慢性便秘患者における小腸内細菌過剰増殖が糞便微生物叢移植の有効性に及ぼす影響

慢性便秘患者における小腸内細菌過剰増殖（SIBO）が糞便微生物叢移植（FMT）の有効性に及ぼす影響を検討するため、我々の研究チームはFMT治療を受けた慢性便秘患者218名を対象とした。SIBO呼気試験の結果に基づいて、患者をSIBOを伴う便秘群（SIBO群）とSIBOを伴わない便秘群（非SIBO群）の2群に分けた。両群の有効性は便秘関連スコアリング尺度を用いて評価された。同時に、FMTの前後で両群から糞便と小腸液を採取し、16S rRNA配列決定によって腸内細菌叢の変化を比較した。その結果、SIBO群におけるFMTの臨床効果は非SIBO群よりも優れていた。FMT治療後、両群とも排便回数が有意に増加し、便の性状が改善した。腹部症状、直腸症状、排便症状は有意に緩和され（P＜0.05）、患者のQOLは有意に向上した（P＜0.05）。FMT後、便秘評価尺度得点以外の尺度得点は両群間で有意差を示し、SIBO群は非SIBO群より有意に良好であった（P＜0.05）。FMT後、大腸の微生物叢にはわずかな変化がみられたが、小腸の微生物叢にはより大きな変化がみられた。ベースラインでは、SIBO群は非SIBO群と比較してVeillonellaの存在量が多く、Escherichia-Shigellaと Acinetobacterの存在量が少なかった。SIBOを有する慢性便秘患者は、SIBOを有さない患者よりもFMTに対して良好な反応を示した。

重要性

既存の研究では、小腸の微生物状態が糞便微生物叢移植（FMT）の有効性に及ぼす影響について検討されたことはほとんどなく、また小腸の微生物状態が大腸運動性の回復に及ぼす影響についても広範に検討されたことはない。そこで本研究では、小腸内細菌過剰増殖（SIBO）が便秘治療におけるFMTの有効性に及ぼす影響、特に小腸の微生物状態が大腸ホメオスタシスの回復、ひいては大腸運動能の回復に及ぼす影響について検討する。

はじめに

小腸内細菌過剰増殖（SIBO）とは、小腸内に過剰な数の細菌が存在し、胃腸症状を引き起こすものと定義される。これらの細菌は通常、大腸内細菌叢の一部であり、主にグラム陰性好気性菌と炭水化物を発酵させてガスを産生する嫌気性菌で構成されている(1)。SIBOの徴候や症状は、小腸における病的な細菌発酵によって引き起こされる、栄養素の吸収不良、腸管透過性の変化、炎症、免疫活性化によるものである(2)。主な症状は、吐き気、腹部膨満感、腹痛、下痢、便秘などである。極端な場合には、体重減少、貧血、脂溶性ビタミンの欠乏、小腸粘膜の炎症などの症状が現れることもある(3)。最近の北米のコンセンサスでは、十二指腸/十二指腸からの吸引液中のコロニー数が1mlあたり103個以上であることがSIBOの診断基準であるとされている(4)。呼気試験は、主に水素ガスとメタンガスを測定するもので、現在、SIBOの診断に最も一般的に用いられている方法である(5,6)。
便秘は通常、Romeの診断基準に従って、排便回数の減少（成人では週3回未満）、排便困難（いきむ、閉塞感、不完全な排便）、便が乾燥して硬い、排便を容易にするために手作業が必要、などと定義される。便秘は、一次性であることもあれば、パーキンソン病などの他の疾患に続発することもある(7)。成人における慢性便秘の世界的な有病率は8.2％～32.9％で、中国人の有病率は4.0％～10.0％である(8,9)。慢性便秘患者における微生物叢の多様性は、健常人とは異なっている。研究により、慢性便秘患者と健常人の大腸粘膜微生物叢構造に有意な違いがあることが判明している(10)。慢性便秘患者では、2つの一般的なプロバイオティクス属、Lactobacillus属とBifidobacteria属の相対量が顕著に減少している。さらに、2つの主要な微生物代謝産物である短鎖脂肪酸と二次胆汁酸のレベルは、健康な人に比べて慢性便秘患者の糞便中で有意に低い(11 -13)。
糞便微生物叢移植（FMT）とは、健康なドナーの糞便を最小限の処理でレシピエントの腸管に移植することであり、腸内微生物叢を回復させ、腸内細菌叢の変化に関連する疾患を治療することを目的としている(14)。腸内細菌叢は、主に細菌、ウイルス、真菌、原生動物、古細菌から構成され、ヒトの健康と疾病に重要な役割を果たしている。腸内細菌叢の恒常性が乱れると、便秘、炎症性腸疾患（IBD）、過敏性腸症候群（IBS）、大腸がん、メタボリックシンドローム、自閉症など、さまざまな疾患と関連する腸内細菌叢異常症（dysbiosis）が引き起こされる（15、16）。現在、FMTは再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症（rCDI）に対する治療法として確立しており、国際的なガイドラインでも推奨されている(17)。また、FMTはrCDIのリスクが高い患者にも予防効果をもたらし、rCDIのリスクがある患者の78.1％が移植後1年以内にCDI感染のない状態を維持したとの研究結果もある(18)。近年、FMTは便秘、下痢、IBSなどの消化器系疾患の治療に適用されることが多くなっている(19,20)。FMTの有効性は疾患のタイプによって大きく異なり、例えば、FMTは出口閉塞型便秘に比べ、緩徐通過型便秘や混合型便秘に良好な結果を示している(21)。腸内細菌叢の状態もFMTの有効性に影響するが、慢性便秘患者におけるSIBOがFMTの有効性に及ぼす影響に関する研究は限られている。そこで、本研究の目的は、慢性便秘症患者におけるFMTの有効性に対するSIBOの影響を検討することである。

材料と方法

患者およびデータ収集

本研究は、ClinicalTrials.govに識別子NCT06208930で登録された研究の一部であり、2022年11月から2023年12月までに当科でFMTを受けた慢性便秘患者218名を対象とした。本試験では、糞便サンプル389検体、小腸液サンプル250検体を含む合計639検体が採取された。患者の基本情報を表1に示す。全患者は入院時にSIBOの呼気検査を受け、FMTの前後に便秘関連の質問票を実施した［Bristol Stool Form Scale（BSFS）、Constipation Assessment Scale（CAS）、Constipation Scoring System（CSS）、Patient Assessment of Constipation Symptoms（PAC-SYM）、Patient Assessment of Constipation Quality of Life（PAC-QOL）を含む］。腸内細菌叢の状態を評価するため、各FMT前およびFMT後に患者の糞便サンプルおよび小腸液を採取し、16S rRNA塩基配列決定を行った。

表1

表1患者の一般情報a,b

特徴全体（N= 218）
年齢（平均±標準偏差） 55.62±16.48
性別（男性/女性） 95/123
SIBO（陽性/陰性） 88/130
罹病期間（年） 13.46 ± 7.98
完全自然排便（CSBM）時間/週 1.32 ± 0.66
自発的腸運動（SBM）時間/週 1.76 ± 0.59
ウェクスナースケール 16.27 ± 1.68
ブリストル便形態尺度（BSFS） 1.30 ± 0.46
パックシム 2.95 ± 1.32
パックコール 2.89 ± 0.48
下剤使用歴
刺激性下剤 94
浸透圧性下剤 70
溶剤性下剤 58
潤滑性下剤 36
プロバイオティクスの服用 123
浣腸 22

除外基準： (i)慢性便秘の診断で入院した、(ii)入院時にSIBO呼気検査を受けた、(iii)FMT前後の糞便および小腸液サンプルが入手可能である。

除外基準： (i)消化器悪性腫瘍の存在；(ii)消化器手術歴；(iii)巨大結腸症の存在；(iv)抗生物質の大量使用歴；(v)他の疾患による慢性便秘患者。

観察指標

排便回数

完全自然排便（Complete Spontaneous Bowel Movement：CSBM）とは、患者が満足または安心できると感じる排便を指す。自然排便回数（SBM：Spontaneous Bowel Movement）は週単位でカウントし、FMT前後でのCSBMとSBMの変化を追跡する。

便形スケール

BSFS(22)を使用し、便のタイプを1～7で評価する：タイプ1：分離した硬い塊、タイプ2：塊のあるソーセージ状、タイプ3：表面にひび割れのあるソーセージ状、タイプ4：滑らかで柔らかいソーセージまたはスネーク、タイプ5：縁がはっきりした柔らかい塊、タイプ6：ドロドロした粘性、タイプ7：水様で固形片がない。

便秘症状

ウェクスナースケール

この尺度には、排便回数、1回あたりの排便時間、疼痛の評価、介助の形態、完全性、24時間以内に排便に失敗した回数、腹痛、および症状の持続期間の8項目が含まれる。それぞれ重症度または頻度に応じて0点（全くない）から4点（非常にひどい）まで点数化され、点数が高いほど重度の便秘であることを示す。合計スコアが15以上であれば便秘とみなされ、スコアが高いほど重症であることを示す(23)。

CAS

CASは、便秘症状の重症度を評価するために用いられるツールである。通常、慢性便秘患者、特に高齢者や長期療養者に用いられる。CASは、排便回数、便の硬さ、排便困難、腹部不快感を含む8つの項目をカバーしている。各項目は0点（症状なし）から2点（症状重度）までのスコアで評価され、全項目のスコアを合計すると0点から16点までの総スコアが得られる。点数が高いほど重度の便秘であることを示す。

CSS

1993年にJorgeとWexnerによって提案されたCSSは、便秘の重症度を評価する尺度である。便秘の重症度を定量化するために、便秘患者の複数の症状を点数化する。症状には、排便回数、いきみ、便の硬さ、排便の不完全さ、閉塞感、手指操作（指の使用など）、下剤の使用、1週間の排便回数などが含まれる。総スコアが高いほど重度の便秘であることを示す。

PAC-SYM

この便秘症状の自己評価尺度には、腹部症状、直腸症状、便症状の3つの側面があり、合計12項目がある。0（全くない）から4（非常にひどい）までの5段階のリッカート尺度が用いられ、各次元の得点はその次元のすべての症状の得点の平均、合計得点は12項目すべての平均である。得点が高いほど、より重度の便秘症状を表す。

QOL評価

QOLは、治療前後にPAC-QOL質問票（24）を用いて評価される。この質問票には28の項目があり、身体的不快感、心理社会的不快感、心配と懸念、満足感の4つの次元に分かれている。各項目は、0（まったく感じない）から4（非常に感じる）までの5段階で評価される。各次元の得点はその次元内の全項目の平均であり、総合得点は全28項目の平均である。得点が高いほど生活の質が低いことを示す。

結果と定義

FMTによる入院中の有害事象（AE）を記録する。AEとは、FMTの過程で生じた新たな症状、以前の症状の悪化、臨床検査値の異常を指し、患者の症状に基づいて軽度、中等度、重度に分類する。臨床的治癒とは、自律排便回数が週3回以上、BSFSスコアが3～5点、腹部症状がないこと、臨床的改善とは、入院時と比較して自律排便回数が増加しているが週3回未満、または腹部症状が軽減していること、臨床的不全とは、入院時と比較して自律排便回数が増加せず、腹部症状が持続していることと定義する。

呼気試験

呼気検査を受ける前に、患者は12時間絶食しなければならない。検査方法はコンセンサス法(4,6)に従う。患者の検査結果が以下の条件のいずれか1つ以上を示す場合： CH4（メタン）≧10ppb、H2（水素）≧20ppb、またはNO（一酸化窒素）≧10ppbであれば、呼気検査の結果は陽性とみなされる。それ以外の場合は陰性です。

ドナーのスクリーニング

ドナーの選択は以下の基準を満たす必要がある： (i) 年齢が18～30歳であること、(ii) 体格指数が18～25kg/m2であること、(iii) 身体検査で病理学的徴候がないこと、(iv) 感染症の既往歴がないこと、(v) 最近の胃腸疾患、代謝性疾患、神経学的既往歴、その他の全身疾患がないこと、(vi) 腸内細菌叢の構成に損傷を与える可能性のある薬剤を最近使用していないこと； (vii) 規則正しい健康的な食事、適切な運動、調和のとれた家庭環境、喫煙や飲酒の習慣がないこと (viii) 一般的な血液検査や便検査、潜在的な病原体や感染症のスクリーニングなど、糞便を提供する前の血液検査や便検査に合格していること。

FMTの準備と手順

提供された糞便約100gを無菌容器に採取し、生理食塩水300mLを加える。混合物を撹拌し、2.0mmおよび0.5mmメッシュフィルターを通過させる。滅菌グリセロールを最終濃度10％になるように加え、溶液は使用まで-20℃で1～8週間保存する。患者はFMTの12～24時間前にポリエチレングリコール腸洗浄を受ける。糞便懸濁液は37℃の水浴中で解凍され、解凍後6時間以内にあらかじめ留置した経鼻腸管から患者に注入される。

DNA抽出および16S rRNA遺伝子配列決定

PowerMax Extraction Kit（MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA）を用いて、メーカーのプロトコールに従い、糞便検体から微生物ゲノムDNAを抽出した。その後、アガロースゲル電気泳動とNanoDrop ND-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、微生物DNAの量と純度を評価した。16S rRNAのV4領域を増幅するために、2つのユニバーサルプライマー、具体的には515フォワードプライマー（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）と806リバースプライマー（5′-GGACTACNVGGTWTCTAAT-3′）を用いた。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、50μLの反応混合物内で行った。PCRサイクルは、98℃で30秒間の初期変性、98℃で15秒間の変性、58℃で15秒間のアニーリング、72℃で15秒間の伸長、72℃で1分間の最終伸長を含む25サイクルで構成された。その後、PCR産物をAMPure XP Beads (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)を用いて精製し、PicoGreen double-stranded DNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてDNA濃度を測定した。定量後、DNAライブラリーをIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで2×250 bpペアエンド配列決定した。(Ltd.（中国、上海）で行った。アンプリコンはAxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City, CA）を用いて精製した後、Qubit dsDNA BR Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてライブラリーを定量した。最後に、プールしたアンプリコンをIllumina HiSeq PE250シーケンスプラットフォームでペアエンドシーケンス（2×250bp）した。シーケンス深度はサンプルあたり42,501リードであった。

データ処理、解析、可視化

Qiime2バージョン2023.2.0を利用して、生のシーケンスデータに対してDADA2処理を行った（25,26）。まず、アダプター配列とバーコード配列を除去する品質フィルタリングを実行し、配列を適切な長さにトリミングして、平均品質スコアが25以下の配列を廃棄した。次に、配列の複製を解除し、配列のバリアントを評価し、マージし、最後に標準的なDADA2法に従ってキメラ配列を評価した。全サンプルにおける頻度が50未満のアンプリコン配列バリアント（ASV）、または3サンプル未満に出現したアンプリコン配列バリアントは除外した。濾過後、Greengenes2 2022.10データベースCを使用して、代表的な配列とbiom形式の表にラベルを付けました。得られた表と分類学的アーチファクトは、biom形式のASV表に分類群データを統合した後の追加解析のために、それぞれbiom表とテキストファイルとしてエクスポートしました。
microeco "パッケージ（v.0.15.0）を用いて、アルファ多様性指数とベータ多様性指数を計算し、可視化した（27）。主座標分析（PCoA）、分類学的構成バープロット、特徴量ボックスプロット、ベンプロット、ヒートマッププロットもこのパッケージを使って作成した。微生物相は相対的な存在量で表されることから、微生物相組成の違いを比較するために線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析を利用した（28）。また、Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (v.2.5.1)ワークフローを適用して微生物叢のメタゲノム機能を予測し、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)データベースを用いて機能パスウェイをアノテーションした(29)。

統計解析

本研究では、2群間の連続変数はt検定を用い、複数群間の連続変数は分散分析（F検定としても知られる）を用いて評価した。すべてのカテゴリー変数と順序変数はχ2検定で評価し、結果は度数とパーセンテージで表した。分析に使用した統計ツールはSPSS version 26.0である。

結果

SIBO便秘患者に対するFMTの安全性

FMTの治療および追跡期間中、SIBO群の患者の11.36％（10/88）が15件のAEを経験した（表2参照）。最も多かったのは腹部膨満感で5件、残りは腹痛4件、下痢2件、悪心・嘔吐2件、発熱2件などであった；13. 08％（17/130）の非SIBO群では24件のAEが発生し、最も多かったのは腹部膨満感で10件、残りは腹痛8件、下痢1件、悪心・嘔吐2件、発熱3件であった。これらのAEは対症療法により消失または軽減し、FMTに関連した死亡例はなかった。

表2

表2有害事象の2群

有害事象非SIBO群 n (n/N%)
(N= 130) SIBO n (n/N%)
(N= 88)
頻度
有害事象 24 (100) 15 (100)
重篤な有害事象 0 (0) 0 (0)
重症度
軽度 19 (79.17) 11 (73.33)
中等度 5 (20.83) 4 (26.67)
重症 0 (0) 0 (0)
生命を脅かすもの 0 (0) 0 (0)
死亡 0 (0) 0 (0)
有害事象の種類
腹部膨満感 10 (41.67) 5 (33.33)
腹痛 8 (33.33) 4 (26.67)
下痢 1 (4.17) 2 (13.33)
吐き気・嘔吐 2 (8.33) 2 (13.33)
発熱 3 (12.5) 2 (13.33)

SIBOを有する便秘患者はSIBOを有さない患者よりもFMTの効果が高い

本試験において、SIBO群の臨床効果は非SIBO群よりも優れていた。具体的には、治癒率はSIBO群で有意に高く（P=0.003）、非反応率は非SIBO群と比較して有意に低く、統計学的有意差（P=0.0001）が認められた。しかし、症状緩和率には両群間に有意差はなかった（P=0.38）（表3参照）。FMT治療後、両群とも排便回数は有意に増加し、1週間あたりのCSBMおよびSBMの回数は増加した（P＜0.05）（表4）。さらに、BSFSスコアの上昇に示されるように、便の性状は顕著に改善した（P< 0.05）。腹部症状、直腸症状、排便症状も有意に改善した。これらの改善はPAC-SYM、Wexnerスコア、CAS、CSSを含む様々な尺度を用いて評価され、それぞれ統計学的に有意な変化を示した（P< 0.05）（表5、6）。患者のQOLは、PAC-QOL質問票のスコアの有意な変化（P< 0.05）が示すように、かなり改善した（表7）。群間差分析では、CASを除くすべての得点尺度がFMT後に2群間で有意差を示し、SIBO群の方が非SIBO群よりも得点が高かった（P＜0.05）。

表3

表3両群の総合的臨床効果

非SIBO群 % (n/N) SIBO群 % (n/N)P
治癒率 35.38 (46/130) 55.68 (49/88) 0.003
寛解率 20.00 (26/130) 25.00 (22/88) 0.38
無効率 44.62 (58/130) 19.32 (17/88) 0.0001
臨床的奏効率 55.38 (72/130) 80.68 (71/88) 0.0001

表4

表4両群におけるFMT前後の排便回数

非SIBO SIBO FP
FMT前 FMT後 FMT前 FMT後
SBM時間/週 1.88 ± 0.60 3.13 ± 1.58 1.67 ± 0.61 3.84 ± 1.60a54 .03 0.001
CSBM time/week 1.41 ± 0.66 2.40 ± 1.12 1.27 ± 0.64 2.94 ± 1.29a51 .34 0.001

SIBO群のFMT後のスケールスコアが非SIBO群と比較して有意差があったことを示す、P＜0.05。

表5

表5両群における治療前後のPAC-SYMスコア

非SIBO SIBO FP
FMT前 FMT後 FMT前 FMT後
腹部症状 3.01 ± 0.78 1.71 ± 1.12 2.91 ± 0.71 1.23 ± 1.06a54 .189 0.001
直腸症状 2.98 ± 0.69 1.76 ± 1.10 2.84 ± 0.69 1.18 ± 1.00a61 .68 0.047
排便症状 3.02 ± 0.69 1.66 ± 1.11 3.07 ± 0.66 1.26 ± 1.04a62 .51 0.001
合計スコア 3.00 ± 0.38 1.71 ± 1.00 2.94 ± 0.43 1.22 ± 0.95a86 .83 0.002

SIBO群のFMT後のスケールスコアが非SIBO群と比較して有意差があることを示す、P＜0.05。

表6

表62群における治療前後の臨床スコアスケールのスコア

非SIBO SIBO FP
FMT前 FMT後 FMT前 FMT後
BSFS 1.30 ± 0.74 2.52 ± 0.83 1.32 ± 0.47 2.94 ± 0.92a102 .01 0.001
ウェクスナー 16.37 ± 1.85 11.03 ± 3.92 16.57 ± 1.49 9.15 ± 3.90a118 .17 0.001
キャス 10.06 ± 1.79 5.11 ± 2.77 10.27 ± 1.83 4.49 ± 2.53 145.45 0.003
CSS 20.30 ± 3.78 10.96 ± 5.59 21.12 ± 3.32 8.59 ± 5.67a140 .56 0.007

SIBO群ではFMT後のスケールスコアが非SIBO群と比較して有意差があったことを示す、P＜0.05。

表7

表7両群における治療前後のQOLのPAC-QOLスコア

非SIBO SIBO FP
FMT前 FMT後 FMT前 FMT後
身体的不快感 3.04 ± 0.69 1.76 ± 1.05 3.12 ± 0.66 1.44 ± 0.98a55 .401 0.001
心理社会的不快感 2.97 ± 0.58 1.66 ± 1.02 2.96 ± 0.59 1.34 ± 0.89a63 .68 0.002
心配・不安 2.91 ± 0.52 1.98 ± 1.13 2.99 ± 0.56 1.41 ± 1.03a52 .062 0.016
満足感 3.02 ± 0.57 1.58 ± 0.94 2.87 ± 0.57 1.09 ± 0.87a123 .935 0.027
総合得点 2.99 ± 0.31 1.74 ± 0.92 2.98 ± 0.27 1.32 ± 0.84a132 .722 0.001

SIBO群のFMT後のスケールスコアが非SIBO群と比較して有意差があったことを示す、P＜0.05。

SIBO群と非SIBO群の2群におけるFMT後の腸内細菌叢の変化

2群の患者の糞便および小腸液サンプルの16S rRNA遺伝子配列データを比較し、FMT前後の違いを分析した。Vennプロット（図1A）によると、糞便サンプルでは、非SIBO群ではFMT前、FMT7日後、FMT30日後にそれぞれ3912個、2019個、640個のユニークASVが存在したのに対し、SIBO群では対応する時点で3389個、1315個、1275個のユニークASVが存在し、全群で1013個のASVが認められた。小腸液では、FMT前後でSIBO群と非SIBO群に共通するASVが538個存在した（図1B）。両群におけるFMT前後の微生物群集の豊かさと構成を示すために、αダイバーシティ解析とβダイバーシティ解析を行った。FMT前後で両群の糞便中の微生物のα多様性に有意差は認められなかったが（図1C）、小腸液中の微生物のα多様性はFMT後に減少傾向を示した（図1D）。加重UniFrac距離を用いたβダイバーシティ解析（図1E～H）では、糞便のβダイバーシティはFMT前後でやや変化し、特に非SIBO群で顕著であった（図1E、F）。小腸液のβダイバーシティはFMT前後でより顕著に変化し、特にSIBO群で顕著であった（図1G、H）。

図1

図1微生物叢構造の概要。大腸微生物叢（A）と小腸微生物叢（B）の固有のASVと共有ASVを示すベンプロット。大腸微生物叢（C）と小腸微生物叢（D）のシャノン指数の比較。重み付けしたUnifrac PCoAを用いたこれらのグループ間の大腸微生物叢（EおよびF）と小腸微生物叢（GおよびH）のβ多様性。「Neg」は非SIBO群、「Pos」はSIBO群を表す。「F」は糞便、「I」は小腸液。"0 "はFMT前、"7 "はFMT後7日、"30 "はFMT後30日を表す。

図2は、FMT前後の2群の大腸・小腸微生物叢の組成の変化を分類学的に示したものである。その結果、大腸微生物叢の門レベルでは、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリウム門が上位4位を占めたが、FMT前後での変化は両群とも軽微であった（図2AおよびB）。属レベルでは、バクテロイデス属、エシェリヒア・シゲラ属、フェーカリバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属が上位4位を占めた。非SIBO群ではFMT前後でこれらの微生物叢の存在量に有意な変化はなかったが、SIBO群ではEscherichia-Shigellaと Bifidobacteriumの存在量が有意な増加傾向を示し、特にBifidobacteriumはFMT7日後に4.29％から4.94％に増加し、さらにFMT30日後には8.21％に増加した（図2CおよびD）。小腸内細菌叢はより顕著に変化した。門レベルでは、小腸微生物叢の上位4門は、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門、バクテロイーダ門、パテシバクテリア門であった。両群とも、ファーミキューテス門はFMT後7日目に有意な減少傾向を示したが、非SIBO群ではFMT後30日目に顕著な増加傾向がみられたのに対し、SIBO群では増加傾向は顕著ではなかった。FMT前と比較して、SIBO群ではファーミキューテス属が6.30％から4.14％に減少し、非SIBO群では5.36％から4.47％に減少した。プロテオバクテリアは、両群ともファーミキューテスとは逆の傾向を示した（図2EおよびF）。属レベルでは、Streptococcus属の存在量傾向は両群で同様であり、FMT後7日目には有意な減少傾向を示したが、FMT後30日目には増加傾向を示したのに対し、Escherichia-Shigella属の存在量は両群ともFMT後に顕著に増加した（図2GおよびH）。

図2

図2大腸と小腸の微生物叢における異なるレベルの最も豊富な上位10種の棒グラフと箱ひげ図。(AおよびB）大腸微生物叢の門レベル。(Cと D）大腸微生物叢の属レベル。(EおよびF）小腸微生物叢における門レベル。(GおよびH）小腸微生物叢の属レベル。「Neg」は非SIBO群、「Pos」はSIBO群を表す。「F」は糞便、「I」は小腸液。"0 "はFMT前、"7 "はFMT後7日、"30 "はFMT後30日を表す。

次に、両群の移植前後の糞便および小腸液中の特定の分類群の違いを明らかにすることを目的とした。そこで、エフェクトサイズの大きさを利用して、2群間で存在量が異なる細菌群を濃縮するLEfSe解析を行った。有意閾値（P< 0.05）およびLDAスコア>2の下で、図3AからDにそれぞれ、存在量の異なる大腸および小腸微生物叢の分類学的単位を表示した。さらに、LEfSe解析からクラドグラムを作成し、これらのサンプルのクラスから属レベルまでの系統的分布を視覚的に示した。

図3

図3は、2つの患者グループの大腸微生物叢と小腸微生物叢のLEfSe解析結果を示している。LEfSe解析は、2.0を超えるLDAスコア閾値を使用して行われ、2群におけるFMT前後の大腸微生物叢（パネルAおよびB）およびそのクラドグラム（パネルC）の違いを決定した。また、2群間の小腸微生物叢（パネルDとE）とそのクラドグラム（パネルF）の違いも調べている。「Neg "は非SIBO群、"Pos "はSIBO群を示す。「F」は糞便、「I」は小腸液。「0」はFMT前、「7」はFMT7日後、「30」はFMT30日後を表す。

小腸内細菌叢のベースライン状態がFMT治療効果に影響する

FMTの有効性に影響を及ぼす決定因子をより深く掘り下げるために、2つの患者コホート間で大腸および小腸の微生物叢のベースライン微生物プロファイルの比較解析を行った。その結果、大腸の微生物組成は両群間でほとんど差がないことが明らかになった（図4A〜D）。しかし、小腸の微生物叢にはより大きな違いがあった。門レベルでは、多い上位4門は、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門、バクテロイド門、およびアクチノバクテリオータ門であった。非SIBO群と比較して、SIBO群ではファーミキューテス属の存在量が多く、プロテオバクテリア属の存在量が少なかった（図4EおよびF）。属レベルでは、SIBO群のVeillonellaの存在量（13.90％）は非SIBO群（11.30％）より高く、Escherichia-ShigellaおよびAcinetobacterの存在量は非SIBO群より低かった。Escherichia-Shigellaは非SIBO群で6.10％、SIBO群で1.17％、Acinetobacterは非SIBO群で3.41％、SIBO群で0.26％であった（図4GおよびH）。

図4

図4ベースライン時の2群の患者における大腸微生物叢と小腸微生物叢の異なるレベルにおける最も豊富な上位10種の棒グラフと箱ひげ図。(AおよびB）大腸微生物叢の門レベル。(Cと D）大腸微生物叢の属レベル。(Eと F）小腸微生物叢の門レベル。(GおよびH）小腸微生物叢の属レベル。「Neg」は非SIBO群、「Pos」はSIBO群を示す。「F」は糞便、「I」は小腸液。「0」はベースライン状態を表す。

小腸液のベースライン状態がFMTの有効性にどのような影響を及ぼすかをさらに検討するため、2群の患者のベースライン検体についてLEfSe解析を行った。その結果、非SIBO群ではCandidatus_Obscuribacter、Anaerostipes、Gracilibacteriaが、SIBO群ではSphingomonasと Meiothermusが濃縮されていた（図5A）。さらに、ベースラインの小腸液で機能予測を行ったところ、SIBO群ではイソロイシンとバリンの生合成能が強いことが明らかになった（図5B）。これまでの研究で、イソロイシンとバリンは筋タンパク質合成の増加に寄与することが示されており(30)、その結果、腸の運動性をある程度高めることができ、SIBOの便秘患者においてFMTがより効果的である理由を説明することができる。さらに、小腸液中の濃縮度の異なる菌種と臨床的特徴との相関を解析した。その結果、SIBO群のCandidatus_Saccharimonasは心配や不安と有意な相関があり（P< 0.05）、SIBO群のAbiotrophiaは排便回数と有意な相関があった（P< 0.05）（図5CおよびD）。

図5

図5小腸内細菌叢におけるLEfSe解析と、異常に豊富な菌種と臨床的特徴との相関。(A）LDAスコア閾値＞2.0のLEfSe解析により、2群の小腸内細菌叢の違いを同定した。(B）2群の小腸内細菌叢で異なる豊富な機能経路のKEGGレベル2アノテーション。臨床的特徴とLEfSe解析により同定された異常に豊富なASVとの相関のヒートマップ（C）と分岐マップ（D）。「Neg」は非SIBO群、「Pos」はSIBO群を示す。「I」は小腸液を示す。「0」はベースライン状態を表す。

考察

SIBOは、小腸内の細菌数の増加および/または異常な型によって特徴づけられる胃腸疾患である。腸管解剖学的構造の変化、腸管運動の低下、消化管機能障害による二次的疾患と考えられている(31)。これらの細菌には主にグラム陰性嫌気性菌と好気性菌が含まれ、特定の条件下では過剰増殖し、下痢、体重減少、栄養不良などの症状を引き起こすことがある(32)。本試験では、2群の便秘患者がFMTの過程で経験したAEに差はなく、SIBO患者に対するFMT治療の安全性を反映していた。さらに、ランダム化比較試験でもSIBO患者に対するFMTの安全性が確認されている（33）。
この研究では、腹部症状、直腸症状、腸症状を含む便秘関連症状を、患者のFMT前後に特定の尺度を用いて評価した。その結果、便秘とSIBOを合併している患者は、SIBOを合併していない便秘患者と比較して、顕著に良好な臨床転帰を示すことが観察された。潜在的な機序を検討するため、両患者群の糞便および小腸液サンプルについて16S rRNA配列決定が行われた。その結果、FMT後の大腸微生物叢の変化はわずかであったが、小腸微生物叢には有意な差が認められた。属レベルでは、両群ともFMT後にStreptococcusと Veillonellaの存在量が有意に減少したが、Escherichia-Shigellaの存在量は増加した。研究では、FMTが抗生物質による腸内微生物の多様性の乱れを改善し、さまざまな嫌気性菌の存在量を回復させ、腸球菌、連鎖球菌、Veillonella属などの存在量を減少させることが報告されている(34)。潰瘍性大腸炎に対するFMTの二重盲検試験では、ドナー便中のレンサ球菌の存在量と患者の寛解率との間に負の相関関係があることが明らかになった(35)。原発性硬化性胆管炎とIBDの患者106人の微生物叢データを健常人と比較して解析した結果、ベヨネラとIBDの関連が示唆された（36）。ベヨネラは、炎症の特徴的な代謝副産物である硝酸塩を終末電子受容体として嫌気性呼吸に利用することができ、硝酸塩呼吸のためにnarGHJIオペロンに依存して、有機酸での増殖を促進し、アミノ酸やペプチドを炭素源として利用することができる(37)。抗生物質関連下痢症や慢性下痢症の患者の便検体では、Escherichia-Shigellaの増加が認められた(38)。これらの細菌は腸管内腔側から腸管細胞に侵入し、腸管バリアの完全性を損ない、急速に陰窩様浸潤部にコロニー形成し、その接着を促進する（39）。さらに、コアマイクロバイオーム以外にも、十二指腸や空腸にも一般的に赤痢菌が存在することが研究でわかっている（40）。同じ微生物集団が、腸の異なる生理的部分で異なる役割を果たすことがある。十二指腸から結腸へと腸内環境が変化するにつれて、機能特異的な細菌が特定の場所で活動することが促進される(40)。
慢性便秘に対するFMTの有効性に対するSIBOの影響をさらに検討するため、2つの患者群における大腸および小腸の微生物叢のベースライン状態の調査が行われた。その結果、ベースライン時の糞便微生物叢には2群間で有意差はなかったが、小腸液の微生物組成には明らかな違いが認められた。FMTに関する316の臨床データとメタゲノミックデータセットを解析した研究によると、FMT前の微生物構造と多様性、そしてドナーとレシピエントの微生物相補性が、FMTの回復能力と効果を決定することがわかった(41)。レシピエントの元々の腸内細菌叢は、エネルギー競合、生態学的ニッチ競合、免疫相互作用を通じて、導入されたドナー微生物のコロニー形成に影響を与える可能性がある(42)。便秘およびSIBO患者では、非SIBO便秘群と比較して、小腸液中の連鎖球菌およびVeillonellaの存在量が有意に高く、Escherichia-Shigellaの存在量は顕著に低かったことから、小腸微生物叢のベースライン状態がFMTの有効性に影響を及ぼす可能性が示された。研究では、Escherichia-Shigellaが炭水化物関連の代謝や様々な脂質関連の代謝産物と関連しており、Veillonellaは乳酸をプロピオン酸に代謝することができる(43,44)。FMTは腸内の偏性嫌気性菌の相対的な存在量を変化させ、また炭水化物代謝経路を修正し、壊死性腸炎の発生率を低下させることが示されている（45）。したがって、2つの便秘患者群で観察された治療成績の違いは、小腸液の微生物叢のベースライン状態、特に炭水化物代謝に関連しているのではないかと推測される。
小腸は人体における栄養吸収のための重要な部位であるが、その微生物叢の研究は依然として急務である。既存の研究では、小腸の微生物叢と機能性消化管疾患、免疫系障害、代謝関連疾患との関連が指摘されている(40)。ある研究では、健常対照者と比較して、クローン病患者では十二指腸粘膜微生物叢のα-多様性が有意に増加し、十二指腸と回腸における連鎖球菌を含む24の細菌属の存在量に顕著な変化が認められた(46)。別の研究では、環境性腸管機能障害を有する小児36人の十二指腸マイクロバイオームを解析し、通常腸管病原体とは考えられていない14のコア細菌分類群を同定した。Veillonella属、Streptococcus属、Rothia mucilaginosa属を含むこれらの細菌は、小児の成長と逆相関を示し、Lipocalin-2（LCN2）のような免疫・炎症反応に関与する十二指腸タンパク質と正の相関を示した。小腸内細菌叢とヒトの健康との間に密接な関係があることを示唆する証拠が増えており、今回の研究結果も、小腸内細菌叢の状態がFMTの治療効果に影響を及ぼす可能性があることを示している。研究により、全腸内細菌叢移植はFMTよりも正確であることが示されている。動物実験では、ドナーの微生物叢の特定のセグメントとその機能が、レシピエントの腸の対応するセグメントにコロニー形成し、その効果を発揮する傾向があることが明らかにされている。例えば、ドナーの小腸のプロテオバクテリア、乳酸菌、シアノバクテリアはレシピエントの小腸に定着しやすく、ドナーの大腸の炭水化物を分解する嫌気性菌はレシピエントの大腸に定着しやすい(48)。しかし、サンプル採取に限界があるため、小腸内細菌叢の研究にはさらなる探求が必要である。
この研究には一定の限界がある。第一に、患者の糞便および小腸液サンプルの検査は16S rRNA配列決定法を用いて行われ、我々の現在の機能は16S rRNA配列決定とKEGG予測に基づいている。次のステップとして、メタゲノムおよびメタボロミクスのシーケンシングを実施する予定である。さらに本研究では、サンプル採取の過程で、鼻空腸チューブを通して小腸液を吸引する陰圧装置を使用した。この方法は、小腸液サンプルにある程度の汚染を引き起こした可能性がある。今後、小腸液サンプルの採取方法を改善する予定である。

謝辞

本研究は、「第十三次五カ年計画」国家重点研究開発計画「積極的健康・加齢科学技術対応」重点プロジェクト（2022YFC20101）、上海市科学技術革新行動計画（21Y11908300、22DZ2203700）、中国国家自然科学基金（82100698）、同済大学第十人民病院クライム計画（2021SYPDRC045）の助成を受けた。

脚注

L.W.がプロジェクト全体の設計と原稿の執筆、Y.X.が微生物叢データの解析、L.L.が設計のアイデア提供、B.Y.とD.Z.がサンプル情報の提供、C.Y.、Z.L.、J.C.が患者からの情報とサンプルの収集、Y.L.とW.Z.が患者の治療効果のモニタリングを担当、N.L.、H.T.、Q.C.が研究全体の監督と修正を行った。

参考文献

Pimentel M、Saad RJ、Long MD、Rao SSC。2020. ACG臨床ガイドライン：小腸細菌の過剰増殖。Am J Gastroenterol115:165-178.

慢性便秘患者における小腸内細菌過剰増殖が糞便微生物叢移植の有効性に及ぼす影響