pGEM-T assay プロトコル
概要
自前のインサートとキットの溶液を混ぜて室温で1時間
反応液
2 x Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase ... 5 μl
pGEM-T Vector(50ng/μl) ... 1 μl
insert(PCR product) ... X μl
T4 DNA Ligase ... 1 μl
MilliQ ... 3-X μl
・Positive Control
Control insert DNA ... 2 μl (X=2)
・Background(Negative Control)
Control insert DNA ... 0 μl (X=0)
Xの厳密な求め方
(中略)
200 μl PCR tubeにそれぞれのサンプルごと混ぜたら、incubate 室温 1hr
公式プロトコルの形質転換
1. JM109(promega, L2001) 50 μl に 反応液 2 μlを混ぜる
2. on ice 20 min
3. Heat Shock 42 ℃, 45~50 sec @ water bath
4. on ice 2 min
5. SOC 950 μl 加える
6. 37℃, 1.5 hrs, ~150 rpm
7. 100 μlをLB(+抗生物質等)プレートにまく
8. 37 ℃, 1 o/n
2020.7/22
・Xの値 ... 適当に3 μl
・DH5α (TAKARA, #9057 ) 50 μl, DNA 2 μl
・on ice 30 min → heat shock 42℃, 45 sec → on ice 2 min → SOC 450 μl → 37℃, 30 min, 0 rpm
・100 μl を LB Carb+(50μg/ml) plate
・25 ℃, 5 o/n
プロメガのページ
pGEM-T assayなどTAクローニング原理
Taqポリメラーゼで増幅したPCR productの末端にはAが付与されている。
PCR productを入れるVector側の切断末端にTがあればT=Aで2つの水素結合を形成する。
そこにT4 DNA Ligaseでホスホジエステル結合を形成させることで、目的DNAを合成する。
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