雌性ドナーからの糞便微生物叢移植は、アルコールに曝露した中年雄性マウスの腸透過性を回復させ、肝臓傷害および炎症を軽減する

2024年5月4日 09:58

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オリジナル研究論文
フロント栄養学、2024年4月18日
栄養と微生物
第11巻-2024年｜https://doi.org/10.3389/fnut.2024.1393014
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腸内細菌叢の制御因子としての食品由来ファイトケミカル

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雌性ドナーからの糞便微生物叢移植は、アルコールに曝露した中年雄性マウスの腸透過性を回復させ、肝臓傷害および炎症を軽減する

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2024.1393014/full

Arantza Lamas-Paz1,2† Mariana Mesquita1,3† Marcos Garcia-Lacarte4,5,6 Olga Estévez-Vázquez1 Raquel Benedé-Ubieto1 Alejandro H. Gutierrez1 Hanghang Wu1 Hector Leal Lasalle1 Javier Vaquero7,8,9 Rafael Bañares7,8,9 Eduardo Martínez-Naves1,2 Sergio Roa4,5,6,10 Yulia A. Nevzorova1,8,9 Gonzalo Jorquera11,12*‡ Francisco Javier Cubero1,8,9*‡ 1.
1スペイン、マドリード、コンプルテンセ大学医学部、免疫学・眼科・眼鼻咽頭科
212デ・オクトゥブレ健康研究所（imas12）、スペイン、マドリード
3カンピナス州立大学、カンピナス、SP、ブラジル
4スペイン、パンプローナ、ナバラ大学生化学・遺伝学教室
5スペイン、パンプローナ、ナバラ大学がんセンタークリニカ
6ナバーラ健康研究所（IdiSNA）、パンプローナ、スペイン
7スペイン、マドリード、グレゴリオ・マラニョン総合大学病院消化器外科
8スペイン、マドリード、グレゴリオ・マラニョン衛生研究所
9スペイン、マドリード、肝疾患・消化器疾患研究センター
10スペイン、マドリード、カルロス3世医学研究所、癌生物医学研究センター（CIBERONC）
11バルパライソ大学理学部神経生物学・理学病理学統合研究センター（CENFI）、バルパライソ、チリ
12チリ大学栄養・食品技術研究所（チリ、サンティアゴ
背景中年層におけるアルコールの誤用、暴飲パターン、性差による影響は明らかに過小評価されている。本研究では、アルコール暴露が腸-肝臓軸に及ぼす性差影響と、アルコール摂取に対する性差反応を調節する腸内細菌叢の役割を理解することに焦点を当てた。

方法 52週齢の雌雄C57BL/6マウスを12時間絶食させ、エタノール（EtOH）（6g/kg）を単回経口投与した。対照にはPBSを単回投与した。動物は8時間後に犠牲となった。また、52週齢の雄マウスに同齢の雌マウスドナーから糞便微生物叢移植（FMT）を行った。大腸（結腸）の透過性、腸内細菌叢、肝障害、炎症はすべての群で徹底的に評価された。

結果 EtOHに曝露された中年雄性マウスは、PBS投与群と比較して、FITC-デキストランアッセイおよびZO-1、OCCLUDIN、MUCIN-2免疫染色により、大腸の腸管透過性が有意に上昇した。一方、同年齢の雌性マウスも腸管透過性は上昇したが、腸管バリアの完全性は部分的に維持された。さらに、雄マウスではEtOH暴露後、TLRと肝細胞傷害、細胞死（AST、TUNEL陽性細胞）、脂質蓄積（ORO）のマーカーが有意に上昇した。興味深いことに、雌性ドナーから雄性マウスへのFMTは、腸管漏出を減少させ、腸内細菌叢組成を変化させ、中年マウスの肝障害と炎症、TLR活性化、老化表現型を改善した。

結論我々の研究結果は、アルコールに暴露された中年個体において、腸肝軸における性別の関連性を浮き彫りにした。さらに、本研究により、性別に特異的な微生物叢移植が、加齢に伴うアルコール関連障害の管理において、妥当な治療法である可能性が明らかになった。

はじめに
アルコールの誤用は、世界的に重要な罹患率と死亡率を引き起こしている(1)。世界全体では、死亡率は3.8％、障害調整生存年数の4.6％を喪失している(2)。残念ながら、大量飲酒は世界的に増加しており、この疫病と闘うためには治療管理を開発する必要がある。2019 National Survey on Drug Use and Healthによると、米国では12歳以上の約6600万人、つまり約24％が暴飲暴食を報告している(3)。暴飲暴食とは、米国アルコール乱用・アルコール依存症研究所（NIAAA）が一般的に定義するもので、成人女性では2時間以内に4杯以上、成人男性では2時間以内に5杯以上、血中アルコール濃度（BAC）が0.08％以上のものを指す(3)。

暴飲暴食は、発展途上国の若年成人の間で一般的に行われるようになったが、その割合はここ10年で減少している。一方、高齢者での有病率は増加しており、中高年成人の過去1ヶ月の有病率は17.5％である(4, 5)。最近、若年成人における暴飲暴食の影響が研究されているが、中高年層における影響は依然として不明である(3)。暴飲暴食の頻度が高いことと、このようなアルコール誤用によって引き起こされる病態生理学的影響についての認識が低いことから、研究が必要である。

驚くべきことに、アルコールは、腸透過性の変化［タイトジャンクション（TJ）と粘液バリアの変化］、腸内細菌叢の形成異常（病原性生物と常在菌の不均衡をもたらす微生物叢の組成の乱れ）、抗菌ペプチドの産生（これらのペプチドへの微生物曝露の増加と肝臓における炎症性環境の発生）など、腸-肝臓軸を破壊する(6-8)。現在のデータでは、アルコールによる肝実質細胞への直接的な毒性作用のほかに、腸内細菌叢の異常、腸管バリア機能の喪失、その結果としての肝免疫細胞上のToll様受容体（TLR）の活性化が、アルコール関連肝疾患（ArLD）の病態形成に寄与していることが示されている。注目すべきことに、腸内細菌叢の変化がArLDに及ぼす影響は、肝疾患の兆候が現れる前から始まっている(9)。新たな証拠から、腸内細菌叢の組成は、腸-肝臓軸の恒常性を維持するために重要であり、この双方向コミュニケーションの一環として、肝臓が腸内微生物群集を形成していることが示された(9)。

本研究では、中高齢の雌雄マウスを用い、アルコール中毒の病態生理の根底にある影響を徹底的に調べることを目的とし、性別に特異的な腸内細菌叢の役割と腸-肝軸への影響を評価した。

材料と方法
急性アルコール中毒モデル
ENVIGO社（スペイン、バレンシア）のC57BL/6Jバックグランドを飼育し、コンプルテンセ医科大学の動物飼育施設で12時間明暗サイクルの温度・湿度管理された部屋で飼育し、餌と水を自由に与えた。本研究では、52週齢の雌雄マウスを使用した。52週齢の雌マウスは生殖機能が老化している(10)。動物実験はConserjería de Medio Ambiente, Administración Local y Ordenación del Territorio (PROEX 125.1/20 and 264.2/23)の承認を得た。

EtOHの急性投与は経口経口投与で行った。要約すると、野生型（WT）マウス（各実験につきn＝4～11）を夜間12時間絶食させ、朝、ガベージニードル（Kent Scientific, Torrington CT）を用いて30％EtOHを1回経口投与（6g/kg体重のガベージ）した(11)。対照として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ガベージを用いた。すべての動物は、チャレンジの8時間後にイソフルラン（SOLVET、セゴビア、スペイン）で犠牲にした。

抗生物質投与と糞便微生物叢移植
52週齢の雄マウスに、FMT（1日目）の前に高用量の抗生物質カクテル（ABx）を投与した。ABxは滅菌H2O中、アンピシリン（1mg/ml）、バンコマイシン（5mg/ml）、ストレプトマイシン（10mg/ml）、メトロニダゾール（10mg/ml）の濃度で調製した。この抗生物質カクテルは、b-ラクタム系（アンピシリン）、グリコペプチド系（バンコマイシン）、アミノグリコシド系（ストレプトマイシン）、ニトロイミダゾール系（メトロニダゾール）の抗生物質を組み合わせたもので、グラム陽性株（アンピシリンとバンコマイシン）とグラム陰性株（アンピシリンとネオマイシン）の両方を含むフルスペクトラムの細菌を対象とし、数時間以内にマウスの腸内細菌量を減少させるのに十分であることが証明された(12)。すべての抗生物質はマドリッド（スペイン）のグレゴリオ・マラニョン大学病院から入手した。抗生物質カクテルは治療当日に新たに調製し、糞便サンプル採取後の0日目に1回経口投与（各マウス250μl）した。

全群52週齢のマウスからABx投与前（Day 0）に糞便ペレットを採取した。52週齢の雌マウスの便をプールし、PBS中で1g糞/10mLの濃度になるように混合し、ホモジナイズした(13, 14)。混合物を500rpm、5分間、4℃で遠心し、上清を回収してFMTに用いた。52週齢の雄マウスに上清150μLを1日1回、3日間（2～4日目）連続経口投与した。30%EtOHの急性中毒（6g/kg体重の経口投与）を行い、FMTの15日後、52週齢（Day 19）で前述のようにマウスを犠牲にした。EtOHの経口投与は前述(12)と同様に行った。52週齢の雄マウスからFMT中およびFMT16日後に便を採取し、腸内細菌叢の変化を解析した。

組織学的および形態学的解析
マウスの肝臓と大腸を採取し、4％PFAで固定した後、パラフィンに包埋して組織学的評価を行った。ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色とオイルレッドO（ORO）染色を、それぞれ肝臓切片と結腸切片および肝臓切片に対して、既述のように行った（15, 16）。染色切片の顕微鏡写真を光学顕微鏡（Nikon Eclipse Ci、東京、日本）を用いて20倍および40倍の倍率で無作為に撮影し、オイルレッドO陽性領域を、既述のようにNIH Image/Jソフトウェア（National Institutes of Health、Bethesda、MD、USA）を無償で用いて定量化した（17）。

生化学的測定
各マウスの門脈から血液を採取し、ドイツのアーヘン大学病院（University Hospital RWTH）およびスペインのマドリッドにあるグレゴリオ・マラニョン研究所（Gregorio Marañon Research Institute：iISGM）に送った。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）は、肝障害の指標として、アーヘンRWTH大学病院およびグレゴリオ・マラニョン研究所の中央検査施設の標準手順に従って測定した。血清トリグリセリドは、ドイツのアーヘン大学病院（University Hospital RWTH of Aachen）との共同研究によるサンプルで測定した。肝内トリグリセリド含量を評価するために、肝臓サンプルを特定のTris緩衝液（10 mM Tris、2 mM EDTA、0.25 Mスクロース、pH 7.5）でホモジナイズし、市販の比色キット（10724600、Human Diagnostics）の製造元の指示に従って連続的に処理した。

定量的リアルタイムPCR
Trizol試薬（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を用いて肝臓組織から全RNAを精製した。Super Script first Strand Synthesis System (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を用いてcDNAを合成し、100μlのRNAse-free water (Sigma, St. Louis, MO, USA)に懸濁した。Genomics and Proteomics Facility (School of Biology, UCM)により、SYBR Green Reagent (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を用いて定量的リアルタイムPCRを行った。相対的遺伝子発現は、内部標準として用いたGAPDHの発現で各遺伝子を正規化する2-ΔΔCt定量式を用いて計算した(18)。プライマー配列は要望に応じて提供できる。

免疫蛍光およびTUNELアッセイ
各マウスの肝臓と結腸のサンプルは、Tissue-Teck（Sakura Finetek U.S.A、Torrance、CA）中のカセットに入れ、-80℃で保存した。ZO-1、MUCIN-2、OCCLUDIN、F4/80、CD11b、β-GALACTOSIDASEおよびTUNEL試験は、製造業者のプロトコール（Roche, Rotkreuz, Switzerland）に従って標準的手順で行った。

in vivoにおける腸管透過性の解析
腸管透過性は、マーカーであるイソチオシアネート結合デキストラン（TdB Consultancy AB Uppsala, Sweden）の血中出現量を測定することにより決定した。イソチオシアネート結合デキストラン（FITC-デキストラン、分子量4.0 kDa）（TdBCons, Uppsala, Sweden）を200 mg/mlの濃度でPBSに溶解し、12時間絶食させたマウス（10 ml/kg体重）にガベージ針（Kent Scientific社製）を用いて投与した。4時間後、マウスをイソフルラン（Solvet）の過量吸入により犠牲にした。血清中のFITC濃度は、標準物質として連続希釈したFITC-デキストラン（0、125、250、500、1,000、2,000、4,000、6,000、8,000、10,000 ng/ml）を用い、励起波長485 nm、発光波長528 nmのフルオロメトリーにより測定した。

微生物叢分析
マウスの糞便サンプルを採取し、PureLinkTM Microbiome DNA Purification Kit（Invitrogen社）の遠心アフィニティーカラムシステムを用い、メーカーの説明書に従って細菌DNAを抽出した。抽出したゲノムDNAの量と純度はThermo Scientific NanoDropで評価し、使用するまで-20℃で保存した。16S rRNA遺伝子のロングリードシークエンシングのために、10 ngの全ゲノムDNAを、Oxford Nanopore Technologies (ONT)のプロトコールに従って、16S barcoding kit (SQK-16S024)を用いてライブラリー構築に供した。具体的には、ナノポアライブラリー調製時に必要なラピッドシーケンシングアダプターのリガーゼフリーアタッチメントを容易にする5′タグを持つONTが提供するバーコード化ユニバーサル16Sプライマー（27Fおよび1492R）を用いて細菌DNAを増幅した。バーコード付きライブラリーをMinIONフローセル（FLO-MIN106D R9.4.1；ONT）にロードし、MinION-Mk1C装置（ONT）を用いて配列決定した。24時間後、本研究の11個のサンプルについて、2回のプールランで合計398,221個のナノポアリードが得られ、ロングリード長の中央値は1.59 kbで、予想される16S rRNAサイズと一致した。データ取得、リアルタイム解析、ベースコール、およびFASTQファイルのデータ送信は、MinION-Mk1Cシーケンス装置上のMinKNOW（v22.10.7）オペレーティングソフトウェアを用いて操作した。クラウドベースのEPI2ME Fastq 16S (v2023.04.21)アルゴリズムは、NCBI 16S rRNA参照配列データベース（細菌および古細菌の16S rRNAの26,000以上のキュレーションされたタイプ株配列を含む）に従って、16S rRNA FASTQファイルの解析ワークフローに使用された。

ミトコンドリアと葉緑体のリードカウント、およびサンプルの少なくとも10%で観察数が5未満の分類群は、Phyloseq Rパッケージ(v1.38.0)(19)を用いて下流解析用にフィルタリングされ、アルファ多様性推定のための観察数OTUとシャノンインデックスの計算にも使用された。最後に、MicrobiotaProcess Rパッケージ（v1.15.0）（20）を用いて希薄化曲線を作成し、実験グループ間の微生物叢の存在量と分布をさらに可視化した。

統計解析
すべての統計解析は、GraphPad Prismバージョン8.0.2ソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、一元配置分散分析（One-Way ANOVA）とTukeyポストホック検定を行った。p < 0.05を統計的に有意とみなした。異常値を定量化するためのGrubbs'検定は、GraphPadを用いて行った。データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）で表した。

結果
EtOH急性投与後、中年メスマウスでは腸管大腸透過性が回復する傾向が見られたが、同年齢のオスマウスでは見られなかった。
In vivoでの急性EtOH中毒後の腸-肝軸における性別依存的影響を調べるため、52週齢の雌雄C57/BL6JマウスにEtOHを経口投与し（6 g/kg）、腸管構築と透過性を調べた。興味深いことに、大腸のH&E染色では、52週齢の雄マウスでEtOH中毒による腸上皮の変化（陰窩の変化）が認められた（図1A）が、52週齢のEtOH投与雌マウスおよびPBS経口投与マウスでは関連する所見は認められなかった（図1A）。

図1
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図1. 52週齢の雌性C57BL/6マウスの大腸における腸管バリアは、同年齢の雄性マウスと比較して、急性エタノール曝露後も部分的に維持されている。(A）52週齢の雌雄C57BL/6マウスにEtOH（6g/kg）を投与し、パラフィン肝切片で大腸をH&E染色した。Lieberkuhn Cryptを矢印で示す。(B）EtOH/PBSを経口投与した雌雄マウスにおけるFITC-デキストランに対する腸透過性を、mg/mL血清として表した（n = 3-4）。(C）急性EtOH中毒後の52週齢雌雄マウスの大腸におけるZO-1染色と（D）各定量。(E）52週齢のC57BL/6雌雄マウスにEtOH（6g/kg）またはPBSを投与した大腸凍結切片のMucin-2免疫蛍光染色と（F）各定量。(n = 7). スケールバー： 100 μm。*P＜0.05、***P＜0.001、#P＜0.05。

急性EtOH暴露は腸透過性を変化させる可能性があるため、FITC-デキストラン法を用いて腸透過性を測定した。52週齢のメスマウスはPBS投与マウス、さらにはEtOH投与メスマウスと比較して、腸管透過性が有意に増加したのに対し、同年齢のオスマウスはFITC-デキストランレベルが悪化した（図1B）。

腸管透過性は腸上皮バリアの完全性と関連している。腸管上皮のタイトジャンクション（TJs）はゲートとして機能し、管腔内抗原の細胞外透過に対する構造的バリアとして機能する(21)。TJは、zonula occludes-1 (ZO-1)やOCCLUDINを含む薄いタンパク質複合体からなり、細胞の頂点を完全に取り囲み、隣接する細胞のTJと接触して、連続的な傍細胞シールを形成している(22)。先に我々は、急性EtOH中毒がTJを破壊することを報告した(23)。そこで次に我々は、52週齢の雌雄マウスで実験的に急性EtOH傷害を起こし、リーキーガットをもたらす腸TJの変化が起こるかどうかを評価した。興味深いことに、EtOH中毒後の52週齢雌マウスの大腸では、ZO-1の発現が、PBSを与えた雌マウスと比較して、わずかではあるが有意に低下していた（図1C, D）。興味深いことに、同年齢の雄マウスでは、PBSを投与した雄マウスと比較して、ZO-1の発現が劇的に減少した（図1C, D）。これらの結果と同時に、OCCLUDINの発現は、PBS処理マウスと比較して、EtOH中毒後のマウスの両群で有意に減少した（補足図1A, B）。

粘膜は厚い粘液層で覆われており、細菌を含む有害物質に対する保護バリアとして機能している。腸粘液層の主要なタンパク質成分はMUCIN-2で、これはゴブレット細胞から分泌され、腸内細菌と大腸上皮細胞との直接接触を防ぐ最初のバリアとして働く(24)。免疫蛍光染色により、ETOHを投与した52週齢の雄マウスの大腸におけるMUCIN-2の発現は、PBSを投与したマウスと比較して有意に低く、同齢の雌マウスにETOHを投与したマウスと比較しても統計学的に有意であった（図1E、F）。これらの結果を総合すると、52週齢の雄マウスは同年齢の雌マウスと比較して、腸管透過性が亢進し、TJの数が減少し、粘液防御能が低下していたことが示唆される。しかし、メスマウスも腸管障害を示したが、実験的な急性EtOH曝露後には、より回復力のある腸の生理機能を有しているようであった。

52週齢のメスマウスは、同齢のオスマウスに比べてEtOH中毒後の肝障害が少ない。
EtOH曝露時の腸管バリア機能障害は肝障害の発症に寄与する(25)。実験的な急性EtOH曝露は腸管バリアの完全性を損なったので、続いて肝臓における影響を調べた。52週齢のマウスにEtOHを急性投与した結果、巨視的な違いは認められなかったが（補足図2A）、EtOH投与後の雌雄間で肝臓重量（LW）対体重比（LW/BW）に有意差が認められた（補足図2B）。H&E染色による肝臓の組織学的検査では、急性EtOH曝露後のマウスでは肝小葉の構造が乱れていた。特に52週齢の雄マウスでは、細胞質は半透明で、ある程度の肝細胞壊死と目に見える微小ステアトーシスを示した。PBS投与マウスは、洞状の肝硬変と典型的な肝臓を有する正常な小葉構造を示した（図2A）。

図2
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図2. EtOHを投与した52週齢の雌マウスは、同年齢の雄マウスに比べて肝臓への脂質の蓄積が少なかった。(A）52週齢の雌雄C57BL/6マウスにEtOH（6g/kg）を投与し、パラフィン肝切片で行ったH&E染色。(B）52週齢の雌雄マウスの血清中ALT値をEtOHまたはPBS投与後に測定した（U/L）（n = 7-9）。(C）EtOH（6g/kg）またはPBSで処理した52週齢雌雄マウスの肝臓凍結切片で行ったORO染色と（D）各定量。(E）EtOH/PBS経口投与後の52週齢雌雄マウスの肝臓中のトリグリセリド含量（mg TG/mg肝臓）の定量。(F）血清トリグリセリド（mg/dL）（n = 5-7）。スケールバー： 100 μm。*ns, 統計的差なし。

次に、肝障害の血清マーカーを評価した。ALT値は、52週齢の雄性EtOH投与マウスで、EtOH投与雌性マウスまたはビヒクル投与マウスと比較して、わずかではあるが有意に上昇した（図2B）。重アルコール暴露は肝細胞死を誘発する(26)。そこで、TUNELアッセイを用いて肝臓の細胞死を調べた。TUNEL陽性細胞の割合は、52週齢の雄の肝臓で急性EtOH曝露後に増加した。EtOHを投与した雌マウスでは細胞死が増加する傾向が観察されたが、同年齢の雄マウスやPBS投与動物と比較して有意差は認められなかった（補足図2C, D）。

エタノールは肝臓で肝細胞によって代謝され、EtOHの代謝産物は肝障害と肝脂肪症を引き起こす(27-29)。ORO染色による中性脂質の染色は、52週齢の雄マウスの肝臓にEtOHを負荷した場合、PBS処理したものに比べて脂質の蓄積が有意に増加することを示した。興味深いことに、同年齢の雌マウスでは、ORO染色で観察された脂質蓄積に差は見られなかった（図2C, D）。これらの観察と一致して、肝トリグリセリドの定量は52週齢の雄マウスでのみEtOH投与後に有意な増加を示した（図2E）が、血清トリグリセリドはEtOH中毒後の実験群間で差を示さなかった（図2F）。以上より、中年齢の雌性マウスはアルコール曝露後に肝臓の変化を経験したが、52週齢の雄性マウスはEtOH誘発肝細胞傷害および脂質蓄積に対してより感受性が高いことが示唆された。

52週齢の雌性マウスドナーからの糞便微生物叢移植は、中年雄性マウスにおけるEtOH誘発性腸機能障害を予防した
EtOH中毒後の腸肝軸の保護における腸内細菌叢の役割をさらに調べるため、52週齢の雄マウスにFMTを行った。健康な52週齢の雌性ドナーの糞便微生物叢を、前日にABxカクテルを投与した同年齢の雄性マウスに3日間経口投与した。その後、前述(11)と同様に、FMTの15日後に急性EtOH中毒を経口投与（6g/kg）した（補足図3A）。

興味深いことに、FMT＋EtOH後の52週齢の雄マウスは、同年齢の雌マウスと同様に腸管バリアの完全性が改善されていた。実際、52週齢の雄＋FMTマウスの大腸を光学顕微鏡で観察したところ、EtOH中毒後に関連する所見は認められなかった（図3A）。次に、腸管透過性を評価した。雄マウスへのFMTは、同年齢の雌マウスで観察されたのと同程度に腸透過性を回復させるであろうという仮説を立てた。興味深いことに、雌性糞便微生物叢を移植し、EtOHで処理した52週齢の雄性マウスのTJでは、非移植の雄性マウスと比較して、ZO-1染色と定量によりZO-1発現が有意に増加していた（図3B、C）。同時に、52週齢の雄マウスにFMTを行ったところ、EtOH曝露後の大腸におけるOCCLUDINの発現が、非移植の雄マウスと比較して有意に上昇し、EtOHで処理した同年齢の雌マウスと同レベルまで上昇した（図3D、E）。さらに、大腸のMUCIN-2の免疫蛍光染色では、52週齢の雄＋FMTマウスと雌マウスでEtOH曝露後に同程度の値を示したが、EtOH非投与の雄マウスでは前述のように粘液層の減少が認められた（図3F、G）。以上より、中年齢雌性マウスの腸内細菌叢は、EtOH曝露後に同年齢雄性マウスの腸透過性機能を改善することが可能であった。

図3
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図3. 52週齢のメスドナーからの糞便微生物叢移植（FMT）は、EtOH中毒後の同年齢のオスマウスの腸透過性を低下させる。(A）EtOH経口投与後の52週齢メス、オスおよびオス＋FMTマウスの大腸のH&E染色。(B）52週齢の雌、雄、雄＋FMTマウスのEtOH経口摂取後の大腸凍結切片におけるZO-1免疫蛍光染色（C）と各定量。(D)52週齢メス、オス、オス＋FMTマウスのEtOH(6g/kg)経口投与後の大腸凍結切片におけるオクルディン免疫蛍光染色と(E)各定量。(n = 4). スケールバー： 100 μm。(F)52週齢の雌、雄、雄＋FMTマウスのEtOH経口投与後の大腸でMUCIN-2免疫蛍光染色を行い、(G)各定量を行った（n = 4-7）。スケールバー 100 μm。*ns, 統計的差なし。

EtOH中毒後52週齢の雄マウスに糞便微生物叢を移植すると、肝細胞傷害と脂質蓄積が減少した。
腸管透過性の破壊は、微生物叢のトランスロケーションと肝障害を引き起こす。肝臓の巨視的および顕微鏡的検査では、移植していない雄マウスと比較して、EtOH中毒後の52週齢雄マウス＋FMTでは関連する所見は認められなかった（補足図3B；図4A）。興味深いことに、血清中のASTやALTなどの肝障害マーカーは、EtOH後の52週齢の雄マウス＋FMTで低下傾向を示し、同年齢の雌マウスと同程度の値を示した（図4B、C）。

図4
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図4. 糞便微生物叢移植（FMT）後の52週齢EtOH投与雄性マウスは肝障害および脂質蓄積に対する保護作用を示す。(A）52週齢のメス、オス、オス＋FMTマウスのEtOH経口投与後の肝臓のH&E染色。(B）EtOH（6g/kg）経口投与後の52週齢の雌、雄および雄＋FMTマウスの肝障害マーカー、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）および（C）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の血清レベル。(D)EtOH経口投与後の雌、雄、雄＋FMTマウスの肝臓凍結切片におけるORO染色と(E)各定量。(F）52週齢の雌、雄および雄＋FMTマウスのEtOH経口投与後の肝臓中のトリグリセリド含量（mg TG/mg肝臓）の定量。(G）血清トリグリセリド（mg/dL）（n = 4-11）。スケールバー： 100 μm。*ns, 統計的差なし。

さらに、52週齢の雄マウス＋FMTにおいて、EtOH後の肝臓への脂質蓄積は有意に減少した。ORO染色では、52週齢のEtOH投与雄＋FMTマウスの肝臓において、総中性脂質（面積％で定量）の減少が認められた（図4D, E）。これらの結果と一致して、肝臓測定における肝トリグリセリド含量は、非移植雄マウスと比較して、52週齢のEtOH飼育雄＋FMTマウスで有意に減少した（図4F）が、血清トリグリセリドにはいずれの実験群でも差は認められなかった（図4G）。まとめると、この一連のデータは、同年齢の雄マウスにおいて、EtOH中毒の結果としての肝細胞傷害および脂質蓄積を軽減するために、中年の雌ドナーからのFMTが果たす役割を証明した。

EtOH中毒後の52週齢雄マウスへの糞便微生物叢移植は、TLRカスケードの活性化、免疫細胞の浸潤、および老化の活性化を改善した。
まず、実験群の肝臓への免疫細胞浸潤を評価した。そこで、F4/80とCD11bの免疫蛍光染色を行ったところ、52週齢の雄＋FMTマウスでは、EtOH投与後、F4/80陽性細胞（図5A、B）とCD11b陽性細胞（図5C、D）の割合が、同年齢の非移植雄マウスと比較して有意に減少していることが明らかになった。

図5
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図5. 糞便微生物叢移植（FMT）は、雄マウスにおけるEtOHチャレンジ後の細菌の移動、免疫細胞の浸潤および老化を減少させる。(A）52週齢の雌、雄、雄＋FMTマウスのEtOH中毒後の肝臓凍結切片におけるF4/80免疫蛍光染色と（B）各定量；および（C）肝臓におけるCD11b免疫蛍光染色と（D）各定量。(E）EtOH経口投与後の52週齢の雌、雄および雄＋FMTマウスの肝臓におけるGapdhに対するTlr4、（F）Tlr2および（G）Tlr9 mRNA相対発現（H）EtOH経口投与後の雌、雄および雄＋FMTマウスの肝臓凍結切片で行ったβ-ガラクトシダーゼ免疫蛍光染色と（I）各定量（陽性細胞の割合）（n＝3-4）。スケールバー： 100 μm。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. ns, 統計的差なし。

腸管透過性が低下すると細菌の移動が減少し、続いてToll様受容体（TLR）の活性化が低下する。さらに、TLR4はアルコール関連肝疾患において炎症を誘発する(30)。そこでまず、TLRカスケードのmRNA転写産物を分析した。Tlr4、およびTlr2のmRNA発現は、52週齢のEtOH投与雄＋FMTマウスにおいて、同年齢の非移植雄マウスと比較して有意な減少を示したが（図5E、F）、52週齢のEtOH投与雄＋FMTマウスでは、Tlr9のmRNA転写レベルに有意な変化は見られなかった（図5G）。

炎症と老化は老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-GAL）の活性化と密接に関連しており、この酵素は老化表現型に関連し、細胞周期の停止と組織の機能不全に寄与している（31）。そこで、続いて、実験グループにおけるSA-β-GALの発現を解析した。SA-β-GAL陽性細胞の割合は、52週齢のメスおよびオス＋FMTマウスの両方で、EtOH中毒後、同年齢のEtOH投与オスマウスと比較して有意に減少した（図5H、I）。全体として、52週齢の雌性ドナーからのFMTは、同年齢の雄性マウスの肝臓における細菌の移動、免疫細胞の浸潤および老化の表現型を減少させた。

FMT後、EtOHで処理した雄マウスにおける雌のような腸内細菌叢の再構成
FMTおよびEtOH投与中の腸内細菌叢の変化を特徴付けるため、EtOH投与終了時に年齢を一致させた雌性ドナー（n = 4）、FMT雄性受容体（n = 3）、および非FMT雄性マウス（n = 4）から糞便を採取した。これら3群間の細菌多様性の変化を評価するため、これらの糞便のDNAサンプルから全長16Sアンプリコンライブラリーのナノポアベースのシークエンシングを行った。腸内細菌叢の豊かさは希薄化曲線によって推定され、サンプル間で同様のパターンを示した（図6A）。異なるEtOH処理群におけるα多様性を調べるため、Shannon指数とobserved-OTUs指数を算出した。FMT前の抗生物質処理から予想されるように、観察OTUs指数はFMT群で有意に低かったが、OTUの相対存在量（均等性）はシャノン指数に反映されるように群間で同程度であった（図6B）。次に、同定された上位10菌種の相対存在量に注目したところ、女性＋FMTサンプルと男性＋FMTサンプルは、その優勢なVerrucomicrobia属、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属（図6C）に従ってより近くにクラスター化し、ベースラインの男性グループと比較して、ドナーの女性グループと男性＋FMTグループの間で、種レベルでより類似した腸内細菌叢組成を明らかにした（図6D）。これらの結果から、FMTは雄マウスの微生物叢組成を、EtOH中毒に対してより保護的な雌のような腸内微小生態系に回復させる可能性があることが示唆された（図6E）。

図6
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図 6. EtOHで処理したFMT雄マウスにおける腸内細菌叢の変化の特徴。(A）EtOH処理後のメス、オス、およびオス＋FMTマウスの糞便中の細菌16S rRNAのナノポアベースのロングリードシーケンス24時間後の希薄化曲線。(B）グループ間のObserved-OTUsとShannon indexで測定したアルファ多様性。(C)各サンプルの上位10位までのOTUにおける系統の分布による階層的クラスター分析。(D) 種レベルで分類された上位10個のOTUの相対存在量（％）によるグループ間の推定関係を示すサンキー図。(E)アルコール中毒の性差特異的病態生理学の提案モデルと、雌性糞便微生物叢移植（FMT）が雄性レシピエントマウスの腸-肝臓軸に及ぼす影響。*p < 0.05.

考察
先に我々は、若いげっ歯類における実験的急性アルコール傷害に反応して、腸-肝臓軸が変化することを示した(23)。興味深いことに、透過性の増加と腸内細菌叢の変化に伴う腸管上皮バリアの変化が明らかであった。重要なことは、若い雌のマウスは、暴飲暴食に反応して肝障害を起こしやすく、特に脂肪症と炎症のマーカーにおいて顕著であったことである(23)。

本研究では、成熟動物におけるエタノールの腸肝軸への影響に関する現在の理解を深めることに焦点を当てた。高齢のマウスや霊長類では腸の機能が低下しており（32, 33）、高齢者集団では腸障害が増加していることが以前に報告されている（34）。

本研究では、52週齢の成熟成体マウスを用い、我々が以前に発表したエタノール中毒モデルを用い、中高齢集団におけるEtOHの影響を理解することを目的として、腸および肝臓の障害を評価した。その結果、成熟成体雄性マウスは同齢雌性マウスと比較して、実験的急性エタノール曝露後に腸管透過性の亢進、TJ数の減少、粘液防御能の低下を示した。われわれの結果と同じであるが、高齢マウスを用いた実験では、高齢マウスのEtOH曝露がFITC-デキストランの血中への漏出を促進することが報告されており(35)、正常な状態ではZO-1やオクルジンなどのTJsタンパク質によって部分的に支えられている腸管バリアが影響を受けていることがわかる(36)。加齢が進むと腸管透過性が高くなり、アルコールが腸-肝臓軸でより有害な作用を及ぼすと推測したくなる。この仮説と一致するように、老化マウス（33、37）や高齢者（38）では腸管透過性の亢進が観察されている。腸管バリアの破壊が肝臓に有害な影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、我々は続いて肝障害と炎症について研究した。その結果、中年齢の雄マウスは同年齢の雌マウスに比べ、EtOH誘発肝細胞傷害および肝脂質蓄積に対してより感受性が高いことが示された。注目すべきは、中年動物におけるEtOHへの急性曝露モデルは、高濃度のエタノールへの慢性曝露が肝炎（6, 39）や老化（35）を引き起こすという過去の文献を裏付けていることである。

炎症や肝細胞傷害以外にも、老化は自然免疫反応やエタノール代謝の変化など複数の病態生理学的メカニズムと関連している(40)。重要なことは、中年齢のマウスは、（SIRT1のダウンレギュレーションを介して）長期にわたる慢性的かつ多量の暴飲暴食の後、より大きな肝臓線維症に罹患しやすいということである(40)。

アルコールは、腸管バリア機能を破壊して微生物LPSの門脈循環および肝臓への移行を促進することにより、腸内細菌異常を引き起こす(41)。実際、アドヘレンスジャンクション（AJ）やTJタンパク質の発現の減少、柵状内皮の隔膜に関連する膜貫通タンパク質である形質膜小胞関連タンパク質-1（PV-1）の増加（42）といったGVBの変化が、細菌の播種と相関していることが証明されている。例えば、サルモネラはGVBに侵入し、ALT値を上昇させるだけでなく、内皮の漏出も引き起こす(43, 44)。

したがって、我々は、EtOH中毒にかかりにくい成熟雌性ドナーからの糞便微生物叢移植（FMT）が、同年齢の雄性マウスで観察された腸-肝臓軸障害を減弱させる可能性があると仮定した。興味深いことに、中年雌マウスの腸内細菌叢は、EtOH曝露後の同年齢雄マウスの腸透過性、肝細胞傷害および脂質蓄積を部分的に回復させることが可能であった。FMTは、アルコール関連肝疾患（ArLD）の管理に、その主要な障害である腸内細菌異常に作用することが示唆されている。げっ歯類を用いたエレガントな研究では、ArLDに関連した肝障害は、適切なドナーからFMTを行うことで移行可能であり、治療も可能であることが示唆されている(45)。他の報告では、若齢マウスと高齢マウスの間でFMTを行うと、レシピエントの微生物叢組成がドナーに似た組成に置換され、特定の細菌種が濃縮され、その結果得られる腸内微生物組成の代謝能が変化することが示されている（46）。われわれの結果と一致するように、雌のドナーの微生物は雄の消化管でよりうまく定着した(47)。腸内細菌叢は年齢と性別に特異的であり、性別に依存した形で炎症と代謝に影響を及ぼす(48)。加齢に伴う腸内細菌叢の組成、多様性、機能の変化は、腸の透過性を高め、免疫反応を活性化することが提唱されている(49)。さらに、生後52週齢の雌雄マウスでは腸内細菌叢に性差が認められ、加齢に伴う罹患率や死亡率に影響を及ぼす可能性があることが明らかになった(48)。性差のあるマイクロバイオームは、マイクロジェンダーホームと呼ばれている(50)。これらのデータを総合すると、成熟した成人のアルコール関連障害を管理するためのFMTの役割が証明された。FMT後に雄マウスで発現が増加した細菌種の中で、パラバクテロイデス・ゴールドスタイニーは際立っている。その抗肥満作用が報告されており、肥満の抑制、脂肪組織熱産生の増加、腸の完全性の向上、マウスにおける炎症とインスリン抵抗性のレベルの低下などが含まれる(51)。別の細菌であるバクテロイデス・アシディファシエンス（Bacteroides acidifaciens）もまた、FMT後の男性で増加し、肝細胞アポトーシスの減少を介してコンカナバリンA tによって誘発された肝障害の改善と関連している（52）。バクテロイデス・アシディファシエンスは酢酸産生にも寄与し、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）の発症を予防する(53)。さらに、キネオトリックス・アリソイデスは、FMT後の雄マウスでも存在感の増加を示した。代謝異常関連脂肪性肝疾患（MASLD）モデルマウスにおいて、キネオトリックス・アリソイデスを投与した動物は、高フルクトース・高脂肪（HFHF）食を与えたマウスの肝臓において、肝細胞のバルーン化と脂肪沈着の減少を示した。さらに、キネオトリックス・アリソイデスを投与したHFHF飼育マウスの精巣上体脂肪中の脂質滴サイズも減少した。これらの結果は、キネオトリックス・アリソイデスがHFHF食による肝臓への脂肪蓄積を抑制する可能性を示している(54)。このような腸内細菌叢の変化はすべて、少なくとも部分的には、暴飲暴食のプロトコール後に中年齢の雌性マウスドナーからのFMTが中年齢の雄性マウスレシピエントに対して及ぼすポジティブな効果を説明できるかもしれない。

というのも、中年期は寿命の中で非常に重要な時期であり、晩年期の健康に強く影響するからである。実際、暴飲暴食の量と頻度は、中年成人の健康とウェルビーイングに同時的・前向きに影響を及ぼす。閉経前後の女性において、アルコールの使用と健康との関係や、内因性・外因性ホルモンのような因子がアルコールとどのように相互作用して健康に影響を及ぼすかを明らかにすることが強く求められている。

同等のアルコール摂取量であれば、女性はエタノールの排泄速度が速いにもかかわらず、男性よりも高い血中アルコール濃度を示す傾向がある。しかし、経口摂取による血中アルコール濃度の男女差は、静脈内投与では観察されなかった(55)。この男女差は、男性に比べて女性の胃アルコール脱水素酵素（ADH）活性が低いことと関連している(56)。興味深いことに、50歳以上では、胃ADH活性のKmは加齢とともに減少するのは男性だけで、女性では減少しない。その結果、初回通過代謝における性差は、高齢者では等しくなるか、あるいは逆転する傾向にあるが、これはおそらく、女性よりも男性に多い胃粘膜萎縮のためであろう(56, 57)。FMT前後の中年雌雄マウスの胃ADH活性をさらに調べれば、腸内細菌叢がアルコール代謝にどのような影響を及ぼすかについて貴重な知見が得られるであろう。さらに、今回の実験から、暴飲暴食による明らかに多様な健康影響に関与する潜在的なメカニズムが明らかになるかもしれない。加齢に伴う表現型は、加齢関連炎症（炎症老化とも呼ばれる）と呼ばれる全身性炎症の状態と強く関連している。すべての研究が同じ変化の方向を報告しているわけではないが、加齢マウスにおけるTLR発現を調べた研究のほとんどは、高齢になるとマウスやヒトのTLR発現が低下することを示唆している(58)。しかし、我々の研究は52週齢の中高齢動物で行われたものであり、18～24ヵ月齢のマウス-特に老齢マウス-で行われたものではない。したがって、EtOHはTLR発現を増加させ、FMTによって改善された。TLR4の活性化は、老化に関連した表現型を含む様々な炎症性メディエーターの産生を促進するが、FMT後には明らかに回復した。

まとめると、本研究は、成熟成体マウスにおけるEtOH曝露の消化器系における性差特異的影響を初めて報告し、加齢に伴う腸管漏出、肝細胞傷害および脂肪症を回復させるための新たな治療手段としてFMTを提案するものである。

データの利用可能性
本研究で発表した16S rRNA遺伝子のロングリードシーケンスデータは、NCBI Gene Expression Omnibusに寄託されており、GEO Seriesのアクセッション番号GSE263477からアクセス可能である。

倫理声明
動物実験は、Conserjería de Medio Ambiente, Administración Local y Ordenación del Territorio (PROEX 125.1/20 and 264.2/23)により承認された。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献
AL-P：データキュレーション、調査、方法論、原稿執筆、校閲・編集。MM：データキュレーション、バリデーション、執筆-校閲-編集、調査、方法論。MG-L： MG-L：概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、バリデーション、執筆-校閲-編集。OE-V： OE-V：調査、方法論、ライティング、レビュー、編集。RB-U: 調査、方法論、ライティング・レビューと編集。AG：ライティング・レビューと編集、調査、方法論。HH: 調査、方法論、ライティング・レビューと編集。HL：調査、方法論、執筆-校閲-編集。JV：データキュレーション、調査、方法論、執筆・校閲・編集。RB: データキュレーション、調査、方法論、執筆-校閲-編集。EM-N：データキュレーション、資金獲得、方法論、執筆・査読・編集。SR: 監修、バリデーション、執筆・査読・編集、形式分析、調査、方法論。YN：資金獲得、方法論、監修、原案執筆、執筆-校閲-編集。GJ：データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、監修、原案執筆、校閲・編集。FC：概念化、データキュレーション、資金獲得、プロジェクト管理、スーパービジョン、バリデーション、原稿執筆、執筆-校閲-編集。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または出版のために財政的支援を受けたことを表明する。本研究は、MICINN Retos PID2020-11782RB-I00およびPID2020-117941RB-I00//AEI/10.13039/501100011033からYNおよびFCに、MCIN/AEI/10.13039/501100011033からSRに、EXOHEP2-CM (S2022/BMD-7409)およびHORIZON-HLTH-2022-STAYHLTH-02から契約番号101095679に基づくPID2020-112994RB-I00の助成を受けた。研究グループは、有効な研究グループRef. 970935 "Liver Pathophysiology"、920631 "Lymphocyte immunobiology"、920361 "Inmunogenética e inmunología de las mucosas"、IBL-6（imas12-associated）に所属。FCとGJはThe Wellcome Leap Dynamic resilience program（テマセク・トラストとの共同研究）の助成を受けた。AL-PはUCM Real Colegio Complutense (RCC) Harvard-Santander scholarship CT17/17-CT18/17を受けた。GJはANID-Chileの11220927プロジェクトFondecyt-IniciaciónおよびFundación CarolinaのEstancias Cortas Postdoctoralesプログラムの支援を受けた。

利益相反
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

著者は、投稿時にFrontiers誌の編集委員であったことを申告した。このことは、査読プロセスおよび最終的な決定には影響しなかった。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはそのメーカーが主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2024.1393014/full#supplementary-material からオンラインで入手できる。

略語
ABx、高用量抗生物質カクテル、ArLD、アルコール関連肝疾患、ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ、AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、BAC、血中アルコール濃度、BW、体重、EDTA、エチレンジアミン四酢酸、EtOH、エタノール、FMT、糞便微生物移植、H&E、ヘマトキシリン・エオシン、LPS、リポ多糖； LW、肝臓重量；NIAAA、米国アルコール乱用・アルコール依存症研究所；ORO、オイルレッドO；PBS、リン酸緩衝生理食塩水；PFA、パラホルムアルデヒド；SA-β-gal、老化関連βガラクトシダーゼ；SEM、平均値の標準偏差；SIRT1、サーチュイン1；TJs、タイトジャンクション；TLR、toll-like receptor；WT、野生型；ZO-1、zonula occludens-1。

参考文献

レームJ、シールドKD。アルコール使用障害とアルコール性肝疾患の世界的負担。Biomedicines. (2019) 7:99. doi: 10.3390/biomedicines7040099

フルテキスト｜Google Scholar

Cabezas J, Bataller R. アルコール性肝疾患：英国の新しいアルコールガイドラインとドライ1月：酒を断つのに十分か？Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (doi: 10.1038/nrgastro.2016.39