pGEM-T assay プロトコル

概要

自前のインサートとキットの溶液を混ぜて室温で1時間

反応液

2 x Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase ... 5 μl
pGEM-T Vector(50ng/μl) ... 1 μl
insert(PCR product) ... X μl
T4 DNA Ligase ... 1 μl
MilliQ ... 3-X μl

・Positive Control
　Control insert DNA ... 2 μl (X=2)
・Background(Negative Control)
　Control insert DNA ... 0 μl (X=0)

Xの厳密な求め方

(中略)

200 μl PCR tubeにそれぞれのサンプルごと混ぜたら、incubate 室温 1hr

公式プロトコルの形質転換

1. JM109(promega, L2001) 50 μl に 反応液 2 μlを混ぜる

2. on ice 20 min

3. Heat Shock 42 ℃, 45~50 sec @ water bath

4. on ice 2 min

5. SOC 950 μl 加える

6. 37℃, 1.5 hrs, ~150 rpm

7. 100 μlをLB(+抗生物質等)プレートにまく

8. 37 ℃, 1 o/n

2020.7/22
・Xの値 ... 適当に3 μl
・DH5α (TAKARA, #9057 ) 50 μl, DNA 2 μl
・on ice 30 min → heat shock 42℃, 45 sec → on ice 2 min → SOC 450 μl → 37℃, 30 min, 0 rpm
・100 μl を LB Carb+(50μg/ml) plate
・25 ℃, 5 o/n

プロメガのページ

pGEM®-T Easy Vector Systems

pGEM-T assayなどTAクローニング原理

Taqポリメラーゼで増幅したPCR productの末端にはAが付与されている。

PCR productを入れるVector側の切断末端にTがあればT=Aで2つの水素結合を形成する。

そこにT4 DNA Ligaseでホスホジエステル結合を形成させることで、目的DNAを合成する。