン誘発性（Dox-inducible）miR-29b過剰発現（29OE）マウスモデルを活用した（図5A）。なぜなら、小児CDにおいてmiR-29のアップレギュレーションが起こる腸の特定の細胞タイプや組織層さえもわかっていないからである。我々はまず、生後60日のDox投与（29OE/+Dox）後に単離した十二指腸、空腸、回腸組織の組織学的解析を行い、コントロールマウス（29OE/-Dox）と比較した。2回に分けた解析（それぞれn＝4 29OE/+Doxおよびn＝4コントロールマウス）では、小腸の構造における肉眼的な障害は観察されず、コントロールに対する29OE/+Doxの腸陰窩の深さや密度における実質的な差も観察されなかった（補足図3）。

miR-29bのアップレギュレーションは、PMP22の欠損と関連している。
miR-29bのアップレギュレーションは、マウスとヒトの両方でPMP22の欠損と関連している。(A）Dox誘導性miR-29b過剰発現（29OE）マウスモデルの模式図。(B)29OEマウスにおけるmiR-29bの相対定量値(RQV)を、Dox無投与(29OE/-Dox, n = 4)(左)とDox投与(29OE/+Dox, n = 4)のIEC-1とIEC-2(右)について示すqPCR。IEC-1とIEC-2は同じマウスから採取した2つの独立した腸上皮分画を示す。紺色は-Dox処理、ピンク色は＋Dox処理を表す。(C）トランスジェニックマウスモデルにおいて、以前に検証されたmiR-29標的遺伝子Ccnd1とSlc16a1の正規化された数。紺色は-Dox処理（n = 3）、ピンクは＋Dox処理（n = 3）を表す。(D）トランスジェニックマウスモデルにおけるmiR-29予測標的遺伝子Pmp22の正規化数。紺色は-Dox処理（n = 3）、ピンク色は＋Dox処理（n = 3）を表す。(E）小児CDとNIBDの両組織型におけるmiR-29予測標的遺伝子PMP22の正規化数。(F）小児回腸サンプルにおけるmiR-29b（x軸）とPMP22（y軸）の相関。データは平均値±SEMで示した。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; Student's t testおよびMann-Whitney U test。

上皮バリアの障害はCDの特徴的な特徴の一つであるため、次に腸上皮細胞（IEC）を単離し、29OE/+DoxマウスではmiR-29bレベルがコントロールに比べて有意に上昇していること（図5B）、そしてこの誘導はmiR-29過剰発現カセットに依存しており、Dox処理のみによるものではないことを確認した（図5B）。コントロールに対する29OE/+DoxのIECのRNA-Seq解析は、Ccnd1やSlc16a1のような非常によく確立されたmiR-29標的遺伝子を含む72遺伝子の有意なダウンレギュレーションを示した（図5C）(37, 38)。これらのデータは、遺伝子発現レベルで、29OE/+Doxマウスの腸上皮におけるmiR-29の予想された機能獲得を確認した。

注目すべきことに、miR-29の標的遺伝子と予想されるPmp22が、29OE/+Doxマウスで最も有意に発現低下した遺伝子のひとつであることもわかった（図5D）。この遺伝子は、ごく最近、腸のバリア機能を促進することが示されたタイトジャンクションタンパク質をコードしている(39)。miR-29はタイトジャンクションタンパク質Cldn1の制御を通してバリア機能の制御に関与しているが、Pmp22は腸におけるmiR-29の標的としては報告されていない(40, 41)。

この制御関係がヒトでも成り立つかどうかを調べるため、我々は、この研究で使用したのと同じヒトサンプルの大部分（n = 203）のサブセット（補足図4）から、以前に報告したRNA-Seqデータを解析した（未発表）。その結果、PMP22は、小児CD患者の回腸（NIBD対照と比較して）と29OE/+DoxマウスのIEC（29OE/-Dox対照と比較して）の両方で有意にダウンレギュレートされている16の遺伝子のうちのひとつであることがわかった（補足表3）。さらに、PMP22は大腸と比較して小児ヒト回腸ではるかに高発現しており（図5E）、またNIBD対照と比較してCD小児患者の回腸でのみ有意に抑制されており、大腸では抑制されていないことが観察された（図5E）。注目すべきことに、小児CD患者の回腸では、miR-29bレベルがPMP22と高い有意な逆相関があることも観察された（図5F）。これらのデータを総合すると、小腸におけるmiR-29の標的が示唆され、miR-29のアップレギュレーションに伴うmiR-29の減少は、小児CDで観察されるバリアーの低下に寄与している可能性がある。

マウスでmiR-29bを過剰発現させると、パネス細胞遺伝子マーカーが劇的に減少する。空腸のマウスRNA-Seqデータをさらに解析すると、5つの主要なパネス細胞マーカーの劇的なダウンレギュレーションが観察された（図6A）。対照的に、杯細胞や腸内分泌細胞マーカーにはわずかな影響しか認められず（図6A）、幹細胞や腸細胞マーカーにはほとんど影響が認められなかった（図6A）。次に、定量的PCR（qPCR）により、腸管幹細胞（Lgr5）と腸上皮の4つの異なる主要系譜（腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、パネス細胞）のマーカー遺伝子のレベルを測定した。最も劇的な効果が観察されたのは、陰窩を基盤とするパネス細胞の典型的なマーカーであるリゾチーム1（Lyz1）であり、29OE/+Doxではコントロールに対して20倍以上ダウンレギュレートされた（図6B）。同じ期間Doxで処理したWTマウス（miR-29b過剰発現カセットなし）では、Lyz1や他のマーカーに有意な変化は検出されなかった（図6B）。IECにおける追加のパネス細胞マーカーDefa17、miR-152、およびCopz2に対するqPCRでは、コントロールに対して29OE/+Doxで同様のダウンレギュレーションが認められた（図6、C-E）。後者の2つは、Defa17やLyz1とは異なり、顆粒と物理的に結合していないと考えられるので、特に有益である。

マウスでmiR-29bを過剰発現させると、パネス細胞が劇的に減少する図6
マウスでmiR-29bを過剰発現させると、パネス細胞遺伝子マーカーが劇的に減少する。(A）空腸からのRNA-Seqデータは、29OE/+Dox（n = 3）対29OE/-Dox（n = 3）における腸上皮細胞型マーカー（x軸）の相対定量値（RQV）（y軸）を示す。各細胞型のマーカーは図のように色分けされている。*P＜0.05、***P＜0.01、***P＜0.001、***P＜0.0001；Wald検定。(B）29OE/-Dox（左、n＝4）および29OE/+Dox（右、n＝4）のqPCRは、IEC-1およびIEC-2に対するDox処理の有無にかかわらず、腸管幹細胞のマーカー遺伝子（Lgr5）および腸上皮の4つの異なる主要系譜（腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、パネス細胞）のRQVを示した。(C-E）IEC-1（n＝4,4）とIEC-2（n＝4,4）のmiR-152（C）、Copz2（D）、Defa17（E）29OEの相対定量値（RQV）を示すqPCR。紺色は-Dox処理、ピンク色は+Dox処理を表す。データは平均値±SEMで示した。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；スチューデントのt検定およびマン・ホイットニーのU検定。

miR-29bが増加すると、マウスではパネス細胞が消失する。トランスクリプトーム研究の結果と一致するように、H&E解析は、29OE/+Doxマウスにおいて、陰窩あたりの顆粒細胞（これはパネス細胞の代用として用いる）の数が、29OE/-Doxコントロールと比較して有意に減少していることを示した（図7A）。次にLyz1免疫蛍光（IF）分析を行ったところ、正統的なパネス細胞がさらに劇的に減少していた（図7B）。マウスの独立したコホートにおけるH&EおよびIF分析は、これらの結果を確認した（補足図5）。アルシアンブルー染色により、陰窩（補足図6A）と絨毛（補足図6B）の両方における杯細胞数に対するmiR-29b過剰発現の影響は、遺伝子マーカー解析の結果（図6A）と一致し、比較的わずかであることが明らかになった。これらの所見は、同じ期間Doxで処理したWTマウス（miR-29b過剰発現カセットなし）のH&E分析では観察されなかった（補足図7）。

miR-29bの獲得はパネス細胞の消失をもたらす。
miR-29bの獲得はパネス細胞の消失につながる。(A）十二指腸近位部、十二指腸中部、回腸遠位部における29OE/-Dox（n＝4）および29OE/+Dox（n＝4）の明視野H&E染色組織切片からの陰窩あたりのパネス細胞数（600倍像）。(B）十二指腸近位部、十二指腸中部および回腸遠位部における29OE/-Dox（n＝4）および29OE/+Dox（n＝4）のLyz1免疫蛍光（赤色）およびDAPI蛍光（青色）組織切片からの陰窩あたりのパネス細胞数（600倍像）。スケールバー： 600倍で50μm、200倍で100μm。個々のパネス細胞と杯細胞を赤矢印で示す。紺色は-Dox処理、ピンクは＋Dox処理を示す。データは平均値±SEMで示した。**P＜0.01、***P＜0.0001；Student's t testおよびMann-Whitney U test。

miR-29b/cレベルは、小児CD患者のパネス細胞数と関連している。マウスでの機能的研究に基づき、我々はmiR-29b/cレベルが小児CD患者のパネス細胞数と相関しているという仮説を立てた。この仮説を検証するために、まずmiR-29b/cのレベルが最も高いか低い患者を選び、それぞれHigh-29（n = 20）またはLow-29（n = 19）と名付けた（図8A）。このうち9検体は、組織学的な基準である、クリプト底が完全に識別できる、少なくとも10個の良好な向きのクリプトを示すという基準を満たせなかったため、それ以上の解析から外れた。残りの30サンプルのうち、19サンプル（High-29, n = 10; Low-29, n = 9）を炎症について分析した。miR-29bレベルは炎症スコアと有意な相関があることがわかった（図8B）。High-29サンプルは、パネス細胞の特異的マーカーであるDEFA5とDEFA6のレベルが有意に減少していることがわかった（図8Cと表4）。次に、サンプル（n = 30）をH&E分析にかけたところ、High-29グループはクリプトあたりのパネス細胞が有意に少ないことが明らかになった（図8、DおよびE）。これまでの結果と合わせて考えると、これらの所見は、マウスとヒトにおけるパネス細胞に対するmiR-29bの支配的な制御効果を強く示している。

高レベルのmiR-29b/cは、ペディアにおけるパネス細胞の数の少なさと関連している図8
高レベルのmiR-29b/cは、小児CD患者におけるパネス細胞数の減少と関連している。(A）選択されたHigh-29（n = 20）またはLow-29（n = 19）群におけるmiR-29b/cの正規化された数。各データポイントは患者サンプルを表す。(B）小児のHigh-29群とLow-29群（High-29, n = 10; Low-29, n = 9）における患者間のmiR-29b（y軸）と炎症スコア（x軸）の相関。(C）DEFA5とDEFA6の両方について、High-29とLow-29のサンプルにおけるmiR-29b/cの正規化カウント。(D）High-29およびLow-29サンプルにおけるmiR-29b/c発現の相対定量値（RQV）（x軸）およびクリプトあたりの平均パネス細胞数（y軸）。(E）High-29およびLow-29患者の回腸陰窩の2つの代表的な明視野H&E染色像（600倍）。スケールバー： 50 μm。各データ点は患者サンプルを表す。*P＜0.05；***P＜0.001；Studentのt検定およびMann-WhitneyのU検定。

表4
High-29bとLow-29bのカテゴリーにおけるRNA-Seq解析から得られた小児CD患者のデモグラフィック

考察
本研究は、小児CD患者の大規模コホートにおける包括的なmiRNA解析である。本研究の主な長所は以下の通りである： (a)治療を受けていない患者（n = 245）の大きなサンプルサイズ、(b)患者をマッチさせた回腸組織と大腸組織、(c)臨床的特徴との詳細な回帰分析、(d)疾患転帰の指標となる生検miRNAの発見、(e)異常なmiR-29をパネス細胞の消失とPMP22発現の変化と関連付けたマウスとヒトの研究。主要な発見は、miR-29およびおそらく他のmiRNAが、疾患のサブタイプおよび/または重症度の予後指標として使用できる可能性があるということである。われわれの研究で解決されていない主な未解決の問題には以下のものがある。(a)小児CDにおいてmiR-29はどのようにミスレギュレートされているのか？ (b)パネス細胞の発生表現型に対するmiR-29の過剰発現の影響はあるのか？(c) miR-29の過剰発現は、小児CDにおいて、どのような腸の細胞タイプや粘膜層で最も支配的で機能的に関連するのか？これらの疑問は、フォローアップ研究でさらに調査する必要がある。

上に挙げた3番目の質問に対する答えは、小児CDにおいて最も重要なmiR-29の下流標的を決定する上で特に貴重であろう。この研究で示されたネズミのRNA-Seqデータでは、パネス細胞分化(42)の正統的な制御因子（Sox9、Atoh1、Erbb3）をコードする遺伝子のどれもが、miR-29の過剰発現によって腸上皮に影響を与えるようには見えなかった。しかし、興味深いことに、MHCクラスII遺伝子のマスター転写制御因子をコードするCiitaの劇的な減少が観察された(43)。CiitaはmiR-29の予測される標的であり、腸管幹細胞に特異的なMHCクラスII活性の消失は、分泌細胞の割り当てを著しく減少させる(44)。これらのデータを総合すると、miR-29のアップレギュレーションがCiitaの直接標的と抑制を増加させ、その結果MHCクラスIIシグナル伝達とパネス細胞の分化を低下させるという可能性が出てくる。この仮説は広範で厳密な評価が必要であり、本研究の範囲外であるが、将来的に調査する価値があると考える。また、小児CDにおけるmiR-29のアップレギュレーションは、線維芽細胞、リンパ管内皮細胞、毛細血管細胞、免疫細胞、および／または腸管神経細胞など、上皮の下の層の細胞で最も大きい可能性も十分にある。例えば、薄層前膜T細胞で特異的にmiR-29が増加すると、miR-29の直接標的として確立されているDNMT3Aが減少し、IFN-γ遺伝子(IFN-γ)のプロモーターメチル化が減少し、IFN-γレベルが増加し、慢性炎症が促進される可能性がある(45, 46)。今後の研究では、miR-29と炎症、ストリクチュアリング、および/またはパネス細胞の喪失との関連を支える直接的な標的および分子メカニズムを明らかにするために、小児CDにおける異常なmiR-29シグナルを駆動する細胞タイプを決定することに焦点を当てるべきであることを提案する。

miR-29は、いくつかの胃腸表現型の強力な制御因子として以前から注目されてきた(15, 47)。IBSに関するいくつかの異なる研究から、miR-29はタイトジャンクションタンパク質を直接標的にして抑制することにより、マウスにおいて腸の透過性を促進することが示されている(40, 48, 49)。このことから、miR-29のアップレギュレーションは腸のバリア機能を著しく低下させ、IBSの重症化を促進すると考えられる。しかし、他の研究では、miR-29は腸の線維化を抑制し、IBDの防御因子となりうることが示されている(50, 51)。さらに、別の研究では、miR-29の欠損が腸の炎症表現型を悪化させる可能性が示されている(52)。実際、少なくとも1つの研究では、miR-29の模倣物質がIBD、特に重度の炎症の場合の治療薬になる可能性が示唆されている(53)。抗炎症作用、抗線維化作用、そしてバリアー障害作用に関するこれらの別々の報告は、腸におけるmiR-29の非常に多面的な姿を描いている。IBDに関連することとして、miR-29は、細胞の状況、疾患の病因、発症年齢、および/または疾患進行中の時点によって、拮抗的な機能と保護的な機能の両方を持つ可能性がある。

miR-29はパネス細胞も抑制する可能性があるという我々の発見は、腸の透過性と炎症が増加するもう一つの手段を提供する。具体的には、miR-29の早期の増加がパネス細胞の減少を引き起こし、抗菌活性を減弱させ、小腸のディスバイオシスを促進し、ひいてはバリアの完全性を損ない、炎症のリスクを高めることにつながる可能性が示唆される。パネス細胞の欠損はCDの病態に長い間関与しており、実際、成人と比べて小児に多くみられる(54, 55)。我々は、成人CDではなく、小児CDにおけるmiR-29の異常な上昇がこの違いに寄与している可能性を示唆している。我々の知見は、腸管miR-29の挙動に関する豊かで複雑な網に加わった。

いくつかの報告では、IBDとそれに関連した腸の慢性疾患における治療薬として、miR-29の模倣薬と阻害薬の両方を検討することが求められている。しかしながら、上記のようなmiR-29の文脈特異的な機能を考慮すると、miR-29に基づく治療薬は困難である可能性が高いので、我々は強く注意を促している。疾患進行の異なる段階における、腸の異なる細胞タイプにおけるmiR-29の制御作用を整理するために、さらなる研究が必要である。我々は、急性腸疾患（微生物感染のような）、あるいは壊死性腸炎のようなパネス細胞の欠損が病因に重要な疾患に対するmiR-29ベースの治療薬の可能性にさらに興味をそそられている。例えば、サルモネラ菌やリステリア菌の感染後にmiR-29は強く発現上昇するのだろうか、もしそうであれば、それらの条件下で報告されているパネス細胞の欠損の少なくとも部分的な原因なのだろうか？このような疑問は、今回の研究の範囲外ではあるが、今後詳細に調査する価値があると考える。

小児CDの機序はまだ十分に解明されていない。本研究は、小児CDにおけるmiRNAの研究に重要な転機をもたらし、miR-29にとどまらず、小児CDの主要な制御因子を同定するための豊富なリソースを研究コミュニティに提供するものである。例えば、我々のデータはCDにおけるmiR-375の有意な欠損を指摘している。少なくとも1つの先行研究では、miR-375の欠損がTLR4やNF-κBのような炎症性因子をアップレギュレートすることが示されている(56)。今回のデータから明らかになったmiR-375やその他のmiRNAが、炎症性、硬化性、その他のIBD表現型を制御するメカニズムについて、より詳細な研究が必要であると考えられる。このような研究により、小児および／または成人のCDに対する新規で効果的な治療法が発見されるかもしれない。

研究方法
生物学的変数としての性別本研究では、女性および男性の小児患者を調査し、解析においてこの共変数を考慮した。miR-29の発現やその他の所見に性差は見られなかった。従って、扱いやすさとコストの観点から、マウス研究は1つの性（男性）に限定した。この所見がメスのマウスに関連するかどうかは不明である。

患者集団とサンプル取得患者サンプルはUniversity of North Carolina Multidisciplinary IBD Centerから入手した。すべてのサンプルは、IBDの疑いで内視鏡検査を受けた治療歴のない小児患者から採取した。NIBDコントロールサンプルは、その後組織学的に正常と同定された生検を受けた患者とした。本研究で収集した臨床情報には、人口統計学的および臨床的変数：家族歴、年齢、性別、罹病期間、罹病部位が含まれる。患者の臨床パラメータからの情報は、補足表1に示した。ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織から、手術時に上行結腸と終末回腸の巨視的に罹患していない部分から内視鏡検査で粘膜生検が得られた。これらの指標となる生検は、病理医により活動性の炎症がないことも確認された。顕微鏡的炎症は、(a)陰窩上皮への好中球浸潤と陰窩膿瘍形成、および/または、(b)構造的歪曲と固有層の基底リンパ球形質細胞症と定義した。ストリクチュアリングおよび瘻孔形成の表現型は、内視鏡検査および/または画像検査（透視、CT、またはMR）を用いて定義し、ストリクチュアリングおよび瘻孔形成のない表現型と比較して、患者の症状と相関させた。ストリクチュアリングおよび瘻孔形成の表現型は追跡調査時に記録され、平均追跡期間は6年であった。

smRNAライブラリーの調製と配列決定。RNAは、Roche High Pure miRNA Isolation Kitを用いてFFPE組織から単離した。RNA純度はNanoDrop 2000装置（Thermo Fisher Scientific）で定量し、RNA完全性はAgilent 2100 Bioanalyzer（Aglient Technologies）で定量した。smRNAライブラリーはTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit（Illumina）を用いて作製した。シークエンシング（シングルエンド、50 bp）は、Greehey Children's Cancer Research Institute（University of Texas Health Science Center、米国テキサス州サンアントニオ）のGenome Sequencing FacilityでHiSeq 2500プラットフォーム（イルミナ）を用いて行った。過去に発表された生のシーケンスデータは、Gene Expression Omnibus（GEO）のアクセッション番号からアクセスできる。GSE101819。追加サンプルはGEO accession no. GSE221261。

smRNA-Seq解析。リードの質はFastQCを用いて評価した。miRquant 2.0（57）をリードのトリミング、miRNAのアノテーション、定量に用いた。簡単に言うと、リードはCutadaptを用いてトリミングされ、2つの異なるマッピングツール（BowtieとSHRiMP; 参考文献58, 59）を用いてヒトゲノム（hg19）にアライメントされた。miRNAにマッピングされたリード数が100万未満のサンプルは、以降の解析から除外した。

小児サンプルのグループ化された年齢（very early onset [VEO] ≤ 6 years; child = 7-12 years; teen = 13-17 years）、SIM、性別は、limma (61) の removeBatchEffect 関数を用いて説明した。共変量を補正した後、対数正規化したDESeq2 (60)値とRのplotPCA (60)関数を用いてPCA解析を行いました。stats関数distを用いて、発現に基づいてサンプル間のユークリッド距離を計算し、pheatmapでプロットしました。SIM、グループ化された年齢、性別が共変量として考慮されたlog正規化DESeq2 (60)値を用いて、大腸と回腸の両方の組織タイプについて個々のPCAが計算された。MAプロットは、共変量を補正し、baseMean、log2FC、padjにパラメータを設定したggpubr (62)のggmaplotを用いて作成した。

SIM。miRquant2.0を用いて、トリミングしたリードの長さ分布値を求めた。18-24ヌクレオチド間のリードは、miRNA、tRNAフラグメント、Y-RNA由来のsmRNAに富んでいる。30～33ヌクレオチド間のリードは、tRNAハーフおよびY-RNA由来のsmRNAに富んでいる。バックグラウンドシグナルは、18-24および30-33ヌクレオチドのサイズウィンドウ以外のリードのパーセンテージとして定義されます。SIMは、18-24と30-33ヌクレオチドの間のリードの割合をバックグラウンドシグナルで割って計算する。

回帰分析。一般化線形モデル（GLM）を用いて、大腸組織と回腸組織の両方から得られた発現量の異なるmiRNAと二値臨床パラメータとの関連を探索した。臨床データからのカテゴリー変数では、多項回帰モデルからの適合値を生成する "nnet"(63)のmultinom関数を用いて確率を求めた。多重検定の補正は、FDR 調整を用いて行った。

マウスモデル本研究で使用したmiR-29過剰発現マウスモデルは、ref. 64. マウスはノースカロライナ大学のDeshmukh研究室から提供された。

空腸上皮細胞の調製。Doxに曝露したWTマウスと未曝露のmiR-29b過剰発現マウスから採取した小腸を測定し、3等分した。中央部を空腸とした。氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で管腔を洗浄した後、組織を縦に切断し、1％（v/v）プリモシン（InvivoGen）を加えた氷冷PBS中、3mM EDTA中で4℃、15分間インキュベートした。腸管片の粘膜を穏やかに粘液を掻き取り、1%(v/v)プリモシン(InvivoGen)入りの氷冷PBS中で2分間振盪し、1%(v/v)プリモシン(InvivoGen)入りの氷冷PBS中、新鮮な3mM EDTA中で4℃、40分間インキュベートした。1%(v/v)プリモシン(InvivoGen)含有氷冷PBS中で2～6分間穏やかに手動で振盪した後、腸管片を顕微鏡（倍率100倍）で剥離した腸陰窩と絨毛を検査し、1%(v/v)プリモシン(InvivoGen)含有氷冷PBSで1:2に希釈した。70μmのセルストレーナーで濾過したものを空腸上皮細胞画分1（IEC-1）とし、1%(v/v)プリモシン（InvivoGen）を加えた氷冷PBSでセルストレーナー表面を洗浄しながら回収したものをIEC-2とした。IEC-1およびIEC-2調製物を、110g、10分間、4℃で遠心してペレット化した。RNA抽出のため、回収したペレットを200μLの溶解バッファー（Buffer RL, Norgen Biotek）に懸濁し、10秒間ボルテックスし、-80℃で保存した。

RNA抽出とqPCR。Total RNA Purification kit（Norgen Biotek）を用いて全RNAを単離した。miRNAの逆転写にはTaqMan miRNA Reverse Transcription kit（Invitrogen）を用いた。遺伝子発現解析用RNAの逆転写にはHigh Capacity RNA to cDNA kit（Invitrogen）を用いた。miRNAと遺伝子発現の両方のqPCRは、TaqMan Universal PCR Master Mix（miRNA qPCR）またはTaqMan Gene Expression Master Mix（mRNA qPCR）を用いて、Bio-Rad CFX96 Touch Real Time PCR Detection Systemの製造業者のプロトコールに従って、TaqManアッセイ（Invitrogen）を用いて行った。U6 (miRNA qPCR) (Invitrogen, assay ID: 001973) または Rps9 (mouse mRNA qPCR) (Invitrogen, assay ID: Mm00850060_s1) のいずれかをノーマライザーとして用いて、反応は二重または三重で行った。miRNA発現は、以下のプローブを用いてアッセイした：hsa-miR-29b（Invitrogen、アッセイID：000413）およびhsa-miR-152（Invitrogen、アッセイID：000475）。遺伝子発現は、以下のプローブを用いてアッセイした： Chga（Invitrogen、アッセイID：Mm00514341_m1）、Copz2（Invitrogen、アッセイID：Mm04203911_m1）、Defa17（Invitrogen、アッセイID：Mm04205962_gH）、Lgr5（Invitrogen、アッセイID：Mm00438890_m1）： Mm00438890_m1）、Lyz1（Invitrogen、アッセイID：Mm00657323_m1）、Muc2（Invitrogen、アッセイID：Mm01276696_m1）、およびSis（Invitrogen、アッセイID：Mm01210305_m1）。検出できなかったサンプルは解析に含めなかった。

マウスRNAライブラリー調製、配列決定、解析 RNA-Seqライブラリーは、Dox曝露マウスと非曝露miR-29b過剰発現マウスのIEC-1調製物から抽出した全RNAを用いて調製した。RNAはNanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）で定量し、RNAの完全性はAgilent 4200 Tapestation（Agilent Technologies）で評価した。ライブラリーは、リボソーム RNA を除去した NEBNext Ultra II Directional Library Prep Kit（New England Biolabs）を用いて Cornell TREx 施設で調製した。シーケンシングは、コーネル大学バイオテクノロジー研究センターのGenomics Facilityで、NextSeq500プラットフォーム（Illumina）を用いて行った。生のシーケンスデータはGEO（アクセッション番号GSE221261）で入手可能。リード品質はFastQCを用いて評価した。RNA-Seqデータは、STAR (65)を用いてmm6ゲノムにマッピングされた。転写産物は、GENCODEリリース25の転写アノテーションを用いてSalmon (66)で定量された。DESeq2(60)を用いて正規化および差分解析を行った。

ヒトRNAライブラリーの調製、配列決定、および解析。Quick-RNA FFPE MiniPrep（Zymo Research）を用いてFFPE組織から全RNAを単離した。精製はKingFisherシステム（Thermo Fisher Scientific）のMagMAXキットを用いて行った。その後、TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero（イルミナ社）を用いてシーケンスライブラリーを調製した。ペアエンド（50 bp）シーケンスにはNovaSeq 6000プラットフォームを使用した（イルミナ）。その後、Salmon (66)を用いて転写産物を定量した。転写産物数が少なく（<25,000）、転写産物の完全性番号（TIN）が低いサンプルは、さらなる解析から除外した（n = 2）。PCAによってそれぞれの組織タイプ（回腸または結腸）にクラスター化できなかったサンプルも、解析から除外した（n = 5）。

PCA解析では、サンプル間のばらつきが最も大きかった3つの共変量（バッチ、性別、TIN）を考慮した。RUVSeq(67)は、分散が最も大きい上位5,000遺伝子のうち、分散が最も小さい上位1,000遺伝子を計算することにより、さらに不要な変動を同定した。この解析を通して、DESeq2 (60)によって同定されたDEGで観察されたばらつき、相対的な対数発現プロット、および不要なばらつきの因子と結果の相関関係から、最終解析では1つの不要なばらつきの因子を使用することが決定された。

マウス組織学と組織学的解析。マウス十二指腸近位部、十二指腸中部、および回腸遠位部組織を4%(v/v)中性緩衝パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、様々な染色実験のために5μmの横断切片に切り出した。形態分析（陰窩の深さ、絨毛の高さ、陰窩の密度）およびパネス細胞数の決定のためにH&E染色を行った。杯細胞数の決定にはアルシアンブルー（pH2.5）・エオシン（AB&E）染色を行った。パネス細胞数は、リゾチームの免疫蛍光染色によっても決定した。簡単に説明すると、クエン酸緩衝液（10 mM クエン酸、0.05%[v/v] Tween 20、pH 6.0）で脱パラフィンおよび抗原回収を行った後、切片をPBS中の10%(v/v)正常ヤギ血清で室温で1時間ブロッキングし、ウサギ抗LYZ一次抗体（1:1,000、Abcam、クローンEPR2994[2]、カタログab108508）と0. その後、ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 594 二次抗体（1:1,000, Invitrogen, catalog A-11012）を 0.1%（w/v）BSA添加PBS中、室温で1時間インキュベートした。DAPI (0.1 mg/mL in PBS, Invitrogen, catalog D1306) を用いて核を可視化した。画像はオリンパススコープBX53（オリンパス）を用いて撮影した。パラフィン包埋、切片化、およびH&EとAB&Eによる組織染色は、コーネル大学のAnimal Health Diagnostic Care Histology Laboratoryが行った。画像は組織形態計測のために分析し、細胞数はImageJソフトウェア（NIH）を用いて分析した。組織形態測定と細胞数の取得には、少なくとも10個の無傷でよく切断された陰窩と10個の無傷でよく切断された絨毛を用いた。

患者組織の組織像と組織学的解析。2人の病理医が、回腸H&E染色切片の炎症活性（400倍）を、以下の基準を用いて、独立かつ盲検で評価した：高度の炎症、高倍率視野7-10/10における好中球活性；中等度の炎症、高倍率視野3-6/10における好中球活性；低度の炎症、高倍率視野0-2/10における好中球活性。倍率600倍の明視野画像を用いて、陰窩底部が完全に識別できる少なくとも10個の良好な向きの陰窩の陰窩底部好酸球性顆粒化パネス細胞を数えた。

統計。これらのデータ解析にはRソフトウェアバージョン4.1.0を使用した。すべてのsmRNAのアノテーションと定量はmiRquant (57)を用いて行った。RNA-SeqおよびsmRNA-Seqデータは、DESeq2（60）を用いて差次的発現を解析し、2群を比較する場合は仮説検定にWald検定を用い、統計的有意性についてはP値をFDRで調整した。qPCR実験における発現差の有意性は、Studentのt検定（不対、2尾）を用いて独立サンプルの2群を比較して評価した。データセットに正規性が仮定できない場合は、ノンパラメトリック検定（Mann-Whitney U）を用いた。多項ロジスティック回帰分析もRソフトウェアを用いて行い、P値はFDRを用いて調整した。使用されたすべての統計学的検定については、図の凡例に詳述されている。P＜0.05を統計的に有意とみなした。図中のパネルでは、特に断りのない限り、定量的データはすべてのマウス研究についての生物学的複製±SEMの平均値として報告されている。ヒトサンプルについては、定量データは平均値±SDとして報告されている。

研究の承認患者サンプルは、IRB承認のプロトコールに従い、University of North Carolina Multidisciplinary IBD Centerから入手した（Study ID, 15-0024）。本研究に参加する前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。すべての参加者は番号で識別され、氏名や保護されるべき健康情報では識別されない。すべてのマウス実験についてUNCおよびCornell IACUCの承認を得た。

データの利用可能性。過去に発表された生のシーケンスデータは、GEO accession no. GSE101819。追加サンプルはGEO accession no. GSE221261。グラフの全データポイントの値は、Supporting Data Valuesファイルに報告されている。

著者貢献
AJSとMTSは、データの取得、解析、解釈、図の作成、原稿の起草と修正を行った。EHとMDはマウスコロニーの開発と樹立を行った。KCは小児RNA-Seqデータの取得と解析を行った。JWVはSIMの設計を手伝った。SAはデータの解析と解釈を手伝った。CB、GL、MRC、MS、LCZ、SBは組織採取、患者の表現型決定、炎症スコア解析に協力した。TSFは、研究の立案、データの解析と解釈、原稿の修正、資金提供を行った。SZSは研究の立案、データの取得と解釈、原稿の修正、資金調達、IRBの承認を得た。PSは研究の計画、データの解析と解釈、原稿の起草と修正、資金調達、IACUCの承認、研究の監督を行った。すべての著者は研究の完全性を守り、原稿全体の最終承認を得ており、研究のすべての側面について責任を負う。

補足資料
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謝辞
本研究は、SZS、TSF、PSに授与された5P01DK094779（NIH/NIDDK）、SZSに授与されたNIDDK R01 DK136262、PSに授与された5R21HD104922-02（NIH/NICHD）の支援を受けた。また、BioRenderのおかげで抄録を作成することができた。

連絡先 Terrence S. Furey, 120 Mason Farm Road, CB7264, University of North Carolina, Chapel Hill, North Carolina 27599, USA. Tel: 919.966.7033; Email: tsfurey@email.unc.edu. または下記まで： Shehzad Z. Sheikh, 7312B MBRB Building, 111 Mason Farm Road, Chapel Hill, North Carolina 27599, USA. 電話：919.966.0745; Email: shehzad_sheikh@med.unc.edu. または下記まで： Praveen Sethupathy, T7 006D Veterinary Research Tower, Box 117, Ithaca, New York 14853, USA. 電話：607.253.4375 607.253.4375; Email: pr46@cornell.edu.

脚注
利益相反：著者らは利益相反が存在しないことを宣言している。

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大腸上皮のmiR-31はクローン病の表現型の発現と関連する
ベンジャミン・P・キースら、JCIインサイト、2018年
CD11c+骨髄系細胞エクソソームが大腸炎時の腸の炎症を抑える
Kaylyn M. Bauerら、JCI Insight、2022年
歯周病とクローン病の潜在的発症関連性
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小児B細胞急性リンパ芽球性白血病の再発予測因子としてのRNA-seqベースのmiRNAシグネチャー
久保田博仁ら、Blood Advances誌、2023年
若年クローン病患者におけるステロイド温存療法と肛門周囲瘻孔形成合併症リスクとの関連性
Jeremy Adler氏ら、JAMA Network Open、2020年
末期腎疾患患者における炎症関連miR-155と内皮濃縮miR-126の循環レベル
Wangら、Brazilian Journal of Medical and Biological Research誌、2012年
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