膜融合後スパイクのクライオ電子顕微鏡構造(2023年6月)

Cryo-EM structure of SARS-CoV-2 postfusion spike in membrane

SARS-CoV-2 膜融合後スパイクのクライオ電子顕微鏡構造

元→Cryo-EM structure of SARS-CoV-2 postfusion spike in membrane | Nature

Abstract

SARS-CoV-2 が宿主細胞に侵入するには、ウイルスにコードされたスパイクタンパク質が、切断後に準安定となる融合前構造から、エネルギーの少ない安定した融合後構造にリフォールディングされる必要があります。
この遷移は、ウイルスと標的細胞膜の融合に対する運動学的障壁を克服します。
ここでは、融合反応の単一膜生成物である脂質二重層内の融合後スパイクの完全な状態の極低温電子顕微鏡 (cryo-EM) 構造を報告します。
この構造は、融合ペプチドや膜貫通アンカーなど、機能的に重要な膜相互作用セグメントの構造定義を提供します。
内部融合ペプチドは、脂質二重層のほぼ全体に広がるヘアピン状のくさび形を形成し、膜融合の最終段階で膜貫通セグメントが融合ペプチドを包み込みます。
これらの結果は、膜環境におけるスパイクタンパク質についての理解を深め、介入戦略の開発に役立つ可能性があります。

Main

SARS-CoV-2 によって引き起こされた COVID-19 パンデミックは、何百万人もの人々の死をもたらし、世界中で社会経済的に壊滅的な影響を与えています。
SARS-CoV-2 は、エンベロープを持つプラス鎖 RNA ウイルスで、ウイルスと細胞膜が融合した後に宿主細胞に侵入します。
膜融合はエネルギー的には有利ですが、2 つの膜が互いに近づくと、主に反発する水和力のために高い運動障壁があります。
ウイルス膜融合が運動障壁を克服するために必要な自由エネルギーは、ウイルスにコード化された融合タンパク質が融合前の構造から再折り畳まれることで得られます。 融合前の構造は、タンパク質分解による切断後に準安定状態となり、よりエネルギーの低い安定した融合後の状態になります。
SARS-CoV-2 の融合タンパク質は、スパイク (S) タンパク質です。これは、ウイルス膜に埋め込まれた膜貫通 (TM) セグメントを持つ、I 型の高度にグリコシル化された膜タンパク質であり、融合ペプチド (FP) と呼ばれる別の膜相互作用領域は、標的細胞膜に挿入できます。

HIV-1 エンベロープ糖タンパク質、インフルエンザ血球凝集素、エボラ糖タンパク質などの他のクラス I ウイルス融合タンパク質と同様に、S タンパク質は単鎖前駆体として合成され、三量体化され、その後、感染した宿主細胞からのフーリン様プロテアーゼによって 2 つの断片、受容体結合断片 S1 と融合断片 S2 に切断されます。
次のラウンドの感染を開始するために、S タンパク質は新しい宿主細胞の表面にある受容体アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) に結合し、さらに宿主のセリンプロテアーゼ TMPRSS2 またはエンドソームシステインプロテアーゼカテプシン L によって S2 の 2 番目の部位 (S2′ 部位) で切断されます。
その後、大きな構造変化を起こして FP を標的細胞膜に挿入し、ヘアピン状の融合後構造に再び折り畳まれて、TM セグメントと FP を分子の同じ端に配置し、2 つの膜を引き寄せて融合を完了します。

最初の SARS-CoV-2 ゲノム配列が公開されてすぐに、S タンパク質断片の構造が報告されました。融合前立体構造で安定化された外部ドメイン、ACE2と複合体を形成した受容体結合ドメイン（RBD）、融合後立体構造のS2断片など、です。
融合前細胞外ドメイン構造では、S1 は N 末端ドメイン (NTD)、RBD、C 末端ドメイン 1 (CTD-1)、CTD-2 の 4 つの異なるドメインに折りたたまれ、S2 の融合前構造を包み込みます。
その後、精製された完全長 S タンパク質の融合前および融合後の立体構造の構造、および化学的に不活化された SARS-CoV-2 ビリオン上に存在する S タンパク質の構造が決定され、さらなる構造の詳細が明らかになりました。

融合フラグメント S2 には、重要な構造的および機能的役割を持ついくつかのセグメントが含まれています。これには、FP、ヘプタッド リピート 1 (HR1)、セントラル ヘリックス (CH)、コネクタ ドメイン (CD)、ヘプタッド リピート 2 (HR2)、TM セグメントおよび細胞質テール (CT) が含まれます (拡張データ図 1)。
S2 外部ドメインの融合後三量体では、HR1 と CH が中央に長さ約 180 Å の 3 本の撚りコイル状コイルを形成します。
HR2 の一部はらせん構造を採用し、HR1 コイルドコイルの溝に詰め込まれて 6 つのらせん束を形成し、ヘアピン状融合後構造を安定化します。
これは膜融合モデルと一致しています。 この場合、HR1 は「ジャックナイフ」遷移を起こして FP を標的細胞膜に挿入し、HR2 は折り畳まれて FP セグメントと TM セグメントを近づけ、次に 2 つの膜が融合して単一の脂質二重層になります。

しかし、これまでのすべての構造において、ウイルス膜に近い S タンパク質の領域は、構造的および機能的に重要であるにもかかわらず、存在しないか無秩序です。
コロナウイルススパイクタンパク質の膜相互作用領域の中で、FPは膜融合にとって最も重要な構造要素の1つです。 しかし、その正確な位置は、さまざまな競合する理論の源となっています。
SARS-CoV S2 の 3 つの膜向性領域が、推定上の融合ペプチドとして示唆されています (拡張データ図 1)。S2' 切断部位の上流にグリコシル化される可能性のあるセグメント (残基 770 ～ 788、N 末端 FP と呼ばれる) ；S2' 切断部位のすぐ下流のセグメント (残基 798 ～ 816 または 798 ～ 835、真の FP として広く受け入れられています)；HR1 のすぐ上流のセグメント (残基 858 ～ 886、内部 FP とも呼ばれます)。
初期の研究では内部FPの割り当てが支持されていた。なぜなら、この領域には強力な膜撹乱能力があり、この領域の突然変異は S 媒介細胞間融合の阻害につながるからです。
その後の研究では、コロナウイルス間で高度に保存されている真のFPは、内部FPよりもさらに強力なカルシウム依存性膜秩序化活性（溶液中の短いペプチドとして研究された場合のウイルスFPの主な特徴）を有することが示された。
最近、ヒトに感染する既知のすべてのコロナウイルスのスパイクタンパク質の真の FP 領域を認識する、いくつかの広範な中和抗体が同定されたため、この FP は汎用コロナウイルス ワクチン開発の潜在的な標的であることが示唆されています。
TM ドメインに隣接する 4 番目の疎水性領域 (残基 1190 ～ 1203、プレ膜貫通ドメイン (pre-TM) または芳香族ドメインとも呼ばれる) は、SARS-CoV 融合において重要であることが示されています。 そして膜融合をサポートするためにFPと連携して機能する可能性があります。

融合後 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の膜相互作用領域を視覚化するために、脂質ベースのナノディスクで全長タンパク質を再構成し、可溶性ACE2を使用して構造変化を誘導し、脂質二重層の融合後スパイクのサンプルを調製しました。そして、クライオEMを使用してその構造を決定し、SARS-CoV-2の侵入を完全に理解するために重要な構造の詳細を明らかにしました。
この研究は、標的膜挿入によって定義される真の FP は、残基 867 ～ 909 を含むセグメントであることを示しています。
したがって、そのセグメントのみを指すために FP という呼称を使用します。

脂質ナノディスクにおける融合後 S2 三量体

我々は、環状膜足場タンパク質 (MSP) を使用して、脂質ナノディスク内の初期変異体 G614 (B.1) に由来する精製された無傷のタンパク質を再構成しました。
再構成されたサンプルは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって 3 つの主要なピークに分離されました。
SDS-PAGE 分析により、ピーク I には主にナノディスク内の切断された S タンパク質が含まれていることが示されました。ピーク II には S タンパク質を含まない空のナノディスクが含まれていました。 ピーク III には遊離 MSP が含まれていました (図 1a)。

陰性染色 EM により、ピーク I がナノディスクに関連する融合前 S 三量体であることが確認され、細胞外ドメインと TM 領域の間にある程度の柔軟性があることが示されました。
我々は、再構成反応物またはナノディスク内の精製三量体を可溶性ACE2とインキュベートすることにより、融合前S三量体の構造変化を誘導した（図1bおよび拡張データ図2）。
ACE2 処理サンプルも、ゲルろ過クロマトグラフィーに基づいて 3 つのピークに分離されました。
ピーク I には主にナノディスク内の解離した S2 が含まれていました； ピーク II には、ACE2 と複合体を形成した解離した S1 と共溶出する空のナノディスクが含まれていました；ピーク III には、遊離 MSP と共溶出する未結合の ACE2 が含まれていました (図 1b および拡張データ図 2)。
ピーク I 画分のネガティブ染色 EM 画像は、ナノディスクから突出する非常に硬い融合後の S2 三量体を示しました。
SDS-PAGE 分析と N 末端配列決定を使用して決定したところ、融合後 S2 三量体の S2 ' 部位は切断されていないように見えました。
これらの結果は、ナノディスク内の制限された二分子膜の状況下であっても、ACE2 結合が精製 S 三量体の融合前から融合後への立体構造転移を引き起こすのに十分であることを示しています。

膜における融合後S2の構造

我々は、上記のように調製したナノディスク内の融合後 S2 三量体の構造をクライオ EM を使用して決定しました。
S2 ポリペプチド鎖のさまざまなセグメントの用語を図 2a に示します。

Gatan K3 直接電子検出器を備えた Titan Krios 電子顕微鏡でクライオ EM 画像を記録し、粒子ピッキング、2 次元 (2D) 分類、3 次元 (3D) 分類と精密化に crioSPARC38 を使用しました(拡張データ図3)。
1 つの主要なクラスが 3D 分類から取得され、2.9 Å の解像度に精製されました (図 2b、拡張データ図 3 ～ 5、および拡張データ表 1)。

ナノディスク付近の局所解像度を向上させるために、追加のマスクされた局所リファインメントを実行し、TM 領域と CT 領域をカバーする 3.3 Å マップを作成しました。
ナノディスク内の融合後 S2 外部ドメインの全体構造は、界面活性剤に可溶化されたタンパク質の構造および SARS-CoV の構造とほぼ同一です。
これは、クライオ電子断層撮影法によって再構成された、SARS-CoV-2 ビリオン表面の融合後スパイクの低解像度マップにもよく適合します (拡張データ図 6)。

以前に報告されたように、コア構造はHR1とCHによって構成される長い中央の3本鎖コイルドコイルです（図2c）。
CD の β ヘアピンと S1/S2-S2' フラグメントのセグメント (残基 718 ～ 729 (β718 ～ 729)) によって形成される 3 本鎖 β シートは、タンパク質分解による切断によって生成され、CH コイルドコイルの C 末端を包み込みます。
このコネクターβシートとCHは、融合前構造と融合後構造の間の不変構造を形成します。

S1/S2-S2' フラグメントの別のセグメント (残基 737 ～ 769 (s737 ～ 769)) は 3 つの連続する α ヘリックス (3H) に折りたたまれます。2 つのジスルフィド結合によってロックされており、CH コイルドコイルの溝に対してしっかりと詰め込まれています。
新しい構造では、3H のすぐ下流のセグメントの密度が追加されています。これはTM領域に向かって曲がり、融合後構造の表面に付着し、Gln785の後に無秩序になります。
この立体構造状態で切断されると考えられる Arg815 付近の S2' 部位は、見えないままです。
S2 の C 末端半分では、別のプロトマーからの HR2 の上流の残基 1127 ～ 1135 (β1127 ～ 1135) によって形成される β 鎖がコネクター β シートに結合して 4 つの鎖に拡張します。 HR2 を TM 領域に向かって投影し、おそらく HR2 の折り畳みを開始します。
さらに、隣接する 2 つの 3H の間にある残基 1148 ～ 1155 (α1148 ～ 1155) のウェッジによって形成される 2 巻きヘリックスと HR2 の長いヘリックスが、HR1 コイルドコイルとの 6 ヘリックスバンドルを構成します。 非常に硬い融合後の構造を強化します。
S2 の膜相互作用セグメントは、クラス I ウイルス融合タンパク質のこれまでのすべての融合後構造では欠落していますが、この新しい構造ではよく解像されています。
ナノディスク領域には 9 つの膜貫通ヘリックス (プロトマーあたり 3 つ) があり、これらは改良されたマップで完全に解像されています。
HR1 のすぐ上流の FP 領域は、中央のコイルドコイルを約 218 Å の長さまで延長し、脂質二重層にまで達する連続した α ヘリックスを形成します (図 2c)。これが、膜貫通領域を含む融合後構造全体の剛性の原因であると考えられます。

この最初の FP 膜貫通ヘリックスの後には、脂質二重層内で鋭い U ターンがあり、さらに別のヘリックスが膜を再び貫通して、隣接する FP 近位領域 (FPPR) を膜の外部ドメイン側に戻します。
3 つのプロトマーから得た FP の膜貫通ヘリックスの合計 6 本が密集して鈍い円錐形を形成します (図 2c)。これはおそらく、標的細胞膜を効果的に貫通するために必要です。
3 番目の膜貫通ヘリックスは TM セグメントで、膜の平面に対して傾いており、鈍い円錐を緩やかに包みます。
後続の CT の一部は、脂質二重層の細胞質ヘッドグループ領域に水平に埋め込まれているように見え、その 3 つのコピーが膜貫通円錐の先端を覆う三角形を形成します (図 2c)。

融合前と融合後の構造を比較すると、長い融合後中央ヘリックスの形成により FP が 185 Å 移動し、FP が再構成されて標的膜に挿入されたヘアピンのようなくさびになります (図 2d)。
FP は標的膜に挿入されるだけでなく、膜融合の最終段階で TM ヘリックスのドッキング サイトにもなります。

SARS-CoV-2 FP セグメントと TM セグメントの定義

膜貫通領域の多くの残基の側鎖密度を含む局所的に洗練されたマップにより、明確なモデリングが可能になりました (拡張データ図 5)。
s788〜806とs816〜834（補足図2）の両方が無秩序であるが、膜の外側に位置している（図2c）ため、実際のFPとして機能しないことは明らかです。
脂質二重層のほぼ全体に及ぶ三量体の円錐形集合体でヘアピン状のくさびを形成するのがFPです（図3a）。

予想どおり、ウェッジの膜挿入領域の大部分は疎水性であり、鈍化先端の Trp886 と Phe888 が存在します。一方、脂質二重層のヘッドグループ領域に位置するくさびの基部には、いくつかの荷電残基 (Asp867、Glu868、および Arg905) があります。
したがって、合計 43 残基 (Asp867 ～ Ile909) が膜に挿入され、機能的な FP を構成します。
特に、Pro897 は中央の長いらせんにねじれを導入しています。 これにより、融合ウェッジの先端近くの領域が標準的なコイルドコイル構造から逸脱し、876AXXXG880モチーフを介して戻ってくるヘリックス（残基870〜882）をしっかりと詰めて鈍い円錐形を形成することが可能になりました（図3a）。
3 つのプロトマーの FP 間の相互作用は、Pro897 によるキンクの前では主に極性残基 (Thr881 および Gln895) によって媒介されますが、キンクの後では疎水性残基 (Phe898、Met902、Phe906 および Ile909) によって媒介されます (拡張データ図 7)。

膜貫通アンカーの場合、TM ヘリックスは Tyr1215 で始まり Leu1234 で終わり、プレ TM の Trp1212 と Trp1217 は脂質二重層に完全に埋め込まれています。 これは、pre-TM が別個の構造要素ではなく、TM ドメインの一部であることを示しています。
さらに、Cys1235およびCys1236は明らかにTMヘリックスの一部ではなく、CTの始まりを示しています（図3a）。
これら 2 つのシステイン残基は、ウイルス内でパルミトイル化されている可能性があり、隣接するプロトマーの CT の Cys1247 および Cys1248 にも非常に近いですが、サイトゾル側でそれらの間にジスルフィド結合が形成される可能性は低いです。

膜領域間の相互作用

クラス I ウイルス融合タンパク質の FP は、融合プロセスの最終段階でその TM ドメインと相互作用する可能性があると仮定されていますが、膜の文脈における無傷のタンパク質におけるこの相互作用についての直接的な構造的証拠はありません。

ここで報告された構造は、SARS-CoV-2 融合後スパイクにおける密接な FP-TM 相互作用を示しています。
TM セグメントは、2 つの主要な接触を持つ別のプロトマーからの FP に対してパックされます。

まず、細胞外ドメイン側に近い Trp1212、Trp1217、および Phe1220 が融合ウェッジの基部に対して固まります；膜面に対して垂直に整列した、付近の強く細長い密度によって示唆されるように、接触には一部のリン脂質も関与している可能性があります（図3b）。
第二に、CT側近くのLeu1234は、融合ウェッジの先端にある2つの異なるプロトマーからのTrp886およびPhe888と相互作用します（図3c）。
CT フラグメントの 3 つのコピーが集まって、融合ウェッジの先端をキャップします。

FP のすぐ上流のセグメント (残基 857 ～ 866) は脂質二重層のヘッドグループ領域にあり、いくつかの疎水性残基が膜の疎水性コアに向いています。
この構成はおそらく、隣接するジスルフィドロックされたFPPR（残基835〜856）を、C末端半分も膜に埋め込まれた形で配向するのに役立ちます（図3d、e）。

FPPR の N 末端半分は、無秩序な s816 ～ 834 に直接接続されており、膜から突き出ています。
さらに、FPPR は FP ウェッジに対してパックされ、FPPR の Asp848 が FP の Arg905 と塩橋を形成します。
したがって、融合前立体構造におけるRBDのクランプダウンを促進するFPPRは、融合後S2構造の膜相互作用領域の固定にも寄与する可能性があります。

設計された突然変異の機能的効果

・・・省略・・・

Discussion

膜関連要素が脂質二重層と相互作用する SARS-CoV-2 融合後 S2 の構造は、FP の機能的アイデンティティに関するコロナウイルス分野における長年の論争の的となっていた問題を解決しました。
s788〜806とFPの両方が候補として提案されましたが、s816〜834はコロナウイルスの間でより保存されており、合成ペプチドとして膜構造を撹乱する際に他の2つよりも強い活性を示したため、その後、s816〜834が本物であると広く受け入れられました。

我々の結果は、FP のみが膜と相互作用することを明確に示しています。
我々の結果は、多くの疎水性ペプチドが脂質二重層の構造変化を誘導する可能性があるため、無傷のウイルス融合タンパク質の文脈から切り離して融合ペプチドを研究することの危険性を強調しています。
例えば、一部の研究ではSARS-CoVの融合ペプチド2としても同定されているFPPRは、膜ヘッドグループ領域の途中まで突き出ており、そのため局所的な膜構造を改変する可能性があります。しかし、脂質二重層の疎水性部分には挿入されません。
私たちの構造から、s788-806 も s816-834 も融合後構造の膜に挿入されないため、どちらも実際の FP として機能するとは考えられません。
この結論は、複数の荷電残基を s816 ～ 834 に導入しても完全長 S の膜融合活性が消失しないという証拠と、s788 ～ 806 に保存された N 結合型グリコシル化部位の存在によってさらに裏付けられます。

s788-806 および s816-834 が融合プロセス中に一時的に膜と相互作用する可能性を排除することはできません。
それにもかかわらず、FPの膜挿入は、おそらく隣接するHR1のコイルドコイルへのリフォールディングと直接結合しているため、s788-806またはs816-834には依存していないと思われます。
さらに、融合ペプチドは、標的膜に正確に挿入する能力を維持する限り、そのアミノ酸配列が完全に保存されている必要はありません。
実際、HCoV-OC43 や HCoV-229E などの一部のコロナウイルスでは FP の先端に 4 残基の欠失があります (拡張データ図 6)。しかし、フュージョンウェッジの全体的な形状、したがってその保存された機能を変える可能性は低いです。

ここで観察された融合ウェッジの実質的な脂質二重層相互作用表面は、拡張中間体の安定性と一致しています。この状態は、SARS-CoV-2が細胞表面に結合すると、S1とそれに関連するACE2が放出された後でも、pHが中性以下にならない限り、何分間も持続することが示されています。
インフルエンザウイルス融合ペプチドについて想定されているものなど、疎水性接触があまり広範ではない融合ペプチドは、おそらく寿命が短いだろうと思われます。

我々の構造は、TM ドメインのより正確な構造定義と、クラス I ウイルス融合タンパク質の融合膜における FP セグメントと TM セグメント間の相互作用の直接的な証拠も提供します。
以前に指定されたプレTMセグメントは、現在TMセグメントの一部であることが示されており、FPに対するTMセグメントのパッキングに寄与しており、膜融合におけるその機能的役割を説明しています。

ある研究では、SARS-CoV SのTMセグメントへの単一残基の挿入により膜融合が完全に失われることが報告されており、融合前立体構造における推定三量体TMドメイン構造に基づいて観察を解釈するのは困難でした。
この挿入は、SARS-CoV の Gly1201 と Phe1202 の間にあり、SARS-CoV-2 の Gly1219 と Phe1220 に対応します。
このような挿入は、おそらく融合後構造の CT とともに TM ヘリックスの C 末端部分の回転を引き起こすでしょう。これにより、FP、TM セグメント、および CT 間の相互作用が破壊され、膜融合の最終段階がブロックされます。
これらの結果は、我々の新しい構造と合わせて、これまで認識されていなかった、脂質二重層内の膜相互作用要素間の相互作用の機能的重要性を浮き彫りにする。それにもかかわらず、これらの相互作用が膜融合に機能的にどのように、どの程度寄与するのかは未解決の疑問のままです。

最後に、我々の構造は、SARS-Cov-2 スパイクの実際の FP はおそらく有用なワクチン標的ではないことを示唆しています。 これは十分に保護されており、融合前の立体構造では抗体がアクセスできず、プレヘアピン中間状態で標的細胞膜に挿入された後も露出されないためです。
いくつかの広範な中和抗体の標的となる s816 ～ 834 は、他の構造的または機能的な理由で保存されている可能性があり、さらなる研究が必要です。
さらに、我々の構造に示されているFPとFPPR、TMセグメント、およびCTの間の相互作用は、ペプチドベースまたは低分子融合阻害剤を開発するための治療標的を提供する可能性があります。
特に、FPPRとFPの相互作用を破壊するように設計されたFPPRの変異は、融合活性を完全に無効にし、この相互作用を標的にしてウイルス感染をブロックする治療候補を同定できる可能性を高めています。

以下省略。