溶菌性バクテリオファージはヒト呼吸器上皮細胞から抗ウイルス性および炎症性サイトカインの分泌を誘導する
研究論文
溶菌性バクテリオファージはヒト呼吸器上皮細胞から抗ウイルス性および炎症性サイトカインの分泌を誘導する
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002566
ポーラ・F・ザモラ、トーマス・G・レイディ、キャサリン・R・アームブルスター、ミン・スン、ダリア・ヴァン・タイン、ポール・E・ターナー、ジョナサン・L・コフ、ジェニファー・M・ボンバーガー
要旨
ファージ療法は、多剤耐性（MDR）感染症を治療するためのアプローチであり、溶菌性バクテリオファージ（ファージ）を用いて細菌を駆除する。東欧では抗菌薬としての成功例が数多く報告されているにもかかわらず、ヒト宿主への影響に関するデータはほとんどない。ここでは、多くの慢性呼吸器疾患において細菌のバイオフィルムが形成される組織部位である気道上皮の細胞と、溶菌性ファージがどのように相互作用するかを理解することを目的とした。緑膿菌ファージのパネルと嚢胞性線維症（CF）患者由来のヒト気道上皮細胞（AECs）を用いて、ファージと上皮細胞の相互作用は、微小環境の物理化学的特徴だけでなく、特定のファージの性質にも依存することを明らかにした。気道上皮は、ファージを内在化することは苦手であるが、転写プロファイルを変化させ、特定のファージファミリーと相関する抗ウイルス性および炎症性サイトカインを分泌することによって、ファージ暴露に応答する。全体として、我々の知見は、ファージに対する哺乳類の応答は不均一であり、ファージ治療中に呼吸器系の局所防御が細菌の除去を助ける方法を変える可能性があることを示している。従って、特定の細菌分離株におけるファージレセプター特異性の他に、治療に用いる溶菌性ファージを選択する基準を、哺乳類細胞応答を含めて拡大すべきである。
引用 Zamora PF, Reidy TG, Armbruster CR, Sun M, Van Tyne D, Turner PE, et al. (2024) 溶菌性バクテリオファージは、ヒト呼吸器上皮細胞から抗ウイルス性および炎症性サイトカインの分泌を誘導する。PLoS Biol 22(4): e3002566. doi:10.1371/journal.pbio.3002566
編集者 ジェレミー・バー、モナシュ大学、オーストラリア
受理された： 2023年9月29日受理： 受理：2023年9月29日; 受理：2024年2月27日; 掲載：2024年4月23日 2024年4月23日発行
Copyright: © 2024 Zamora et al. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンスの条件の下で配布されるオープンアクセス論文であり、原著者および出典のクレジットがあることを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可する。
データの利用可能性： 関連データは論文およびそのSupporting Informationファイル内にある。RNAシーケンスFASTQファイルはNCBI SRAデータベース（BioProject PRJNA1075455）から入手可能。NCBI GEOでは、アクセッション番号GSE255619で生カウント表と関連メタデータが利用できる。この解析のコードはhttps://github.com/Bomberger-Lab/ およびhttps://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.10723798。ファージ配列はNCBI GenBankから入手可能（PSA04 MZ089728、PSA34 MZ089739、OMKO1 ON631220、LPS-5 PP203294）。
資金提供 この研究は、Cystic Fibrosis Foundation (CFF, www.cff.org)の博士研究員奨学金ZAMORA20F0およびNational Institute of Health (NIH, www.nih.org)の助成金T32AI060525によりP.F.Z.に助成された。 C.R.A.にはCFF助成金ARMBRU19F0およびARMBRU22F5、NIH助成金T32HL129949を、J.M.B.にはCFF助成金BOMBER21P0を授与した。本研究の助成者は、研究デザイン、データ収集および解析、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
競合利益： PETは、ヒト治療のためのファージ開発を目指すフェリックス・バイオテクノロジー社の共同設立者である。イェール大学はこのプロジェクトに関して組織的利益相反がある（PETとJLK）。イェール大学はこのプロトコールで使用された治療法に関して金銭的利益を受ける可能性がある。
略語 3D、3次元;AEC、気道上皮細胞;ALI、気液界面;ASL、気道表面液;CDC、疾病管理予防センター;CF、嚢胞性線維症;COPD、慢性閉塞性肺疾患； DAMP、損傷関連分子パターン;FBS、ウシ胎児血清;FDA、食品医薬品局;G6PD、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ;GEO、遺伝子発現オムニバス;HEMT、高効率モジュレーター療法;IPA、創意工夫経路解析； LB、溶菌ブロス、LOD、検出限界、MDR、多剤耐性、MEM、最小必須培地、NTA、ナノ粒子追跡分析、PAMP、病原体関連分子パターン、PFU、プラーク形成単位、pwCF、嚢胞性線維症患者； SEAP、分泌型胚アルカリホスファターゼ、SEM、平均値の標準誤差、TEER、経上皮電気抵抗、TEM、透過型電子顕微鏡、TLR、Toll様受容体、TNF、腫瘍壊死因子。
はじめに
ファージ療法は、特定の細菌株に感染して死滅させるバクテリオファージ（またはファージ）を利用した、多剤耐性（MDR）感染症を治療するための新たな治療法である[1]。米国では臨床試験やコンパッショネートユース（緊急時使用許可による）のケースでファージ療法が使用されることが増えているが [2]、グルジア、ポーランド、ロシア [3]では、治療が困難な感染症にファージを処方することが日常的な医療行為となっており [4]、ファージ療法には数十年の経験がある。西ヨーロッパでのファージ療法の成功や、エリアバ・バクテリオファージ・微生物学・ウイルス学研究所（グルジア、トリリシ）やルドウィク・ヒルシュフェルド免疫学・実験療法研究所（ポーランド、ブロツワフ）の研究のおかげで、西ヨーロッパではこの治療戦略に対する関心が再び高まっている。ファージの単離、調製、応用に関する彼らの専門知識は、臨床試験を計画し、ファージ療法へのアクセスを拡大する上で極めて重要である[5]。細菌による抗生物質耐性の増加 [6]と、抗生物質パイプラインにおける新規化合物の減少 [7]という問題を考慮すると、米国では感染症の潜在的治療法としてファージ療法を検討することが不可欠である。
ファージ療法に対する興奮の一部は、副作用がほとんど報告されておらず、比較的安全であると考えられていることに起因している [8]。ファージ療法では溶菌性ファージを優先的に使用し、ファージは哺乳類細胞内で複製できないため、ヒトの宿主には無害であると考えられている［1,9］。しかしその一方で、バクテリオファージが真核細胞に結合し、取り込まれる可能性があることが報告されている [10-12]。この知識は、治療効果を引き出すためには高用量のファージが必要とされることが多いため、治療におけるファージに懸念を抱かせるものである[1,13-15]。さらに、ファージは自己複製能力を持つため、治療中にファージの濃度が上昇し、ファージの複製が維持できなくなるまで感受性菌の数が減少する。その結果、哺乳類の粘膜表面は治療中にファージと接触する可能性が高い。
ファージ療法はさまざまなMDR感染症の治療に用いられているが [2]、最も有望な応用例のひとつが緑膿菌の治療である。緑膿菌は、利用可能なほとんどすべての抗生物質に耐性を持つMDR株が出現しているため、人間の健康にとって深刻な脅威であると疾病管理予防センター（CDC）によって分類されている細菌である［16］。日和見病原体である緑膿菌感染は、入院患者や免疫力の低下した人々など、脆弱な集団において特に危険である [17] 。嚢胞性線維症（pwCF）は、肺に濃厚で粘着性の粘液が蓄積することを特徴とする遺伝病であり、一般的に生涯にわたる慢性の緑膿菌感染症を抱え、抗生物質による治療を繰り返し必要とする [18] 。緑膿菌感染症は、pwCFにおける肺機能の低下と相関しており、この集団における呼吸不全と死亡の主な原因となっている [19] 。これらの理由から、緑膿菌感染症を治療するための代替療法を見つけることが非常に必要であり、ファージ療法はそのような選択肢のひとつである。
現在、肺感染症の治療はファージ療法の最も一般的な指標のひとつである [20] 。しかし、ファージ療法が普及する前に、ファージと肺の相互作用に関する知識の重要なギャップに答える必要がある。治療中にファージをより適切に選択するためには、溶解性ファージの免疫原性に関する情報が必要である［20］。細胞膜受容体-リガンド特異性に加えて、哺乳類細胞はウイルスやその他のナノ粒子をサイズや形状に依存して取り込む［21,22］。同じ細菌特異性を持つファージでも物理的な特徴が異なるため、ヒト宿主との相互作用も多様である。肺がファージ療法にどのように反応するかをよりよく理解するために、われわれは治療の可能性のある溶菌性バクテリオファージのパネルと呼吸器上皮細胞との関連を調べた。ファージが気管支上皮細胞と相互作用する際には、粘膜微小環境の特異的性質に加えて、ファージ固有の形態学的特徴に依存することが示された。気管支上皮細胞のファージ取り込み速度は、他の報告されている細胞種よりも遅く［11］、一部のファージは基底側腔まで通過できることから、選択されたファージが吸入ファージ療法中に血流に入る可能性が示唆された。まれにしか取り込まれないにもかかわらず、気道上皮はファージを検出し、免疫関連遺伝子の発現に富むトランスクリプトーム反応を起こす。以上の結果から、呼吸器上皮細胞は溶菌ファージを感知し、反応することが示された。その結果、ファージ療法は、細菌量を減少させるファージの直接的な効果とは独立したメカニズムによって気道に変化を引き起こす可能性がある。このような変化をファージ投与前に予測することで、この治療効果を増強できる可能性がある。
結果
治療用緑膿菌溶菌バクテリオファージのパネルは遺伝的・形態的に多様である
CF気道におけるファージ療法をモデル化するために、米国食品医薬品局（FDA）の緊急使用認可の下、pwCFにおいて治療的に使用されている緑膿菌ファージのパネルと、慢性MDR緑膿菌感染症を治療するための臨床試験（NCT04684641）を利用した[23]。我々はこのパネルを、病院廃水から得られた緑膿菌ファージで補完した。このファージは、治療用途に使用するために分離されたpwCFの様々な緑膿菌臨床分離株に対して溶菌活性を有する[24]。大量の緑膿菌培養液で高力価で複製する能力について最初の特性評価を行った後、さらなる研究のために4つのファージのパネルを選択した。これらのファージはOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34と名付けられた（S1図）。哺乳類細胞培養研究に利用する高純度ファージ粒子を得るために、数回のろ過工程、ヌクレアーゼ処理、2回連続の塩化セシウム（CsCl）勾配遠心分離を用いたプロトコルを開発し、細菌タンパク質、細菌核酸、内毒素をほとんど含まないファージ調製物を得た（S1表）。注目すべきは、CsCl勾配により、密度の違いから密度勾配中のファージと汚染細菌産物を分離できたことである。さらに、ファージバンドは遠心分離チューブの極薄の壁を穿刺することで回収され、ファージと細菌残渣の相互汚染を防ぐことができた（S1図）。
このファージの溶菌活性を確認するために、実験室適応株と臨床分離緑膿菌のパネルを用いて、無生物的な浮遊性およびバイオフィルム条件下で増殖させた緑膿菌と、CFヒト気道上皮細胞（AECs、CFBE41-細胞株、ホモ接合性ΔF508 CFTR気管支上皮細胞株）と関連して増殖させたバイオフィルムを用いて、殺傷アッセイを行った（図1A、1B、S2、およびS2表）[25]。全体的に、LPS-5とPSA34は、OMKO1とPSA04よりも殺傷活性が高いことがわかったが、各ファージ-細菌のペアに対する殺傷の程度は、各アッセイで異なっていた。これらのファージの形態と構造の特徴を調べるために、精製したファージストックの透過型電子顕微鏡（TEM）を行った（図1Cと1D）。ファージOMKO1とLPS-5はミオウイルスであることが判明し、PSA04とPSA34はそれぞれサイホウイルスとポドウイルスとして確立された。OMKO1は長軸が400nmのジャンボファージで、他のファージよりもサイズがはるかに大きい（図1D）。LPS-5、PSA04、PSA34ファージは、それぞれ長軸が150nm、200nm、80nmであった。頭の大きさは似ているが、尾の性質は異なっていた。LPS-5は硬い尾部を持っていたが、PSA04はより長く柔軟な尾部を持っており、PSA34は非常に短い尾部を持っていた。ファージ粒子の構造的特徴は、それらが遭遇する哺乳類細胞との相互作用を定義する鍵となることから[11]、これらのデータは、我々のパネルに含まれる異なるファージが、異なる哺乳類細胞応答を引き起こす可能性を示唆している。
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図1. ファージパネルは臨床に関連する様々な形態の溶菌性ファージを示す。
(A）PAO1、DVT411、DVT423株の緑膿菌バイオフィルムをLB培地中のプラスチックウェル上で18時間培養した。(B）PAO1、DVT411、DVT423をCFBE41-細胞上で、MEM中で16時間培養した。細菌凝集体を可溶化し、遠心分離によって細菌細胞とファージを分離した。バイオマスはCFUドリップアッセイで定量した。(C）陰性に染色したファージのTEM写真の代表的な画像。スケールバーは50nm。(D）ファージの構造的特徴を示す表。ファージは形態によって分類された。キャプシドと尾の長さの測定は、3つの独立した画像からの平均長さを用いてImageJを用いて行った。エラーバーは3つの独立した生物学的複製のSEMを示す。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。MEM、最小必須培地、PFU、プラーク形成単位、SEM、平均値の標準誤差、TEM、透過型電子顕微鏡。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g001
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ファージの分類学とゲノムの特徴を評価するために、ファージDNAの全ゲノム配列を決定し、ゲノムをアセンブルして注釈を付け、BlastNを用いてファージ同士や以前に配列決定されたファージと比較した（S1表）。この原稿提出時点でNCBIでゲノム配列が入手可能な、形態が既知でゲノム配列が入手可能な優先宿主細菌を持つファージの文献検索を行い、我々のファージパネルと他の溶菌性ファージとの系統関係を決定した（図2）。ファージOMKO1、LPS-5、PSA34は、同様の形態とゲノム長を持つファージとクラスターを形成した。対照的に、PSA04ファージは他のファージよりも遺伝的に乖離しており、解析した他のサイホウイルスとはクラスター形成しなかった。興味深いことに、形態やゲノムの長さが類似したファージのクラスター内では、頭部と尾部の長さが異なっており、系統的に近縁なファージが必ずしも形態的に類似しているわけではないことが示唆された。これらのファージは、臨床的に緑膿菌慢性感染症の治療に使用されている様々なファージを代表するものである。
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図2. 系統学的にも形態学的にも異なるファージパネル。
ファージ間の系統学的距離を示す中点根付の木で、枝の数字はブートストラップ値を示す。ファージは、そのゲノム配列と宿主のゲノム配列にアクセスでき、TEM画像が入手可能なものを選んだ。頭部と尾部の長さはImageJを用いて測定した。スケールバーは部位ごとのアミノ酸置換数を表す。本研究で使用したファージには下線を引いた。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。TEM、透過型電子顕微鏡。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g002
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ファージと気道上皮との相互作用は、酸性pH下および上皮のリモデリング領域で促進される
次に、ファージが気道上皮と会合する能力を評価しようとした。気道表面液（ASL）の酸性pHは、CFや慢性閉塞性肺疾患（COPD）などの炎症性疾患の病態生理の特徴であるため、酸性pHがファージと気管支上皮細胞との相互作用に影響を及ぼすかどうかを試験した[26-29]。ファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34を、pHを6.5または7.5に調整した細胞培養液中でCF AECと24時間（h）アピカルにインキュベートし、プラークアッセイにより洗浄後に残存する生存ファージを定量することで、ファージと気道上皮との会合を決定した（図3AおよびS3）。その結果、pH6.5はpH7.5よりも哺乳類細胞とファージの相互作用を促進することがわかった。細胞との相互作用の増加は、ミオウイルスOMKO1とLPS-5で統計的に有意であったことから、ビリオンの形態が上皮とファージの相互作用におけるpH依存性の一因であることが示唆された。我々は、CF AECをpH6.5または7.5で24時間処理した後、蛍光標識したファージを共焦点顕微鏡で観察することで、これらの研究を補完した（図3B、3C、S3）。酸性pHは気道上皮上での粒子凝集を促進することが観察された。呼吸器細胞と会合した粒子の総数を定量したところ、ファージLPS-5とPSA34では、pH7.5で培養した場合と比較して、酸性pHでは会合した粒子の数が多くなる傾向があり、この会合の増加はファージOMKO1では統計的に有意であった。ファージPSA04では、pHは会合した粒子の総数に影響しなかったが、一般に、パネルの他のファージと比較して、哺乳類細胞との会合が不十分であった。凝集体の大きさでビニングすると、pH6.5と比較してpH7.5では、より小さなサイズの粒子の割合が高いことがわかった。このことは、粘膜表面の局所的なpHがファージ-ファージ相互作用に影響を与えることを示唆している（図3Dおよび3E）。ファージPSA04とPSA34は、OMKO1とLPS-5と比較して、pH6.5では5μm3以上の粒子の割合が有意に高かったことから、ミオウイルスは上皮細胞上で凝集しにくいことが示唆された。重要なことに、気道上皮がない場合のファージ粒子の動態は、どちらのpH値でも同程度であり、ファージの凝集が気道粘膜表面に依存していることを示唆している（S4図）。全体として、我々の実験から、ファージと気道上皮の結合はpHに依存し、異なるファージファミリーに特異的であることが示された。
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図3. 気道上皮とファージの相互作用はpHに依存する。
(A）CFBE41-細胞を、pHを6.5または7.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で24時間先端処理した。(B～E）CFBE41-細胞を、pHを6.5または7.5に調整したMEM中で、蛍光標識したファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34（マゼンタ）で1×109 PFU/mlの濃度で24時間アピカル処理した。細胞は蛍光標識したファロイジン（シアン）とヘキスト（イエロー）で染色し、それぞれアクチンと核を標識した。(B）共焦点顕微鏡のZスタックの3D再構成。スケールバー、10μm。(C～E) Nikon Elementsの3D Object Measurement機能を用いて、Alexa Fluor 555陽性粒子を3D再構成で同定した。(C) 両pH条件における0.05 μm3以上の粒子の総数。(DおよびE) 0.05μm3以上の粒子を、0.05～0.5μm3、0.5～5μm3、5μm3以上の3つのグループに分類した。エラーバーは3つの独立した生物学的複製のSEMを示す。*p < 0.05, ****p < 0.0001。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。3Dは3次元、MEMは最小必須培地。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g003
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ファージと上皮の相互作用をイメージングすると、凝縮した核物質が豊富な領域でファージが繰り返し発見されることが観察された。上皮組織におけるこのような現象は、細胞の押し出しによる細胞リモデリングと関連していることが多い。これは、細胞骨格タンパク質がアポトーシス細胞や過密状態の細胞の周囲を収縮し、バリア機能を破壊することなく上皮層から細胞を除去する恒常的な組織プロセスである[30,31]。ファージが上皮領域により頻繁に局在するかどうかをよりよく理解するために、上皮の押し出しの速度がその時間枠よりも遅いので、ファージが細胞のリモデリングを誘導する可能性を除外するために選んだ時間である、我々のファージパネルで1時間アピカル処理した後のCF AECを撮像した（図4A）。ファージは、上皮が押し出される際に露出または放出される細胞成分と結合する可能性を示唆している。ホスファチジルセリン（アポトーシス時に外葉に反転する細胞膜リン脂質）を染色したイメージング実験では、ホスファチジルセリン染色が陽性である領域と陰性である領域の両方で、ファージが結合していることがわかった（S5図）。この観察は、ホスファチジルセリンはファージと上皮の会合には必要ないことを示唆している。
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図4. ファージは細胞の完全性を破壊することなく、上皮のリモデリング領域に位置する。
(A）CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、蛍光標識したファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34（マゼンタ）を1×109 PFU/mlの濃度で1時間、先端処理した。細胞は蛍光標識したファロイジン（シアン）とヘキスト（イエロー）で染色し、それぞれアクチンと核を標識した。画像は共焦点顕微鏡のZスタック（左）、XZおよびYZ投影（右）の3D再構成として示されている。赤い矢頭は、アクチン染色と核外物質が豊富な領域を示す。スケールバー、10μm。(B）CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で48時間アピカル処理した。点線は、完全性が破壊された細胞のTEER値を示す。値は、各処置の読み取り値から、細胞を含まないトランスウェルインサートの値を差し引いた値で示されている。(C）CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で先端処理し、24時間培養した。上清を回収し、レサズリンのレゾルフィンへの還元を蛍光で測定することにより、G6PD活性を定量した。値は、各ファージの蛍光値とネガティブコントロール（MEMで希釈した透析バッファー）の蛍光値との差として示され、その後、溶解バッファーが投与された細胞からの測定上清の蛍光値に対して正規化された。アポトーシス陽性対照としてスタウロスポリン（1μM）を用いた。エラーバーは3つの独立した生物学的複製のSEMを示す。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。MEM、最小必須培地；G6PD、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；TEER、経上皮電気抵抗。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g004
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ファージが上皮の完全性を失わせないことを検証するために、ファージ処理48時間中の経上皮電気抵抗（TEER）を測定した（図4B）。ファージとインキュベートした細胞培養は、処理期間中TEERを維持した。ファージが細胞死を引き起こさないことを確認するために、細胞内酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）の先端培地への放出を測定することによって、ファージの細胞毒性を評価した（図4C）。その結果、G6PDの放出を誘導しなかったことから、ファージ処理はCF AECモデルにおいて細胞毒性を示さないことがわかった。まとめると、ファージは哺乳類細胞を殺傷することはないが、上皮の再編成が起こった部分に付着する。
ファージは気道上皮に侵入し、その分布はファージ特異的である。
我々のイメージング実験では、ファージの局在は先端領域だけに分布しているわけではなく、いくつかのファージ粒子は上皮全体に分布していることが観察された。これらの観察を補足するために、ファージ処理1時間後と24時間後のCF AECにおけるファージの深さ分布を分析した（図5Aから5D）。1時間後、上皮全体におけるファージの分布は、異なる形態のファージで異なっていた（図5Aおよび5B）。ファージOMKO1とLPS-5は、上皮の深さに沿って分布し、平均分布は上皮全体の深さの50%前後に位置し、平均深さの上下に同程度の割合の粒子が存在した。対照的に、ファージPSA04とPSA34は、1時間のインキュベーションで全く異なる深さ分布を示した。ファージPSA04は、平均深度はファージOMKO1やLPS-5と同様であったが、ほとんどが上皮の深部に分布していた。ファージPSA34は主に先端側に局在し、細胞上で観察された凝集量と一致した。
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図5. ファージは気道上皮に浸透し、その深さはファージに依存する。
CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、蛍光標識したファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34（マゼンタ）を1×109 PFU/mlの濃度で、1時間（AおよびB）および24時間（CおよびD）、先端処理した。細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡用に固定した。細胞は蛍光標識したファロイジン（シアン）とヘキスト（イエロー）で染色し、それぞれアクチンと核を標識した。(AおよびC）共焦点顕微鏡のZスタックの3D再構成。スケールバー、10μm。Alexa Fluor 555陽性粒子は、虹色スケールで深さ方向に投影した粒子として示されており、先端に位置する粒子は青色、基底側に位置する粒子はピンク色で示されている。 BとD）Alexa Fluor 555陽性粒子は、Nikon Elementsの3Dオブジェクト測定機能を用いて3D再構成で同定した。そのZ位置は、各Zスタックの全深さに対するパーセンテージとしてプロットし、スタックの厚さは実験レプリケート間で同様とした。プロットは、3つの独立した共焦点イメージングスタックから追跡された粒子の深さを合計したものである。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。MEMは最小必須培地。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g005
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培養24時間後、ファージの上皮への侵入が時間依存的であることを示す、ファージ侵入の増加を発見した（図5Cおよび5D）。全体として、24時間後には気道上皮へのファージの侵入がより深くなり、ファージ間で均一性が増したことから、ファージの形態がファージと哺乳類細胞との初期の相互作用に影響を与えることが示唆された。1時間後の観察と同様に、ファージPSA34の位置は先端側に偏っていたが、他のすべてのファージはより深い位置に到達した。まとめると、気道上皮へのファージの侵入は時間依存的であり、ファージ特異的である。ミオウイルスOMKO1とLPS-5は同様の侵入パターンを示した。ファージPSA04は他のファージよりも上皮の奥深くまで侵入したが、試験したファージの中で最も小さいPSA34は先端部に局在する傾向を示した。
ファージと哺乳類細胞間の細胞内相互作用をより深く理解するために、細胞内のインタクトなファージを経時的に測定するプラークアッセイを行った[10]。プラークアッセイでは、感染して子孫を作ることができるファージのみを測定するため、このアッセイでは、まだ複製能力を持つファージ粒子を定量することができる。ファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34をCF AECの先端側に添加した。細胞内のインタクトなファージを処理後の異なる時間で定量した。1時間後、CF呼吸細胞におけるファージの内在化とファージの生存は一般的に悪く、内在化したファージは接種量の0.001%以下であった（図6A）。ファージLPS-5とPSA04は、OMKO1とPSA34よりも高い力価を示す傾向があり、ファージの内在化速度に違いがあることが示唆された。より遅い時点では、1時間培養後に最も多くのファージが内在化したファージLPS-5が、1時間後のものより3倍高い細胞内力価を示したことから、LPS-5の内在化がパネルの他のファージよりも先に飽和に達したことが示唆された（図6B）。ファージOMKO1とPSA04では、24時間後の力価は1時間後の力価の約10倍であった。ファージPSA34は24時間後の変化率が最も大きく、CF AECにおける力価は1時間後の力価の約25倍であった。
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図6. ファージの内在化、分解、基底側空間への移動はファージ特異的である。
CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で先端処理した。(A)プラークアッセイにより、溶解細胞中の総ファージと無傷細胞中の細胞外ファージを測定し、処理後1時間で内在化ファージを定量した。結果は、溶解細胞と無傷細胞の差として描かれ、接種量に対して正規化された。(B）プラークアッセイにより、処理後1、4、24時間で内在化ファージを定量した。各時点の結果は、処理後1時間の力価に対して正規化した。(C）24時間のファージ処理後、細胞外ファージを除去するために細胞を広範囲に洗浄した。広範な洗浄後0、24、48時間で、上記のように内在化ファージを定量した。結果は、広範な洗浄の0時間後の内在化ファージ量に対して正規化したパーセンテージでプロットした。(D)ファージの基底側空間への移行は、ファージ処理後1、4、24時間のプラークアッセイで測定した。結果は少なくとも3つの独立した生物学的複製の平均ファージ力価で示した。エラーバーはSEMを示す。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。MEMは最小必須培地。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g006
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次に、哺乳類細胞においてファージが異なる速度で分解されるかどうかを確認することを目的とした。我々は、CF AECをファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34と24時間インキュベートし、その後、細胞外ファージを除去するために広範囲に洗浄した。その時点（0時間後）、24時間後、48時間後に細胞を採取し、プラークアッセイを行い、上述と同様のアッセイ法を用いて無傷の細胞内ファージを定量した（図6C）。その結果、ファージOMKO1とLPS-5は同程度の速度で分解され、ファージPSA04とPSA34の分解速度よりも遅いことがわかった。24時間後、ファージOMKO1とLPS-5では洗浄時の約50％に相当するファージ力価が検出されたが、ファージPSA04とPSA34では同じ時点で25％の活性ファージ粒子しか検出されなかった。48時間後までには、OMKO1とLPS-5では25％のファージ力価が検出されたのに対し、ファージPSA04とPSA34では約10％であった。これらのデータは、ヒト呼吸器上皮細胞内では、ミオウイルスは他のタイプのファージよりも安定であることを示唆している。細胞内でのファージの分解は、各ファージの固有の安定性に影響される。哺乳類細胞非存在下、37℃の新鮮な細胞培養液中でファージの分解アッセイを行ったところ、ミオウイルスOMKO1とLPS-5は、ファージPSA04とPSA34よりも長く生存していることが確認された（S6図）。
ファージが基底側腔を通過することは、ファージが血液区画に入り、他の臓器に到達する可能性が高くなるため、ファージ療法中の懸念事項である。各ファージの上皮バリア越境能を調べるため、CF AECモデルで頂膜処理後の基底側ファージ量を測定した（図6D）。その結果、ファージは基底側コンパートメントに入る能力に違いがあることがわかった。我々のパネルの中で最も大きなファージであるOMKO1は、上皮層を通過することができず、基底側培地中の感染性ウイルスを定量することができなかった。しかし、LPS-5、PSA04、PSA34ファージでは、経時的に基底細胞側ファージの増加が検出された。ファージLPS-5では、24時間処理後、細胞がTEERを維持していても、細胞内力価と比較して高い力価が基底側部で検出された。この結果は、気道上皮がLPS-5の先端コンパートメントから基底側コンパートメントへの移動を促進していることを示唆している。PSA34の力価の約50％が細胞内力価と比較して基底側腔で検出されたことから、PSA34は基底側腔層を通過できるが、ファージLPS-5ほど効率的ではない可能性が示唆された。ファージPSA04の場合、基底側ファージ力価は細胞内力価の約15％であり、PSA04のファージ移行性は低いことが示唆された。全体として、ファージの形態、サイズ、凝集などの因子がファージと哺乳動物との相互作用に影響すること、したがって、ヒト宿主とのファージ動態はファージの種類ごとに特異的である可能性が高いことが示された。
気道上皮細胞はサイトカインシグナル伝達遺伝子の発現を増加させることによってファージに応答する。
次に我々は、呼吸器上皮細胞が精製した溶菌ファージを感知し、それに応答できるかどうかを調べた。ファージ処理したCF AEC由来のRNA配列決定を行った。ファージ陽性細胞を濃縮するため、CFBE41-細胞を蛍光標識したOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34に24時間曝露し、フローサイトメトリーによる細胞選別を行った。その結果、試験したすべてのファージが転写変化を引き起こし、その中核となる12の遺伝子が、評価したすべての条件下で有意に変化していることがわかった（図7A）。この12遺伝子はすべて、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達に関与するタンパク質をコードしており、ファージが呼吸器上皮によって病原体関連分子パターン（PAMP）として感知されたことを示している。マイオウイルスのOMKO1とLPS-5は、気道上皮上での安定性に優れ、凝集が最も少ないファージであり、サイホウイルスのPSA04やポドウイルスのPSA34よりも遺伝子発現の変化が少なかった。全体として、CF AECsのファージ処理による評価遺伝子の発現変化は2％未満であり、呼吸器細胞はトランスクリプトームを大きく変化させることなくファージ処理に耐えることが示された。パスウェイ解析の結果、複合Zスコアが最も高かったパスウェイは、病原体誘導性サイトカインストームシグナル伝達に関与するパスウェイであり、すべてのファージ処理細胞で差次的に発現した遺伝子のコアセットが免疫系のサイトカインシグナル伝達に関与しているという前回の観察結果を裏付けていた（図7B）。Zスコアが高い他の発現上昇経路も、多発性硬化症シグナル伝達経路やマクロファージ古典的活性化シグナル伝達経路、FAKシグナル伝達経路を含む細胞骨格再編成経路など、免疫系に関連していた。
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図7. AECは治療用ファージに応答してトランスクリプトームを変化させる。
CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、蛍光標識したファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34を1×109PFU/mlの濃度で24時間、先端処理した。ヒトゲノムへのアラインメントと正規化を行い、1つの処理条件につき少なくとも2つの独立したサンプルから得られたRNA配列を用いて、EdgeRにより発現差のある遺伝子を決定した。(A)ボルケーノプロットでは、ファージ処理細胞と未処理細胞の間で発現が増加（赤）した遺伝子と減少（青）した遺伝子を強調し、増減のカットオフ値は+/- 1.5、p < 0.001とした。描かれているのは、すべてのファージ処理条件で発現が異なる遺伝子である。(B)差次的に発現した遺伝子の各セットのIPA。ヒートマップは活性化Zスコアを示しており、示された経路と上流の制御因子が、未処理の細胞よりもファージ処理した細胞でより活性化されていることが予測される。(C）TNFスーパーファミリーに属する遺伝子の正規化転写産物量。転写量が非常に低い（10以下）遺伝子は含まれていない。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。AEC, 気道上皮細胞; IPA, ingenuity pathway analysis; MEM, 最小必須培地; TNF, 腫瘍壊死因子。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g007
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次に、病原体が誘導するサイトカインストームシグナル伝達経路に属する個々の遺伝子の発現を解析したところ、ファージ処理したすべての細胞で遺伝子発現の変化が最も大きかったのは、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーの遺伝子であった（S7図）。TNFスーパーファミリーは膜貫通タンパク質のスーパーファミリーで、細胞外でのタンパク質分解切断により可溶性となり、サイトカインとなる。我々は、LTA、LTB、TNF、TNFSF14の転写産物量が、未処理の細胞に比べて、ファージ処理したCFB41-細胞でアップレギュレートされていることを発見した（図7C）。これらのデータを総合すると、ファージは気道上皮によって病原体として検出され、サイトカインシグナル伝達経路のトランスクリプトーム変化を引き起こすことが示唆される。
気道によるサイトカイン分泌はファージに特異的である。
免疫関連遺伝子の転写の変化がサイトカイン分泌の変化をもたらすかどうかを決定するために、我々はCF AECを我々のファージパネルで処理し、処理後24時間に頂膜分泌液と基底膜分泌液を採取した。サイトカインはLuminexビーズベースアッセイで測定した（図8A）。その結果、特定のサイトカイン群がファージ処理によって増加することがわかった。ほとんどの変化は先端的に分泌されるサイトカインで起こり、気道上皮の防御プログラムが高度に極性化されていることを示唆している。ファージPSA04とPSA34で処理した細胞は、炎症性サイトカインの分泌を最も多く誘導したが、これはこれらのファージによって引き起こされるトランスクリプトーム上の変化を反映している。サイトカインTNFSF13B、TNFSF8、IL-8は、PSA04とPSA34で処理した細胞の頂膜上清で有意に増加したが、IFN-λ1はOMKO1とLPS-5で処理した細胞で有意に増加した（図8B）。我々のパネルに含まれる全てのファージは、もう一つの抗ウイルス性サイトカインであるIFN-βの基底側分泌を誘導した。これらの結果は、呼吸器上皮が抗ウイルス性および炎症性サイトカインを分泌することによって、溶菌性ファージに応答することを示唆している。
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図8. AECは炎症性サイトカインを分泌することでファージを感知し、応答する。
(AおよびB）CFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で先端処理し、24時間培養した。炎症性サイトカインは、マルチプレックスサイトカインアレイを用いて測定した。すべての生物学的複製について検出限界以上のサイトカインのみが示されている。(A）各ファージ処理条件と未処理条件との間の倍数変化を表したヒートマップ。(B）サイトカインTNFSF13B、TNFSF8、IL-8、およびIFN-λ1の生値で、ファージ処理条件と未処理条件の間で最も大きな変化を示した。(C）TLRレポーターHEK293細胞を1×1010 PFU/mlの濃度でOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で24時間処理し、その後レポーター活性を測定した。結果は650 nmにおける生の吸光度値で示した。エラーバーは、少なくとも3つの独立した生物学的複製のSEMを示す。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。AEC、気道上皮細胞；MEM、最小必須培地；TLR、Toll様受容体。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.g008
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ファージに反応して免疫関連遺伝子の転写が変化し、サイトカイン分泌が増加することから、次に、レポーター上皮細胞株を用いて、我々のファージパネルがパターン認識受容体に関与できるかどうかを評価した。Toll様受容体（TLR、[33]）をほとんど発現しないHEK293細胞を、ヒトTLRとTLR活性化を検出するレポーター遺伝子を発現する異なるプラスミドでトランスフェクトした。これらのレポーター細胞株にファージを加え、24時間後にレポーター活性を測定した（図8C）。その結果、試験したすべてのファージがTLR 1、2、4、6を活性化することがわかり、トランスクリプトームおよびタンパク質レベルで検出された免疫応答がPAMP認識の結果であることが示唆された。まとめると、治療効果のあるファージは細胞外TLRに関与し、特異的な抗ウイルス性および炎症性サイトカインの増加を誘導する。これらの反応はそれぞれのファージに特異的であるため、治療用ファージを選択する際には考慮する必要がある。
考察
細菌感染に対する代替治療法の需要は急速に高まっている。ファージ療法には、特異性や自己増幅性など、従来の抗菌薬と比較していくつかの利点がある。その結果、バクテリオファージはMDR感染症の治療にますます使用されるようになっている。ファージは安全であり、有害事象も少ないことが報告されているが、ファージと宿主との相互作用に関する知識にはいくつかのギャップがある。ファージは哺乳類の細胞内では複製しないが、治療中は高濃度のファージが粘膜表面に密接に接触する。ここでは、バクテリオファージと気道上皮との相互作用がファージのタイプに特異的であることを示す証拠を示す。これらの相互作用は、ファージの形態や凝集といった内在的な性質だけでなく、ヒト宿主の物理化学的環境の特徴といった外在的な性質にも依存している。我々のデータは、AECがファージを感知し、炎症性サイトカインの分泌につながるトランスクリプトーム変化を起こすこと、そしてこれらの反応がファージ特異的であることを示している。さらに、我々の発見は、ファージ療法、特にヒト宿主の組織における結果に関する知識を深めることの重要性を強調している。最初のファージ特性解析の際に哺乳類細胞を含むアッセイを行うことは、この治療法が普及する前にその有効性を検証するのに役立つであろう。われわれの結果は、治療可能性のある異なる溶菌性緑膿菌ファージ群に対する細胞応答には不均一性があり、したがって哺乳類宿主におけるファージの効果を一般化することはできないことを示している。
ASLは、多くの呼吸器感染症でバイオフィルムが蓄積する気道粘膜の領域であり、そのため、ネブライザーによるファージ療法でファージと哺乳類上皮が相互作用する場所である。ASLのpHは気道の自然免疫防御を制御するのに重要である。多くの慢性呼吸器疾患は、CF、COPD、鼻副鼻腔炎など、ASLのpHの調節異常によって特徴づけられる[29]。われわれの研究から、酸性pHがAECとファージの相互作用に影響を与え、細胞と結合するファージ粒子の数を増やしたり、上皮上でのファージの凝集を促進したりすることが明らかになった。この観察から、炎症反応時に起こる酸性粘膜環境を特徴とする疾患では、ファージと上皮の相互作用が亢進する可能性が高いことが示唆される。いくつかのタンパク質レセプターは酸性pHでのみリガンドと結合するため、これらのレセプターがファージの付着因子として機能する可能性がある[34,35]。ファージは哺乳類ウイルスと同様に細胞表面の糖鎖と結合することができ［36］、これもpHの影響を受ける［37］。哺乳類の細胞表面でファージが結合する特異的なレセプターは、まだ解明されていない。上皮とファージの相互作用が気道の物理化学的環境によってどのような影響を受けるかを理解することは、特にCFTR調節薬による治療後に特性が変化するCFにおいて必要である［38-41］。CFやCOPDの治療に使用される吸入コルチコステ ロイドや気管支拡張剤も、気道の炎症を抑制し、それに 伴って気道のpH、イオン組成、ムチン分泌に影響を及ぼ す。CFやその他の炎症性疾患におけるファージ、細菌、宿主の三者関係に対する物理化学的環境の影響を完全に理解するためには、さらなる研究が必要である。
異なる形態を持つファージを使用することで、ファージの種類と気道における挙動との関連を調べることができた。その結果、特に培養の最初の1時間において、先端コンパートメントを通過するファージの内在化は、ファージのサイズと凝集に依存していることがわかった。ジャンボファージOMKO1はゆっくりと細胞内に取り込まれるが、小型ファージLPS-5はより速やかに細胞内に取り込まれる。細胞上で凝集するファージであるPSA34は、最初の1時間は細胞内への侵入が遅かったが、24時間後には数倍に増加した。一方、PSA04は、培養開始後1時間で、他のファージと比較して上皮の奥深くに局在した。全体として、検出されたインタクトな細胞内ファージの量は、開始時の接種量に比べて少なかったため、ファージ療法がヒトの宿主に遺伝毒性作用を及ぼす可能性に関する懸念は軽減された[42,43]。同様の結果は、腸や腎臓の上皮など、他の種類の哺乳類細胞を使っても得られている[11,12,44]。ビリオンの安定性はファージの形態と関連しており、ミオウイルスは他のファージよりも安定であることがわかった[45]。ファージの大きさは、基底側転位に影響する因子であることが観察された。例えば、大きなOMKO1ファージは上皮を通過することができなかったが、LPS-5、PSA04、PSA34ファージは可能であった。これらの結果は、ヒト宿主における相互作用と活性を調べる際には、哺乳類細胞との適合性はファージ特異的であるため、異なるタイプのファージを試験すべきであることを例証している。
我々の研究は、異なるファージ間で内在化レベルや分解速度に違いがあるにもかかわらず、試験した全てのファージがAECsにおいて中核となる遺伝子群を誘導することを示した。これらの遺伝子は、炎症や創傷治癒に機能する免疫可溶性メディエーターをコードしている。興味深いことに、我々のファージ・パネルがCFのAECで誘導する反応は、緑膿菌のバイオフィルムで産生される糸状の温帯ファージであり、pwCFの臨床分離株でプロファージとしてよく見られるPfファージにケラチノサイトを曝した後に起こる反応とは異なっていた[46-48]。ケラチノサイトでは、Pfファージは、細胞の遊走と創傷治癒を妨げる上皮反応を促進するため、Pfファージを保有する緑膿菌による皮膚感染症が治癒しにくい理由を説明できるかもしれない[46]。CFの肺では、組織修復機構が変化しており、細胞遊走と増殖が減少し、組織の肥厚をもたらす構造リモデリングが増加している [32]。我々のデータは、ファージ療法が細菌を殺すファージ の能力以上の効果を持つ可能性を示唆している。CFの場合、創傷治癒が促進されれば、病気の進行に伴って失われる細胞外マトリックス成分の一部を回復させることができるため、有益であると考えられる[49]。創傷治癒経路におけるファージ療法の効果がCFTR機能に依存しているかどうかを明らかにするためには、高効率モジュレーター療法（HEMT）で治療したCF細胞のトランスクリプトーム解析が必要である。
我々は、我々のファージパネルによって誘導される様々な上皮免疫応答を発見した。我々のファージ調製物はほとんど細菌成分を含まないことを考慮すると、免疫刺激に関与する特定のファージリガンドはまだ決定されていない。われわれは、われわれのファージ・パネルが、しばしば細胞外パターン認識に関連するTLRに関与することを発見した[50]。従来、これらのレセプターは細菌成分を検出するタンパク質として説明されてきたが、複数の証拠から、TLRは損傷関連分子パターン（DAMP）認識において重要であり、無菌性炎症を媒介することが示されている［51］。TLRはまた、繰り返しサブユニットパターン［52］や特異的な構造タンパク質［53］の検出を通じてウイルスのキャプシドを感知することから、呼吸器上皮細胞によるファージの認識にも同様のメカニズムが関与していると考えられる。抗体やアミロイドのような内因性タンパク質で実証されているように、タンパク質の凝集もTLRを誘発する [54]。呼吸器上皮は、試験したすべてのファージに反応して、基底側腔でIFN-βを放出した。しかしながら、アピカルサイトカインの分泌はファージに特異的であり、ミオウイルスのOMKO1とLPS-5はファージPSA04とPSA34によって誘導されたものとは異なる免疫プロフィールを誘導した。OMKO1とLPS-5は、もう一つの抗ウイルス性サイトカインであるIFN-λ1の分泌を誘導したが、PSA04とPSA34は炎症性サイトカインであるTNFSF13B、TNFSF8、IL-8の分泌を刺激した。興味深いことに、これらの免疫応答は、TNFの分泌を防ぎながら抗ウイルス免疫応答を誘導するPfファージで処理した哺乳類細胞で観察されたものとは異なっている [55]。これらを総合すると、ヒトの宿主におけるファージに対するサイトカイン応答はファージ特異的であることが明らかになり、ファージ療法の安全性と最適な結果を得るためには、ファージと哺乳類細胞の相互作用を考慮すべきであることが支持される。
気道上皮によるファージに対する免疫応答に関する我々の発見は、重要な意味を持つ。異なるファージがユニークな免疫プロファイルを誘導することを考慮すると、ヒト宿主におけるファージの効果について一般化することはできない。この観察は、ファージを治療用に選択する際に考慮されるべきである。例えば、黄色ブドウ球菌感染のマウスモデルにおいて、ファージ療法は細菌量を減少させる直接的な効果とは別に、創傷治癒を改善した［56］。このような効果は、線維芽細胞の活性の亢進や細胞外マトリックスの沈着によって組織機能が損なわれるような線維症の場合には、有害となる可能性がある。私たちの場合、OMKO1やLPS-5のようなファージは、抗ウイルス薬の効果を増強するアジュバントとして使用することができる[57,58]。IL-8の分泌を増加させるPSA04やPSA34のようなファージは、好中球の機能が損なわれていないほとんどの感染症に使用できると考えられる。しかし、好中球反応の亢進が病態の一因となるpwCFには最適ではないかもしれない［59］。ファージ療法は、患者固有の細菌を溶解する特定のファージを同定する必要があるため、すでに個別化された治療法となっている。ファージ療法の合理的なデザインは、ファージ耐性が進化する可能性を減らすファージカクテルの選択に重点を置いている[60]。我々の研究は、特定の患者に対してファージを選択する際には、免疫反応のプロファイリングも考慮すべきであることを示唆している。
我々の研究には、今後の研究で取り組むべき重要な限界がある。治療用ファージに使用される様々な形態を網羅する、異なる物理的特性を持つ4つのファージが含まれているにもかかわらず、これらのファージが溶解性ファージの多様性全体を代表しているとは断言できない。ファージと哺乳類細胞の相互作用や免疫反応を評価する哺乳類細胞を用いたハイスループットアッセイを開発することで、患者に最も有益な反応をもたらすファージの選択を改善できる可能性がある。この研究で使用したファージは、エンドトキシンをほとんど含まないが、細菌の残骸を完全に除去することは不可能である。われわれの調製物中のエンドトキシンレベルは、AECsで検出された炎症反応と相関していないが、ごく低レベルの細菌残渣が哺乳類細胞によって感知され、トランスクリプトーム変化を起こす可能性は排除できない。加えて、われわれの超高純度ファージ調製物は、ファージ療法を行う際に気道上皮が最初に出会うであろうウイルス、すなわち細菌の細胞壁成分を含まないウイルスの形態を表している。これとは対照的に、従来の抗生物質と比較してこの治療法の利点のひとつである、細菌バイオフィルム内でのファージ増幅は、おそらく形態学的に異なるため、呼吸器上皮が新たなレセプターを用いて認識する可能性が高い。ファージは複製後、外膜小胞とともに宿主細菌から放出され、気道上皮の反応を変化させる[61,62]。哺乳類細胞が二次複製後の異なるファージにどのように反応するかは不明である。この研究で行われた実験は、気液界面（ALI）で培養されたCFBE41-細胞を用いて行われたもので、この細胞は粘膜繊毛表現型に分化し、気道を再現している[63]。しかし、極性化した細胞ではエンドサイトーシス機構が異なることが知られているように、他の細胞型は異なる方法でファージと相互作用するかもしれない[64]。さらに、私たちの実験では、ファージと上皮の相互作用におけるムチンの影響については触れていない。ムチンは、CFで過剰分泌されるASLの成分である。ファージがムチンと結合することで、ファージの拡散が妨げられ、宿主細菌との相互作用が促進されるため、宿主にとって有益であることが示唆されている[65]。また、ファージがムチンに結合する能力は、各ファージに特有であり、ファージの様々なタイプの会合に影響を与えると考えられる[66]。私たちの研究は粘膜の自然免疫反応に焦点を当てたものであるが、ファージに対する適応免疫反応を理解することは、この治療法の有効性を確保するために重要なステップである。多くの治療レジメンでは、数週間から数ヵ月にわたって連続投与が行われ、多くの研究でファージ成分が哺乳類抗体の標的であることが示唆されている［67-69］。最後に、ファージ、哺乳類細胞、モデルマイクロバイオームを用いた実験は、CF気道のより生理的な状況において、宿主細菌やバイスタンダー細菌に対するファージの効果を明らかにするために重要である。
米国では、FDAがファージを選択する際に、ファージの供給源、エンドトキシン含有量、無菌性、患者の細菌株に対する溶菌活性を提供することを推奨している[70]。しかし、これらの推奨には、哺乳類の細胞や組織を含むアッセイは含まれていない。私たちの研究結果や他の研究者の研究結果［71］、そしてファージ療法の副作用を報告した臨床例［8］から、少なくとも緊急時以外の使用状況においては、これらの推奨事項を拡大して、ファージと哺乳類の相互作用に関する文書を含めるべきであることが示唆される。我々の研究で実施されたようなアッセイは、同等の溶菌活性を持つファージの選択に役立つ情報を提供する可能性がある。LPSをほとんど含まないファージ調製物でも病原体として認識されることが私たちや他の研究者によって示されているように、哺乳類細胞の反応を引き起こすファージの決定因子を完全に理解するためには、さらなる研究が必要である。
材料と方法
細胞培養
CFBE41-細胞（J. P. Clancy, Cincinnati Childrenより入手）。Clancy, Cincinnati Children's Hospital, USA）から入手したヒトCF ΔF508/ΔF508 AEC株であるCFBE41-細胞は、10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS, GeminiBio）、2mM L-グルタミン（Corning）、5U/mlペニシリン-5mg/mlストレプトマイシン（Corning）を添加した最小必須培地（MEM, Gibco, Thermo Fisher Scientific）で、37℃、5％CO2の付着性細胞培養条件下で培養した。実験に使用するため、CFBE41-細胞をトランスウェルインサート（Costar）に、6.5mmインサートでは1.5～2.5×105個/インサート、12mmインサートでは4～5×105個/インサート、24mmインサートでは1.5～2×106個/インサートの密度で播種した。48時間後、アピカル培地を除去し、細胞をALIで培養した。基底側培地は、実験時間まで1日おきに交換した。細胞は培養2～3週間の間に、TEERが300 Ω*cm2 以上であることを確認してから使用した。CF AECに対するすべての処理は、6.5mm、12mm、24mmのインサートに、それぞれ100μl、250μl、500μlのMEM中でアピカルに行った。CFBE41-細胞の同一性は、ショートタンデムリピートプロファイリング（University of Arizona Genetics Core、USA）により確認した。細胞は、マイコプラズマ検出キット（SouthernBiotech社製）を用いてPCRを行うことにより、マイコプラズマが存在しないことを日常的に確認した。
細菌株と培養条件
緑膿菌実験室株[72,73]および臨床株[24,74]（S2表、希望により共有可）は、リゾジニーブロス（LB、Fisher Scientific）中で、37℃、16時間、250rpmで振とう培養するか、LB寒天培地（Fisher Scientific）上で培養した。
バクテリオファージの調製と増殖
ファージPSA04（GenBank: MZ089728）およびPSA34（GenBank: MZ089739）はピッツバーグ大学から、ファージOMKO1（GenBank: ON631220）およびLPS-5（GenBank: PP203294）はイェール大学から受け取り（Paul Turner博士からの贈り物）、以下に記載する二層寒天法を用いてプラーク精製用にプレーティングした。プラークを24時間後に滅菌ピペットチップで採取し、5ml培養液中でそれぞれのファージ宿主に感染させた。培養液は16時間後、ポリエーテルスルホン（PES）膜（Thermo Fisher Scientific社製）付き0.45μmと0.22μmのシリンジフィルターを用いて濾過し、以下に記載するようにプラークアッセイによってフロースルーを滴定した。ファージ溶解液は4℃で保存し、1L培養で大規模なファージ精製に使用した。緑膿菌PAO1株（ファージOMKO1およびLPS-5用）、DVT423株（PSA04用）、およびDVT411株（PSA34用）を対数期中期で増殖させ、0.001 MのCaCl2およびMgCl2を添加したLB培地中、37℃で16時間、250 rpmで振盪しながら、0.005 PFU/cellのMOIでファージを感染させた。細菌を1%クロロホルムで溶解し、5,500×gで20分間遠心分離して除去した。上清を1μg/mlのDNase I（Sigma） およびRNase A（Thermo Fisher Scientific）で37℃、1時間処理した後、0.45μmフィルターおよびPES膜付き0.22μmフィルター（Thermo Fisher Scientific）を用いて真空ろ過した。上清は、膜孔径100,000 Daの遠心フィルターユニットCentricon Plus-70（EMD Millipore社製）を用いて、メーカーの指示に従って濃縮した。遠心分離は、上清が初期容量の100倍に濃縮されるまで繰り返した。上清をSM緩衝液[75]で調製した塩化セシウム（CsCl）勾配（密度：1.70、1.50、1.45、1.33g/ml）にロードし、90,000×g、4℃で16時間遠心した。20ゲージのシリンジを用いてバンドを回収し（S1図）、同様のCsCl勾配に再ロードし、ファージの純度を高めるために前と同様に再度遠心した。透析バッファー（50 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM Tris (pH 7.4)）とポアサイズ10,000 Da (Sigma)の透析フロートAライザーデバイスを用いた広範囲の透析によりCsClを除去した。ファージの同一性は、ファージ特異的プライマーを用いたPCRで確認した（S1表）。ファージ粒子濃度は、269nmと320nmの吸光度を測定して求め、記載されているように、（A269-A320）×6×1016/ビリオンあたりの塩基数を用いて計算した[76]。製剤は、Limulus amoebocyte lysate test（Thermo Fisher Scientific）を用いてエンドトキシンを検査し、16S rRNA遺伝子プライマーを用いて細菌DNAを増幅した[77]。我々のファージ調製物の平均エンドトキシンレベルは、S1 Tableに示されているように、1×109 PFUで2～110 EU/mlであった。
ファージDNA抽出、ファージの全ゲノム配列決定、ゲノムアセンブリ
1×1012粒子/mlのファージを600 mAU/mlのプロテイナーゼKとともに56℃で90分間インキュベートした。DNAは、DNeasy Blood and Tissue kit（Qiagen）を用いて、メーカーの指示に従って単離した。ファージDNAはMicrobial Sequencing and Analysis Center（MIGS、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）で塩基配列を決定した。ライブラリーは、IDT 10 bp UDIインデックスを用いたイルミナDNAプレップキットを用いて調製した。サンプルはIllumina NextSeq 2000でシーケンスし、2 × 151 bpリードを得た。bcl-convert（v3.9.3）[78]を用いて、デマルチプレックス、品質チェック、アダプタートリミングを行った。サンプルはtrimomatic version 0.36でトリミングした[79]。ファージゲノムはSPAdes version 3.12.0を用い、オプションフラグ"-careful" [79]でアセンブルし、prokka version 1.14.6 [80]でアノテーションした。
バクテリオファージ系統樹の構築
バクテリオファージの系統樹は、Virus Classification and Tree Building Online Resource (VICTOR)サーバーで、全ゲノム連結アミノ酸配列を使って構築した[81]。バクテリオファージのアミノ酸配列の一対比較は、原核生物ウイルス[81]に推奨される設定を用いて、d6式（34%の平均支持をもたらす）を用いたGenome-BLAST Distance Phylogeny (GBDP)法[82]で作成した。ブランチサポートは100の擬似ブートストラップレプリケートから推測された。
ファージのPCR
ファージDNAを上記のように抽出し、Nanodrop装置（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量した。ファージDNAは、Primer-BLASTツール[83]を用いて設計したファージ特異的プライマー（S1表）とGoTaq Green（Promega）を用いて、メーカーの指示に従って増幅した。PCR産物は、SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen)を用いて、0.5% Tris-acetate-EDTA(TAE)アガロースゲル上で100V、1時間の電気泳動により可視化した。
ファージの蛍光標識
ファージを0.1Mの炭酸水素ナトリウムで4×1012粒子/mlに希釈した。ファージ溶液をAlexa Fluor 555 NHS Ester（Succinimidyl Ester, Thermo Fisher Scientific）と100μMの濃度で2時間、遮光した室温でインキュベートした。蛍光ファージは、上記のように透析バッファーと透析チューブを用いて広範囲に透析した。ファージの蛍光は、実験使用前に免疫蛍光顕微鏡で確認した。
ファージプラークアッセイ
感染性ファージの定量は二層寒天培地法で行った。緑膿菌PAO1株（ファージOMKO1およびLPS-5用）、DVT423株（PSA04用）、DVT411株（PSA34用）、およびpwCFからの臨床分離株（S2表）を、上記のようにLB培地で対数期中期で培養した。培養液は、新鮮なLB培地と「ソフト」寒天（0.7%）とそれぞれ1:2:6の割合で合わせた。この溶液をベースLB寒天（1.5％）上に注ぎ、4℃で一晩培養した。ファージを0.9 mM CaCl2と0.5 mM MgCl2を添加したPBSで連続希釈し、二寒天プレートにスポットした。OMKO1、PSA04、PSA34ファージをスポットしたプレートを37℃でインキュベートし、LPS-5を室温で16時間インキュベートした。
透過型電子顕微鏡
精製したファージを200メッシュのカーボンコートグリッドに移し、1%酢酸ウラニルでネガティブ染色した後、フィルターペーパーでブロッティングしてイメージングを行った。グリッドを風乾し、ピッツバーグ大学（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）の生物学的イメージングセンターで日本電子1400-PLUS 120KV透過型電子顕微鏡を使用し、80kVで作動させて画像化した。形態分類には、国際ウイルス分類委員会（ICTV）のガイドラインを使用した[84]。ファージのキャプシドと尾の長さの測定は、ImageJを用いて行った。少なくとも3つの独立した画像を使用し、報告された長さはそれらの測定値からの平均長さに対応する。
液体培養におけるファージ死滅アッセイ
LBブロスで培養した緑膿菌PAO1株、DVT423株、DVT411株の対数期中期の培養液をOD600で0.05に標準化し、平底の非接着透明96ウェルプレートに100μlの容量で播種した。ファージOMKO1（PAO1）、LPS-5（PAO1）、PSA04（DVT423）、およびPSA34（DVT411）を0.01 PFU/菌のMOIで添加し、37℃で5分ごとに振盪しながらインキュベートした。SpectraMax M2マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）を用いて、16時間にわたり600nmの吸光度を測定し、経時的な細菌の増殖をモニターした。
バイオフィルムの定量化
緑膿菌PAO1株（ファージOMKO1およびLPS-5用）、DVT423株（PSA04用）、およびDVT411株（PSA34用）をLB培地中ログ相中期で37℃、96ウェルプレートで18時間培養し、生物学的細菌バイオマスを定量する実験を行った。上清を注意深く除去した後、バイオマスをクリスタルバイオレット（H2O中41％クリスタルバイオレット、12％エタノール）で染色し、30％酢酸で可溶化し、SpectraMax M2マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で550 nmの吸光度を測定することにより定量した。
生物学的細菌バイオマスの定量は、CFBE41-細胞を、緑膿菌PAO1株（ファージOMKO1およびLPS-5用）、DVT423株（PSA04用）、およびDVT411株（PSA34用）で、MOI 0.025バクテリウム/細胞、MEM pH 6.5、37℃で1時間処理することにより行った。 上清を除去し、0.9 mM CaCl2 と 0.5 mM MgCl2 を添加したPBSで細胞を洗浄した後、PBS中0.1% Triton X-100 (Bio-Rad) を用いてバイオマスを可溶化した。バイオマスを3,500×g、室温で3分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを0.9 mM CaCl2と0.5 mM MgCl2を添加したPBSに再懸濁した。細菌を連続希釈し、LB寒天培地にプレーティングし、37℃で16時間培養した。
プラークアッセイを用いたファージ上皮実験
気道上皮に関連するファージは、トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、pHを6.5または7.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で処理することにより決定した。 細胞を、0.9 mM CaCl2および0.5 mM MgCl2を添加したPBSで6回洗浄し、PBS中0.1% Triton X-100（Bio-Rad）で溶解し、ファージ感染性粒子を上記のようにプラークアッセイで定量した。ファージの内在化は、記載されているように、気道上皮に結合した総ファージ粒子（溶解したファージ処理細胞）と細胞外に結合したファージ（無傷のファージ処理細胞）との差を計算することによって決定された[10]。簡単に説明すると、ファージの内在化を定量化するために、ファージ処理を二重ウェルで行った。定量時に、TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific）を用いてトランスウェル挿入部から細胞を酵素的に剥離した。細胞を150×g、4℃で5分間遠心した。全ファージウェルの細胞は、PBS中の0.1% Triton X-100に再懸濁し、もう一方のウェルは、細胞を洗剤なしでPBSに再懸濁することにより、細胞外ファージを定量するために使用した。サンプルは連続希釈し、プラークアッセイに使用した。細胞を0.9mM CaCl2と0.5mM MgCl2を添加したPBSで6回洗浄し、37℃のインキュベーターに戻した。内在化したファージは、その時点、24時間後、48時間後に定量した。ファージ力価は各時刻で計算され、結果は最初の洗浄ステップの直後（0時間）に得られた力価に対して正規化された。基底側ファージは、ファージ接種後1、4、24時間に基底側培地を採取し、プラークアッセイで定量した。
免疫蛍光顕微鏡を用いたファージ上皮実験
トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、pHを6.5または7.5に調整したMEM中で、Alexa Fluor 555蛍光-OMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34を1×109 PFU/mlの濃度で37℃、1時間または24時間処理した。 5 mM MgCl2で3回洗浄し、PBS中4%パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences）で固定し、PBS中1% Triton X-100（Bio-Rad）で透過処理し、200 nM濃度のAlexa Fluor 647ファロイジン（Thermo Fisher Scientific）およびPBS中20 μm濃度のHoescht 33342（Thermo Fisher Scientific）で染色した。剥離メス（Electron Microscopy Science社製）を用いて膜を切り出し、厚さ1.5 mmのスライドグラス（Fisherbrand社製）にマウントし、ProLong Gold Antifade mounting medium（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて厚さ#1のガラスカバースリップ（Fisherbrand社製）で覆った。画像はNikon C2共焦点システムとPlan Apo 60× oil/1.40 NA対物レンズを用いて得た。画像はNikon Elementsバージョン5.10を使用し、denoise.ai機能を用いて処理した。ファージ粒子は、Nikon Elements Analysisソフトウェアの3D体積再構成と3Dオブジェクト測定機能を用いて解析した。0.05μm3以下の粒子は、バックグラウンドノイズを減らす目的で解析から除外した。気道上皮の深部への粒子の侵入は、各Zスタックの最上部から0.05 μm3以上の各粒子までのZ軸方向の距離を計算することにより決定した。
上皮生存率アッセイ
ファージ処理後の上皮の完全性を評価するため、トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、37℃でpHを6.5に調整したMEM中で、1×109 PFU/mlの濃度でファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34で処理した。処理後0、24、48時間にMEMをアピカルコンパートメントに加え、37℃で30分間インキュベートし、EVOM2箸電極セット（World Precision Instrument STX2）を用いてTEERを測定した。結果は、細胞を含むトランスウェルインサートとブランクのトランスウェルインサートで得られた差として示されている。ファージによる細胞毒性は、トランスウェルインサートで増殖したCFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中、1×109 PFU/mlの濃度のファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34で37℃、24時間処理することによって分析した。培地中のG6Pの量に比例するレゾフリンは、インキュベーション30分後に、Molecular Devices SpectraMax M2プレートリーダーを用いて蛍光（励起540 nm、発光590 nm）で測定した。アポトーシス陽性対照として、濃度1μMのスタウロスポリン（Selleckchem）を用いた。結果は、ファージ処理サンプルと未処理サンプルの差として描かれ、Cell-Lysis Buffer（Thermo Fisher Scientific）で処理した細胞の細胞毒性値に対して正規化された。アポトーシスの測定は、共焦点顕微鏡でホスファチジルセリンのトランスロケーションを可視化することによって行った。簡単に説明すると、トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、上記のように24時間ファージで処理した。細胞をPBSで洗浄し、Annexin V-FITC (Thermo Fisher Scientific)をBinding Buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)中で、メーカーの指示通りにインキュベートし、室温で15分間インキュベートした。細胞をBinding Bufferで洗浄し、PBS中4%パラホルムアルデヒドで固定し、上記のように共焦点顕微鏡用に処理した。
ナノ粒子追跡分析（NTA）
ファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34を1×108 PFU/mlの濃度で、pHを6.5または7.5に調整したMEM中、37℃で24時間インキュベートした。NanoSight NS300（Malvern Panalytical）を用い、シリンジポンプ速度30 AU、sCMOSカメラで1サンプルあたり30秒のキャプチャを3回撮影するように設定してファージを分析した。その他のパラメーターは製造元の指示に従って設定した。
細胞選別とRNA配列決定
トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、pHを6.5に調整したMEM中で、Alexa Fluor 555蛍光-OMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34を1×109 PFU/mlの濃度で37℃、24時間処理した。細胞を、0.9 mM CaCl2および0.5 mM MgCl2を添加したPBSで3回洗浄し、TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific）と37℃で40分間インキュベートして細胞を剥離した。細胞を回収し、370×g、4℃で5分間遠心し、2％FBS添加PBSに再懸濁した。細胞を40μmメッシュサイズのストレーナー（Thermo Fisher Scientific）で濾し、ピッツバーグ大学免疫学部のフローサイトメトリーコアにあるBS LSR IIフローサイトメーターを用いて、Alexa Fluor 555陽性集団と陰性集団にフローソーティングした。細胞はDNA/RNAシールド（Zymo Research社製）に選別され、RNA抽出と全RNA配列決定のためにZymo Research社に提出された。RNA抽出はQuick-RNA Miniprep kit（Zymo Research社製）を用いて行い、続いてRNA Clean and Concentrator-5 kit（Zymo Research社製）を用いてRNAのクリーンアップを行った。ライブラリー調製はZymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit（Zymo Research）を用いて行い、ライブラリーはIllumina NovaSeq 6000装置で3000万リードペアのシーケンス深度でシーケンスした。FastqファイルはNCBIのSequence Read Archive (SRA) (BioProject PRJNA1075455)で公開されている。
RNAシーケンスのバイオインフォマティクス解析
生リードの品質は、まずFastQC v.0.11.9 [85]を用いて確認した。リードはTrim Galore v0.6.6[86]を用いてアダプターや低品質配列をトリミングし、STAR v2.6.1d[87]を用いてリファレンスヒトゲノムGRCh38/hg38にアライメントした。エクソンにマッピングされたリードはfeatureCounts v2.0.1 [88]を用いて割り当てられた。品質管理はMultiQC v1.9 [89]を用いて追跡した。生のカウント表と関連するメタデータは、NCBIのGene Expression Omnibus (GEO)のアクセッション番号GSE255619で入手できる。差次的遺伝子発現解析はEdgeR v3.42.4 [90]を用いて行った。低発現遺伝子は除去され（カウントは10以下）、データはM値のトリム平均で正規化され、各ファージのデータセットと未処理サンプルのデータセットとの対比が行われた。ボルケーノプロットはEnhancedVolcano v3.17 [91]を使って作成した。この解析のコードは https://github.com/Bomberger-Lab/ と https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.10723798 にある。遺伝子発現の差分log2 fold changeが｜1.5｜より大きく、p≦0.001の場合、遺伝子は有意であるとみなされた。パスウェイ解析は、遺伝子発現の差分log2 fold changeが｜1.5｜より大きい遺伝子を用いて、ingenuity pathway analysis (IPA, Qiagen)を用いて行った。
サイトカイン解析
気道上皮に関連するファージは、トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、37℃でpHを6.5に調整したMEM中、1×109 PFU/ml濃度のファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34で24時間処理することによって決定された。アピカルおよび基底側培地を回収し、370×g、4℃で5分間遠心分離し、Bio-Plex Pro Human Inflammation Panel 1（BioRad）を用いてヒト炎症性サイトカインを定量した。蛍光はUPMC Children's Hospital of Pittsburgh（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）でMAGPIX System（Luminex）を用いて読み取った。検出限界以下の値を示したサイトカインは解析から除外した。
パターン認識受容体スクリーニング
Toll様受容体のスクリーニングは、HEK-Blue hTLR2-TLR1、HEK-Blue hTLR2-TLR6、HEK-Blue hTLR2、HEK-Blue hTLR3、HEK-Blue hTLR4、HEK-Blue hTLR5、HEK-Blue hTLR7、HEK-Blue hTLR8、およびHEK-Blue hTLR9（InvivoGen）を96ウェルプレートに播種することにより行った。ファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34を、0.9 mM CaCl2および0.5 mM MgCl2を添加したPBS中、1×1010 PFU/mlの濃度で添加し、37℃で24時間、5% CO2でインキュベートした。インキュベーションの最後に、NF-κB活性を、HEK-Blue（InvivoGen）の加水分解による分泌型胚アルカリホスファターゼ（SEAP）の産生によってモニターした。光学濃度は、SpectraMax340 PCプレートリーダー（Molecular Devices社製）を用いて650 nmで読み取った。
統計解析
in vitroおよび細胞培養実験の統計解析はGraphPad Prism v.10を用いて行った。ただし、RNA配列解析は上記のように解析した。細胞培養実験は、少なくとも3つの独立した生物学的複製を用いて実施した。これは、CFBE41o細胞の異なる継代を用いて、別々の日に実施した独立した実験として定義した。RNAシーケンス実験は、少なくとも2つの独立した生物学的複製を用いて行った。データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）で示した。統計的有意性を定義するために、両側スチューデントのt検定または一元配置分散分析（one-way ANOVA）、およびDunnettのpost hoc検定を用いた。
参考情報
S1 図. 高度に精製されたファージを調製するためのプロトコール。
バクテリオファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34を4℃で出荷し、小規模増殖に使用してファージ溶解液を作製し、4℃で保存した。大規模増殖の前に、ファージをプラークアッセイで再分離し、緑膿菌PAO1株（ファージOMKO1およびLPS-5用）、DVT423株（PSA04用）、DVT411株（PSA34用）の大量培養に感染させた。ろ過し濃縮したファージ溶解液をCsClグラジエントにロードし、グラジエント超遠心によりファージを2回精製した。ファージバンドを収集し、CsClを除去するために広範に透析し、ファージ特異的プライマーを用いたPCRによってファージの同一性を確認した（S1表）。ファージ粒子は269nmと320nmの吸光度によって定量した。エンドトキシンレベルはリムルスアメーバサイト溶解液（LAL）テストを用いて定量した。顕微鏡実験に使用するファージはAlexa Fluor色素で蛍光標識し、顕微鏡実験前に蛍光を確認した。図はBioRender.comで作成した。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s001
(TIF)
S2 図. ファージは液体培養で異なる殺傷動態を示す。
LBブロス中で増殖した緑膿菌PAO1、DVT423、およびDVT411株を、0.01 PFU/菌のMOIでファージOMKO1（PAO1）、LPS-5（PAO1）、PSA04（DVT423）、およびPSA34（DVT411）と37℃でインキュベートした。時間経過に伴う細菌の増殖は、16時間にわたって600 nmの光学濃度で吸光度を測定することによりモニターした。この図のパネルの基礎となるデータは、S1 Dataに掲載されている。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s002
(TIF)
S3 図：上皮細胞との会合アッセイにおいて、ファージのバックグラウンドシグナルは最小であった。
非標識（上）と蛍光標識（下）のOMKO1ファージとLPS-5ファージを1×109 PFU/mlのMOIでCFBE41-細胞とインキュベートした。これらのファージは、1時間のインキュベーション後、最も高いファージと最も低いファージの内在化を示すため、この実験に選ばれた（図6のデータ）。プラークアッセイにより、接種ファージと細胞内ファージを定量した（上）。接種物を除去した後、細胞を固定し、共焦点顕微鏡で観察した（下）。画像は3D再構成で示す。LOD、検出限界。結果は3回の独立した実験から得られた平均値である。この図のパネルの基礎となるデータは、S1 Dataに掲載されている。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s003
(TIF）。
S4 図：無細胞培養条件下では、酸性pHはファージ粒子サイズに影響しない。
ファージOMKO1、LPS-5、PSA04、およびPSA34を、pH6.5または7.5の最小必須培地中で、1×108 PFU/mlの濃度で37℃、24時間インキュベートした。図は、2つの独立した複製からの代表的な実験を示している。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s004
(TIF）
S5 図：ファージ粒子はアポトーシスが起こった上皮領域に位置する。
トランスウェルインサートで増殖させたCFBE41-細胞を、1×109PFU/mlのMOIでファージOMKO1およびPSA04と37℃で1時間インキュベートした。これらのファージは、気道上皮と異なる相互作用パターンを持つファージを代表しているため、この実験に選ばれた。細胞をアネキシンVで染色してアポトーシス領域を標識し、固定した後、共焦点顕微鏡で観察した。画像は3D再構成図（左）を示し、赤矢印はアネキシンV染色で陽性の領域を示す。白線は、X軸上の蛍光強度を示す強度プロファイル（右）のために選択されたXY次元の位置を示す。白矢印はアネキシンVとファージ染色の共局在領域を示す。この図は、2つの独立した複製による代表的な実験を示している。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s005
(TIF）
S6 図. 細胞培養液中でのファージの物理的安定性は異なる。
ファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34を組織培養培地中で、1×109 PFU/mlの濃度で37℃、48時間インキュベートした。結果は独立した3生物学的複製の平均値を示し、エラーバーはSEMを示す。この図のパネルの基礎となるデータは、S1 Dataに掲載されている。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s006
(TIF）
S7 図. ファージ処理後に活性化すると予測されるTNFスーパーファミリー遺伝子。
Pathogen Induced Cytokine Storm」経路における遺伝子の個々のZスコア値。ヒートマップはIPA z-scoreアルゴリズム[92]によって決定されたZスコアを示す。Zスコアは、処理条件ごとに少なくとも2つの独立したサンプルから配列決定したRNAを用いて、図7に示した差次的発現遺伝子から求めた。この図のパネルの基礎となるデータはS1 Dataにある。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s007
(TIF)
S1表。ファージの特徴のまとめ。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s008
(TIF)
S2 表。異なる緑膿菌株に対するファージ殺傷活性。
緑膿菌の実験室株と臨床分離株をプラークアッセイによりファージOMKO1、LPS-5、PSA04、PSA34に対する感受性を試験した。「は感受性、-は特定のファージに対する耐性を示す。*はCF喀痰から得られた臨床分離株[24]、**はCF副鼻腔から得られた臨床分離株[74]。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s009
(TIF)
S1データ。図中のグラフおよび図表の作成に使用した数値。
doi:10.1371/journal.pbio.3002566.s010
(XLSX)
謝辞
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